JP2023529506A - バイオフィルム関連の感染症の診断および処置のための方法 - Google Patents

Abstract

医療用インプラントを有する対象におけるバイオフィルム関連の感染症の迅速な診断および処置のための方法およびシステムが、本明細書に開示されている。レポーターカクテル組成物が、本明細書に開示されており、目的の微生物の検出および感染症の存在の決定に使用することができる。治療カクテル組成物もまた、本明細書に開示されており、バイオフィルム関連の感染症と診断された対象の処置に使用することができる。本開示の第２の局面は、対象における感染症を予防または阻害する方法であって、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物を、外科的インプラント、包帯剤または縫合糸に適用する工程を含む、方法である。

Description

関連出願への相互参照
本願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２０年６月１５日に出願された米国仮出願第６３／０３９，１４６号に基づく優先権およびその利益を主張する。

発明の分野
本発明は、感染性因子を使用した細菌感染症の検出および処置のための組成物、方法およびシステムに関する。

背景
植込み型デバイスの術後感染症は、医療分野内における大きな懸念である。このような感染症は、診断および処置することが困難なことがある。特に複雑化する因子の１つは、バイオフィルムの形成である。バイオフィルムは、細菌または他の微生物の層であり、１または複数の種の細菌から形成され得る。バイオフィルムとして成長する細菌は、タンパク質、多糖および核酸からなりバイオフィルムが天然物の表面や医療用デバイスに接着することを可能にする細胞外ポリマー分泌物（ＥＰＳ）のマトリックス内に存在する。細菌は、その環境へとＥＰＳを分泌し、バイオフィルムの機能的および構造的統合性を確立する。バイオフィルムは、細菌がその栄養素を共有することを可能にし、抗生物質を含む有害因子から細菌を保護する。

バイオフィルムは、慢性、院内および医療用デバイス関連の感染症を引き起こすことができる。そのような感染症は、その抗生物質抵抗性の性質が原因で、処置することが困難であり、よって、抗生物質単独での使用は典型的に、バイオフィルム関連の感染症の処置に無効である（Khatoon et al., 2018, Heliyon）。バイオフィルム関連の感染症は、処置することが困難であるのみならず、感染症の種分化（speciation）／感受性による正確な診断を確立するための課題も提示する。

抗生物質は、微生物によって引き起こされた感染症を処置するために広く使用されている。一部の微生物は、特定の抗生物質に対して天然で抵抗性であるが、他の微生物は、しばらくの間抗生物質で処置された後に、そのような抵抗性を獲得することができる。抗生物質抵抗性は、望まれない結果を引き起こし得る；微生物は依然として、抗生物質の存在下で成長し、したがって、感染症を増悪させ、無効な抗生物質は、重篤な副作用を引き起こし、場合によっては生命を脅かし得る状況をもたらすことがある。結果として、抗生物質抵抗性は、より高い医療費、延長された病院滞在および増大された死亡率をもたらし得る。

したがって、特定の抗生物質に対して抵抗性である微生物の検出は、非常に重要である。身体に存在する感染症の原因となる微生物が、抗生物質に対して抵抗性であるか否か決定する医療提供者の能力は、的確な処置の選択において極めて重要である。さらに、低レベルの微生物を有するサンプルから短い時間枠内で微生物の抗生物質抵抗性を決定することができることは、重症になる前の感染症の成功裏の処置にとって不可欠である。

抗生物質抵抗性検出の現在の方法は、多くの場合、時間がかかる、技術的な要求が厳しい、および／または十分な感度を欠如するアッセイを要求する。典型的には、このようなアッセイは、ゲル電気泳動、リアルタイムＰＣＲ／マルチプレックス化および／または多座位配列タイピングを要求する、培養サンプルにおけるイムノアッセイおよび分子に基づくアッセイを伴う。これらの検査は、多くの場合、完了するのに２４～４８時間を要する、および／または十分な感度を欠如する。現在利用できる方法は典型的に、検出に先立つ微生物の培養による単離および／または富化を要求する、よって、結果までの時間の増大を要求する。したがって、目的の微生物、例えば、感染症を引き起こした微生物が、特定の抗生物質に対して抵抗性であるか否か、当該抗生物質を使用する前に決定するための迅速かつ高感度な検査に強い関心がある。本発明は、検出に先立つ微生物の単離を要求しないことによって、微生物の検出のための迅速な検査として優れている。この知識は、感染症を適時に制御するために、適した抗生物質の処方において臨床医を助け、医療設定における能動的なモニタリングにより重篤感染症の伝播を予防する能力を増大させることができる。

バクテリオファージは、抗生物質処置の代用または補足として示唆された。バイオフィルム関連の感染症を有効に処置することができるように、酵素機能を最適化するためにバクテリオファージを改変することが、有利となるであろう。

概要
本発明の実施形態は、微生物関連の感染症の診断および処置のための組成物、方法およびシステムを含む。本発明は、種々の方法で具現化され得る。

本開示の第１の局面は、対象におけるバイオフィルム関連の感染症の診断および処置のための方法であって、（ｉ）対象から採取された生体サンプルを提供する工程；（ｉｉ）（ａ）生体サンプルの少なくとも１つのアリコートを、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むある量の診断カクテル組成物と接触させる工程；（ｂ）組換えバクテリオファージの複製後に生成されたシグナルを検出する工程であって、シグナルの検出が、目的の微生物がサンプル中に存在することを示す、工程を含む、少なくとも１種の目的の微生物の存在を検出することにより、対象をバイオフィルム関連の感染症と診断する工程；ならびに（ｉｉｉ）（ａ）工程（ｉｉ）の診断に基づき治療カクテル組成物を選択する工程；（ｂ）少なくとも１種のバクテリオファージを含む治療有効量の治療カクテル組成物を投与する工程であって、バクテリオファージが、検出された目的の微生物に特異的である、工程；および（ｃ）少なくとも１種の追加の治療剤を必要に応じて投与する工程を含む、バイオフィルム関連の感染症と診断された対象を処置する工程を含む、方法である。いくつかの実施形態において、治療カクテル組成物は、少なくとも１種のバクテリオファージを含み、バクテリオファージは、組換えバクテリオファージまたは野生型バクテリオファージである。いくつかの実施形態において、対象は、インプラントを有する。

本開示の第２の局面は、対象における感染症を予防または阻害する方法であって、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物を、外科的インプラント、包帯剤または縫合糸に適用する工程を含む、方法である。

本開示の第３の局面は、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物でコーティングされた外科的インプラント、包帯剤または縫合糸である。

本開示のある特定の特異的な実施形態は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１５／０２１８６１６号および米国特許出願公開第２０１９／００１０５３４号に記載されている方法および構築物を活用する。

発明の詳細な説明
細菌感染症を診断するための驚くべきスピードおよび感度ならびに増大された処置有効性を実証する組成物、方法およびシステムが本明細書に開示されている。診断は、現在利用できる方法を用いるよりも短い時間枠で達成され得る。本開示は、アッセイにおける遺伝子改変された感染性因子の使用を記載する。

定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者が一般に理解する意味を有するべきである。さらに、他に状況によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むべきであり、複数の用語は、単数を含むべきである。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。公知の方法および技術は、他に示さない限り、当技術分野で周知の通常の方法によって、および本明細書を通して考察される様々な一般のおよびより特定の参考文献において記載されているように一般に行われる。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造元の仕様によって行われる。本明細書に記載されている実験室の手順および技術に関連して使用される命名法は当技術分野で周知のものであり、一般に使用される。

下記の用語は、他に示さない限り、下記の意味を有すると理解すべきである：

本明細書において使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、他に特に留意しない限り、１つまたは複数を指すことができる。

「または」という用語の使用は、代替物のみを言及することが明確に示されない限り、または代替物が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において使用する場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ超を意味することができる。

本出願を通して、「約」という用語は、その値が、値を決定するために用いられているデバイス、方法についての固有の誤差の変動、または試料の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。

「固体支持体」または「支持体」という用語は、その上に生体分子が結合され得る基材および／または表面を提供する構造物を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイウェル（すなわち、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルプレート等）であり得る、または固体支持体は、ビーズもしくは膜（例えば、フィルタープレート、ラテックス粒子、常磁性粒子またはラテラルフローストリップ（lateral flow strip））等のフィルター、アレイもしくは可動性の支持体上の位置であり得る。

「結合因子」という用語は、第２の（すなわち、異なる）対象分子に特異的および選択的に結合することができる分子を指す。相互作用は、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、または静電相互作用もしくは疎水的相互作用の結果として非共有結合性であり得、あるいは相互作用は共有結合性であり得る。「可溶性結合因子」という用語は、固体支持体に会合（すなわち、共有結合または非共有結合）していない結合因子を指す。

本明細書で使用される場合、「分析物」とは、測定されている分子、化合物もしくは細胞をいう。目的の分析物は、ある種の実施形態において、結合因子と相互作用し得る。本明細書で記載される場合、用語「分析物」とは、目的のタンパク質もしくはペプチドをいい得る。分析物は、アゴニスト、アンタゴニスト、もしくはモジュレーターであり得る。あるいは、分析物は、生物学的効果を有しなくてもよい。分析物としては、低分子、糖、オリゴサッカリド、脂質、ペプチド、ペプチド模倣物、および有機化合物などが挙げられ得る。

「インジケーター部分」または「検出可能な生体分子」または「レポーター」または「インジケータータンパク質生成物」という用語は、定量的アッセイにおいて測定され得る分子を指す。例えば、インジケーター部分は、測定され得る生成物へと基質を変換するために使用され得る酵素を含むことができる。インジケーター部分は、生物発光放射を生成する反応を触媒する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）であり得る。あるいは、インジケーター部分は、定量化され得る放射性同位元素であり得る。あるいは、インジケーター部分は、フルオロフォアであり得る。あるいは、他の検出可能な分子が使用され得る。

本明細書で使用される場合、「バクテリオファージ」もしくは「ファージ」とは、複数の細菌のウイルスのうちの１種またはそれより多くを含む。本開示において、用語「バクテリオファージ」および「ファージ」は、生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、酵母、および他の顕微鏡レベルの生存している生物に侵入し得るウイルスであって、そして上記生物を使用して、該ウイルス自体を複製するウイルスを指す、マイコバクテリオファージ（例えば、ＴＢおよびパラＴＢに関する）、マイコファージ（ｍｙｃｏｐｈａｇｅ）（例えば、真菌に関する）、マイコプラズマファージ、および任意の他の用語などのウイルスを含む。ここで、「顕微鏡レベルの」とは、最大寸法が１ミリメートルまたはそれ未満であることを意味する。バクテリオファージは、それらを複製する手段として、天然において細菌を使用するように進化したウイルスである。ファージは、このことを、ファージ自体を細菌に付着させ、そのＤＮＡ（もしくはＲＮＡ）をその細菌の中に注入し、上記ファージを数百倍もしくはさらには数千倍も複製するようにその細菌を誘導することによって行う。これは、ファージ増幅ともいわれる。

本明細書で使用される場合、「後期遺伝子領域」とは、ウイルス生活環において後期に転写されるウイルスゲノムの領域をいう。上記後期遺伝子領域は、代表的には、最も豊富に発現される遺伝子（例えば、上記バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質）を含む。後期遺伝子は、クラスＩＩＩ遺伝子と同義であり、構造およびアセンブリ機能を有する遺伝子を含む。例えば、上記後期遺伝子（クラスＩＩＩと同義）は、ファージＴ７では、例えば、感染後８分から溶解するまでに、クラスＩ（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）は、早期に４～８分に、およびクラスＩＩは、６～１５分に転写されるので、ＩＩおよびＩＩＩのタイミングは重なり合っている。後期プロモーターは、天然に位置し、このような後期遺伝子領域において活性であるプロモーターである。

本明細書で使用される場合、「富化のための培養」とは、旧来からの培養（例えば、微生物繁殖に都合のよい培地中でのインキュベーション）をいい、語句「富化」の他の考えられる使用（例えば、サンプルの液体構成要素を取り出して、その中に含まれる上記微生物を濃縮することによる富化）、または微生物繁殖の旧来の促進を含まない富化の他の形態と混同されるべきではない。ある期間にわたる富化のための培養は、本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において使用され得る。

本明細書で使用される場合、「組換え（recombinant）」とは他の方法では見いだされない遺伝的物質を一緒にするために、通常は実験室で行われる場合、遺伝的な（すなわち、核酸）改変をいう。この用語は、本明細書において用語「改変された」と交換可能に使用される。

本明細書において使用する場合、「ＲＬＵ」は、ルミノメーター（例えば、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６）または光を検出する類似の機器によって測定される、相対発光量を指す。例えば、ルシフェラーゼと適当な基質（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）とＮＡＮＯ－ＧＬＯ（登録商標））の間の反応物の検出が、検出されるＲＬＵでしばしば報告される。

本明細書において使用する場合、「結果までの時間」は、サンプルのインキュベーションの開始から結果の生成までの合計時間量を指す。結果までの時間は、いかなる確認試験時間も含まない。データ収集は、結果が生成された後、いつでも行われ得る。

サンプル
本開示の方法およびシステムの実施形態のそれぞれは、バイオフィルム関連の感染症の迅速かつ高感度な診断および処置を可能にすることができる。例えば、本開示に係る方法は、短縮された期間内で優れた結果を伴い行うことができる。

本開示によって検出可能な目的の微生物は、生体サンプルに存在する細菌細胞を含むがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、生体サンプルは、郭清（ｄｅｂｒｉｄｅ）された組織、血液、血清、血漿、粘膜関連リンパ系組織、関節液（ａｒｔｉｃｕｌａｒ ｌｉｑｕｉｄ）、胸水（ｐｌｅｕｒａｌ ｌｉｑｕｉｄ）、唾液および尿であり得る。いくつかの実施形態において、灌注が、生体サンプルの収集に使用される。灌注は、開放創または植え込まれた装具を通った溶液（例えば、食塩水）の流れである。よって、いくつかの実施形態において、生体サンプルは、創傷洗浄剤または装具洗浄剤である。

サンプルは、液体、固体または半固体であり得る。サンプルは、固体表面（例えば、医療用インプラント）のスワブであり得る。他の実施形態において、サンプルは、医療用インプラントの周囲の生体液から採取され得る。医療用インプラントは、中心静脈カテーテル、心臓弁、心室補助装置、冠動脈ステント、神経外科的心室シャント、植込み型神経学的刺激装置、人工関節（ａｒｔｈｒｏ－ｐｒｏｓｔｈｅｓｅ）、骨折固定デバイス、可膨張性陰茎インプラント（ｉｎｆｌａｔａｂｌｅ ｐｅｎｉｌｅ ｉｍｐｌａｎｔ）、乳房インプラント、蝸牛インプラント、眼内レンズ、歯科インプラントを含むがこれらに限定されない。

いくつかの実施形態において、サンプルは、調製、濃縮、希釈、精製または単離することなく、本開示の検出方法において直接的に使用され得る。例えば、生体液を含むがこれに限定されない、液体サンプルは、直接的にアッセイされ得る。サンプルは、緩衝溶液または細菌培養培地を含むことができるがこれらに限定されない、溶液に希釈または懸濁され得る。固体または半固体であるサンプルは、液体において固体を刻む、混合するまたは浸軟することにより、液体に懸濁され得る。サンプルは、宿主細菌細胞へのバクテリオファージ付着を促進するｐＨ範囲内に維持されるべきである。サンプルはまた、Ｎａ^＋、Ｍｇ^２＋およびＣａ^２＋を含むがこれらに限定されない、適切な濃度の二価および一価カチオンを含有するべきである。好ましくは、サンプルは、サンプル内に含有される任意の病原体細胞の生存性を維持する温度で維持される。

