CN111788314A - 用于抗微生物剂敏感性测试和细菌菌种确认的基于噬菌体的检测方法 - Google Patents

用于抗微生物剂敏感性测试和细菌菌种确认的基于噬菌体的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了确定细菌身份和对抗生素或抗微生物剂的敏感性或耐受性的方法。在一个实施方式中，在存在或不存在抗生素剂的情况下培养细菌以产生多种原代培养物，然后在存在或不存在转化噬菌体的情况下将其培养以产生第一继代培养物和第二继代培养物，该第一继代培养物包含已经用抗生素剂处理过的转化细菌，而第二继代培养物包含未用抗生素剂处理过的转化细菌。重组噬菌体对细菌具有特异性，并包含异源标记。细菌对抗生素或抗微生物剂的敏感性或耐受性通过比较第一继代培养物和第二继代培养物中标记的水平或活性来确定。

Description

用于抗微生物剂敏感性测试和细菌菌种确认的基于噬菌体的 检测方法
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2017年10月2日提交的美国临时申请号62/566,864的权益，其内容在此通过引用全文并入。
技术领域
本文描述的主题涉及用于确认细菌病原体并界定细菌对测试剂的敏感性的方法，以及用于确定目标细菌菌种是否对一种或多种抗微生物剂具有抗性的方法。进一步的实施方式涉及筛选新的测试化合物的抗微生物或益生菌活性的方法，包括检测生物样品(包括临床样品、食品和环境样品)中此类试剂的存在。
背景技术
自从抗生素青霉素首次实际应用以来，已经开发了许多其他抗菌剂，并且抗菌疗法极大地促进了现代医学的发展和平均寿命的延长。然而，致病菌已经获得了对大多数抗菌剂的抗性，从而损害了抗菌疗法的整体有效性，同时也带来了新的公共卫生问题。特别地，显示出对β-内酰胺抗菌剂具有抗性的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)是高度抗性的病原体。它与每年将近94,000例新住院直接相关，仅在美国每年就导致大约19,000人死亡(Voss等人，International Journal of Antimicrobial Agents，5：101-106，1995；McGeer等人，LPTP Newsletter，190：1-4，1996；CDC MRSA追踪)。部分原因是畜牧业和医院中抗生素的使用增加，新的耐多种药的细菌菌株也以惊人的速度出现。例如，有报告称在接受万古霉素治疗的MRSA感染患者中出现了万古霉素中间金黄色葡萄球菌(VISA)感染(Hiramatsu等人，J Antimicrob Chemother，40(1)，135-6，1997；Perichon等人，Antimicrob AgentsChemother.，53(11)：4580-7，2009)。实际上，一些菌株已对几乎所有常用抗菌剂产生抗性。一个声名狼藉的例子是MRSA的Mu50菌株，它也对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素、氯霉素和林可酰胺类耐药(Hiramatsu等人，同上)。还已经确认了对异烟肼和利福平具有耐受性的耐多种药物的结核分枝杆菌(Dalton等人，Lancet，380：1406-17，2012)。
食源性细菌疾病，特别是由抗药性细菌引发的疾病，也对人类健康构成重大威胁。一项微生物学研究分析了包括蔬菜沙拉、生鸡蛋表面、生鸡肉、未巴氏灭菌的牛奶和生肉在内的150份食物样品中的大肠杆菌，发现在生鸡肉中检出的抗药性大肠杆菌分离物的百分比最高(23.3％)，其次是蔬菜沙拉(20％)、生肉(13.3％)、生鸡蛋表面(10％)和未经巴氏灭菌的牛奶(6.7％)。抗药性大肠杆菌的总发病率为14.7％(Rasheed等人，Rev Inst MedTrop Sao Paulo，56(4)：341-346，2014)。这项研究进一步强调了抗药性大肠杆菌将抗药基因转移到其他物种(如克雷伯氏菌属)的能力带来的威胁。
越来越多的科学证据指出细菌如何进化防御系统，以防御目前使用的五类主要抗菌药物。这些药物大致分为β-内酰胺类、β-内酰胺酶抑制剂、头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素/甘氨酰环素和多粘菌素。下文概述了每种试剂的局限性，尤其是在以单个使用时。
β-内酰胺类是一大类广谱药物，它们是革兰氏阴性感染的主要治疗方法。β-内酰胺类药物的亚类范围从窄谱(青霉素)到广谱(碳青霉烯)。革兰氏阴性菌已发展出多种抗β-内酰胺的途径。可能最令人担忧的机制涉及β-内酰胺酶的进化，这种酶会破坏β-内酰胺抗生素。一些β-内酰胺酶会破坏窄谱药物(例如仅对青霉素有活性)，而更新的β-内酰胺酶(如对碳青霉烯耐药的肠杆菌或CRE中发现的碳青霉烯酶)可以中和所有β-内酰胺抗生素。
β-内酰胺酶抑制剂仍然对革兰氏阴性菌具有活性，所述革兰氏阴性菌具有的β-内酰胺酶破坏β-内酰胺抗生素的活性有限。对广谱头孢菌素和碳青霉烯类耐药的细菌通常也对这些药物耐药。正在开发的新型β-内酰胺酶抑制剂组合药具有克服某些但不是全部对最有效的β-内酰胺酶(如CRE中发现的)耐受性的潜力。
在过去的20年中，广谱头孢菌素一直是治疗严重革兰氏阴性感染的基石。抗(药)的革兰氏阴性菌感染正在蔓延到社区。耐受性通常使碳青霉烯类药物作为唯一有效的抗生素。
氟喹诺酮类药物是通常口服的广谱抗生素，使它们在住院患者和门诊患者中都方便使用。但是，随着在患者群体中的使用增加，抗药菌株迅速发展，从而使药物无效。增加的使用还与由抗性的、艰难梭状芽胞杆菌的高毒力菌株引起的感染增加有关。
氨基糖苷类常与β-内酰胺类药物联合使用，以治疗革兰氏阴性菌引起的感染。尽管人们越来越担心耐受性，但作为对抗严重感染的最后手段，这些药物仍然是重要的治疗选择。但是，由于担心耐受性及其长期副作用，临床医生很少单独使用它们(如果有的话)。
四环素不是严重革兰氏阴性感染的一线治疗选择；但是，由于其他药物类别的功效有限，它们被认为是治疗严重感染的一种选择。甘氨酰环素(即替加环素)通常被认为用于治疗多重耐药的革兰氏阴性菌感染。替加环素是一种在体内分布不均的药物，因此根据感染部位的不同，它经常与其他药物联合使用。尽管相对不常见，但是已经报告了对替加环素具有抗性的菌株的发生。
多粘菌素是一种较旧的种类，由于担心毒性而失宠。现在，它们通常被用作治疗多重耐受性革兰氏阴性菌感染的“最后手段”。由于这些是仿制药，因此关于剂量确定和功效的当代数据有限。另外，关于高抗性菌株的检测，有一些但有限的数据。
鉴于细菌的耐药菌株数目的迅速增加，迫切需要新的有效方法来确认细菌的临床分离株和非临床分离株，特别是属于ESKAPE组的细菌(粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌和肠杆菌属)，并对它们进行核型分析。(Boucher等人，Clinical Infectious Diseases，48：1-12，2009)。还需要快速而准确的病原体识别，以使医生对感染做出反应并做出适当反应，包括可能威胁生命的感染。当前，病原体确认需要在固体培养基(基于琼脂的平板)上进行培养，然后进行诊断分析，而诊断分析通常需要在培养基或特定细菌产品的纯化中进行额外的复制。最好的情况下，微生物确认需要几天的时间，在此期间，可能需要根据病原体的总体分类来提高生物安全性水平。这种基于生长的生物学测定的第二代版本通过使用放射(例如Becton Dickinson的BACTECTM)或比色/荧光法(例如Becton Dickinson的MGITTM和Biomerieux's BACT
Figure BDA0002518693810000041
)设备测量细菌生长产生的代谢产物，而不必等待细菌种群达到足以用肉眼看到的密度来加快微生物确认和耐受性检测的时间。然而，这些确定系统经常面临污染问题，从而增加了对后处理的需要并导致不必要的延迟(Tortoli等人，J.Clin.Microbiol.，40：607-610，2002)。
加快耐药细菌的生物学检测的更近期方法集中于使用噬菌体来探测抗微生物剂对分离物的影响(Schofield等人，Bacteriophage，2(2)：105-283，2012和WO 08/124119)。噬菌体用于感染细菌、劫持宿主的细胞生物合成机器进行复制，从而用作确认临床样品中特定细菌菌株的工具。在噬菌体的检测中可以采用多种方法。一种方法依赖于核酸扩增的使用(美国专利公开号2014-0256664和WO 12/158502)。在这种方法中，通过分析结核分枝杆菌噬菌体D29 DNA的实时PCR产物来筛选结核分枝杆菌的药敏性。
一种相关方法依赖于用噬菌体感染细菌感染继代培养物并分析该继代培养物的生长特性。该方法通常用于确认耐受性结核分枝杆菌。基于这种间接检测方法的示例性商业试剂盒由Biotec，Inc.(英国萨福克)以商标FASTPLAQUE-RESPONSETM(Mole等人，J MedMicrobiol.，56(Pt 10)：1334-9，2007；Albert等人，J Appl Microbiol.，103(4)：892-9，2007)出售。该试剂盒还提供了分枝杆菌噬菌体D29，然而与D29DNA的直接PCR分析相比，该方法试图通过使用杀病毒剂消除未感染细菌的噬菌体来最大程度地减少假阳性。在筛选了受感染的分枝杆菌后，将噬菌体感染的分枝杆菌与快速复制的耻垢分枝杆菌合并，然后将混合物铺在琼脂皿上。该测定系统基于以下原理：耻垢病菌被D29有效交叉感染，并在耻垢菌细菌坪上形成清晰可见的斑块，从而每个斑块代表最初被D29感染的结核分枝杆菌细胞。因此，该测定定量测量了结核分枝杆菌小池中的D29复制。尽管此方法准确、快速，但该方法对于资源匮乏的环境却过于复杂和繁琐，因为必须在实验室中由训练有素的技术人员来在琼脂平板上形成噬菌斑进行病毒生长的分析。此外，可用于该测定的次级快速生长细菌的数量是有限的，不能定制或修改该测定以筛选大量目标细菌菌种。