検出アッセイのいくつかの実施形態において、サンプルは、サンプルに存在する任意の病原体細胞の生存性を維持する温度で維持される。例えば、バクテリオファージが細菌細胞に付着する工程の間、バクテリオファージ付着を容易にする温度でサンプルを維持することが好ましい。バクテリオファージが感染細菌細胞内で複製するまたはそのような感染細胞を溶解させる工程の間、バクテリオファージ複製および宿主の溶解を促進する温度でサンプルを維持することが好ましい。そのような温度は、少なくとも約２５摂氏度（Ｃ）、より好ましくは、約４５℃以下、最も好ましくは、約３７℃である。

アッセイは、様々な適切なコントロールサンプルを含むことができる。例えば、バクテリオファージを含有しないコントロールサンプル、または細菌なしでバクテリオファージを含有するコントロールサンプルは、バックグラウンドシグナルレベルに関するコントロールとしてアッセイされ得る。

インジケーター組換えバクテリオファージ
本明細書においてより詳細に記載されている通り、本開示の組成物、方法およびシステムは、バイオフィルム関連の感染症の診断における使用のための感染性因子を含むことができる。ある特定の実施形態において、本開示は、組換えインジケーターバクテリオファージを含む組成物を含むことができ、バクテリオファージゲノムは、インジケーターまたはレポーター遺伝子を含むように遺伝子改変される。

組換えインジケーターバクテリオファージは、レポーターまたはインジケーター遺伝子を含む遺伝的構築物を含むことができる。組換えインジケーターバクテリオファージのある特定の実施形態において、インジケーター遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。例えば、ある特定の実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製中のインジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物をもたらす。いくつかの例では、遺伝的構築物は、外因性プロモーターをさらに含むことができる。ある特定の実施形態において、遺伝的構築物は、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入され得る。後期遺伝子は、構造タンパク質をコードするため、一般に、他のファージ遺伝子よりも高いレベルで発現される。後期遺伝子領域は、クラスＩＩＩ遺伝子領域であり得、主要カプシドタンパク質の遺伝子を含むことができる。

いくつかの実施形態は、主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する（および、必要に応じて調製する）ことを含む。他の実施形態は、主要カプシドタンパク質遺伝子の上流に相同組換えのための配列を設計する（および、必要に応じて調製する）ことを含む。いくつかの実施形態において、配列は、非翻訳領域の後にコドン最適化レポーター遺伝子を含む。非翻訳領域は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含み得る。

組換えインジケーターファージのいくつかの実施形態において、追加の外因性後期プロモーター（クラスＩＩＩプロモーター、例えば、ファージＫまたはＴ７またはＴ４に由来）は、ファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質の遺伝子を転写する、同じ天然ファージ（例えば、それぞれファージＫまたはＴ７またはＴ４）のＲＮＡポリメラーゼに対して高い親和性を有する。これらのタンパク質は、各ファージ粒子が数ダースまたは数百コピーのこれらの分子を含むため、ファージによって作製される最も豊富なタンパク質である。ウイルス後期プロモーターの使用は、インジケータータンパク質生成物の最適に高レベルの発現を確実にすることができる。インジケーターファージが由来する本来の野生型ファージに由来する、それに対して特異的であるまたはそこで活性がある後期ウイルスプロモーター（例えば、ファージＫまたはＴ４またはＴ７に基づくシステムによるファージＫまたはＴ４またはＴ７後期プロモーター）の使用は、酵素の最適な発現をさらに確実にすることができる。標準細菌（非ウイルス／非ファージ）プロモーターの使用は、このようなプロモーターがファージ感染中に下方調節されることが多いため（ファージが、ファージタンパク質産生のために細菌の資源を優先するために）、一部の場合では、発現にとって有害であり得る。よって、いくつかの実施形態において、ファージは、好ましくは、インジケータータンパク質生成物をコードし、高レベルで発現するように操作される。

いくつかの実施形態において、組換えインジケーターファージは、バイオフィルム形成が可能な細菌種に特異的なバクテリオファージから構築される。本開示によって検出可能な細菌細胞は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓを含むがこれに限定されないＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの全ての種、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉの全ての株、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むがこれに限定されないＬｉｓｔｅｒｉａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．を含むがこれらに限定されない。

請求されている方法およびシステムを使用してその抗生物質抵抗性が検出され得る追加の微生物は、Ａｂｉｏｔｒｏｐｈｉａ ａｄｉａｃｅｎｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｉｉ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、ＣｙｔｏｐｈａｇａおよびＦｌｅｘｉｂａｃｔｅｒ ｐｈｙｌｕｍ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉおよびＥ．ｃｏｌｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｄｕｂｌｉｎｉｅｎｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｕｉｌｌｉｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｌｕｓｉｔａｎｉａｅ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｚｅｙｌａｎｏｉｄｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｐｐ．、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐｐ．、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ、Ｃｒｙｐｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｓｐｐ．、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ群、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｃａｓｓｅｌｉｆｌａｖｕｓ－ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ－ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ群、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉおよびＳｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．群、Ｇｅｍｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ ｓｐｐ．、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ科、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｄｓ群、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．からなる群から選択され得る。

ある特定の実施形態において、インジケーターバクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓまたはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ特異的ファージに由来する。いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、目的の特定の病原性微生物に高度に特異的なバクテリオファージに由来する。

本明細書に記述される通り、そのようなファージは、細菌の内側で複製して、数百個の子孫ファージを生成することができる。ファージに挿入されたインジケーター遺伝子の検出は、サンプル中の細菌の尺度として使用され得る。Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージは、ファージＫ、ＳＡ１、ＳＡ２、ＳＡ３、ＳＡ１１、ＳＡ７７、ＳＡ １８７、Ｔｗｏｒｔ、ＮＣＴＣ９８５７、Ｐｈ５、Ｐｈ９、Ｐｈ１０、Ｐｈ１２、Ｐｈ１３、Ｕ４、Ｕ１４、Ｕ１６およびＵ４６を含むがこれらに限定されない。Ｅ．ｃｏｌｉの十分に研究されたファージは、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７およびラムダを含む；ＡＴＣＣ収集物において利用できる他のＥ．ｃｏｌｉファージは、例えば、ｐｈｉＸ１７４、Ｓ１３、Ｏｘ６、ＭＳ２、ｐｈｉＶ１、ｆｄ、ＰＲ７７２およびＺＩＫ１を含む。その代わりに、天然ファージは、種々の環境供給源から単離され得る。ファージ単離のための供給源は、目的の微生物が見出されることが予想される場所に基づき選択され得る。

本発明の組成物について上に記載されている通り、ファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ファージＫ、ＭＰ１３１、ＭＰ１１５、ＭＰ１１２、ＭＰ５０６、ＭＰ８７、ＩＳＰ、または上に開示されているファージと少なくとも９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８９、８８、８７、８６、８５、８４、８３、８２、８１、８０、７９、７８、７７、７６、７５、７４、７３、７２、７１もしくは７０％相同性を有するゲノムを有する別の天然に存在するファージに由来する。いくつかの局面において、本発明は、ファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む組換えファージを含む。いくつかの実施形態において、ファージは、ＴｅｑｕａｔｒｏｖｉｒｕｓまたはＫａｙｖｉｒｕｓ属に属する。一実施形態において、組換えファージは、ファージＫ、ＩＳＰまたはＭＰ１１５に由来する。ある特定の実施形態において、組換えファージは、特定の細菌に高度に特異的である。例えば、ある特定の実施形態において、組換えファージは、ＭＲＳＡに高度に特異的である。ある実施形態において、組換えファージは、ＭＲＳＡを少なくとも１００種の他の型の細菌から区別することができる。

いくつかの実施形態において、選択される野生型バクテリオファージは、Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ目のファージに由来する。Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）ゲノムを有する尾を持つバクテリオファージの目である。Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ目の各ビリオンは、ウイルスゲノムを含有する正二十面体頭部と、可撓性の尾部とを有する。Ｃａｕｄｏｖｉｒａｌｅｓ目は、５つのバクテリオファージの科を含む：Ｍｙｏｖｉｒｉｄａｅ（長い収縮性尾部）、Ｓｉｐｈｏｖｉｒｉｄａｅ（長い非収縮性尾部）、Ｐｏｄｏｖｉｒｉｄａｅ（短い非収縮性尾部）、ＡｃｋｅｒｍａｎｎｖｉｒｉｄａｅおよびＨｅｒｅｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ。マイオウイルスという用語は、ＭｙｏｖｉｒｉｄａｅおよびＨｅｒｅｌｌｅｖｉｒｉｄａｅ科の両方の内にあるバクテリオファージを包含する、正二十面体頭部および長い収縮性尾部を有する任意のバクテリオファージを記載するために使用され得る。

さらに、非必須であると考えられるファージ遺伝子は、認識されていない機能を有し得る。例えば、見かけ上非必須の遺伝子は、アセンブリーにおける僅かなカッティング、フィッティングまたはトリミング機能等、バーストサイズの上昇において重要な機能を有し得る。したがって、インジケーターを挿入するために遺伝子を欠失させることは、有害であり得る。大部分のファージは、その天然のゲノムよりも数パーセント大きいＤＮＡをパッケージングすることができる。この考察により、より小さいインジケーター遺伝子が、バクテリオファージ、特に、より小さいゲノムを有するバクテリオファージを改変するためのより適切な選択であり得る。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、僅か約２０ｋＤａ（コードするためにおよそ５００～６００ｂｐ）であり、一方、ＦＬｕｃは、約６２ｋＤａ（コードするためにおよそ１，７００ｂｐ）である。さらに、レポーター遺伝子は、細菌によって内在性に発現されるべきではなく（すなわち、細菌ゲノムの一部ではなく）、高いシグナル対バックグラウンド比を生成するべきであり、適時な様式で容易に検出可能であるべきである。ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、改変されたＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（深海エビ）ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯ－ＧＬＯ（登録商標）、イミダゾピラジノン基質（フリマジン（ｆｕｒｉｍａｚｉｎｅ））と組み合わせたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、低いバックグラウンドで堅固なシグナルを提供することができる。

いくつかのインジケーターファージ実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、野生型ファージ遺伝子を無傷のままにして、機能的遺伝子の破壊を回避するために非翻訳領域へと挿入され得、これは、非実験室株の細菌に感染させる場合に、より大きな適合をもたらし得る。さらに、３つ全てのリーディングフレームに終止コドンを含めることは、リードスルー（発現漏れ（ｌｅａｋｙ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）としても公知）を低減することによって、発現を増加させる一助になり得る。このストラテジーはまた、上記ファージから分離できないバックグラウンドシグナル（例えば、ルシフェラーゼ）として現れる融合タンパク質が低レベルで作られるという可能性を排除し得る。

インジケーター遺伝子は、種々の生体分子を発現し得る。上記インジケーター遺伝子は、検出可能な生成物を発現する遺伝子もしくは検出可能な生成物を生成する酵素である。例えば、一実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素をコードする。種々のタイプのルシフェラーゼが使用され得る。代替の実施形態において、および本明細書でより詳細に記載されるように、ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたは工学技術で作製された（engineered）ルシフェラーゼのうちの１種である。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子はＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓに由来する。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）などの遺伝子改変されたルシフェラーゼ遺伝子である。

従って、いくつかの実施形態において、本発明は、上記後期（クラスＩＩＩ）遺伝子領域において非バクテリオファージインジケーター遺伝子を含む遺伝子改変されたバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、後期プロモーターの制御下にある。ウイルス後期遺伝子プロモーターを使用することは、上記レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がウイルスカプシドタンパク質のように、高レベルで発現されるのみならず、内因性細菌遺伝子もしくはさらには初期ウイルス遺伝子のように停止もされないことを確実にする。

感染性因子に対する遺伝的改変は、核酸の小さなフラグメント、遺伝子の実質的部分、もしくは遺伝子全体の挿入、欠失、もしくは置換を含み得る。いくつかの実施形態において、挿入もしくは置換された核酸は、非天然の配列を含む。非天然のインジケーター遺伝子は、バクテリオファージプロモーターの制御下にあるように、バクテリオファージゲノムへと挿入され得る。したがって、いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、融合タンパク質の一部ではない。すなわち、いくつかの実施形態において、遺伝的改変は、上記インジケータータンパク質生成物が上記野生型のバクテリオファージのポリペプチドを含まないように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記インジケータータンパク質生成物は、可溶性である。いくつかの実施形態において、本発明は、目的の細菌を検出するための方法を包含し、上記方法は、試験サンプルをこのような組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程を包含する。

いくつかの実施形態において、宿主細菌の感染後の子孫バクテリオファージにおけるインジケーター遺伝子の発現は、遊離の可溶性タンパク質生成物をもたらす。いくつかの実施形態において、非天然インジケーター遺伝子は、ファージ構造タンパク質をコードする遺伝子と連続していないので、融合タンパク質を生じない。カプシドタンパク質へのインジケータータンパク質生成物の融合体（すなわち、融合タンパク質）を用いるシステムとは異なり、本発明のいくつかの実施形態は、可溶性インジケーターまたはレポーター（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）を発現する。いくつかの実施形態において、インジケーターまたはレポーターは、理想的には、バクテリオファージ構造を含まない。すなわち、インジケーターまたはレポーターは、ファージ構造に付着されない。したがって、インジケーターまたはレポーターの遺伝子は、組換えファージゲノムにおける他の遺伝子と融合されない。このことは、アッセイの感度を大幅に増大させ（単一の細菌に至るまで）、アッセイを単純化し、アッセイが、検出可能な融合タンパク質を産生する構築物により要求される追加の精製工程に起因する数時間とは対照的に、いくつかの実施形態に関して、２時間またはそれ未満で完了されることを可能にすることができる。さらに、融合タンパク質は、例えば、酵素活性部位のコンホメーションまたは基質へのアクセスを変更させ得るタンパク質折り畳みの制約に起因して、可溶性タンパク質より活性が低い場合がある。濃度が、サンプル１ｍＬあたり１，０００個の細菌細胞である場合、例えば、４時間未満が、アッセイに十分であり得る。

さらに、融合タンパク質は、定義によると、バクテリオファージにおけるタンパク質のサブユニットに付着される部分の数を限定する。例えば、融合タンパク質のためのプラットフォームとして機能するように設計された市販のシステムの使用は、各Ｔ７バクテリオファージ粒子における約４１５コピーの遺伝子１０Ｂカプシドタンパク質に対応する、約４１５コピーの融合部分をもたらす。この制約なしで、感染した細菌は、バクテリオファージにおいてフィットすることができるものよりも多くのさらなるコピーのインジケータータンパク質生成物（例えば、ルシフェラーゼ）を発現することが予想され得る。その上、カプシド－ルシフェラーゼ融合体等、大きい融合タンパク質は、バクテリオファージ粒子のアセンブリーを阻害し得、よって、より少ないバクテリオファージ子孫を生じる。よって、可溶性の非融合インジケーター遺伝子生成物が好ましいものであり得る。

いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、検出可能な酵素等のレポーターをコードする。インジケーター遺伝子生成物は、光を生成し得る、および／または色の変化によって検出可能であり得る。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）等、様々な適切な酵素が市販されている。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、インジケータータンパク質生成物として機能することができる。いくつかの実施形態において、ホタルルシフェラーゼが、インジケータータンパク質生成物である。いくつかの実施形態において、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼが、インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）が、インジケータータンパク質生成物である。他の操作されたルシフェラーゼまたは検出可能なシグナルを生成する他の酵素もまた、適切なインジケーター部分であり得る。

いくつかの実施形態において、可溶性インジケータータンパク質生成物の使用は、感染したサンプル細胞の溶解物から混入するストックファージを除去する必要性を排除する。融合タンパク質システムにより、サンプル細胞の感染に使用される任意のバクテリオファージは、付着されたインジケータータンパク質生成物を有し、インジケータータンパク質生成物を同様に含有する娘バクテリオファージから区別不能となる。サンプル細菌の検出は、新たに創出された（ｄｅ ｎｏｖｏ合成された）インジケータータンパク質生成物の検出に頼るため、融合構築物の使用は、古い（ストックファージ）インジケーターを、新たに合成されたインジケーターから分離するための追加の工程を要求する。これは、バクテリオファージ生活環の完了に先立ち感染細胞を複数回洗浄すること、物理的もしくは化学的手段によって感染後に過剰なストックファージを不活性化すること、ならびに／またはその後に結合および分離され得る（ストレプトアビジンでコーティングされたセファロースビーズによる等）結合部分（ビオチン等）によりストックバクテリオファージを化学的に改変することにより達成することができる。しかし、除去においてこれらの試みの全てを用いたとしても、少数のサンプル細胞の感染を保証するために高濃度のストックファージが使用された場合、ストックファージは残り、感染細胞子孫ファージからのシグナルの検出を不明瞭にし得るバックグラウンドシグナルを創出し得る。

対照的に、ストックファージ組成物は、いかなるインジケータータンパク質生成物も有しないため、本発明のいくつかの実施形態において発現された可溶性インジケータータンパク質生成物により、最終溶解物からのストックファージの精製は、不必要である。よって、感染後に存在するいかなるインジケータータンパク質生成物（これは感染した細菌（単数または複数）の存在を示す）も、ｄｅ ｎｏｖｏで創出されている必要がある。この利益を活用するために、ファージの産生および調製は、細菌培養物における組換えバクテリオファージの産生の際に産生された任意の遊離インジケータータンパク質生成物からのファージの精製を含むことができる。ショ糖密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、および透析または派生技術（Ａｍｉｃｏｎブランド濃縮器 － Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｉｎｃ．等）等、標準バクテリオファージ精製技法を用いて、本発明に係るファージのいくつかの実施形態を精製することができる。本開示の組換えファージの調製の一部として塩化セシウム等密度超遠心分離を用いて、細菌宿主におけるファージの繁殖後に産生された混入するルシフェラーゼタンパク質からストックファージ粒子を分離することができる。このようにして、本発明の組換えバクテリオファージは、細菌の産生の際に生成されたいかなるルシフェラーゼも実質的に含まない。ファージストックに存在する残留ルシフェラーゼの除去は、組換えバクテリオファージが検査サンプルと共にインキュベートされたときに観察されるバックグラウンドシグナルを実質的に低減させることができる。

改変された組換えバクテリオファージのいくつかの実施形態において、後期プロモーター（クラスＩＩＩプロモーター）は、バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質の遺伝子を転写する、同じバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼに対して高い親和性を有する。これらのタンパク質は、各バクテリオファージ粒子が数ダースまたは数百コピーのこれらの分子を含むため、ファージによって作製される最も豊富なタンパク質である。ウイルス後期プロモーターの使用は、ルシフェラーゼインジケータータンパク質生成物の最適に高レベルの発現を確実にすることができる。インジケーターファージが由来する本来の野生型バクテリオファージに由来する、それに対して特異的であるまたはそこで活性がある後期ウイルスプロモーターの使用は、インジケータータンパク質生成物の最適な発現をさらに確実にすることができる。例えば、ＭＲＳＡに特異的なインジケーターファージは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓファージＩＳＰ由来のコンセンサス後期遺伝子プロモーターを含むことができる。標準細菌（非ウイルス／非バクテリオファージ）プロモーターの使用は、このようなプロモーターがバクテリオファージ感染中にダウンレギュレートされることが多いため（バクテリオファージが、ファージタンパク質産生のために細菌の資源を優先するために）、一部の場合では、発現にとって有害であり得る。よって、いくつかの実施形態において、ファージ構造的構成要素のサブユニットの数に発現を限定しないゲノムにおける配置を使用して、ファージは、好ましくは、可溶性（遊離）インジケーター部分をコードし、高レベルで発現するように操作される。

本開示の組成物は、１種または複数の野生型または遺伝子改変された感染性因子（例えば、バクテリオファージ）および１種または複数のインジケーター遺伝子を含むことができる。いくつかの実施形態において、組成物は、同じまたは異なるインジケータータンパク質をコードおよび発現し得る異なるインジケーターファージのカクテルを含むことができる。いくつかの実施形態において、インジケーターバクテリオファージのカクテルは、少なくとも２種の異なる型の組換えバクテリオファージを含む。

治療上有効なバクテリオファージ
本明細書においてより詳細に記載されている通り、本開示の組成物、方法およびシステムは、バイオフィルム関連の感染症の診断および処置における使用のための感染性因子を含むことができる。ある特定の実施形態において、本開示は、治療上有効なバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、治療上有効なバクテリオファージは、野生型バクテリオファージである。他の実施形態において、治療上有効なバクテリオファージは、組換えバクテリオファージであり、バクテリオファージゲノムは、酵素をコードする遺伝子を含む遺伝的構築物を含むように遺伝子改変されている。

ある特定の実施形態において、遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。例えば、ある特定の実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製中の酵素の発現は、遊離酵素の産生をもたらす。いくつかの例では、遺伝的構築物は、外因性プロモーターをさらに含むことができる。ある特定の実施形態において、遺伝的構築物は、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入され得る。後期遺伝子は、構造タンパク質をコードするため、一般に、他のファージ遺伝子よりも高いレベルで発現される。後期遺伝子領域は、クラスＩＩＩ遺伝子領域であり得、主要カプシドタンパク質の遺伝子を含むことができる。

改変されたファージのいくつかの実施形態において、追加の外因性後期プロモーター（クラスＩＩＩプロモーター、例えば、ファージＫまたはＴ７またはＴ４に由来）は、ファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質の遺伝子を転写する、同じ天然ファージ（例えば、それぞれファージＫまたはＴ７またはＴ４）のＲＮＡポリメラーゼに対して高い親和性を有する。これらのタンパク質は、各ファージ粒子が数ダースまたは数百コピーのこれらの分子を含むため、ファージによって作製される最も豊富なタンパク質である。ウイルス後期プロモーターの使用は、酵素の最適に高レベルの発現を確実にすることができる。治療用ファージが由来する本来の野生型ファージに由来する、それに対して特異的であるまたはそこで活性がある後期ウイルスプロモーター（例えば、ファージＫまたはＴ４またはＴ７に基づくシステムによるファージＫまたはＴ４またはＴ７後期プロモーター）の使用は、酵素の最適な発現をさらに確実にすることができる。標準細菌（非ウイルス／非ファージ）プロモーターの使用は、このようなプロモーターがファージ感染中にダウンレギュレートされることが多いため（ファージが、ファージタンパク質生成物のために細菌の資源を優先するために）、一部の場合では、発現にとって有害であり得る。よって、いくつかの実施形態において、ファージは、好ましくは、酵素をコードし、高レベルで発現するように操作される。

バイオフィルムは、細菌が不活性な（例えば、植え込み式医療用デバイス）または生きている表面に接着することを可能にする、細胞外マトリックスに囲まれた細菌細胞の凝集体である。その上、バイオフィルムは、対象における感染の機会を増大させ、抗生物質および食細胞の両方に対して抵抗性であることが示された。バクテリオファージは、細胞外マトリックスを崩壊させることができる酵素を産生することが公知であり、よって、バイオフィルム内の細菌を標的とすることができる。

バクテリオファージは、バイオフィルムマトリックスを崩壊させることができる酵素を天然に産生することが公知である。いくつかの例では、バクテリオファージゲノムは、細胞壁に浸透することが意図される可溶性酵素をコードする遺伝子を含有する。このような酵素は、細菌の細胞壁を加水分解することができ、よって、ファージが細胞から脱出することを可能にする。バイオフィルムを囲む細胞外マトリックスの組成は、細菌細胞壁の組成と同様であり、よって、バクテリオファージ酵素の発現を増大させることは、バイオフィルム関連の感染症の処置にとって有利であり得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、産生される酵素（例えば、溶解素およびエンドリシン）のレベルを増大させるように、または異なる酵素の産生を可能にするように改変される。その上、いくつかのバクテリオファージ（例えば、Ｔ４）は、細菌細胞壁浸透をさらに助ける、バクテリオファージ尾部に存在する追加の酵素を有する。しかし、天然の感染プロセスにおいて、このような酵素は、感染サイクルにおいて尾部が再構成されるまで遮蔽されている。

いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、目的の微生物に特異的な酵素の産生を可能にするように改変される。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、病原性増強因子を含むように遺伝子操作される。いくつかの実施形態において、酵素をコードする遺伝子は、バクテリオファージゲノムに挿入される。細菌細胞の感染後に、酵素をコードする挿入された遺伝子は、高レベルで産生され、溶解された細菌細胞からバイオフィルムの細胞外マトリックス中に放出される。ある特定の実施形態において、酵素は、グリコシダーゼ、アミダーゼまたはエンドペプチダーゼである。グリコシダーゼ、アミダーゼおよびエンドペプチダーゼは、細胞の溶解または細胞壁を通したＤＮＡの注入のためにファージによって産生される主な酵素である。例えば、いくつかの実施形態において、治療用組換えバクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染に特異的であり得る。Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｍｃｏｍｉｔａｎｓによって産生され、β－１，６－Ｎ－アセチル－Ｄ－グルコサミンを加水分解するグリコシドヒドロラーゼ酵素であるディスパーシン（dispersin）Ｂ（ＤｓｐＢ）を含有するＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的ファージを使用して、バイオフィルム関連のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ感染症を処置することができる。

他の実施形態において、バクテリオファージは、天然に存在する酵素の産生を増強するように改変される。例えば、そのような酵素は、組換えによりファージゲノムに挿入され得、ビリオン表面に、または感染細菌からバイオフィルムへと拡散し得る可溶性タンパク質として、融合タンパク質を創出する。これは、相同組換えクローニング、ＣＲＩＳＰＲに基づくクローニングにより、または一般に当技術分野で公知の他の任意の方法によって行うことができる。

バイオフィルム関連の感染症の診断および処置のためにバクテリオファージを使用する方法
本明細書に注記されている通り、ある特定の実施形態において、本発明は、微生物を検出するために感染性粒子を使用する方法を含むことができる。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。

いくつかの実施形態において、診断用組換えバクテリオファージは、バイオフィルム関連の感染症において存在する細菌株（単数または複数）を決定することができる。バイオフィルムに存在する細菌株（単数または複数）の検出は、感染症の適切な処置の決定にとって重要である。

一実施形態において、本発明は、インプラントを有する対象におけるバイオフィルム関連の感染症の診断および処置のための方法であって、（ｉ）インプラントを有する対象から採取された生体サンプルを提供する工程；（ｉｉ）（ａ）生体サンプルの少なくとも１つのアリコートを、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むある量のレポーターカクテル組成物と接触させる工程；（ｂ）組換えバクテリオファージの複製後に生成されたシグナルを検出する工程であって、シグナルの検出が、目的の微生物がサンプル中に存在することを示す、工程を含む、少なくとも１種の目的の微生物の存在を検出することにより、対象をバイオフィルム関連の感染症と診断する工程；ならびに（ｉｉｉ）（ａ）工程（ｉｉ）の診断に基づき治療カクテル組成物を選択する工程；少なくとも１種のバクテリオファージを含む治療有効量の治療カクテル組成物を投与する工程であって、バクテリオファージが、検出された目的の微生物に特異的である、工程；および（ｃ）少なくとも１種の追加の治療剤を必要に応じて投与する工程を含む、バイオフィルム関連の感染症と診断された対象を処置する工程を含む、方法を含むことができる。

ある特定の実施形態において、対象をバイオフィルム関連の感染症と診断する工程は、少なくとも１種の目的の微生物を検出する工程を含む。ある実施形態において、サンプルにおける少なくとも１種の目的の微生物を検出するための方法は、サンプルを、目的の細菌に感染するバクテリオファージと共にインキュベートする工程であって、目的の細菌の感染後のバクテリオファージ複製中のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケータータンパク質生成物の産生をもたらすように、バクテリオファージが、遺伝的構築物を含み、遺伝的構築物が、インジケーター遺伝子を含む、工程；およびインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、インジケータータンパク質生成物の陽性検出が、目的の微生物がサンプル中に存在することを示す、工程を含む。ある特定の実施形態において、遺伝的構築物は、追加の外因性プロモーターをさらに含む。

いくつかの実施形態において、アッセイは、異なるサンプル型またはサイズおよびアッセイフォーマットに対応するように改変され得る一般概念を利用するように行うことができる。本発明の組換えバクテリオファージ（すなわち、インジケーターバクテリオファージ）を用いる実施形態は、サンプル型、サンプルサイズおよびアッセイフォーマットに応じて、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、１５．０、１５．５、１６．０、１６．５、１７．０、１７．５、１８．０、１８．５、１９．０、１９．５、２０．０、２１．０、２１．５、２２．０、２２．５、２３．０、２３．５、２４．０、２４．５、２５．０、２５．５または２６．０時間に満たない総アッセイ時間で特異的細菌株の迅速な検出を可能にすることができる。例えば、要求される時間の量は、バクテリオファージの株およびアッセイにおいて検出されるべき細菌の株、検査されるべきサンプルの型およびサイズ、標的の生存性に要求される条件、物理的／化学的環境の複雑さ、ならびに「内在性」非標的細菌夾雑物の濃度に応じて、若干短いことも、または長いこともある。例えば、グラム陰性株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ）の存在に関する検出は、抗生物質抵抗性に関する検出なしでは０．５、１．０、１．５、２．０、２．５もしくは３．０時間に満たない総アッセイ時間で、または抗生物質抵抗性に関する検出ありでは１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０もしくは４．５時間に満たない総アッセイ時間で完了することができる。グラム陽性株の存在に関する検出は、抗生物質抵抗性の検出なしでは１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０もしくは４．５時間に、または抗生物質抵抗性の検出ありでは２．０、３．０、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０もしくは６．５時間に満たない総アッセイ時間で完了することができる。

バクテリオファージ（例えば、ファージＫ、ＩＳＰ、ＭＰ１１５）は、ファージの複製中に可溶性ルシフェラーゼを発現するように操作され得る。ルシフェラーゼの発現は、ウイルスカプシドプロモーター（例えば、バクテリオファージＰｅｃｅｎｔｕｍｖｉｒｕｓまたはＴ４後期プロモーター）によって駆動されて、高度な発現を生じる。ストックファージは、ルシフェラーゼを含まないように調製されるため、アッセイにおいて検出されるルシフェラーゼは、細菌細胞の感染中の子孫ファージの複製に由来する筈である。よって、一般に、子孫ファージから親ファージを分離する必要はない。

いくつかの実施形態において、サンプルにおける細菌の富化は、検査に先立ち必要とされない。いくつかの実施形態において、サンプルは、成長を促す条件におけるインキュベーションによって、検査に先立ち富化され得る。そのような実施形態において、富化期間は、サンプル型およびサイズに応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間またはそれよりも長いことがある。

いくつかの実施形態において、インジケーターバクテリオファージは、検出可能なインジケータータンパク質生成物を含み、単一の病原性細胞（例えば、細菌）の感染は、インジケータータンパク質生成物により生成される増幅されたシグナルによって検出され得る。よって、方法は、ファージ複製中に産生されたインジケータータンパク質生成物を検出する工程を含むことができ、インジケーターの検出は、目的の細菌がサンプル中に存在することを示す。

ある実施形態において、本発明は、サンプルにおける目的の細菌を検出するための方法であって、サンプルを、目的の細菌に感染する組換えバクテリオファージと共にインキュベートする工程であって、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製中のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケータータンパク質生成物の産生をもたらすように、組換えバクテリオファージが、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、工程；およびインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、インジケータータンパク質生成物の陽性検出が、目的の細菌がサンプル中に存在することを示す、工程を含む、方法を含むことができる。いくつかの実施形態において、検出されるインジケータータンパク質生成物の量は、サンプル中に存在する目的の細菌の量に対応する。いくつかの実施形態において、特定の目的の細菌の陽性検出は、対象をバイオフィルム関連の感染症と診断するのに使用される。