类似地，原始萤光素酶报告基因分析(LRA)的变化，例如使用工程改造分枝杆菌噬菌体TM4进行检测的敏感性也受到限制。参见Piuri等人，PLoS One，2009；4(3)：e4870，其中在感染后16小时，氟噬菌体(氟分枝杆菌噬菌体)仅能检测到50％的结核分枝杆菌细胞。而且，由于该测定涉及检测小样品中表达的荧光或发光标记，因此该测定在可以分析的样品类型方面受到限制。
综上所述，目前确认抗药性细菌的方法不能满足当今对多种细菌(包括其混合物)的基于它们所具有的抗性类型的表型分析的有效且实用手段的需求。因此，迫切需要用于筛选特定菌株对抗菌剂的敏感性的测定系统。这种测定技术可以有效地与许多人类和兽医疾病(如泌尿道感染、呼吸道感染、血液感染等)的诊断、治疗和管理相结合。此类系统和测定也可以用于筛选可用于补充工业用微生物(如大肠杆菌、皮氏罗尔斯顿氏菌、肉食链球菌等)的生长的益生菌。
发明内容
因此，本发明的一个目的是提供比现有技术所提供的更廉价、更有效、更具体、更快速、更易访问，以及更好的用于选择性微生物(如细菌)检测的方法和装置。因此，提供了确定细菌对抗生素的抗性的方法和确认微生物种类的方法。该方法利用了噬菌体对其相应宿主细菌的固有特异性。
根据前述内容，实施方式提供了重组噬菌体，构建和生产这种重组噬菌体的方法，以及使用这种重组噬菌体检测目标细菌和/或确定对目标细菌有抗性的药物或抗生素的方法。所述组合物和方法也可以适于在实验室水平或工业规模上筛选可用于酶、激素、抗体、核酸、糖和其他生物分子的生物合成的新的益生菌剂。
根据一个实施方式，能够检测例如细菌的特定类型的产品、试剂盒和方法，例如通过探测特定分子的存在，例如通过检测目标活菌中的标记(例如蛋白质)。一旦确认出抗药性菌株，则该方法可以例如与其他技术结合以确认抗药性机理的分子基础，抗药性机理如基因突变、基因复制、转化、抗生素降解等。包括可通过荧光测定法检测的包含异源水解酶或非编码RNA的基因的重组噬菌体的当前用途达到了上述目的。
在一些实施方式中，提供了一种用于同时确认细菌菌种并确定该细菌菌种对测试抗微生物剂的敏感性的方法，其包括(a)提供对所述细菌菌种特异性的转化噬菌体，其中所述转化噬菌体是具有用于编码标记的基因的工程或重组噬菌体，所述基因对于人类和细菌菌种都是异源的；(b)通过在不存在所述测试抗微生物剂的情况下培养所述细菌菌种，以产生原代无测试抗微生物剂的培养物并在存在所述转化噬菌体的情况下培养所述原代无测试抗微生物剂的培养物来制备第一培养物；(c)通过在存在所述测试抗微生物剂的情况下培养所述细菌菌种以产生原代包含所述测试抗微生物剂的培养物来制备第二培养物；在存在所述转化噬菌体的情况下培养原代包含测试抗微生物剂的培养物；(d)分析所述第一培养物和第二培养物以确定在所述第一培养物和第二培养物中的每一个中的所述标记的水平或活性。
在一些实施方式中，检测所述第一培养物中的所述标记提供了所述细菌菌种作为对所述转化噬菌体是特异性的细菌菌种的阳性确认。
在一些实施方式中，所述第二培养物中的所述标记的水平或活性比与所述第一培养物中的所述标记的水平或活性降低表明所述细菌菌种对所述测试抗微生物剂敏感。
在一些实施方式中，所述第二培养物中的所述标记的水平或活性与所述第一培养物中的所述标记的水平或活性一致或比所述第一培养物中的所述标记的水平或活性增高表明所述细菌菌种对所述测试抗微生物剂不敏感或是对所述测试抗微生物剂具有抗性的。
在一些实施方式中，提供了一种用于确定测试剂对细菌菌种的益生菌作用的方法，该方法包括(a)提供对细菌菌种特异性的转化噬菌体，其中该转化噬菌体是工程改造的或重组的噬菌体，具有用于编码标记的基因，该基因对于人类和细菌菌种都是异源的；(b)通过在不存在测试剂的情况下培养细菌菌种以产生原代无测试剂的培养物并在存在转化噬菌体的情况下培养原代无测试剂的培养物来制备第一培养物；(c)通过在测试剂的存在下培养细菌菌种以产生原代含测试剂的培养物来制备第二培养物；在转化噬菌体的存在下培养原代含测试剂的培养物；(d)分析第一和第二培养物以确定在第一和第二培养物中每一个的标记的水平或活性，其中与第一培养物中的标记的水平或活性相比，第二培养物中的标记的水平或活性增加，表明该测试剂具有益生菌作用。
在一些实施方式中，提供了一种用于筛选测试剂针对目标细菌标本的抗菌活性的方法，其包括(a)提供对目标细菌标本特异性的转化噬菌体，其中所述转化噬菌体是具有编码标记的基因的工程改造或重组噬菌体，该基因对于人类和细菌都是异源的；(b)通过在不存在测试剂的情况下培养目标细菌标本以产生原代无测试剂的培养物并在存在转化噬菌体的情况下培养原代无测试剂的培养物来制备第一培养物；(c)通过在测试剂的存在下培养目标细菌标本以产生原代含测试剂的培养物来制备第二培养物；在转化噬菌体的存在下培养原代含测试剂的培养物；(d)分析第一和第二培养物以确定在第一和第二培养物中的每一个中的标记的水平或活性，其中与第二培养物中的标记的水平或活性相比，第一培养物中的标记的水平或活性降低，表示该测试剂具有抗菌活性。
在一些实施方式中，提供了一种用于确定食物样品中存在或不存在抗生素的方法，该方法包括(a)在多种细菌培养物中培养食物样品，其中第一培养物包含对抗生素敏感的细菌菌种，并且第二培养物包含抗抗生素的相同的细菌菌种，从而产生多种原代培养物；(b)提供对细菌菌种特异性的转化噬菌体，其中该转化噬菌体是具有编码标记的基因的工程改造的或重组噬菌体，该基因对于人类和细菌菌种都是异源的；(c)在存在或不存在对细菌菌种具有特异性并且包含标记的转化噬菌体的情况下培养(a)的原代培养物，从而产生多种继代培养物，其中第一转化的继代培养物来源于包括对抗生素敏感的细菌的培养物，且第二转化的继代培养物包括抗抗生素的转化细菌；(c)分析所述第一和第二转化的继代培养物以确定所述第一和第二转化的继代培养物中每一个的标记的水平或活性，其中与所述第二转化的继代培养物中的标记的水平或活性相比，第一转化的继代培养物中的标记的水平或活性降低，表明食品样品包含抗生素。
在一些实施方式中，提供了一种用于确定抗细菌剂对目标细菌标本的最小抑制浓度(MIC)的方法，其包括(a)提供对细菌标本特异性的转化噬菌体，其中所述转化噬菌体是具有编码标记的基因的工程改造的或重组噬菌体，该基因对人类和细菌标本都是异源的；(b)通过在不存在抗菌剂的情况下培养目标细菌标本以产生原代培养物，然后在转化噬菌体的存在下培养原代培养物来制备对照培养物；(c)通过制备包含目标细菌标本和抗菌剂的多种实验培养物来制备实验组，其中所述抗生素的浓度在实验培养物之间变化，然后在转化噬菌体的存在下培养实验培养物；(d)分析来自实验组和对照培养物的培养物，以确定标记在实验组和对照培养物的培养物中的水平或活性，其中与对照培养物中的标记的阈值水平或活性相比，抗菌剂能够降低该标记的水平或活性时的最低浓度是指示试剂对目标细菌样本的最小抑制浓度。
在一些实施方式中，提供了一种用于在需要的受试者中诊断和治疗细菌性疾病的方法，其包括：(a)提供包含细菌菌种的受试者样品；(b)培养受试者样品以产生多种原代细菌培养物；(c)提供多个转化噬菌体，每个转化噬菌体都对不同的细菌菌种具有特异性，其中每个转化噬菌体是具有编码独特标记的基因的工程或重组噬菌体，该基因对于人类和细菌都是异源的；(d)在(c)的转化噬菌体的存在下培养(a)的原代细菌培养物以提供多个继代细菌培养物，其中所述转化噬菌体在所述继代细菌培养物之间变化；(e)分析继代细菌培养物以确定继代细菌培养物中独特标记的存在或不存在；(f)将独特标记的检测与细菌菌种的存在相关联；(g)将细菌菌种的存在与细菌性疾病相关联；(h)可选地对受试者施用对所检测的细菌菌种具有特异性的抗生素，从而治疗细菌性疾病。
在上述方法的一些实施方式中，细菌菌种或目标细菌样品选自由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌组成的组。
在上述方法的一些实施方式中，细菌选自由下述组成的组：鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、布鲁氏菌(Brucella aborus)、狗布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucellamelitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风杆菌(Clostridiumtetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、耐万古霉素的粪肠球菌(vancomycin-resistantEnterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC))、进入致病性大肠杆菌(enter opathogenic Escherichia coli)、大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157.H7)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、变形杆菌(Proteus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次氏菌(Rickettsia rickettsii)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA))、耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus(VSA))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)和鼠疫杆菌(Yersinia pestis)或其组合。