本明細書においてより詳細に記載されている通り、本開示の組成物、方法およびシステムは、サンプル中に存在する細菌を感染させるために、ある範囲の濃度の親インジケーターバクテリオファージを利用することができる。いくつかの実施形態において、インジケーターバクテリオファージは、１０個の細胞等、サンプル中にごく少数で存在する標的細菌を迅速に見出し、結合し、感染させるのに十分な濃度でサンプルに添加される。いくつかの実施形態において、ファージ濃度は、１時間未満で標的細菌を見出し、結合し、感染させるのに十分であり得る。他の実施形態において、これらの事象は、サンプルへのインジケーターファージの添加後２時間未満または３時間未満または４時間未満で起こり得る。例えば、ある特定の実施形態において、インキュベートする工程のためのバクテリオファージ濃度は、１×１０^５ＰＦＵ／ｍＬを超える、１×１０^６ＰＦＵ／ｍＬを超えるまたは１×１０^７ＰＦＵ／ｍＬを超えるまたは１×１０^８ＰＦＵ／ｍＬを超える。

ある特定の実施形態において、組換えストックファージ組成物は、ファージストックの産生後に生成され得るいかなる残留インジケータータンパク質も含まないように精製され得る。よって、ある特定の実施形態において、組換えバクテリオファージは、サンプルとのインキュベーションに先立ちショ糖勾配または塩化セシウム等密度密度勾配遠心分離を使用して精製され得る。感染性因子がバクテリオファージである場合、この精製は、ＤＮＡを有しないバクテリオファージ（すなわち、空のファージまたは「ゴースト」）を除去するという付加利益を有することができる。

本発明の方法のいくつかの実施形態において、上記微生物はサンプルからの上記微生物のいかなる単離または精製もなしに、検出され得る。例えば、ある種の実施形態において、１または数個の目的の微生物を含むサンプルは、アッセイ容器（例えば、スピンカラム、マイクロタイターウェル、またはフィルター）に直接適用され得、上記アッセイはそのアッセイ容器の中で行われる。このようなアッセイの種々の実施形態は、本明細書に開示される。

いくつかの実施形態において、生体サンプルの少なくとも１つのアリコートは、ある量のインジケーターバクテリオファージカクテル組成物と接触される。ある特定の例では、インジケーターカクテル組成物は、特定の目的の細菌に特異的な少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含む。他の実施形態において、インジケーターカクテル組成物は、特定の目的の細菌に特異的な、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９または少なくとも１０種の型の組換えバクテリオファージを含む。ある特定の実施形態において、対象をバイオフィルム関連の感染症と診断する工程は、生体サンプルの複数のアリコートを、複数のインジケーターカクテル組成物と接触させる工程をさらに含む。いくつかの例では、各インジケーターカクテル組成物は、異なる目的の微生物に特異的である。例えば、第１のアリコートは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓに特異的な組換えバクテリオファージカクテル組成物と接触され得、第２のアリコートは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに特異的な組換えバクテリオファージカクテル組成物と接触され得、第３のアリコートは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓに特異的な組換えバクテリオファージカクテル組成物と接触され得、第４のアリコートは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｖｉｒｉｄａｎｓに特異的な組換えバクテリオファージカクテル組成物と接触され得、第５のアリコートは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉに特異的な組換えバクテリオファージカクテル組成物と接触され得、第６のアリコートは、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅに特異的な組換えバクテリオファージカクテル組成物と接触され得、第７のアリコートは、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓに特異的な組換えバクテリオファージカクテル組成物と接触され得、第８のアリコートは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに特異的な組換えバクテリオファージカクテル組成物と接触され得る。いくつかの実施形態において、生体サンプルの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個のアリコートは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５種の異なるレポーターカクテル組成物と接触される。

検査サンプルのアリコートが、マルチウェルプレートのウェルへと直接的に分配され得、インジケーターファージが添加され得、感染に十分な期間の後に、溶解緩衝液が、インジケーター部分に対する基質（例えば、ルシフェラーゼインジケーターに対するルシフェラーゼ基質）と共に添加され、インジケーターシグナルの検出についてアッセイされ得る。方法のいくつかの実施形態は、フィルタープレートまたは９６ウェルプレートにおいて行われ得る。方法のいくつかの実施形態は、インジケーターファージによる感染前のサンプルの濃縮ありまたはなしで行われ得る。

例えば、多くの実施形態において、マルチウェルプレートは、上記アッセイを行うために使用される。プレート（もしくは検出する工程が行われ得る任意の他の容器）の選択は、上記検出する工程に影響を及ぼし得る。例えば、いくつかのプレートは、光の放射の検出に影響を及ぼし得る、着色したもしくは白色のバックグラウンドを含み得る。概して、白色のプレートは、より高い感度を有するが、より高いバックグラウンドシグナルをも生じる。プレートの他の色は、より低いバックグラウンドシグナルを生成し得るが、わずかにより低い感度を有し得る。さらに、バックグラウンドシグナルに関する１つの理由は、１つのウェルから別の隣接するウェルへの光の漏れである。白色のウェルを有するいくつかのプレートがあるが、上記プレートの残りは黒色である。これは、上記ウェルの内部での高いシグナルを可能にするが、ウェルからウェルへの光の漏れを防止し、従って、バックグラウンドを低減し得る。従って、プレートもしくは他のアッセイ容器の選択は、上記アッセイのための感度およびバックグラウンドシグナルに影響を与え得る。

本開示の方法は、感度を増大させるための様々な他の工程を含むことができる。例えば、本明細書でより詳細に記述される通り、方法は、バクテリオファージを添加した後に、ただし、インキュベートする前に、捕捉および感染された細菌を洗浄して、バクテリオファージ調製物に混入する過剰なバクテリオファージおよび／またはルシフェラーゼもしくは他のレポータータンパク質を除去するための工程を含むことができる。

いくつかの実施形態において、目的の微生物の検出は、微生物の集団を増大させる仕方としてサンプルを培養する必要なく、完了され得る。例えば、ある特定の実施形態において、検出に要求される総時間は、２８．０時間、２７．０時間、２６．０時間、２５．０時間、２４．０時間、２３．０時間、２２．０時間、２１．０時間、２０．０時間、１９．０時間、１８．０時間、１７．０時間、１６．０時間、１５．０時間、１４．０時間、１３．０時間、１２．０時間、１１．０時間、１０．０時間、９．０時間、８．０時間、７．０時間、６．０時間、５．０時間、４．０時間、３．０時間、２．５時間、２．０時間、１．５時間未満または１．０時間未満である。結果までの時間の最小化は、診断検査において重大な意味を持つ。

当技術分野で公知のアッセイとは対照的に、本開示の方法は、個々の微生物を検出することができる。よって、ある特定の実施形態において、方法は、サンプル中に存在する微生物の１０個程度の細胞を検出することができる。例えば、ある特定の実施形態において、組換えインジケーターバクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．、Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｓｐｐ．またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｐ．に高度に特異的である。ある実施形態において、組換えインジケーターバクテリオファージは、他の型の細菌の存在下で、目的の細菌を区別することができる。ある特定の実施形態において、組換えバクテリオファージを使用して、サンプルにおける特異的な型の単一の細菌を検出することができる。ある特定の実施形態において、組換えインジケーターバクテリオファージは、サンプルにおける２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個程度の特異的細菌を検出する。

よって、本開示の局面は、インジケータータンパク質生成物による検査サンプルにおける微生物の検出のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、目的の微生物が細菌である場合、インジケータータンパク質生成物は、インジケーターバクテリオファージ等の感染性因子に関連し得る。インジケータータンパク質生成物は、基質と反応して検出可能なシグナルを放射することができる、または内因性シグナル（例えば、生物発光タンパク質）を放射することができる。いくつかの実施形態において、検出感度は、検査サンプルにおける目的の微生物の５０、２０、１０、９、８、７、６、５、４、３または２個程度の細胞の存在を明らかにすることができる。いくつかの実施形態において、目的の微生物の単一細胞であっても、検出可能なシグナルを生じることができる。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、ファージＫ、ＩＳＰまたはＭＰ１１５である。ある特定の実施形態において、組換えＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．特異的バクテリオファージは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．に高度に特異的である。

いくつかの実施形態において、組換えインジケーターバクテリオファージによってコードされるインジケータータンパク質生成物は、バクテリオファージの複製中または複製後に検出可能であり得る。インジケーター部分としての使用に適した多くの異なる型の検出可能な生体分子は、当技術分野で公知であり、多くが市販されている。いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、インジケーター部分として機能する酵素を含む。いくつかの実施形態において、インジケーターファージのゲノムは、可溶性タンパク質をコードするように改変される。いくつかの実施形態において、インジケーターファージは、検出可能な酵素をコードする。インジケーターは、光を放射することができる、および／または添加された基質の色の変化によって検出可能であり得る。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）等、様々な適切な酵素が市販されている。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、インジケーター部分として機能することができる。いくつかの実施形態において、ホタルルシフェラーゼが、インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼが、インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）が、インジケーター部分である。他の操作されたルシフェラーゼまたは検出可能なシグナルを生成する他の酵素も、適切なインジケーター部分であり得る。

よって、いくつかの実施形態において、組成物、方法またはシステムの組換えインジケーターバクテリオファージは、野生型バクテリオファージから調製される。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質またはその他）等の内因性シグナルを放射するタンパク質をコードする。インジケーターは、光を放射することができる、および／または色の変化によって検出可能であり得る。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、基質と相互作用して、シグナルを生成する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、ウミシイタケルシフェラーゼ、Ｅｘｔｅｒｎａｌ Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、ルチア（Lucia）ルシフェラーゼ、またはＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）、Ｒｌｕｃ８．６－５３５もしくはＯｒａｎｇｅ Ｎａｎｏ－ｌａｎｔｅｒｎ等の操作されたルシフェラーゼのうち１種である。

インジケーターの検出は、光の放射の検出を含むことができる。いくつかの実施形態において、インジケータータンパク質生成物（例えば、ルシフェラーゼ）を、基質と反応させて、検出可能なシグナルを生成する。シグナルの検出は、一般に当技術分野で公知の任意の機械またはデバイスにより達成され得る。いくつかの実施形態において、シグナルは、Ｉｎ Ｖｉｖｏイメージングシステム（ＩＶＩＳ）を使用して検出され得る。ＩＶＩＳは、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳセンサーを使用して、全フラックスにより光放射を測定する。全フラックス＝ラジアンス（光子／秒）。平均ラジアンスは、光子／秒／ｃｍ^２／ステラジアンとして測定される。他の実施形態において、シグナルの検出は、色の変化および他の光放射を検出することができるルミノメーター、分光光度計、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラにより達成され得る。いくつかの実施形態において、シグナルは、絶対的ＲＬＵとして測定される。さらなる実施形態において、単一細胞または少数の細胞が、信頼できるように検出されるためには、シグナル対バックグラウンド比が高い（例えば、＞２．０、＞２．５または＞３．０）必要がある。

いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、上記ファージが特異的に認識しかつ感染する細菌の感染の際にのみ生成される酵素（例えば、ルシフェラーゼ）の遺伝子を含むように遺伝子操作される。いくつかの実施形態において、上記インジケーター部分は、ウイルス生活環において後期に発現される。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される場合、上記インジケーターは、可溶性タンパク質（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）であり、そのコピー数を制限するファージ構造タンパク質と融合されない。

従って、インジケーターファージを利用するいくつかの実施形態において、本発明は、目的の微生物を検出するための方法を包含し、上記方法は、少なくとも１個のサンプル細菌を捕捉する工程；該少なくとも１個の細菌を、複数のインジケーターファージとともにインキュベートする工程；子孫ファージを生成し、可溶性インジケーター部分を発現するための、感染および複製の時間を与える工程；ならびに上記子孫ファージ、好ましくは上記インジケーターを検出する工程であって、ここで上記インジケーターの検出は、上記細菌が上記サンプルに存在することを示す工程を包含する。

例えば、いくつかの実施形態において、検査サンプル細菌は、プレートの表面に結合させることにより、または細菌学的フィルター（例えば、０．４５μｍポアサイズスピンフィルターまたはプレートフィルター）を通してサンプルを濾過することにより捕捉され得る。ある実施形態において、感染性因子（例えば、インジケーターファージ）は、フィルターにおいて直接的に捕捉されたサンプルに最小体積で添加される。ある実施形態において、フィルターまたはプレート表面において捕捉された微生物をその後、１または複数回洗浄して、過剰な結合していない感染性因子を除去する。ある実施形態において、培地（例えば、ルリア・ベルターニ（Luria-Bertani）（ＬＢ）ブロス、緩衝ペプトン水（ＢＰＷ）またはトリプシンダイズブロスまたはトリプトンダイズブロス（ＴＳＢ）、ブレインハートインフュージョン（BrainHeart Infusion）（ＢＨＩ））を、さらなるインキュベーション時間にわたり添加して、細菌細胞およびファージの複製ならびにインジケーター部分をコードする遺伝子の高レベル発現を可能にし得る。しかし、検査アッセイのいくつかの実施形態の驚くべき局面は、インジケーターファージとのインキュベーション工程が、単一のファージ生活環に十分な長さであることのみを必要とすることである。インジケーターファージの単回の複製サイクルは、本発明のいくつかの実施形態に従った高感度かつ迅速な検出を容易にするのに十分であり得る。

いくつかの実施形態において、細菌を含む試験サンプルのアリコートをスピンカラムに適用し得、組換えバクテリオファージでの感染および任意の過剰なバクテリオファージを除去するための任意選択の洗浄後に、検出される可溶性インジケーターの量は、感染した細菌によって生成されるバクテリオファージの量に比例する。

上記細菌の溶解の際に周囲の液体へと放出された可溶性インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）は、次いで、測定および定量され得る。一実施形態において、上記溶液は、フィルターを通して遠心され、その濾液はアッセイ（例えば、ルミノメーターでの）のために新しい容器に収集され、その後、上記インジケーター酵素のための基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）が添加される。あるいは、インジケーターシグナルは、フィルター上で直接測定され得る。

様々な実施形態において、親ファージは、検査サンプルとのインキュベーションに使用される前に精製され得るため、精製された親インジケーターファージは、検出可能なインジケーターそれ自体を含まない。後期（クラスＩＩＩ）遺伝子の発現は、ウイルス生活環における後期に起こる。本発明のいくつかの実施形態において、親ファージを精製して、いかなる現存するインジケータータンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）も排除することができる。いくつかの実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製中のインジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物をもたらす。よって、多くの実施形態において、検出工程に先立ち子孫ファージから親を分離する必要はない。ある実施形態において、微生物は細菌であり、インジケーターファージはバクテリオファージである。ある実施形態において、インジケータータンパク質生成物は、宿主微生物の溶解の際に放出される、遊離した可溶性ルシフェラーゼである。

アッセイは、種々の方法で行われ得る。一実施形態において、サンプルは、９６ウェルプレートにおける少なくとも１個のウェルに添加され、ファージと共にインキュベートされ、溶解され、基質と共にインキュベートされ、次いで読み取られる。他の実施形態において、サンプルは、ファージと共にインキュベートされる前に、９６ウェルフィルタープレートに添加され、プレートは、遠心分離され、培地は、フィルター上に収集された細菌に添加される。さらに他の実施形態において、サンプルを、ファージと共にインキュベートする前に、抗体を使用して、９６ウェルプレートの少なくとも１個のウェルに捕捉し、培地で洗浄して、過剰な細胞を除去する。

いくつかの実施形態において、細菌の溶解は、検出工程前または検出工程中に起こり得る。実験は、いくつかの実施形態において、感染した溶解されていない細胞が、ルシフェラーゼ基質の添加後に検出可能であり得ることを示唆する。おそらく、完全な細胞溶解なしで、ルシフェラーゼは、細胞を出ることができる、および／またはルシフェラーゼ基質は、細胞に入ることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼの基質は、細胞透過性である（例えば、フリマジン）。よって、溶解物へと放出されたルシフェラーゼのみが（インタクトな細菌の内側に依然としてあるルシフェラーゼではない）ルミノメーターにおいて解析される、スピンフィルターシステムを利用する実施形態に関して、溶解が検出に要求される。しかし、インタクトな細胞および溶解された細胞に満ちた本来のプレートがルミノメーターにおいて直接的にアッセイされる、溶液または懸濁物中のサンプルを含むフィルタープレートまたは９６ウェルプレートを利用する実施形態に関して、溶解は検出に必要ない。

いくつかの実施形態において、基質とインジケーター部分（例えば、ルシフェラーゼ）の反応は、６０分間またはそれよりも長く続くことができ、様々な時点における検出が、感度を最適化するために望ましいことがある。例えば、９６ウェルフィルタープレートを固体支持体として、ルシフェラーゼをインジケーターとして使用した実施形態において、ルミノメーター読み取り値は、最初に、および反応が完了するまで１０または１５分間間隔で得ることができる。

驚くべきことに、検査サンプルの感染に利用される高濃度のファージは、非常に短い時間枠におけるごく少数の標的微生物の検出の達成に成功した。検査サンプルとファージのインキュベーションは、いくつかの実施形態において、単一のファージ生活環に十分な長さであることのみを必要とする。いくつかの実施形態において、このインキュベート工程のためのバクテリオファージ濃度は、１．０×１０^６、２．０×１０^６、３．０×１０^６、５．０×１０^６、６．０×１０^６、７．０×１０^６、８．０×１０^６、９．０×１０^６、１．０×１０^７、１．１×１０^７、１．２×１０^７、１．３×１０^７、１．４×１０^７、１．５×１０^７、１．６×１０^７、１．７×１０^７、１．８×１０^７、１．９×１０^７、２．０×１０^７、３．０×１０^７、４．０×１０^７、５．０×１０^７、６．０×１０^７、７．０×１０^７、８．０×１０^７、９．０×１０^７または１．０×１０^８ＰＦＵ／ｍＬを超える。

多数のファージは以前に、標的細胞を死滅させ、これにより、初期ファージアッセイからの有用なシグナルの生成を防止した「非感染溶菌（lysis from without）」に関連付けられたため、そのように高濃度のファージでの成功は驚くべきことである。ファージに関連するあらゆる混入するルシフェラーゼの除去に加えて、この浄化（clean-up）は、ゴースト粒子（ＤＮＡを失った粒子）を除去することもできるため、本明細書に記載されている調製されたファージストックの浄化（例えば、ショ糖勾配または塩化セシウム等密度密度勾配超遠心分離による浄化）が、この問題の軽減に役立つことが可能である。ゴースト粒子は、「非感染溶菌」により細菌細胞を溶解し、細胞を早まって死滅させ、これにより、インジケーターシグナルの生成を防止し得る。電子顕微鏡は、粗ファージ溶解物（すなわち、塩化セシウム浄化前の）が、５０％を超えるゴーストを有し得ることを実証する。このようなゴースト粒子は、細胞膜を穿刺する多くのファージ粒子の作用を介した微生物の早期の死滅に寄与し得る。よって、ゴースト粒子は、高ＰＦＵ濃度が有害であると報告された以前の問題に寄与した可能性がある。さらに、非常にクリーンなファージプレップは、アッセイが、洗浄工程なしで行われることを可能にし、これにより、アッセイを初期濃縮工程なしで行うことが可能になる。いくつかの実施形態は、初期濃縮工程を含み、いくつかの実施形態において、この濃縮工程は、より短い富化インキュベーション時間を可能にする。

検査方法のいくつかの実施形態は、確認アッセイをさらに含むことができる。通常、より後期の時点で、初期結果を確認するための種々のアッセイが当技術分野で公知である。例えば、サンプルを培養することができ（例えば、選択的発色プレーティング）、ＰＣＲを利用して、微生物ＤＮＡの存在を確認することができる、または他の確認アッセイを使用して、初期結果を確認することができる。

ある特定の実施形態において、本開示の方法は、感染性因子を用いた検出に加えて、結合剤（例えば、抗体）の使用を組み合わせて、サンプルからＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．等の目的の微生物を精製および／または濃縮する。例えば、ある特定の実施形態において、本発明は、サンプルにおける目的の微生物を検出するための方法であって、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．等の目的の微生物に特異的な捕捉抗体を使用して、以前の（prior）支持体におけるサンプルから微生物を捕捉する工程；サンプルを、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．に感染する組換えバクテリオファージと共にインキュベートする工程であって、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製中のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケータータンパク質生成物をもたらすように、組換えバクテリオファージが、バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む、工程；およびインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、インジケータータンパク質生成物の陽性検出が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．がサンプル中に存在することを示す、工程を含む、方法を含む。

いくつかの実施形態において、合成ファージは、病原体検出アッセイにおける使用のために望ましい形質を最適化するように設計される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変のバイオインフォマティクスおよび以前の解析は、望ましい形質を最適化するように用いられる。例えば、いくつかの実施形態において、ファージ尾部タンパク質をコードする遺伝子は、細菌の特定の種を認識しこれに結合するように最適化され得る。他の実施形態において、ファージ尾部タンパク質をコードする遺伝子は、細菌の属全体または属内の種の特定の群を認識しこれに結合するように最適化され得る。このようにして、ファージは、病原体のより広いまたはより狭い群を検出するように最適化され得る。いくつかの実施形態において、合成ファージは、インジケーター遺伝子の発現を改善するように設計され得る。その上および／またはその代わりに、いくつかの例では、合成ファージは、ファージのバーストサイズを増大させて、検出を改善するように設計され得る。

いくつかの実施形態において、ファージの安定性は、貯蔵寿命を改善するために最適化され得る。例えば、その後のファージ安定性を高めるために、エンザイバイオティック（ｅｎｚｙｂｉｏｔｉｃ）溶解度を高めてもよい。加えて、および／または代替的に、ファージの熱安定性を最適化してもよい。熱安定性ファージは、貯蔵の間の機能活性をより良好に保存し、それによって貯蔵寿命を向上させる。したがって、いくつかの実施形態において、熱安定性および／またはｐＨ耐性が最適化され得る。

いくつかの実施形態において、遺伝子改変されたファージまたは合成により派生されたファージは、検出可能なインジケーターを含む。いくつかの実施形態において、インジケーターは、ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ファージゲノムは、インジケーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ遺伝子または検出可能なインジケーターをコードする別の遺伝子）を含む。

いくつかの実施形態において、組換えバクテリオファージの検出は、バイオフィルム関連の感染症の存在の診断、およびバイオフィルムの原因となる特異的な株の識別に使用される。次に、診断を使用して、適切な処置を選択することができる。

ある特定の実施形態において、治療カクテル組成物は、決定された診断に基づき（basedoff）選択される。例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．が、対象の診断において検出される場合、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．に特異的な組換えバクテリオファージを含む治療カクテル組成物は選択される。他の実施形態において、広域スペクトル治療カクテル組成物が、複数の潜在的感染症を処置するために選択される。

いくつかの実施形態において、治療カクテル組成物は、少なくとも１種の型のバクテリオファージを含む。他の実施形態において、治療カクテル組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０種の型のバクテリオファージを含む。これらのバクテリオファージは、細菌の同じ種または細菌の異なる種に特異的であり得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージは、野生型バクテリオファージである。他の実施形態において、バクテリオファージは、組換えバクテリオファージである。

バイオフィルム関連の感染症は、典型的な抗菌薬（例えば、抗生物質）がバイオフィルムを崩壊させることができないことが原因で、処置することが困難である。抗生物質処置の代替または補完として、細菌細胞を加水分解することができる酵素を発現するように遺伝子改変されたバクテリオファージを使用することができる。このようなファージは、バイオフィルムの細菌細胞に感染し、複製して子孫ファージを産生し、また、バイオフィルムを崩壊させることができる酵素を産生することができる。感染が進行するにつれて、子孫バクテリオファージは、他の細菌細胞に感染し続け、これは次いで、環境中に酵素を放出し、これにより、バイオフィルムを除去する。

いくつかの実施形態において、治療有効量の治療カクテル組成物は、バイオフィルム関連の感染症と診断された対象に投与される。いくつかの実施形態において、治療カクテル組成物は、静脈内に投与される（例えば、人工心臓弁感染症を処置するために）。他の実施形態において、治療カクテル組成物は、局所的に投与される（例えば、人工関節感染症を処置するために）。いくつかの実施形態において、治療カクテル組成物の反復した投薬量が投与される。投薬量の頻度が、感染症の重症度、特異的ファージ、および投与の経路に基づき変動し得る。例えば、治療カクテル組成物は、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間または４８時間毎に投与され得る。カクテル組成物の治療有効量はまた、いずれのファージが使用されたかに応じて変動する。いくつかの実施形態において、治療有効量の治療カクテル組成物は、１．０×１０^６、１．０×１０^７、１．０×１０^８、１．０×１０^９、１．０×１０^１０、１．０×１０^１１、１．０×１０^１２を超える濃度を有する少なくとも１種の治療用ファージを含む。

追加の実施形態において、少なくとも１種の追加の治療剤が投与される。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、抗生物質である。本発明において使用され得る抗生物質の非限定的な例は、アミノグリコシド、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ベータ－ラクタム抗生物質、キノロン、バシトラシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、ストレプトグラミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシンおよびリンコサミド、セファマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、オキサゾリジノンおよびグリコペプチド抗生物質を含む。

別の局面において、本開示は、対象における感染症を予防または阻害する方法であって、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物を、外科的インプラント、包帯剤または縫合糸に適用する工程を含む方法を含む。ある特定の例では、カクテル組成物は、治療用組換えバクテリオファージを含む。さらなる実施形態において、カクテル組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５種の型の組換えバクテリオファージを含む。カクテル組成物を構成する組換えバクテリオファージは、細菌の同じまたは異なる種に特異的であり得る。

さらに別の局面において、本開示は、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物でコーティングされた外科的インプラント、包帯剤または縫合糸を含む。ある特定の例では、カクテル組成物は、治療用組換えバクテリオファージを含む。さらなる実施形態において、カクテル組成物は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５種の型の組換えバクテリオファージを含む。カクテル組成物を構成する組換えバクテリオファージは、細菌の同じまたは異なる種に特異的であり得る。

抗生物質抵抗性の決定
いくつかの局面において、本発明は、微生物の抗生物質抵抗性を検出するための方法を含む。いくつかの実施形態において、本開示は、サンプルにおける抗生物質抵抗性微生物を検出するための方法であって、（ａ）サンプルを抗生物質と接触させる工程、（ｂ）サンプルを感染性因子と接触させる工程であって、感染性因子が、インジケーター遺伝子を含み、微生物に特異的であり、インジケーター遺伝子が、インジケータータンパク質生成物をコードする、工程、および（ｃ）インジケータータンパク質生成物によって生成されたシグナルを検出する工程であって、シグナルの検出が、抗生物質抵抗性の決定に使用される、工程を含む、方法を提供する。

方法は、目的の微生物の検出のために感染性因子を使用することができる。例えば、ある特定の実施形態において、目的の微生物は細菌であり、感染性因子はファージである。本出願において言及される抗生物質は、静菌的（微生物の成長を阻害することができる）または殺菌的（微生物を死滅させることができる）である任意の薬剤であり得る。よって、ある特定の実施形態において、方法は、サンプルを抗生物質と接触させ、抗生物質と接触させられたサンプルを、目的の微生物に感染する感染性因子と共にインキュベートすることにより、抗生物質に対するサンプルにおける目的の微生物の抵抗性の検出を含むことができる。これは、抗生物質抵抗性を付与し得る遺伝子（例えば、ＰＣＲ）またはタンパク質（例えば、抗体）の存在を検出するが、その機能性を検査しない、アッセイとは別個のものである。よって、本アッセイは、遺伝子型検出とは対照的に、表現型検出を可能にする。

ある特定の実施形態において、方法は、抗生物質に対する、サンプルにおける目的の微生物における機能的な抵抗性遺伝子の検出を含むことができる。ＰＣＲは、抗生物質抵抗性遺伝子の検出を可能にする；しかし、ＰＣＲは、機能的な抗生物質抵抗性遺伝子を有する細菌と、非機能的な抗生物質抵抗性遺伝子を有する細菌との間を区別することができず、よって、抗生物質抵抗性細菌の偽陽性検出をもたらす。本明細書において具現化された方法は、非機能的な抗生物質抵抗性遺伝子を有する細菌を陽性検出することなく、機能的な抗生物質抵抗性遺伝子を有する細菌を陽性検出することができる。本明細書に開示されている方法は、抵抗性の機構が、単一の遺伝子／タンパク質または変異ではない場合であったとしても、抗生物質に対する機能的な抵抗性の検出を可能にする。よって、方法は、抵抗性を媒介する遺伝子（ＰＣＲ）またはタンパク質（抗体）の知識に頼らない。

ある特定の実施形態において、感染性因子は、インジケータータンパク質生成物を発現することができるインジケーター遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、方法は、インジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、インジケータータンパク質生成物の陽性検出が、目的の微生物がサンプル中に存在することと、微生物が、抗生物質に対して抵抗性であることを示す、工程を含むことができる。いくつかの例では、目的の微生物は、抗生物質抵抗性についての検査に先立ち、サンプルから単離されない。ある特定の実施形態において、サンプルは、培養されていないまたは富化されていないサンプルである。一部の場合では、抗生物質抵抗性を検出する方法は、５時間以内に完了され得る。いくつかの実施形態において、方法は、インジケーター部分の検出に先立ち、感染性因子に感染した微生物を溶解するための溶解緩衝液による処置を含む。

本発明の別の局面において、本発明は、微生物の死滅における抗生物質の有効用量を決定する方法であって、（ａ）抗生物質溶液のうち１種または複数のそれぞれを別々に、微生物を含む１種または複数のサンプルと共にインキュベートする工程であって、抗生物質溶液のうち１種または複数の濃度が異なり、範囲を規定する、工程、（ｂ）サンプルのうち１種または複数における微生物を、インジケーター遺伝子を含む感染性因子と共にインキュベートする工程であって、感染性因子が、目的の微生物に特異的である、工程、および（ｃ）サンプルのうち１種または複数における感染性因子によって産生されたインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、複数のサンプルのうち１種または複数におけるインジケータータンパク質生成物の検出が、サンプルのうち１種または複数の処置に使用される抗生物質溶液の濃度が、有効ではないことを示し、インジケータータンパク質の検出の欠如が、抗生物質が有効であることを示し、これにより、抗生物質の有効用量を決定する、工程を含む、方法を含む。

本明細書に開示されている方法を使用して、目的の微生物が、抗生物質に対して感受性であるかまたは抵抗性であるかについて検出することができる。特定の抗生物質は、それが死滅させるまたは阻害する微生物の型に特異的であり得る；抗生物質は、抗生物質に対して感応性である微生物を死滅させまたはその成長を阻害し、抗生物質に対して抵抗性である微生物を死滅させることもその成長を阻害することもない。一部の場合では、以前に感応性であった微生物株が、抵抗性になる場合がある。抗生物質に対する微生物の抵抗性は、多数の異なる機構によって媒介され得る。例えば、いくつかの抗生物質は、微生物における細胞壁合成を妨害する；そのような抗生物質に対する抵抗性は、抗生物質の標的、すなわち、細胞壁タンパク質を変更することにより媒介され得る。一部の場合では、細菌は、細菌に達する前に抗生物質を不活性化することができる化合物を産生することにより、抗生物質に対する抵抗性を創出する。例えば、いくつかの細菌は、ペニシリンまたは／およびカルバペネムのベータ－ラクタムを切断し、よって、これらの抗生物質を不活性化することができるベータ－ラクタマーゼを産生する。一部の場合では、抗生物質は、特異的なポンプによって、標的に達する前に細胞から除去される。一例は、ＲＮＤトランスポーターである。一部の場合では、いくつかの抗生物質は、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）に結合することにより作用し、微生物におけるタンパク質生合成を阻害する。そのような抗生物質に対して抵抗性である微生物は、抗生物質への低減された結合能力を有するが、リボソーム内で本質的に正常な機能を有する、変異したｒＲＮＡを含むことができる。他の場合では、細菌は、抵抗性を付与することができる遺伝子を有する。例えば、いくつかのＭＲＳＡは、ｍｅｃＡ遺伝子を有する。ｍｅｃＡ遺伝子生成物は、細菌細胞壁形成に要求されるトランスペプチダーゼに典型的には結合するある特定の抗生物質の環状構造に対して低い親和性を有する、代替トランスペプチダーゼである。したがって、ベータ－ラクタムを含む抗生物質は、このような細菌における細胞壁合成を阻害することができない。いくつかの細菌は、おそらく遺伝子または調節の変異が原因で、非機能的な抗生物質抵抗性遺伝子を有し、これは、ＰＣＲ等の従来の核酸方法では抗生物質抵抗性として誤って検出され得るが、抗生物質を用いたプレーティングもしくは培養または本方法等の機能的な方法では検出されない。