在上述方法的一些实施方式中、细菌选自表1至3中列出的细菌。在上述方法的一些实施方式中，细菌选自由炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)组成的组。
在上述方法的一些实施方式中，噬菌体是裂解性或生产性噬菌体；温和或溶原性噬菌体；或丝状噬菌体。
在上述方法的一些实施方式中，所述噬菌体是选自由T4、T7、T3和MS2组成的组的裂解性或生产性噬菌体。
在上述方法的一些实施方式中，所述温和或溶原性噬菌体是λ噬菌体。
在以上方法的一些实施方式中，所述噬菌体是选自由f1、fd和M13组成的组的丝状噬菌体。
在上述方法的一些实施方式中，可以使用各种噬菌体的组合来实施该方法。
在上述方法的一些实施方式中，所述基因是真菌、植物或昆虫来源的。
在上述方法的一些实施方式中，标记是水解酶。在一些实施方式中，所述水解酶选自由纤维素酶、角质酶、酯酶、脂肪酶、磷酸酯酶、限制性核酸内切酶和蛋白酶组成的组。在一些实施方式中，水解酶选自由胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、弹性蛋白酶、DNase I、分散酶、纤溶酶、菠萝蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、神经氨酸酶、磷脂酶、胆固醇酯酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、纤维蛋白溶酶、沙雷菌蛋白酶、胰酶、淀粉酶、溶菌酶、组织蛋白酶-G、碱性和酸性磷酸酶、酯酶、脱羧酶、磷脂酶D、P-木糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶、硫代葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酸酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-果糖呋喃糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酸苷酶和PMN白细胞丝氨酸蛋白酶组成的组。
在一些实施方式中，分析培养物以确定所述水解酶的水平或活性包括检测对所述水解酶特异性的底物的水解。在一些实施方式中，所述底物是分子内淬灭的荧光团或分子内淬灭的发色团。在一些实施方式中，所述分子内淬灭的荧光团或分子内淬灭的发色团是具有下式的化合物：
Q-S-F
其中，
S包含对水解酶特异性的底物；
F是荧光团、化学发光分子或发色团；和
Q是淬灭剂；
其中S在Q和F之间形成链，并且S的水解切断所述链，从而减轻了Q对F的淬灭作用。
其中，
在一些实施方式中，F是发色团，并且检测所述底物的水解包括检测可目视颜色变化或获取比色或光谱学读数。在一些实施方式中，F是荧光团，并且检测所述底物的水解包括检测荧光或获取荧光读数。在一些实施方式中，F选自由Alexa 405、FAM、Cy3以及Cy 5组成的组，并且Q选自由DABCYL、BHQ-1、BHQ-2以及BHQ-3组成的组。在一些实施方式中，F是化学发光分子，并且检测所述底物的水解包括进行化学发光测定。
在一些实施方式中，所述底物包含核酸序列，并且所述水解酶是对所述核酸序列特异性的限制性核酸内切酶。在一些实施方式中，所述底物包含多肽，所述水解酶是蛋白酶，并且所述多肽对所述蛋白酶是特异性的。
在一些实施方式中，所述标记是与人类和所述目标物种都异源的非编码核糖核酸(RNA)。在一些实施方式中，非编码RNA是自剪接的。在一些实施方式中，非编码RNA包含两个或更多个剪接的内含子。
在一些实施方式中，分析培养物以确定所述非编码RNA的水平或活性包括扩增所述非编码RNA。在一些实施方式中，通过逆转录酶解旋酶依赖性扩增(RT-HDA)扩增所述非编码RNA，从而产生对应于所述非编码RNA的互补脱氧核糖核酸(cDNA)扩增子。在一些实施方式中，所述非编码RNA被扩增至少约10,000倍、至少约100,000倍、至少约1×106倍、至少约1×107倍、至少约1×108倍、至少约1×109倍、或至少约1×1010倍。
在一些实施方式中，分析培养物以确定非编码RNA的水平或活性还包括经由与所述cDNA扩增子特异性结合的分子内淬灭的探针检测所述cDNA扩增子。在一些实施方式中，所述分子内淬灭的探针在与对应于所述非编码RNA的剪接点的位点重叠的区域结合所述cDNA扩增子。在一些实施方式中，所述分子内淬灭的探针包含荧光团，所述荧光团经由长度为约15至约30个碱基的核酸接头与淬灭剂连接。在一些实施方式中，检测cDNA扩增子还包括通过使RNase与所述分子内淬灭的探针接触而使所述荧光团与所述淬灭剂断开连接。在一些实施方式中，RNase是RNase HII。在一些实施方式中，分析培养物以确定非编码RNA或cDNA扩增子的水平或活性还包括检测荧光或获取荧光团的荧光读数。
在上述方法的一些实施方式中，该方法可以进一步包括通过检测继代标记来验证检测结果，该继代标记是选自由DNA、RNA或其组合组成的组的核酸。在验证初始检测的此类实施方式中，可以通过凝胶电泳、核酸扩增技术(例如聚合酶链反应(PCR)、定量聚合酶链反应(qPCR)或其组合)来检测继代核酸标记。
附图说明
在附图/表和以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施方式的细节。根据附图/表和具体实施方式以及根据权利要求书，本发明的其他特征、目的和优点将是明显的。
图1显示了如本文所述的分子内淬灭底物的示例性图示。
具体实施方式
本文所述的实施方式提供了使用重组噬菌体来诊断或检测细菌感染原(infectious agent)和疾病的方法和检测。该方法适用于细菌感染原的检测，也适合于确定这种感染原的耐药性。另外，该方法用于提供有关感染原对抗微生物剂的敏感性的信息。
A.传染性细菌
基本上可以检测到任何细菌，并且所述方法和组合物可以用于确定细菌的抗生素敏感性或用于筛选对目标细菌产生期望的(例如，抗微生物或细胞毒性)作用的候选抗生素。
在一个实施方式中，细菌是革兰氏阴性菌。典型的革兰氏阴性菌包括诸如大肠杆菌、沙门氏菌、假单胞菌和幽门螺杆菌以及蓝细菌的蛋白细菌。当与药物分类时，革兰氏阴性菌包括会引起呼吸系统紊乱的绿脓杆菌和流感嗜血杆菌、引起泌尿系统紊乱的大肠杆菌和变形杆菌、引起消化系统紊乱的幽门螺杆菌和格特纳杆菌、和微球菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌、卡他莫拉菌(引起例如中枢神经系统紊乱)和淋病奈瑟菌(引起生殖系统紊乱))。
在另一个实施方式中，细菌是革兰氏阳性菌。“革兰氏阳性菌”是指在其细胞壁内含有一种或多种磷壁酸(例如脂磷壁酸和/或壁磷壁酸)或功能上等效的含糖共聚物(如鼠李糖多糖、四糖醛酸、阿拉伯半乳聚糖、脂甘露糖和脂阿拉伯甘露糖)的一种或多种细菌。功能上等效的含糖共聚物的非限制性实例在Weidenmaier等人，Nature，6：276-287，2008中描述。功能上等效的含糖共聚物的其他实例是本领域已知的。在一些实施方式中，使用革兰氏染色法(如通常包括用结晶紫染色、用碘溶液处理、用酒精脱色和用番红花复染色的步骤，其中革兰氏阳性菌保留紫罗兰色)确认革兰氏阳性菌。本文描述了革兰氏阳性菌的非限制性实例。革兰氏阳性菌的其他实例是本领域已知的。本文描述了用于检测或确认革兰氏阳性菌的示例性方法。用于检测或确认革兰氏阳性菌的其他方法是本领域已知的。