本発明において使用され得る抗生物質の非限定的な例は、アミノグリコシド、カルバセフェム、カルバペネム、セファロスポリン、グリコペプチド、マクロライド、モノバクタム、ペニシリン、ベータ－ラクタム抗生物質、キノロン、バシトラシン、スルホンアミド、テトラサイクリン、ストレプトグラミン、クロラムフェニコール、クリンダマイシンおよびリンコサミド、セファマイシン、リンコマイシン、ダプトマイシン、オキサゾリジノンおよびグリコペプチド抗生物質を含む。

本明細書に注記されている通り、ある特定の実施形態において、本発明は、抗生物質に対する微生物の抵抗性を検出するために、または別の仕方で記すと、微生物に対する抗生物質の有効性を検出するために、感染性粒子を使用する方法を含むことができる。別の実施形態において、本発明は、感染症の処置のための抗生物質を選択するための方法を含む。その上、方法は、サンプルにおける抗生物質抵抗性細菌を検出するための方法を含むことができる。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。

方法は、上に記載されている通り、微生物を含むサンプルを、抗生物質および感染性因子と接触させる工程を含むことができる。いくつかの実施形態において、本開示は、微生物を死滅させるかまたはその成長を阻害することにおける抗生物質の有効用量を決定する方法であって、（ａ）抗生物質溶液のうち１種または複数のそれぞれを別々に、微生物を含む１種または複数のサンプルと共にインキュベートする工程であって、抗生物質溶液のうち１種または複数の濃度が異なり、範囲を規定する、工程、（ｂ）サンプルのうち１種または複数における微生物を、インジケーター遺伝子を含む感染性因子と共にインキュベートする工程であって、感染性因子が、目的の微生物に特異的である、工程、および（ｃ）サンプルのうち１種または複数における感染性因子によって産生されたインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、複数のサンプルのうち１種または複数におけるインジケータータンパク質生成物の検出が、サンプルのうち１種または複数の処置に使用される抗生物質溶液の濃度が、有効ではないことを示し、インジケータータンパク質の検出の欠如が、抗生物質が有効であることを示し、これにより、抗生物質の有効用量を決定する、工程を含む、方法を提供する。

他の実施形態において、抗生物質および感染性因子は、逐次に添加される、例えば、サンプルが感染性因子と接触される前に、サンプルは、抗生物質と接触される。ある特定の実施形態において、方法は、サンプルを感染性因子と接触させる工程の前の期間にわたり、サンプルを抗生物質と共にインキュベートする工程を含むことができる。インキュベーション時間は、抗生物質および微生物の性質に応じて、例えば、微生物の倍加時間に基づき変動し得る。いくつかの実施形態において、インキュベーション時間は、２４時間未満、１８時間未満、１２時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分間未満または３０分間未満である。感染性因子と微生物のインキュベーション時間はまた、特定の感染性因子の生活環に応じて変動し得、一部の場合では、インキュベーション時間は、４時間未満、３時間未満、２時間未満、１時間未満、４５分間未満、３０分間未満である。抗生物質に対して抵抗性である微生物は、生き延び、繁殖する可能性があり、微生物に特異的な感染性因子は、複製し、インジケータータンパク質生成物（例えば、ルシフェラーゼ）の産生をもたらす；逆に、抗生物質に対して感応性である微生物は、死滅させられ、よって、感染性因子は、複製しない。その上、静菌的抗生物質は、細菌を死滅させない；しかし、これは、細菌の成長および／または富化を停止させる。いくつかの例では、静菌的抗生物質は、細菌タンパク質合成に干渉し得、バクテリオファージが、インジケーター分子（例えば、ルシフェラーゼ）を産生することを防止することが予想される。本方法に係る感染性因子は、インジケーター部分を含み、その量は、抗生物質で処置されたサンプル中に存在する微生物の量に対応する。したがって、インジケーター部分の陽性検出は、微生物が、抗生物質に対して抵抗性であることを示す。

いくつかの実施形態において、方法を使用して、抗生物質抵抗性微生物が、臨床サンプル中に存在するか否か決定することができる。例えば、方法を使用して、患者が、特定の抗生物質に対して抵抗性または感受性であるＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓに感染しているか否か決定することができる。患者から得られた臨床サンプルは次に、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的な抗生物質と共にインキュベートされ得る。次に、サンプルは、ある期間にわたり、Ｓ．ａｕｒｅｕｓに特異的な組換えファージと共にインキュベートされ得る。抗生物質に対して抵抗性であるＳ．ａｕｒｅｕｓを有するサンプルにおいて、組換えファージによって産生されたインジケータータンパク質の検出は、陽性となる。抗生物質に対して感受性であるＳ．ａｕｒｅｕｓを有するサンプルにおいて、インジケータータンパク質の検出は、陰性となる。いくつかの実施形態において、抗生物質抵抗性の検出のための方法を使用して、病原性細菌が感受性である有効な治療薬を選択することができる。

ある特定の実施形態において、検出に要求される総時間は、６．０時間、５．０時間、４．０時間、３．０時間、２．５時間、２．０時間、１．５時間未満または１．０時間未満である。検出に要求される総時間は、目的の細菌、ファージの型、および検査されている抗生物質に応じる。

必要に応じて、方法は、インジケーター部分を検出する前に微生物を溶解する工程をさらに含む。ルシフェラーゼの活性に影響を与えない任意の溶液を使用して、細胞を溶解することができる。一部の場合では、溶解緩衝液は、非イオン性洗剤、キレート剤、酵素、または様々な塩および薬剤の所有権のある組合せを含有することができる。溶解緩衝液は、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｉｇｍａ－ＡｌｄｒｉｃｈまたはＴｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒから市販されてもいる。実験は、感染した溶解していない細胞が、いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ基質の添加後に検出可能であり得ることを示唆する。おそらく、完全な細胞溶解なしで、ルシフェラーゼは、細胞から出ることができる、および／またはルシフェラーゼ基質は、細胞に入ることができる。例えば、いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼの基質は、細胞透過性である（例えば、フリマジン）。よって、溶解物へと放出されたルシフェラーゼのみが（インタクトな細菌の内側に残るルシフェラーゼではない）ルミノメーターにおいて解析される、スピンフィルターシステムを利用する実施形態に関して、溶解が検出に要求される。しかし、インタクトな細胞および溶解された細胞がルミノメーターにおいて直接的にアッセイされ得る、後述する通り溶液または懸濁物中のファージ感染サンプルを用いたフィルタープレートまたは９６ウェルプレートを利用する実施形態に関して、溶解は、検出に必要ない場合がある。よって、いくつかの実施形態において、抗生物質抵抗性を検出する方法は、微生物を溶解する工程を伴わない。

アッセイの実施形態の驚くべき局面は、サンプルにおける微生物を感染性因子と共にインキュベートする工程が、感染性因子、例えば、ファージの単一の生活環に十分な長さであることのみを必要とすることである。ファージを使用する増幅力は、ファージが数回のサイクルにわたり複製するように、より多くの時間を要求すると以前に考えられていた。インジケーターファージの単回の複製は、本発明のいくつかの実施形態に係る高感度かつ迅速な検出を容易にするために十分であり得る。アッセイの実施形態の別の驚くべき局面は、検査サンプルの感染に利用される高濃度のファージ（すなわち、高ＭＯＩ）が、抗生物質で処置されたごく少数の抗生物質抵抗性標的微生物の検出の達成に成功したことである。ファージのバーストサイズを含む因子は、ファージ生活環の数、したがって、検出に必要とされる時間の量に影響を与えることができる。大きいバーストサイズ（およそ１００ＰＦＵ）を有するファージは、検出のために１サイクルのみを要求し得る一方で、より小さいバーストサイズ（例えば、１０ＰＦＵ）を有するファージは、検出のために複数のファージサイクルを要求し得る。いくつかの実施形態において、検査サンプルとファージのインキュベーションは、単一のファージ生活環に十分な長さであることのみを必要とする。他の実施形態において、検査サンプルとファージのインキュベーションは、単一の生活環を超える時間の量にわたる。インキュベート工程のためのファージ濃度は、使用されるファージの型に応じて変動する。いくつかの実施形態において、このインキュベート工程のためのファージ濃度は、１．０×１０^６、２．０×１０^６、３．０×１０^６、５．０×１０^６、６．０×１０^６、７．０×１０^６、８．０×１０^６、９．０×１０^６、１．０×１０^７、１．１×１０^７、１．２×１０^７、１．３×１０^７、１．４×１０^７、１．５×１０^７、１．６×１０^７、１．７×１０^７、１．８×１０^７、１．９×１０^７、２．０×１０^７、３．０×１０^７、４．０×１０^７、５．０×１０^７、６．０×１０^７、７．０×１０^７、８．０×１０^７、９．０×１０^７または１．０×１０^８ＰＦＵ／ｍＬを超える。そのような多数のファージは以前に、直ちに標的細胞を死滅させ、これにより、初期ファージアッセイからの有用なシグナルの生成を防止した「非感染溶菌」に関連付けられたため、そのように高濃度のファージの成功は驚くべきことである。ファージに関連するあらゆる混入するルシフェラーゼの除去に加えて、精製は、ゴースト粒子（ＤＮＡを失った粒子）を除去することもできるため、本明細書に記載されているファージストックの精製が、この問題の軽減に役立つ（例えば、ショ糖勾配塩化セシウム等密度密度勾配超遠心分離による精製）ことが可能である。ゴースト粒子は、「非感染溶菌」により細菌細胞を溶解し、細胞を早まって死滅させ、これにより、インジケーターシグナルの生成を防止し得る。電子顕微鏡は、粗組換えファージ溶解物（すなわち、塩化セシウム精製前の）が、５０％を超えるゴーストを有し得ることを実証する。このようなゴースト粒子は、細胞膜を穿刺する多くのファージ粒子の作用を介した微生物の早期の死滅に寄与し得る。よって、ゴースト粒子は、高ＰＦＵ濃度が有害であると報告された以前の問題に寄与した可能性がある。

本開示に記載されているインジケーター部分のいずれかは、抗生物質処置後の微生物の生存性を検出し、これにより、抗生物質抵抗性を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態において、感染性因子に関連するインジケーター部分は、感染性因子の複製中または複製後に検出可能であり得る。例えば、上に記載されている通り、一部の場合では、インジケーター部分は、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質またはその他）等の内因性シグナルを放射するタンパク質であり得る。インジケーターは、光を生成し得る、および／または色の変化によって検出可能であり得る。いくつかの実施形態において、ルミノメーターを使用して、インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）を検出することができる。しかし、他の機械またはデバイスを使用することもできる。例えば、分光光度計、ＣＣＤカメラまたはＣＭＯＳカメラは、色の変化および他の光放射を検出することができる。

いくつかの実施形態において、抗生物質へのサンプルの曝露は、５分間またはそれよりも長く続けることができ、様々な時点における検出が、最適な感度のために望ましいことがある。例えば、抗生物質で処置された一次サンプルのアリコートは、異なる時間間隔（例えば、５分間、１０分間または１５分間）で採取され得る。変動する時間間隔から得たサンプルは次に、ファージに感染させることができ、インジケーター部分は、基質の添加後に測定される。

いくつかの実施形態において、シグナルの検出を使用して、抗生物質抵抗性を決定する。いくつかの実施形態において、サンプルによって生成されたシグナルは、実験により決定された値と比較される。さらなる実施形態において、実験により決定された値は、コントロールサンプルによって生成されたシグナルである。いくつかの実施形態において、バックグラウンド閾値は、微生物なしのコントロールを使用して決定される。いくつかの実施形態において、ファージなしもしくは抗生物質なしのコントロール、または他のコントロールサンプルを使用して、適切な閾値を決定することもできる。いくつかの実施形態において、実験により決定された値は、平均バックグラウンドシグナル+平均バックグラウンドシグナルの標準偏差の１～３倍、またはそれよりも高いものから計算されたバックグラウンド閾値である。いくつかの実施形態において、バックグラウンド閾値は、平均バックグラウンドシグナル+平均バックグラウンドシグナルの標準偏差の２倍から計算され得る。他の実施形態において、バックグラウンド閾値は、平均バックグラウンドシグナル×ある倍数（例えば、２または３）から計算され得る。バックグラウンド閾値を超えるサンプルシグナルの検出は、サンプルにおける１種または複数の抗生物質抵抗性微生物の存在を示す。例えば、平均バックグラウンドシグナルは、２５０ＲＬＵであり得る。閾値バックグラウンドの値は、平均バックグラウンドシグナル（例えば、２５０）に３を掛けて、７５０ＲＬＵの値を計算することにより計算され得る。７５０ＲＬＵを超えるシグナル値を有する細菌を有するサンプルは、抗生物質抵抗性細菌の含有について陽性であると決定される。

その代わりに、実験により決定された値は、コントロールサンプルによって生成されたシグナルである。アッセイは、様々な適切なコントロールサンプルを含むことができる。例えば、微生物に特異的な感染性因子を含有しないサンプル、または感染性因子を含有するが、微生物がないサンプルは、バックグラウンドシグナルレベルのためのコントロールとしてアッセイされ得る。一部の場合では、抗生物質で処置されていない、微生物を含有するサンプルは、感染性因子を使用して抗生物質抵抗性を決定するためのコントロールとしてアッセイされる。

いくつかの実施形態において、サンプルシグナルを、コントロールシグナルと比較して、抗生物質抵抗性微生物がサンプル中に存在するか否か決定する。感染性因子と接触されたが抗生物質とは接触されていないコントロールサンプルと比較したシグナルの変化しない検出は、微生物が抗生物質に対して抵抗性であることを示し、感染性因子と接触されたが抗生物質とは接触されていないコントロールサンプルと比較したインジケーター部分の低減された検出は、微生物が抗生物質に対して感受性であることを示す。変化しない検出は、抗生物質および感染性因子で処置されたサンプルから検出されたシグナルが、抗生物質で処置されていないコントロールサンプルからのシグナルの少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％であることを指す。低減された検出は、抗生物質および感染性因子で処置されたサンプルから検出されたシグナルが、抗生物質で処置されていないコントロールサンプルからのシグナルの８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満または少なくとも３０％であることを指す。

必要に応じて、目的の微生物を含むサンプルは、培養されていないサンプルである。必要に応じて、感染性因子は、ファージであり、宿主細菌の感染後のファージ複製中のインジケーター遺伝子の発現が、可溶性インジケータータンパク質生成物をもたらすように、ファージの後期遺伝子領域に挿入されたインジケーター遺伝子を含む。上に記載されている通り、方法において使用される組成物のそれぞれの特色は、目的の微生物の抗生物質抵抗性を検出するための方法において利用することもできる。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子の転写は、追加のバクテリオファージ後期プロモーターによって制御される。

微生物の死滅のための抗生物質の有効用量を決定する方法もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、抗生物質は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種の死滅において有効である。例えば、抗生物質は、大部分のメチシリン感応性Ｓ．ａｕｒｅｕｓ（ＭＳＳＡ）に対して有効なセフォキシチンであり得る。典型的には、溶液の異なる濃度が、範囲を規定するように、異なる濃度を有する１種または複数の抗生物質溶液が調製される。一部の場合では、最も濃縮されていない抗生物質溶液の最も濃縮された抗生物質溶液に対する濃度比は、１：２～１：５０、例えば、１：５～１：３０または１：１０～１：２０に及ぶ。一部の場合では、１種または複数の抗生物質溶液の最低濃度は、少なくとも１μｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも４０μｇ／ｍＬ、少なくとも８０μｇ／ｍＬまたは少なくとも１００μｇ／ｍＬである。１種または複数の抗生物質溶液のそれぞれは、目的の微生物を含むサンプルの１個のアリコートと共にインキュベートされる。一部の場合では、微生物に特異的な感染性因子（例えば、バクテリオファージ）は、抗生物質溶液と同時に添加される。一部の場合では、サンプルのアリコートは、感染性因子の添加前の期間にわたり、抗生物質溶液と共にインキュベートされる。インジケータータンパク質生成物を検出することができ、陽性検出は、抗生物質溶液が有効ではないことを示し、陰性検出は、抗生物質溶液が有効であることを示す。抗生物質溶液の濃度は、有効臨床用量に相関することが予想される。したがって、いくつかの実施形態において、目的の微生物の死滅における抗生物質の有効用量を決定する方法は、１種または複数の抗生物質溶液のそれぞれを別々に、サンプルにおける目的の微生物と共にインキュベートする工程であって、１種または複数の抗生物質溶液の濃度が、異なり、範囲を規定する、工程；１種または複数のサンプルにおける微生物を、インジケーター部分を含む感染性因子と共にインキュベートする工程；１種または複数のサンプルにおける感染性因子のインジケータータンパク質生成物を検出する工程であって、１種または複数のサンプルのうち１種または複数におけるインジケータータンパク質生成物の陽性検出が、１種または複数のサンプルのうち１種または複数の処置に使用される抗生物質溶液の濃度が有効ではないことを示し、インジケータータンパク質の検出の欠如が、抗生物質が有効であることを示し、これにより、抗生物質の有効用量を決定する、工程を含む。

いくつかの実施形態において、方法は、抗生物質抵抗性のためのカテゴリー上の割当ての決定を可能にする。例えば、本明細書に開示されている方法を使用して、抗生物質のカテゴリー上の割当て（例えば、感受性、中間（intermediate）および抵抗性）を決定することができる。感受性抗生物質は、病原性微生物を阻害する可能性があるが、これを保証するものではない抗生物質である；これは、処置に適切な選択であり得る。中間抗生物質は、より多い投薬量もしくはより高頻度の投薬量において有効、または抗生物質が浸透して適切な濃度をもたらす特異的身体部位においてのみ有効であり得る抗生物質である。抵抗性抗生物質は、研究室検査における生物の成長の阻害において有効ではない抗生物質であり；これは、処置に適切な選択ではない可能性がある。いくつかの実施形態において、２種またはそれよりも多い抗生物質溶液が検査され、１種または複数の抗生物質溶液における最も濃縮されていない溶液および最も濃縮された溶液の濃度比は、１：２～１：５０、例えば、１：５～１：３０または１：１０～１：２０に及ぶ。一部の場合では、１種または複数の抗生物質溶液の最低濃度は、少なくとも１μｇ／ｍＬ、例えば、少なくとも２μｇ／ｍＬ、少なくとも５μｇ／ｍＬ、少なくとも１０μｇ／ｍＬ、少なくとも２０μｇ／ｍＬ、少なくとも４０μｇ／ｍＬ、少なくとも８０μｇ／ｍＬまたは少なくとも１００μｇ／ｍＬである。

いくつかの実施形態において、本発明は、抗生物質感応性微生物の存在下で抗生物質抵抗性微生物を検出するための方法を含む。ある特定の例では、抗生物質抵抗性細菌の検出を使用して、医療設定における感染症の伝播を予防することができる。いくつかの実施形態において、医療設定における患者は、抗生物質抵抗性細菌の定着についてモニターされ得る。次に、予防策を実行して、抗生物質抵抗性細菌の伝播を予防することができる。

抗生物質抵抗性微生物を検出するための方法のいくつかの実施形態において、サンプルは、抗生物質抵抗性および抗生物質感応性細菌の両方を含有し得る。例えば、サンプルは、ＭＲＳＡおよびＭＳＳＡの両方を含み得る。いくつかの実施形態において、ＭＲＳＡは、サンプルからのＭＲＳＡの単離の必要なく、ＭＳＳＡの存在下で検出され得る。抗生物質の存在下で、ＭＳＳＡは、閾値を上回るシグナルを生成しないが、サンプル中に存在するＭＲＳＡは、閾値を上回るシグナルを生成することができる。よって、両者共にサンプル内に存在する場合、閾値を上回るシグナルは、抗生物質抵抗性株（例えば、ＭＲＳＡ）の存在を示す。

当技術分野で公知の多くのアッセイとは対照的に、微生物の抗生物質抵抗性の検出は、事前の単離なしで達成され得る。多くの方法は、患者サンプルが、寒天プレート上で細菌の個々のコロニーを精製／単離するために予め培養されることを要求する。本明細書に開示されている方法の増大された感度は、一部には、単一の微生物に結合する多数の特異的な感染性因子、例えば、ファージの能力が原因である。ファージの感染および複製後に、標的微生物は、ファージ複製中に産生されたインジケータータンパク質生成物を介して検出され得る。

よって、ある特定の実施形態において、方法は、≦１０細胞の微生物（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の微生物）を含むサンプルにおける微生物の抗生物質抵抗性を検出することができる。ある特定の実施形態において、抗生物質で処置されたサンプルにおける特異的な型の単一の細菌の検出によって、組換えファージを使用して、抗生物質抵抗性を検出することができる。ある特定の実施形態において、組換えファージは、抗生物質と接触させられたサンプルにおける２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個程度の特異的細菌の存在を検出する。

本明細書に開示されている抗生物質抵抗性を検出する方法の感度は、抗生物質とのインキュベーションに先立ち捕捉および感染された微生物を洗浄することにより、さらに増大され得る。評価されている抗生物質が、他の細菌種によって分解されることが公知である場合、標的細菌の単離が要求され得る。例えば、臨床サンプル中に存在する他の細菌が、抗生物質を分解し（ベータ－ラクタマーゼ分泌）、偽陽性をもたらし得るため、ペニシリン抵抗性は、精製なしで評価することが困難である。その上、溶解緩衝液および基質の添加に先立ち、抗生物質および感染性因子とのインキュベーション後に、捕捉された微生物を洗浄することができる。このような追加の洗浄工程は、ファージ調製物に混入する過剰な親ファージおよび／またはルシフェラーゼもしくは他のレポータータンパク質の除去を助ける。したがって、いくつかの実施形態において、抗生物質抵抗性を検出する方法は、ファージを添加した後に、ただしインキュベートする前に、捕捉および感染された微生物を洗浄する工程を含むことができる。

多くの実施形態において、マルチウェルプレートを使用して、アッセイを行う。プレート（または検出を行うことができる他の任意の容器）の選択は、検出工程に影響を与えることができる。例えば、いくつかのプレートは、有色または白色のバックグラウンドを含むことができ、このことは、光放射の検出に影響を与えることができる。一般的に言えば、白色プレートは、より高い感度を有するが、より高いバックグラウンドシグナルも生じる。他の色のプレートは、より低いバックグラウンドシグナルを生成することができるが、僅かにより低い感度も有する。その上、バックグラウンドシグナルの理由の１つは、あるウェルから別の隣接するウェルへの光の漏出である。白色ウェルを有するが、プレートの残りの部分が黒色である、いくつかのプレートが存在する。これは、ウェル内側の高いシグナルを可能にするが、ウェル間の光漏出を防止し、よって、バックグラウンドを減少させることができる。よって、プレートまたは他のアッセイ容器の選択は、アッセイの感度およびバックグラウンドシグナルに影響を与えることができる。

よって、本発明のいくつかの実施形態は、検出可能なシグナルを増幅するために感染性因子に基づく方法を使用し、これにより、微生物が、抗生物質に対して抵抗性であるか否か示すことにより、ニーズを解決する。本発明は、使用者が、精製も単離もされていないサンプル中に存在する微生物の抗生物質抵抗性を検出することを可能にする。ある特定の実施形態において、僅か単一の細菌が検出される。この原理は、微生物表面受容体の特異的な認識に基づき、１個または数個の細胞からのインジケーターシグナルの増幅を可能にする。例えば、微生物の単一の細胞であっても複数のファージに曝露し、その後、ファージの増幅および複製中のコードされたインジケーター遺伝子生成物の高レベル発現を可能にすることにより、インジケーターシグナルは、単一の微生物が検出可能となるように増幅される。本発明は、検出に先立つ微生物の単離を要求しないことによる、微生物の検出のための迅速な検査として優れている。いくつかの実施形態において、検出は、ファージまたはウイルスの１～２回の複製サイクル以内で可能である。

追加の実施形態において、本開示は、本明細書に開示されている方法を行うため、および／または本明細書に記載されている改変された感染性因子を使用するための構成成分を含むシステム（例えば、コンピュータシステム、自動化システムまたはキット）を含む。

本発明のシステムおよびキット
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されている方法を行うための構成成分を含むシステム（例えば、自動化システムまたはキット）を含む。いくつかの実施形態において、インジケーターファージが、本発明に係るシステムまたはキットに含まれる。本明細書に記載されている方法は、そのようなインジケーターファージシステムまたはキットを利用することもできる。方法を行うために要求される最小量の試薬および材料を考慮すると、本明細書に記載されているいくつかの実施形態は、自動化および／またはキットに特に適する。ある特定の実施形態において、キットの構成成分のそれぞれは、第１の部位から第２の部位へと送達可能な内蔵型（ｓｅｌｆ－ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）ユニットを含むことができる。

いくつかの実施形態において、本開示は、サンプルにおける目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットを含む。システムまたはキットは、ある特定の実施形態において、サンプルを目的の微生物に特異的な組換えバクテリオファージと共にインキュベートするための構成成分であって、組換えバクテリオファージが、遺伝的構築物を含み、遺伝的構築物が、インジケータータンパク質生成物をコードする遺伝子を含む、構成成分；およびインジケータータンパク質生成物を検出するための構成成分を含むことができる。いくつかのシステムは、固体支持体上に目的の微生物を捕捉するための構成成分をさらに含む。

他の実施形態において、本開示は、サンプルにおける目的の微生物の迅速な検出のための方法、システムまたはキットであって、目的の微生物に特異的な組換えバクテリオファージ構成成分であって、組換えバクテリオファージが、遺伝的構築物を含み、遺伝的構築物が、インジケータータンパク質生成物をコードする遺伝子を含む、構成成分；およびインジケータータンパク質生成物を検出するための構成成分を含む、方法、システムまたはキットを含む。ある特定の実施形態において、組換えバクテリオファージは、特定の細菌に高度に特異的である。ある実施形態において、組換えバクテリオファージは、１００種を超える他の型の細菌の存在下で目的の細菌を区別することができる。ある特定の実施形態において、システムまたはキットは、サンプルにおける特異的な型の単一の細菌を検出する。ある特定の実施形態において、システムまたはキットは、サンプルにおける２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または１００個程度の特異的細菌を検出する。

ある特定の実施形態において、システムおよび／またはキットは、捕捉された微生物サンプルを洗浄するための構成成分をさらに含むことができる。その上またはその代わりに、システムおよび／またはキットは、インジケータータンパク質生成物の量を決定するための構成成分であって、検出されるインジケーター部分の量が、サンプルにおける微生物の量に対応する、構成成分をさらに含むことができる。例えば、ある特定の実施形態において、システムまたはキットは、ルシフェラーゼ酵素活性を測定するためのルミノメーターまたは他のデバイスを含むことができる。

いくつかのシステムおよび／またはキットにおいて、複数の工程のために同じ構成成分を使用することができる。いくつかのシステムおよび／またはキットにおいて、工程は、コンピュータ入力により、自動化されるかまたは使用者によって制御される、および／または液体を取り扱うロボットが、少なくとも１つの工程を行う。

よって、ある特定の実施形態において、本発明は、サンプルにおける目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットであって、サンプルを目的の微生物に特異的な組換えバクテリオファージと共にインキュベートするための構成成分であって、組換えバクテリオファージが、インジケータータンパク質生成物をコードする遺伝子を含む、構成成分；サンプルから固体支持体上に微生物を捕捉するための構成成分；捕捉された微生物サンプルを洗浄して、結合していない感染性因子を除去するための構成成分；およびインジケータータンパク質生成物を検出するための構成成分を含む、システムまたはキットを含むことができる。いくつかの実施形態において、捕捉および／またはインキュベートおよび／または洗浄する工程のために同じ構成成分（例えば、フィルター構成成分）を使用することができる。いくつかの実施形態はその上、サンプルにおける目的の微生物の量を決定するための構成成分であって、検出されるインジケータータンパク質生成物の量が、サンプルにおける微生物の量に対応する、構成成分を含む。そのようなシステムは、微生物の迅速な検出の方法に関する上述のものに類似した、様々な実施形態および下位実施形態（subembodiment）を含むことができる。ある実施形態において、微生物は細菌であり、感染性因子はバクテリオファージである。コンピュータ処理されたシステムにおいて、システムは、コンピュータを介して、完全自動化され得る、半自動化され得るまたは使用者によって指示され得る（またはこれらのいくつかの組合せ）。

ある実施形態において、本開示は、目的の微生物を検出するための構成成分を含むシステムまたはキットであって、少なくとも１個の微生物を複数の組換えバクテリオファージに感染させるための構成成分；少なくとも１個の感染した微生物を溶解するための構成成分；および組換えバクテリオファージによってコードおよび発現された可溶性インジケータータンパク質生成物を検出するための構成成分であって、感染性因子の可溶性タンパク質生成物の検出が、微生物がサンプル中に存在することを示す、構成成分を含む、システムまたはキットを含む。

いくつかの実施形態において、本開示は、バイオフィルム関連の感染症を処置するための構成成分を含むシステムまたはキットであって、のための構成成分を含むシステムまたはキットを含む。

本開示のこれらのシステムおよびキットは、種々の構成要素を含む。本明細書で使用される場合、用語「構成要素」とは、広く定義され、記載される方法を実施するための任意の適した装置もしくは適した装置の集まりを含む。上記構成要素は、いかなる特定の方法においても互いに関して一体的に接続される必要も据え付けられる必要もない。本発明は、互いに関して上記構成要素の任意の適切な配置を含む。例えば、上記構成要素は、同じ空間の中に存在する必要はない。しかしいくつかの実施形態において、上記構成要素は、一体ユニットにおいて互いに接続される。いくつかの実施形態において、同じ構成要素は、複数機能を実行し得る。

コンピューターシステムおよびコンピューター可読媒体
上記システムは、現在の技術もしくはその構成要素のうちのいずれかにおいて記載されるように、コンピューターシステムの形態で具現化され得る。コンピューターシステムの代表例としては、汎用コンピューター、プログラムされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラー、周辺集積回路素子、および本技術の方法を構成する工程を実装し得る他のデバイスもしくはデバイスの配置が挙げられる。

コンピューターシステムは、コンピューター、入力デバイス、ディスプレイユニット、および／もしくはインターネットを含み得る。上記コンピューターは、マイクロプロセッサをさらに含み得る。上記マイクロプロセッサは、通信バスへと接続され得る。上記コンピューターはまた、メモリを含み得る。上記メモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）およびリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含み得る。上記コンピューターシステムは、記憶デバイスをさらに含み得る。上記記憶デバイスは、ハードディスクドライブもしくはリムーバル記憶デバイス（例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、光学ディスクドライブなど）であり得る。上記記憶デバイスはまた、コンピュータープログラムもしくは他の指示を上記コンピューターシステムへとロードするための他の類似の手段であり得る。上記コンピューターシステムはまた、通信ユニットを含み得る。上記通信ユニットは、Ｉ／Ｏインターフェイスを通じて、上記コンピューターが他のデータベースおよびインターネットに接続することを可能にする。上記通信ユニットは、他のデータベースへの転送、ならびに他のデータベースからのデータの受領を可能にする。上記通信ユニットは、モデム、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）カード、もしくは上記コンピューターシステムをデータベースおよびネットワーク（例えば、ＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮおよびインターネット）に接続することを可能にする任意の類似のデバイスを含み得る。上記コンピューターシステムは、従って、Ｉ／Ｏインターフェイスを介して上記システムへとアクセス可能な入力デバイスを通じてユーザーからの入力を容易にし得る。