目标细菌包括感染哺乳动物宿主(例如牛、鼠、马、灵长类、猫、犬和人宿主)的病原细菌。在一个实施方式中，细菌在人宿主中感染和/或引起疾病。此类病原细菌的实例包括诸如下述的细菌菌种的成员：拟杆菌、梭菌、链球菌、葡萄球菌、假单胞菌、嗜血杆菌、军团菌、分枝杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、弧菌或李斯特氏菌。在人类宿主中引起疾病的致病细菌的临床相关示例包括但不限于炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)、布鲁氏菌(Brucella aborus)、狗布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、耐万古霉素的粪肠球菌(vancomycin-resistant Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichiacoli(ETEC))、进入致病性大肠杆菌(enter opathogenic Escherichia coli)、大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157.H7)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、变形杆菌(Proteus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次氏菌(Rickettsia rickettsii)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcus aureus(MRSA))、耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistantStaphylococcus aureus(VSA))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和鼠疫杆菌(Yersinia pestis)。
在另一个实施方式中，感染细菌选自由艰难梭菌、耐碳青霉烯的肠杆菌科细菌(CR-Klebsiella spp；CR-E.coli)和淋病奈瑟氏球菌。在另一个实施方式中，传染性细菌选自由下述组成的组：抗多药性不动杆菌、抗药性弯曲杆菌、广谱产β-内酰胺酶(ESBL)的肠杆菌、耐万古霉素的肠球菌、抗多药性绿脓杆菌、抗药性非伤寒沙门氏菌、抗药性肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica serovar Typhi)、抗药性志贺氏菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)、抗药性肺炎链球菌和抗药性结核分枝杆菌。在另一个实施方式中，所述感染细菌选自耐万古霉素的金黄色葡萄球菌、耐红霉素的A组链球菌、耐克林霉素的B组链球菌。
在某些实施方式中，感染原天然存在于宿主受试者中。在另一个实施方式中，感染原是宿主对象外来的侵入物种。优选地，宿主是哺乳动物，例如哺乳动物、啮齿动物、人类、牲畜，伴侣动物或非家养或野生动物。在一个实施方式中，受试者可以是啮齿动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠等。在另一个实施方式中，受试者可以是家畜。合适的家畜的非限制性实例可包括猪、牛、马、山羊、绵羊、美洲驼和羊驼。在另一个实施方式中，受试者可以是伴侣动物。伴侣动物的非限制性例子可以包括宠物，例如狗、猫、兔子和鸟。在又一个实施方式中，受试者可以是动物。正如本文中使用的，“动物学上的动物”是指可以在动物园中发现的动物。这样的动物可能包括非人类的灵长类动物、大型猫、狼和熊。在一个示例性的实施方式中，受试者是人类。
该方法可用于分析各种样品中所含的传染原，包括如生物样品、研究测试样品、环境样品(例如水样品，包括选自自然水体、池塘、社区蓄水池、娱乐用水、游泳池、漩涡浴池、热水浴缸、温泉、水上乐园、自然存在的淡水和海洋地表水的水样品)和工业样品(例如发酵接种物(例如乳酸菌)、化学试剂、培养基、清洁溶液)。
优选地，样品是包含体液(例如痰、眼泪、唾液、汗水、粘液、血清、精液、尿液、粪便、呕吐物和血液)的生物样品。在一些实施方式中，样品可以包括例如脑脊髓液(CSF)、血浆、血清、淋巴液、肺灌洗液、胸膜液等。在一些实施方式中，可以使用任何已知的装置或方法从受试者获得样品，例如拭子、尿道导管、抽吸器、皮下注射针头、细针活检、空心针活检、穿孔活检、代谢笼和注射器。
在一些实施方式中，生物样品被加工用于本文所述的方法。作为非限制性示例，将痰液或气道表面液(ASF)收集在适当的容器(例如无菌标本瓶)中。使用例如乙腈将样品增溶至终浓度约60％，使用三氟乙酸增溶至终浓度约0.1％，或使用N-乙酰基半胱氨酸。
在某些实施方式中，可以操纵生物样品以培养其中所含的细菌。术语“培养物”是指培养的细胞、培养物上清液、其混合物或使用液体培养基的培养物滤液。如果使用固体培养基，则术语“培养物”是指细胞与细胞在其上生长的培养基的混合物。例如，如果使用液体培养基，则可以通过以下步骤从培养混合物中回收标记(marker)。当实现细菌完全生长时，将培养混合物用抗生素和/或噬菌体处理。可以通过包括离心或过滤的一个或多个洗涤和/或分离步骤来介入这样的下游过程，以便获得不含污染物的粗制细菌制剂。可以在细胞水平(例如原位)或对培养物进行进一步处理后检测或分析标记。例如，其中标记是胞质溶胶中的蛋白质或DNA，可以通过使用诸如研磨或超声处理的合适方法破坏细胞来提取它们。可以在培养基中直接对细胞进行超声处理以破坏细胞，并且可以通过从处理过的溶液中去除任何不溶物来获得粗制酶溶液。
如果在固体培养基上进行培养，则可以通过以下操作首先对培养物进行分析：将水加入到含有培养细胞的固体培养基中，并立即从混合物中除去任何不溶物，或在通过合适的手段(例如超声处理)破坏细胞后从混合物中除去任何不溶物。可以通过常规纯化技术，例如有机溶剂分级分离、硫酸铵分级分离、渗析、等电沉淀和柱色谱法，从粗制裂解物中分离粗制标记制剂，它们可以单独使用或结合使用。标记的水平或活性可以使用常规方法确定，例如用于酶样标记的酶促确定、核酸杂交和/或核酸扩增等。
根据目的，可以使用常规技术来分析细胞培养物。例如，可以将细菌培养到对数期(MSSA USA300和MRSA USA300)，并且可以使用常规技术(如分光光度法)来检测峰值对数期。对数期细菌的使用可能是优选的，由于粘附素的表达更高，所以对数期细菌可能更粘附，并且与固定相细胞相比，对数期细菌的肽聚糖层的交联程度和厚度都较小，并且细胞的代谢活性更强，允许更快地响应损伤。但是，最佳条件可能因菌株而异。由于在临床环境中经常会遇到不同的菌株，因此该信息对于评估诊断方法的实用性很重要。尽管在此考虑到菌株将具有可变性，但是可以预料细菌将表现出足够相似的行为，以允许使用单一方案来测试所有菌株。这种期望是基于这样的事实，即细菌家族(例如葡萄球菌)在遗传上彼此非常相似，因此具有相似的细胞结构，这将是它们对特定噬菌体反应性的主要组成部分。
在一些实施方式中，所述方法和组合物可用于确定微生物(例如细菌)的敏感性。正如本文中使用的，术语“敏感性”是指细菌细胞受抗生素影响的程度。即该细胞可能根本不受影响、可能使其生长和增殖减慢或停止而没有被杀死、或者可能被杀死。敏感性还指细菌菌种或菌株的种群受抗生素影响的程度。在这种情况下，种群中某些高度敏感的细胞可能非常敏感，并可能被极低浓度的抗生素杀死，其他不太敏感的细胞则可能生长和增殖变慢，而其他细胞则根本不受影响。
在相关的实施方式中，该方法和组合物可用于确认微生物(例如细菌)对抗微生物剂或抗生素的抗性。术语“对抗生素具有抗性”在本文中是指与衍生菌株的相应野生型菌株相比，特定的细菌菌株(通常是突变菌株)没有被杀死，或者杀死的速度明显更慢。抗药性还可以通过突变和野生型菌株的生长特性改变来反映。例如，培养基中低浓度的抗生素将阻止或显著降低野生型菌株的生长，而突变菌株的生长不受影响。可以使用常规技术确定抗性菌株的表型(例如改变的生长、细胞分裂、代谢、生物膜产生、毒力等)，例如在相同条件下生长野生型和突变菌株以评估所测量参数的变化。敏感菌株可用作抗性评估(阳性对照)的参考标准。
在一个实施方式中，该方法通过在存在和不存在抗生素的情况下培养细菌样品来进行。可以修改或调节培养基或发酵培养基以满足各个菌株的需求。美国细菌学会(华盛顿特区，美国，1981)的“Manual of Methods for General Bacteriology”中介绍了各种微生物的培养基。术语培养基(culture medium)和发酵培养基或培养基(medium)可以互换。
从最简单的意义上讲，培养基包含至少一种碳源(例如葡萄糖)和至少一种氮源(例如硝酸盐)，以及可选地与磷源一起，例如磷酸、磷酸钾或其他磷酸盐。优选地，将培养基缓冲用于细菌生长。培养基可另外包含盐，诸如金属(例如钠、钾、镁、钙和铁)的氯化物或硫酸盐，，例如硫酸镁或硫酸铁，它们促进生长和/或代谢活性。最后，根据需要，可以向培养基中添加基本的生长因子，例如氨基酸(例如高丝氨酸)和维生素(例如硫胺素、生物素或泛酸)。参见美国专利号9,074,229。
将含有细菌的起始样品在培养期间以单批的形式添加到培养物中，或者以合适的方式进料，如每2至4小时或每1至3小时，或每1、2、3或4小时。
培养物的pH可以通过以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或酸性化合物例如磷酸或硫酸来控制。通常将pH调节至6.0至8.5，优选6.5至8。为了控制起泡，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持细菌的稳定性，可以向培养基中添加合适的选择性物质，例如诱导剂，例如异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)。发酵优选在有氧条件下进行。为了维持这些条件，将氧气或含氧气的气体混合物(例如空气)引入培养物中。在分批或补料分批工艺中，优选继续培养直至达到所需的微生物密度。检测是通过分光光度法(吸收、荧光)进行的。该目标通常在2个小时到160个小时内实现。在连续过程中，可能需要更长的培养时间。微生物的活性导致发酵培养基和/或微生物细胞中各种标记的浓缩(积累)。
合适的发酵培养基的示例尤其可见于美国专利号5,770,409、5,275,940、5,827,698、5,756,345；以及WO 2007/012078以及WO 2009/043803。
B.抗生素
前述培养基可以补充有抗生素或没有抗生素。正如本文中使用的，术语“抗生素”或“抗微生物剂”是指抑制微生物生长或破坏微生物的物质。优选地，抗生素可用于抑制感染原的毒力和/或治疗传染病。抗生素也指半合成物质，其中由微生物(如酵母或真菌)产生的天然形式，随后进行结构修饰。
在另一个实施方式中，可以在培养基中添加或不添加益生菌物质。正如本文中使用的，术语“益生菌”是指促进微生物的生长或代谢活性的物质，例如微量营养素、生长诱导剂物质或除毒素物质。
优选地，抗生素选自β-内酰胺类(包括β-内酰胺酶抑制剂和头孢菌素)，氟喹诺酮类、氨基糖苷类、四环素和/或甘氨酰环素和/或多粘菌素。也可以测试抗微生物剂的任何组合，例如至少一种β-内酰胺和至少一种氟喹诺酮；至少一种氨基糖苷和一种头孢菌素；至少一种β-内酰胺和一种β-内酰胺酶抑制剂，可选地与氨基糖苷等一起。
正如本文中使用的，术语“β-内酰胺”是指在其分子结构中包含β-内酰胺环的任何抗生素剂。代表性示例包括天然和半合成的青霉素和青霉素衍生物、克拉维酸、碳青霉烯类、头孢菌素、头孢霉素和单环菌素。这些药物被广泛称为“β-内酰胺酶”的酶代谢。β-内酰胺酶分为四个分子类别(A、B、C和D)。A类酶优先水解青霉素；B类酶包括金属酶，其底物谱比其他酶宽；C类酶负责革兰氏阴性菌对多种抗生素的抗性；和D类酶是丝氨酸水解酶，具有独特的底物特征。
通常，β-内酰胺根据其核心环结构分类和分组，其中每组可分为不同类别。术语“杂环体系(penam)”用于描述青霉素抗生素成员，例如含有噻唑烷环的β-内酰胺的核心骨架。青霉素可包括窄谱青霉素，例如苄星青霉素、苄青霉素(青霉素G)、苯氧甲基青霉素(青霉素V)、普鲁卡因青霉素和奥沙西林。窄谱耐青霉素酶的青霉素，例如甲氧西林、双氯西林和氟氯西林。耐窄谱β-内酰胺酶的青霉素可能包括替莫西林。中光谱的青霉素包括例如阿莫西林和氨苄青霉素。广谱的青霉素包括co-amoxiclav(阿莫西林+克拉维酸)。最后，青霉素组还包括扩展光谱的青霉素，例如阿洛西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林和哌拉西林。合成的青霉素衍生物包括例如法罗培南。
含有吡咯烷环的β-内酰胺称为碳青霉烯。碳青霉烯类包括：比阿培南、多立培南、厄他培南、亚胺培南、美洛培南、帕尼培南和PZ-601。
头孢菌素和头孢霉素包括头孢氨苄、头孢菌素、头孢唑林、头孢克洛、头孢呋辛、头孢曼多、头孢替坦、头孢西丁、头孢噻肟和头孢泊肟。对革兰氏阳性菌有活性的第四代头孢菌素包括头孢吡肟和头孢哌酮。头孢菌素类可进一步包括：头孢氨苄、头孢克肟、头孢吡唑、头孢氨苄、头孢菌素、头孢呋辛、头孢曼多尔、头孢吡肟和头孢吡酮。头霉素包括例如头孢西丁、头孢替坦、头孢美唑和氟莫昔芬。
碳头孢烯的一个例子是洛拉卡培。对革兰氏阴性菌有活性的单环菌素包括例如替吉莫南、诺卡汀A和野火菌毒素(tabtoxin)。合成的头孢包括例如棒酸和草丁香，例如莫拉西坦和氟莫昔芬。
氟喹诺酮类通过抑制细菌DNA复制所必需的酶起作用。代表性的例子包括环丙沙星、加仑沙星、加替沙星、吉非沙星、左氧氟沙星和莫西沙星。
氨基糖苷具有针对大多数革兰氏阴性需氧和兼性厌氧杆菌的杀菌活性。代表性例子包括例如卡那霉素、阿米卡星、妥布霉素、地贝卡星、庆大霉素、西索米星、奈替米星、新霉素B、新霉素C、新霉素E(巴龙霉素)和链霉素，包括合成衍生物克拉霉素和阿奇霉素。
四环素是具有八氢并四苯-2-甲酰胺骨架的聚酮的一类。它们可以是天然存在的(如四环素、金霉素、土霉素、地美环素)或半合成的(如莱莫环素、甲氯环素、甲环素、米诺环素、四氟环素)。甘氨酰环素(如米诺环素/替加环素)衍生自四环素。
多粘菌素是对革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌和绿脓杆菌)具有活性的多肽抗生素。临床上仅使用多粘菌素B和多粘菌素E(colistin)。
在实践方法中，可以向培养基补充一种或多种上述抗生素。抗生素的浓度可以根据抗生素和所测试菌株的类型而变化。优选地，抗生素的剂量等于或大于特定抗生素对特定菌株的最小抑制浓度(MIC)。确定MIC的方法是本领域已知的(参见Andrews等人，JAntimicrob Chemother.，48Suppl 1：5-16，2001)。European Committee forAntimicrobial Susceptibility Testing(EUCAST)报告的表3中显示了四种细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和粪肠球菌)上约40种抗微生物剂的MIC代表性图表，标题为“通过肉汤稀释法确定抗细菌剂的最低抑菌浓度(MIC)”(European Society of ClinicalMicrobiology and Infectious Diseases CMI，9、1-7，2003)。
通常，可以增加抗生素的浓度以确认或检测抗性菌株，例如增加至超过基线MIC的至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少300倍或甚至1000倍。这在已知目标细菌和细菌上抗生素的MIC的情况下特别有效。例如对于大肠杆菌，大多数抗生素的MIC可以在约0.01mg/L至约10mg/L的范围内；然而，直到增加浓度，例如比基准水平高10倍(即1个对数倍)至1000倍(即3个对数倍)，抗性菌株才可能不是敏感的。在这方面，最终的抗生素浓度可以相应地调节。
纯粹出于说明性目的，可以采用以下剂量-为了测试细菌对诸如阿莫西林的β-内酰胺的抗性，其浓度范围可以从约2mg/L至约40mg/L，特别是从约5mg/L至约20mg/L。参见美国专利号9,347,888。另一方面，为了测试细菌对氯西林的抗性，该浓度可以在约25mg/L至约300mg/L的范围内。对于碳青霉烯，浓度范围为0.05至32mg/L。对于法罗培南，这包括约2mg/L至约32mg/L的范围；对于多利培南，其范围从约0.05mg/L至约2mg/L的范围(参见Woodman等人，J Med Microbiol.，19(1)：15-23，1983)。对于头孢菌素，浓度范围可以在约1mg/L至约20mg/L之间，优选在约4mg/L至约16mg/L之间(参见Waterworth，J Clin Pathol，35：1177-1180，1982)。
更具体地，抗生素可以以0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、3μg/mL、4μg/mL、5μg/mL、6μg/mL、7μg/mL、8μg/mL、9μg/mL、10μg/mL、11μg/mL、12μg/mL、13μg/mL、14μg/mL、15μg/mL、16μg/mL、17μg/mL、18μg/mL、19μg/mL、20μg/mL、21μg/mL、22μg/mL、23μg/mL、24μg/mL、25μg/mL、26μg/mL、27μg/mL、28μg/mL、29μg/mL、30μg/mL、31μg/mL、32μg/mL、33μg/mL、34μg/mL、35μg/mL、36μg/mL、37μg/mL、38μg/mL、39μg/mL、40μg/mL、41μg/mL、42μg/mL、43μg/mL、44μg/mL、45μg/mL、50μg/mL、60μg/mL、70μg/mL、80μg/mL、90μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、250μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL或更高的任一个浓度使用。例如，亚胺培南和厄他培南可以以50、30、20、15、10、5和1μg/mL的浓度使用。可以类似地调整抗生素的组合的剂量，例如首先确定野生型菌株的MIC(组合的试剂)，然后逐渐增加剂量以确认抗药性菌株。
将细菌在存在或不存在抗生素的条件下培养特定的时间段，如0到2小时之间、2到160小时之间，尤其是8到24小时之间，尤其是10到16小时之间。在与噬菌体接触之前，细菌可以处于其生长期或静止期。生长期是一个以细胞倍增为特征的时期，其中培养物中的细胞数量呈指数增长。固定相既是由于新细菌的生长，又是衰老细胞的死亡，这通常是由于生长限制因素(例如必需营养素的消耗或废物的积累)引起的。优选地，细菌在接种噬菌体之前处于生长期。确定细菌生长阶段的方法是本领域已知的。参见Hall等人，Mol Biol Evol，31(1)：232-8，2014。
在一个实施方式中，在接种噬菌体之前，用抗生素处理细菌。原代培养物可以在接种前可选地洗涤，如用洗涤缓冲液。取决于存活的培养物的密度，可以在已经接种噬菌体的新鲜的天然培养基(或含抗生素的培养基)中重新生长原代培养物或其洗涤团粒(在对原代培养物进行离心后获得)。
在另一个实施方式中，在用抗生素剂处理的同时，用噬菌体接种细菌。该实施方式可以特别适合于非裂解性噬菌体。
C.噬菌体