コンピューティングデバイスは、代表的には、そのコンピューティングデバイスの一般管理およびオペレーションのための実行可能なプログラム指示を提供するオペレーティングシステムを含み、代表的には、サーバーのプロセッサによって実行される場合に、上記コンピューティングデバイスにその意図された機能を行わせる指示を記憶するコンピューター可読記憶媒体（例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリなど）を含む。上記オペレーティングシステムに適した実装および上記コンピューティングデバイスの一般的な機能性は、公知であるかもしくは市販されており、当業者によって、特に本明細書の開示に鑑みて、容易に実装される。

上記コンピューターシステムは、入力データを処理するために、１以上の記憶素子の中に記憶される一群の指示を実行する。上記記憶素子はまた、記載されるとおりのデータもしくは他の情報を保持し得る。上記記憶素子は、処理機械に存在する情報ソースもしくは物理的メモリ素子の形態にあり得る。

環境は、上記で考察されるとおりの種々のデータストアならびに他のメモリおよび記憶媒体を含み得る。これらは、種々の位置に存在し得る（例えば、上記コンピューターのうちの１以上にローカルな（および／もしくは中に存在する）、またはネットワーク全体にわたって記コンピューターのうちのいずれかもしくはすべてから遠隔にある記憶媒体において）。実施形態の特定の一群において、情報は、当業者が精通しているストレージエリアネットワーク（「ＳＡＮ」）に存在し得る。同様に、上記コンピューター、サーバー、もしくは他のネットワークデバイスに帰した機能を行うための任意の必須のファイルは、適切な場合、ローカルにおよび／もしくは遠隔に保存され得る。システムが、コンピューティングデバイスを含む場合、各々のこのようなデバイスは、バスを介して電気的に連結され得るハードウェア要素を含み得、上記要素は、例えば、少なくとも１つの中央処理装置（ＣＰＵ）、少なくとも１つの入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、コントローラー、タッチスクリーン、もしくはキーパッド）、および少なくとも１つの出力デバイス（例えば、ディスプレイデバイス、プリンター、もしくはスピーカー）を含む。このようなシステムはまた、１つ以上の記憶デバイス（例えば、ディスクドライブ、光学記憶デバイス、およびソリッドステート記憶デバイス（例えば、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）もしくはリードオンリーメモリ（「ＲＯＭ」）、ならびにリムーバブルメディアデバイス、メモリカード、フラッシュカードなどを含み得る。

このようなデバイスはまた、コンピューター可読記憶媒体リーダー、通信デバイス（例えば、モデム、ネットワークカード（無線もしくは有線）、赤外線通信デバイスなど）、および上記のとおりのワーキングメモリを含み得る。上記コンピューター可読記憶媒体リーダーは、遠隔、ローカル、固定、および／もしくはリムーバブル記憶デバイスを代表するコンピューター可読記憶媒体、ならびにコンピューター可読情報を一時的におよび／もしくはより恒久的に含む、記憶する、伝達する、および検索するための記憶媒体と接続され得るかまたはこれらを受容するように構成され得る。上記システムおよび種々のデバイスはまた、代表的には、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラム（例えば、クライアントアプリケーションもしくはウェブブラウザ）を含む、少なくとも１つのワーキングメモリデバイス内に位置した多くのソフトウェアアプリケーション、モジュール、サービス、もしくは他の要素を含む。代替の実施形態が、上記のものからの多くのバリエーションを有し得ることは認識されるべきである。例えば、カスタマイズされたハードウェアがまた使用され得る、および／または特定の要素が、ハードウェア、ソフトウェア（ポータブルソフトウェア（例えば、アプレット）を含む）、または両方において実装され得る。さらに、他のコンピューティングデバイス（例えば、ネットワーク入力／出力デバイス）への接続が使用され得る。

コード、もしくはコードの一部を含むための非一時的な記憶媒体およびコンピューター可読媒体としては、当該分野で公知であるかもしくは使用される任意の適切な媒体（記憶媒体および通信媒体（例えば、コンピューター可読の指示、データ構造、プログラムモジュール、もしくは他のデータなどの情報の記憶および／または伝達のための任意の方法または技術において実装される、揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブルの媒体が挙げられるが、これらに限定されない）を含む）が挙げられ得、これらとしては、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、ＣＤ－ＲＯＭ、デジタル多目的ディスク（ＤＶＤ）もしくは他の光学記憶、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶もしくは他の磁気記憶デバイス、または所望の情報を記憶するために使用され得、上記システムデバイスによってアクセスされ得る任意の他の媒体が挙げられる。上記開示および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、上記種々の実施形態を実装するための他のやり方および／または方法を認識する。

コンピューター可読媒体は、プロセッサにコンピューター可読指示を提供することができる電子式、光学式、磁気、もしくは他の記憶デバイスを含み得るが、これらに限定されない。他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭ、連想メモリ（「ＣＡＭ」）、ＤＤＲ、フラッシュメモリ（例えば、ＮＡＮＤフラッシュもしくはＮＯＲフラッシュ、ＡＳＩＣ、構成されたプロセッサ、光学記憶媒体、磁気テープもしくは他の磁気記憶媒体、またはコンピュータープロセッサが指示を読み得る任意の他の媒体。一実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、コンピューター可読媒体（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ））の単一タイプを含み得る。他の実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、コンピューター可読媒体（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ディスクドライブ、およびキャッシュ）のうちの２またはそれより多くのタイプを含み得る。上記コンピューティングデバイスは、１またはそれより多くの外付けのコンピューター可読媒体（例えば、外付けハードディスクドライブ、または外付けＤＶＤもしくはブルーレイドライブ）と通信状態にあり得る。

上記で考察されるように、上記実施形態は、コンピューター実行可能なプログラム指示を実行および／またはメモリに記憶された情報にアクセスするように構成されているプロセッサを含む。上記指示は、任意の適切なコンピュータープログラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、およびＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ（Ａｄｏｂｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ， Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる）で書かれたコードから、コンパイラおよび／もしくはインタープリターによって生成されたプロセッサ特異的指示を含み得る。一実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、単一のプロセッサを含む。他の実施形態において、上記デバイスは、２またはそれより多くのプロセッサを含む。このようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および状態機械を含み得る。このようなプロセッサは、プログラマブル電子デバイス（例えば、ＰＬＣ）、プログラマブル割り込みコントローラー（ＰＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電子的にプログラム可能なリードオンリーメモリ（electronically programmable read-only memory）（ＥＰＲＯＭもしくはＥＥＰＲＯＭ）、または他の類似のデバイスをさらに含み得る。

上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスを含む。いくつかの実施形態において、上記ネットワークインターフェイスは、有線もしくは無線の通信リンクを介して通信するように構成されている。例えば、上記ネットワークインターフェイスは、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、ＩＥＥＥ ８０２．１１（Ｗｉ－Ｆｉ）、８０２．１６（Ｗｉ－Ｍａｘ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、赤外線などを介して、ネットワーク上での通信を可能にし得る。別の例として、ネットワークインターフェイスは、ネットワーク（例えば、ＣＤＭＡ、ＧＳＭ（登録商標）、ＵＭＴＳ、もしくは他の携帯通信ネットワーク（ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ ｎｅｔｗｏｒｋ））上での通信を可能にし得る。いくつかの実施形態において、上記ネットワークインターフェイスは、別のデバイスでの、例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、１３９４ ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標）、シリアル接続もしくはパラレル接続、または類似のインターフェイスを介したポイントツーポイント接続を可能にし得る。適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、１以上のネットワーク上での通信のための２以上のネットワークインターフェイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスに加えてもしくはその代わりに、データストアを含み得る。

適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、多くの外付けもしくは内部デバイス（例えば、マウス、ＣＤ－ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、オーディースピーカー、１以上のマイクロフォン、または任意の他の入力もしくは出力デバイス）を含み得るかまたはこれらと通信状態にあり得る。例えば、上記コンピューティングデバイスは、種々のユーザーインターフェイスデバイスおよびディスプレイと通信状態にあり得る。上記ディスプレイは、任意の適切な技術（ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＣＲＴなどが挙げられるが、これらに限定されない）を使用し得る。

上記コンピューターシステムによる実行のための指示セットは、特定のタスク（例えば、本技術の方法を構成する工程）を行うための処理機械を指示する種々のコマンドを含み得る。上記指示セットは、ソフトウェアプログラムの形態にあり得る。さらには、上記ソフトウェアは、本技術におけるように、別個のプログラムの集まり、より大きなプログラムを有するプログラムモジュールもしくはプログラムモジュールの一部の形態にあり得る。上記ソフトウェアはまた、オブジェクト指向プログラミングの形態でのモジュラープログラミングを含み得る。処理機械による入力データの処理は、ユーザーコマンド、以前の処理の結果、もしくは別の処理機械によって作成されたリクエストに応じ得る。

本発明は、ある種の実施形態を参照して開示されてきた一方で、記載される実施形態に対する多くの改変、変化および変更は、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく可能である。よって、本発明は、上記記載される実施形態に限定されないことは意図されるが、以下の特許請求の範囲の文言およびその均等物によって定義される全範囲を有する。

次の実施例は、本開示の主題の代表的な実施形態を実施するためのガイダンスを当業者に提供するために含まれている。本開示および当技術分野の一般的な技術水準を踏まえて、当業者は、次の実施例が、単なる例示であることが意図され、本開示の主題の範囲から逸脱することなく、多数の変化、改変および変更を用いることができることを認めることができる。

（実施例１）
Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓバイオフィルムおよび灌注洗浄検査プロトコール
Ｓ．ａｕｒｅｕｓの一晩培養物を、２００μＬ ＴＳＢ（１００％トリプトンダイズブロス）、ＴＳＢｇ（６６％ＴＳＢ＋０．２％グルコース）またはＴＳＢ－ＨＳ（９０％ＴＳＢ＋１０％ヒト血清）のいずれかへと希釈した。初期接種材料は、一晩培養物の２００倍希釈であり、９６ウェルプレートにおいて調製した。プレートにカバーをかけ、３７℃で少なくとも１６時間静的にインキュベートした。培地を廃棄し、２００μＬ食塩水で穏やかに洗浄することにより、非バイオフィルムプランクトン細胞を除去した。バイオフィルム上で２００μＬの食塩水を強制的にピペッティングすることにより、食塩水灌注洗浄を行った。この直接的な洗浄は、接着性バイオフィルムの部分を機械的に放出することが予想される。１５０μＬの各食塩水灌注洗浄サンプルを、乾燥濃縮ＢＨＩ（ブレインハートインフュージョン）を含有する別々の９６ウェルプレートに移した。各ウェルにおけるＢＨＩの最終濃度は、１×（３７ｇ／Ｌ）であった。残留接着性バイオマスを評価するために、１５０μＬのＢＨＩを、灌注洗浄後のバイオフィルムを含有する各ウェルに添加した。全サンプル（残留バイオフィルム＋食塩水灌注洗浄）にカバーをかけ、３７℃で静的にインキュベートして、４時間の期間にわたり富化を容易にした。富化後に、１０μＬの組換えファージカクテルを各ウェルに添加し、ピペッティングによって混合した。プレートにもう一度カバーをかけ、３７℃で２時間静的にインキュベートした。感染後に、ＮＡＮＯ－ＧＬＯ（登録商標）緩衝剤、ＮＡＮＯ－ＧＬＯ（登録商標）基質およびウミシイタケ溶解緩衝液を含有する検出マスターミックスを６５μＬ、各ウェルに添加し、ピペッティングによって再度混合した。３分間の待機時間の後に、１秒間の積分を利用して、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）ルミノメーターにおいてサンプルを読み取った。データは、表１に相対的光単位（ＲＬＵ）として提示される。

Claims (18)

1. 対象におけるバイオフィルム関連の感染症の診断および処置のための方法であって、
   （ｉ）前記対象から採取された生体サンプルを提供する工程；
   （ｉｉ）
   （ａ）前記生体サンプルの少なくとも１つのアリコートを、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むある量のレポーターカクテル組成物と接触させる工程；
   （ｂ）前記組換えバクテリオファージの複製後に生成されたシグナルを検出する工程であって、前記シグナルの検出が、目的の微生物が前記サンプル中に存在することを示す、工程
   を含む、少なくとも１種の前記目的の微生物の存在を検出することにより、前記対象をバイオフィルム関連の感染症と診断する工程；ならびに
   （ｉｉｉ）
   （ａ）工程（ｉｉ）の前記診断に基づき治療カクテル組成物を選択する工程；
   （ｂ）少なくとも１種のバクテリオファージを含む治療有効量の治療カクテル組成物を投与する工程であって、前記バクテリオファージが、検出された前記目的の微生物に特異的である、工程；および
   （ｃ）少なくとも１種の追加の治療剤を必要に応じて投与する工程
   を含む、バイオフィルム関連の感染症と診断された前記対象を処置する工程
   を含む、方法。
2. 前記バイオフィルムが、感染症を有すると疑われる対象におけるインプラントの表面にあるまたはその周囲にある、請求項１に記載の方法。
3. 前記対象を診断する工程が、複数のアリコートを複数のレポーターカクテル組成物と接触させる工程を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記対象を診断する工程が、検出された前記目的の微生物の抗生物質抵抗性を決定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
5. 検出された前記目的の微生物の前記抗生物質抵抗性を決定する工程が、前記生体サンプルを前記レポーターカクテル組成物と接触させる前に、前記生体サンプルを抗生物質と接触させる工程をさらに含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記レポーターカクテル組成物の前記組換えバクテリオファージが、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝的構築物を含み、前記遺伝的構築物が、インジケーター遺伝子および追加のバクテリオファージ後期プロモーターを含む、請求項１に記載の方法。
7. 前記インジケーター遺伝子が、融合タンパク質をコードせず、前記インジケーター遺伝子の転写が、前記追加のバクテリオファージ後期プロモーターによって制御される、請求項６に記載の方法。
8. 宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製中の前記インジケーター遺伝子の発現が、インジケータータンパク質生成物をもたらす、請求項７に記載の方法。
9. 前記インジケーター遺伝子が、ルシフェラーゼ酵素をコードする、請求項８に記載の方法。
10. 前記治療カクテル組成物の前記バクテリオファージが、組換えバクテリオファージである、請求項１に記載の方法。
11. 前記治療カクテル組成物の前記組換えバクテリオファージが、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝的構築物を含み、前記遺伝的構築物が、酵素を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 前記酵素が、グリコシダーゼ、アミダーゼまたはエンドペプチダーゼである、請求項１１に記載の方法。
13. 前記目的の微生物が、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種、Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓおよびＳｈｉｇｅｌｌａ種である、請求項１に記載の方法。
14. 組換えバクテリオファージの少なくとも１つの型が、ファージＫ、ＭＰ１１５またはＩＳＰから構築される、請求項１に記載の方法。
15. 前記生体サンプルが、２４時間、２３時間、２２時間、２１時間、２０時間、１９時間、１８時間、１７時間、１６時間、１５時間、１４時間、１３時間、１２時間、１１時間、１０時間、９時間、８時間、７時間、６時間、５時間、４時間、３時間または２時間の富化期間にわたり、成長を支持する条件で先ずインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
16. 前記治療剤が、抗生物質である、請求項１に記載の方法。
17. 対象における感染症を予防または阻害する方法であって、少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物を、外科的インプラント、包帯剤または縫合糸に適用する工程を含む、方法。
18. 少なくとも１種の組換えバクテリオファージを含むカクテル組成物でコーティングされた外科的インプラント、包帯剤または縫合糸。