本发明方法的实施方式利用宿主特异性噬菌体。正如本文中使用的，术语“噬菌体”具有如本领域中所理解的其常规含义，如选择性感染一种或多种细菌的病毒。许多噬菌体对特定的细菌属或物种或菌株具有特异性。术语“噬菌体(bacteriophage)”与术语“噬菌体(phage)”同义。噬菌体可以包括但不限于属于以下任何病毒家族的噬菌体：覆盖噬菌体(Corticoviridae)、囊状噬菌体(Cystoviridae)、丝状噬菌体(Inoviridae)、轻小噬菌体(Leviviridae)、微小噬菌体(Microviridae)、肌尾噬菌体(Myoviridae)、短尾噬菌体(Podoviridae)、长尾噬菌体(Siphoviridae)或复盖噬菌体(Tectiviridae)。噬菌体可以是裂解性噬菌体或温和噬菌体或丝状噬菌体。裂解性噬菌体是通过经由裂解途径完成裂解循环而不是进入溶原性途径的噬菌体。裂解性噬菌体经历病毒复制，导致细胞膜裂解，细胞破坏以及释放能够感染其他细胞的子代噬菌体颗粒。温和噬菌体是一种能够进入溶原性途径的噬菌体，在该途径中，噬菌体在其裂解周期完成之前就成为细胞基因组的休眠、被动部分。丝状噬菌体包含包装成长丝的环状单链脱氧核糖核酸(ssDNA)基因组。这些噬菌体不会通过裂解细菌而繁殖。相反，它们被隐藏到环境中而不会杀死宿主。
在一个实施方式中，噬菌体是裂解性或生产性噬菌体(如T4、T7、T3和MS2)。在另一个实施方式中，噬菌体是温和或溶原性噬菌体(如λ噬菌体)。在另一个实施方式中，噬菌体是丝状噬菌体(例如f1、fd和Ml3)。也可以使用各种噬菌体的组合。噬菌体展示技术在本领域是已知的，如美国专利号8,685,893；美国专利号7,811,973；美国专利公开号2002-0044922。优选地，噬菌体能够转化宿主细菌。正如本文中使用的，术语“转化”是指将DNA引入宿主细胞，使得DNA可以作为染色体外要素或通过染色体整合而复制。即，转化是指通过将外源DNA引入细胞来合成基因的改变。如本领域所公知的，大多数细菌的DNA包含在单个环状分子中，称为细菌染色体和一个或多个质粒。
噬菌体是工程改造的或重组的噬菌体，其用作天然噬菌体外源基因的载体。正如本文中使用的，术语“重组噬菌体”或“工程改造的噬菌体”是包含非天然存在的核酸序列或具有由两个以其他方式分离的序列区段的人工组合制成的序列的核酸序列。这种人工结合可以通过化学合成或人工分离核酸的片段来完成，例如通过基因工程技术或使用DNA转座。类似地，重组蛋白是由重组核酸分子编码的蛋白。术语重组噬菌体包括仅通过插入核酸，例如通过插入编码充当报告分子或指示分子的异源蛋白质的核酸而改变的噬菌体。
在某些实施方式中，噬菌体是纯化的噬菌体。术语“纯化”不需要绝对的纯度。相反，它旨在作为一个相对术语。纯化分子是其中分子比其自然环境中更富集的分子，例如其中分子占样品中相似分子总含量的至少50％、至少60％、至少80％、至少90％、至少99％或更高含量。例如，纯化的重组噬菌体样品是其中重组噬菌体代表样品中所有噬菌体的至少50％的样品。
在以下段落中给出了致病细菌属及其已知的宿主特异性噬菌体的列表，并且在表1至3中提供了优选类型的细菌-噬菌体对。括号中表示同义词和拼写变体。同名如其出现的频率重复(如D、D、d)。未命名的噬菌体在其属旁边用“NN”表示。
放线菌属的细菌被以下噬菌体感染：Av-1、Av-2、Av-3、BF307、CT1、CT2、CT3、CT4、CT6、CT7、CT8和1281。
气单胞菌属的细菌被以下噬菌体感染：AA-1、Aeh2、N、PM1、TP446、3、4、11、13、29、31、32、37、43、43-10T、51、54、55R 1、56、56RR2、57、58、59.1、60、63、Aehl、F、PM2、1、25、31、40RR2.8t、(syn＝44R)、(syn＝44RR2.8t)、65、PM3、PM4、PM5和PM6。
芽孢杆菌属的细菌被以下噬菌体感染：A、aizl、Al-KI、B、BCJA1、BC1、BC2、BLL1、BL1、BP142、BSL1、BSL2、BS1、BS3、BS8、BS15、BS18、BS22、BS26、BS28、BS31、BS104、BS105、BS106、BTB、B1715V1、C、CK-1、Coll、Corl、CP-53、CS-1、CS1、D、D、D、D5、entl、FP8、FP9、PS1、FS2、FS3、FS5、FS8、FS9、G、GH8、GT8、GV-1、GV-2、GT-4、g3、gl2、gl3、gl4、gl6、gl7、g21、g23、g24、g29、H2、kenl、KK-88、Kuml、Kyul、J7W-1、LP52、(syn＝LP-52)、L7、Mexl、MJ-1、mor2、MP-7、MP10、MP12、MP14MP15、Neol、No 2、N5、N6P、PBC1、PBLA、PBP1、P2、Sa、SF2、SF6、Shal、Sill、SP02、(syn＝ΦSPP1)、SΡβ、STI、ST1、SU-11、t、Tb1、Tb2、Tb5、Tb10、Tb26、Tb51、Tb53、Tb55、Tb77、Tb97、Tb99、Tb560、Tb595、Td8、Td6、Tdl5、Tgl、Tg4、Tg6、Tg7、Tg9、Tgl10、Tgl1、Tgl5、Tg21、Tinl、Tin7、Tin8、Tinl3、Tm3、Tocl、Togl、toll、TP-1、TP-10vir、TP-15c、TP-16c、TP-17c、TP-19、TP35、TP51、TP-84、Tt4、Tt6、类型A、类型B、类型C、类型D、类型E、
Figure BDA0002518693810000251
VA-9、W、wx23、wx26、Yunl、α、γ、ρ11、
Figure BDA0002518693810000252
Figure BDA0002518693810000253
1Α、IB、1-97A、1-97B、2、2、3、3、3、5、12、12、14、20、30、35、36、37、38、41C、51、63、64、138D、I、II、IV、NN-Bacillus(13)、alel、AR1、AR2、AR3、AR7、AR9、Bace-11、(syn＝11)、Bastille、BL1、BL2、BL3、BL4、BL5、BL6、BL8、BL9、BP124、BS28、BS80、Ch、CP-51、CP-54、D-5、darl、denl、DP-7、ent2、FoS1、FoS2、FS4、FS6、FS7、G、gall、γ、GEI、GF-2、GS1、GT-1、GT-2、GT-3、GT-4、GT-5、GT-6、GT-7、GV-6、gl5、19、110、IS1、K、MP9、MP13、MP21、MP23、MP24、MP28、MP29、MP30、MP32、MP34、MP36、MP37、MP39、MP40、MP41、MP43、MP44、MP45、MP47、MP50、NLP-1、No.1、N17、N19、PBS1、PK1、PMB1、PMB12、PMJ1、S、SPO1、SP3、SP5、SP6、SP7、SP8、SP9、SP10、SP-15、SP50、(syn＝SP-50)、SP82、SST、subl、SW、Tg8、Tgl2、Tgl3、Tgl4、thul、thu4、thu5、Tin4、Tin23、TP-13、TP33、TP50、TSP-1、类型V、类型VI、V、Vx、β22、
Figure BDA0002518693810000254
Figure BDA0002518693810000255
1、1、2、2C、3NT、4、5、6、7、8、9、10、12、12、17 18、19、21、138、III、4(B.megaterium)、4(B.sphaericus)、AR13、BPP-10、BS32、BS 107、B1、B2、GA-1、GP-10、GV-3、GV-5、g8、MP20、MP27、MP49、Nf、PP5、PP6、SF5、Tgl 8、TP-1、Versailles、
Figure BDA0002518693810000256
1-97、837/IV、NN-Bacillus(1)、Bat10、BSL10、BSL11、BS6、BS11、BS16、BS23、BS101、BS 102、gl 8、morl、PBL1、SN45、thu2、thu3、Tml、Tm2、TP-20、TP21、TP52、F型、G型、IV型、NN-Bacillus(3)、BLE、(syn＝θc)、BS2、BS4、BS5、BS7、B10、B12、BS20、BS21、F、MJ-4、PBA12、AP50、AP50-04、AP50-11、AP50-23、AP50-26、AP50-27和Bam35。以下芽孢杆菌特异性噬菌体是有缺失的：DLP10716、DLP-11946、DPB5、DPB12、DPB21、DPB22、DPB23、GA-2、M、No.1M、PBLB、PBSH、PBSV、PBSW、PBSX、PBSY、PBSZ、phi、SPα、类型1和μ。
拟杆菌属的细菌被以下噬菌体感染：adl2、Baf-44、Baf-48B、Baf-64、Bf-1、Bf-52、B40-8、F1、β1、
Figure BDA0002518693810000261
11、67.1、67.3、68.1、NN-Bacteroides(3)、Bf42、Bf71和BF-41。
博德特氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：134和NN-Bordetella(3)。
博雷利亚属的细菌被以下噬菌体感染：NN-Borrelia(1)和NN-Borrelia。
布鲁氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：A422、Bk、(syn＝Berkeley)、BM29、FO1、(syn＝F01)、(syn＝FQl)、D、FP2、(syn＝FP2)、(syn＝FD2)、Fz、(syn＝Fz75/13)、(syn＝Firenze 75/13)、(syn＝Fi)、Fl、(syn＝Fl)、Flm、(syn＝Flm)、(syn＝Fim)、F1U、(syn＝F1)、(syn＝FiU)、F2、(syn＝F2)、F3、(syn＝F3)、F4、(syn＝F4)、F5、(syn＝F5)、F6、F7、(syn＝F7)、F25、(syn＝F25)、(syn＝f25)、F25U、(syn＝F25u)、(syn＝F25U)、(syn＝F25V)、F44、(syn＝F44)、F45、(syn＝F45)、F48、(syn＝F48)、I、Im、M、MC/75、M51、(syn＝M85)、P、(syn＝D)、S708、R、Tb、(syn＝TB)、(syn＝Tbilisi)、W、(syn＝Wb)、(syn＝Weybridge)、X、3、6、7、10/1、(syn＝10)、(syn＝F8)、(syn＝F8)、12m、24/II、(syn＝24)、(syn＝F9)、(syn＝F9)、45/III、(syn＝45)、75、84、212/XV、(syn＝212)、(syn＝F10)、(syn＝F10)、371/XXIX、(syn＝371)、(syn＝F11)、(syn＝P11)和513。
伯克霍尔德氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：CP75。
弯曲杆菌属的细菌被下列噬菌体感染：C型、NTCC12669、NTCC12670、NTCC12671、NTCC12672、NTCC12673、NTCC12674、NTCC12675、NTCC12676、NTCC12677、NTCC12678、NTCC12679、NTCC12680、NTCC12681、NTCC12682 32f、111c、191、Vfi-6、(syn＝V19)、Vfv-3、V2、V3、V8、V16、(syn＝Vfi-1)、V19、V20(V45)、V45、(syn＝V-45)和NN-Campylobacter(1)。
衣原体属的细菌被以下噬菌体感染：Chp1。
梭状芽胞杆菌属的细菌被以下噬菌体感染：CAK1、CA5、Ca7、OEβ、(syn＝lC)、CEγ、Cldl、c-n71、c-203Tox-、DEβ、(syn＝lD)、(syn＝l Dtox+)、HM3、KM1、KT、Ms、NA1、(syn＝Naltox+)、PA1350e、
Figure BDA0002518693810000271
PL73、PL78、PL81、PI、P50、P5771、P19402、1Ctox+、2Ctox-、2D、(syn＝2Dtox+)、3C、(syn＝3Ctox+)、4C、(syn＝4tox+)、56、III-1、NN-Clostridium(61)、NBltox-αl、CA1、HMT、HM2、PF1、P-23、P-46、Q-05、Q-06、Q-16、Q-21、Q-26、Q-40、Q-46、S 111、SA02、WA01、WA03、W111、W523、80、C、CA2、CA3、CPT1、CPT4、cl、c4、c5、HM7、H11/Al、H18/A1、H22/S23、H158/A1、K2/A1、K21/S23、ML、NA2tox-、Pf2、Pf3、Pf4、S9/S3、S41/A1、S44/S23、α2、41、112/S23、214/S23、233/Al、234/S23、235/S23、II-1、II-2、II-3、NN-Clostridium(12)、CA1、F1、K、S2、1、5和NN-Clostridium(8)。
棒状杆菌属的细菌被以下噬菌体感染：CGI1(缺陷型)、A、A2、A3、A110、A128、A133、A137、A139、A155、A182、B、BF、B17、B18、B51、B271、B275、B276、B277、B279、B282、C、capl、CC1、CG1、CG2、CG33、CL31、Cog、(syn＝CG5)、D、E、F、H、H1、hql、hq2、I1/H33、I1/H33、J、K、K、(syn＝Ktox-)、L、L、(syn＝Ltox+)、M、MC-1、MC-2、MC-3、MC-4、MLMa、N、O、ovl、ov2、ov3、P、P、P、RP6、RS29、S、T、U、UB1、ub2、UH1、UH3、uh3、uh5、uh6、β、(syn＝βtox+)、βlav64、βνir、γ、(syn＝γtox-)、γ19、δ、(syn＝δtox+)、ρ、(syn＝ρtox-)、
Figure BDA0002518693810000272
ω、1A、1/1180、2、2/1180、5/1180、5ad/9717、7/4465、8/4465、8ad/10269、10/9253、13/9253、15/3148、21/9253、28、29、55、2747、2893、4498和5848。
肠球菌属的细菌被以下噬菌体感染：DF78、F1、F2、1、2、4、14、41、867、D1、SB24、2BV、182、225、C2、C2F、E3、E62、DS96、H24、M35、P3、P9、SB101、S2、2BII、5、182a、705、873、881、940、1051、1057、21096C、NN-Enterococcus(1)、PE1、PI、F3、F4、VD13、1、200、235和341。
丹毒丝菌属的细菌被以下噬菌体感染：NN-Erysipelothrix(1)。
大肠埃希氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：BW73、B278、D6、D108、E、E1、E24、E41、FI-2、FI-4、FI-5、HI8A、HI8B、i、MM、Mu、(syn＝mu)、(syn＝Mul)、(syn＝Mu-1)、(syn＝MU-1)、(syn＝MuI)、(syn＝mu)、025、PhI-5、Pk、PSP3、PI、P1D、P2、P4(有缺陷)、SI、
Figure BDA0002518693810000281
Figure BDA0002518693810000282
(有缺陷)、
Figure BDA0002518693810000283
ψ(有缺陷)、7Α、
Figure BDA0002518693810000284
15(有缺陷)、18、28-1、186、299、NN-Escherichia(2)、A48、CM、C4、C16、DD-VI、(syn＝Dd-Vi)、(syn＝DDVI)、(syn＝DDVi)、E4、E7、E28、F11、F13、H、HI、H3、H8、K3、M、N、ND-2、ND-3、ND4、ND-5、ND6、ND-7、Ox-1、(syn＝OXl)、(syn＝11F)、Ox-2、(syn＝Ox2)、(syn＝OX2)、Ox-3、Ox-4、Ox-S、(syn＝OX5)、Ox-6、(syn＝66F)、
Figure BDA0002518693810000285
Figure BDA0002518693810000286
Figure BDA0002518693810000287
O111、Phl-1、RB42、RB43、RB49、RB69、S、Sal-1、Sal-2、Sal-3、Sal-4、Sal-5、Sal-6、TC23、TC45、TuII*-6、(syn＝TuII*)、TuII*-24、TuII*46、TuII*-60、T2、(syn＝γ)、(syn＝γ)、(syn＝PC)、(syn＝PC)、(syn＝T-2)、(syn＝T2)、(syn＝P4)、T4、(syn＝T-4)、(syn＝T4)、T6、T35、Al、1、1A、3、(syn＝Ac3)、3A、3T+、(syn＝3)、(syn＝M1)、
Figure BDA0002518693810000288
Figure BDA0002518693810000289
9266Q、CFO103、HK620、J、K、K1F、m59、no.A、no.E、no.3、no.9、N4、sd、(syn＝Sd)、(syn＝SD)、(syn＝Sd)、(syn＝sd)、(syn＝SD)、(syn＝CD)、T3、(syn＝T-3)、(syn＝T3)、T7、(syn＝T-7)、(syn＝T7)、WPK、W31、ΔΗ、
Figure BDA00025186938100002810
Φ-CF、Φ05、Φ06、
Figure BDA00025186938100002811
Ω8、1、3、7、8、8、26、27、28-2、29、30、31、32、38、39、42、933W、NN-Escherichia(1)、Esc-7-11、AC30、CVX-5、C1、DDUP、EC1、EC2、E21、E29、Fl、F26S、F27S、Hi、HK022、HK97、(syn＝ΦΗK97)、HK139、HK253、HK256、K7、ND-1、no.D、PA-2、q、S2、T1、(syn＝α)、(syn＝P28)、(syn＝T-l)、(syn＝Tl)、T3C、T5、(syn＝T-5)、(syn＝T5)、UC-1、w、β4、γ2、λ、(syn＝lambda)、(syn＝Φλ)、ΦD326、Φγ、Φ06、Φ7、Φ10、
Figure BDA00025186938100002812
χ、(syn＝χl)、
Figure BDA00025186938100002813
Figure BDA00025186938100002814
2、4、4A、6、8A、102、150、168、174、3000、AC6、AC7、AC28、AC43、AC50、AC57、AC81、AC95、ΗK243、K10、ZG/3A、5、5A、21EL、H19-f和933H。
梭菌属的细菌被以下噬菌体感染：NN-Fusobacterium(2)、fv83-554/3、fv88-531/2、227、fv2377、fv2527和fv8501。
嗜血杆菌属的细菌被以下噬菌体感染：HP1(Haemophilus phage HP1)、S2和N3。
幽门螺杆菌属的细菌被以下噬菌体感染：HP1(Helicobacter pylori phage HP1)和NN-Helicobacter(1)。
克雷伯菌属的细菌被以下噬菌体感染：AIO-2、K14B、K16B、K19(syn＝K19)、K114、K115、K121、K128、K129、K132、K133、K135、K1106B、K1171B、K1181B、K1832B、AIO-1、AO-1、AO-2、AO-3、FC3-10、K、Kll、(syn＝Kll)、K12、(syn＝K12)、K13、(syn＝K13)、(syn＝Kl70/11)、K14、(syn＝K14)、K15、(syn＝K15)、K16、(syn＝K16)、K17、(syn＝K17)、K18、(syn＝K18)、K119、(syn＝K19)、K127、(syn＝K127)、K131、(syn＝K131)、K135、K1171B、II、VI、IX、CI-1、K14B、K18、K111、K112、K113、K116、K117、K118、K120、K122、K123、K124、K126、K130、K134、K1106B、K1165B、K1328B、KLXI、K328、P5046、11、380、III、IV、VII、VIII、FC3-11、K12B、(syn＝K12B)、K125、(syn＝K125)、K142B、(syn＝K142)、(syn＝K142B)、K1181B、(syn＝K1181)、(syn＝K1181B)、K1765/1、(syn＝K1765/1)、K1842B、(syn＝K1832B)、K1937B、(syn＝K1937B)、LI、
Figure BDA0002518693810000291
7、231、483、490、632和864/100。
钩端螺旋体属的细菌被以下噬菌体感染：LEI、LE3、LE4和NN-Leptospira(1)。
李斯特菌属的细菌被以下噬菌体感染：A511、01761、4211、4286(syn＝B054)、A005、A006、A020、A500、A502、A511、A118、A620、A640、B012、B021、B024、B025、B035、B051、B053、B054、B055、B056、B101、B110、B545、B604、B653、C707、D441、HS047、HIOG、H8/73、H19、H21、H43、H46、H107、H108、HIO、H163/84、H1312、H340、H387、H391/73、H684/74、H924A、PSA、U153、
Figure BDA0002518693810000292
(syn＝P35)、00241、00611、02971A、02971C、5/476、5/911、5/939、5/11302、5/11605、5/11704、184、575、633、699/694、744、900、1090、1317、1444、1652、1806、1807、1921/959、1921/11367、1921/11500、1921/11566、1921/12460、1921/12582、1967、2389、2425、2671、2685、3274、3550、3551、3552、4276、4277、4292、4477、5337、5348/11363、5348/11646、5348/12430、5348/12434、10072、11355C、11711A、12029、12981、13441、90666、90816、93253、907515、910716和NN-Listeria(15)。
摩根氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：47。
分枝杆菌属的细菌被以下噬菌体感染：13、AG1、AL1、ATCC 11759、A2、B.C3、BG2、BK1、BK5、butyricum、B1、B5、B7、B30、B35、Clark、CI、C2、DNAIII、DSP1、D4、D29、GS4E、(syn＝GS4E)、GS7、(syn＝GS-7)、(syn＝GS7)、IPα、lacticola、Legendre、Leo、L5、(syn＝ΦL-5)、MC-1、MC-3、MC-4、minetti、MTPH11、Mx4、MyF3P/59a、phlei((syn＝phlei 1)、phlei4、Polonus II、rabinovitschi、smegmatis、TM4、TM9、TM10、TM120、Y7、Y10、
Figure BDA0002518693810000301
IB、IF、1H、1/1、67、106、1430、Bl、(syn＝Bol)、B24、D、D29、FK、FS、HP、Polonus I、Roy、Rl、(syn＝R1-Myb)、(syn＝R1)、11、31、40、50、103a、103b、128、3111-D、3215-D和NN-Mycobacterium(1)。
奈瑟氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：I组、II组和NP1。
诺卡氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：P8、NJ-L、NS-8、N5和NN-Nocardia(1)。
变形杆菌属的细菌被以下噬菌体感染：Pm5、13vir、2/44、4/545、6/1004、13/807、20/826、57、67b、78、107/69、121、9/0、22/608、30/680、Pml、Pm3、Pm4、Pm6、Pm7、Pm9、Pml0、Pml1、Pv2、π1、
Figure BDA0002518693810000302
7/549、9B/2、10A/31、12/55、14、15、16/789、17/971、19A/653、23/532、25/909、26/219、27/953、32A/909、33/971、34/13、65、5006M、7480b、VI、13/3a、Clichy 12、π2600、
Figure BDA0002518693810000303
1/1004、5/742、9、12、14、22、24/860、2600/D52、Pm8和24/2514。
普罗维登西亚属的细菌被以下噬菌体感染：PL25、PL26、PL37、9211/9295、9233/921lb、9248、7/R49、74761322、7473325、7479、7480、9000/9402和9213/9211a。
假单胞菌属的细菌被以下噬菌体感染：Pf1、(syn＝Pf-1)、Pf2、Pf3、PP7、PRR1、7s、NN-Pseudomonas(1)、AI-1、M-2、B17、B89、CB3、Col 2、Col 11、Col 18、Col 21、C154、C163、C167、C2121、E79、F8、ga、gb、H22、K1、M4、N2、Nu、PB-1、(syn＝PBl)、pfl6、PMN17、PP1、PP8、Psal、PsP1、PsP2、PsP3、PsP4、PsP5、PS3、PS17、PTB80、PX4、PX7、PYO1、PYO2、PYO5、PYO6、PYO9、PYO10、PYO13、PYO14、PYO16、PYO18、PYO19、PYO20、PYO29、PYO32、PYO33、PYO35、PYO36、PYO37、PYO38、PYO39、PYO41、PYO42、PYO45、PYO47、PYO48、PYO64、PYO69、PYO103、P1K、SLP1、SL2、S2、S2、UNL-1、wy、Yal、Ya4、Ya11、
Figure BDA0002518693810000311
(syn＝ΦKZ)、
Figure BDA0002518693810000312
Φmu78、
Figure BDA0002518693810000313
1/72、2/79、3、3/DO、4/237、5/406、6C、6/6660、7、7v、7/184、8/280、9/95、10/502、11/DE、12/100、12S、16、21、24、25F、27、31、44、68、71、95、109、188、337、352、1214、NN-Pseudomonas(23)、A856、B26、CI-1、CI-2、C5、D、gh-1、F116、HF、H90、K5、K6、K104、K109、K166、K267、N4、N5、O6N-25P、PE69、Pf、P PN25、PPN35、PPN89、PPN91、PP2、PP3、PP4、PP6、PP7、PP8、PP56、PP87、PPl14、PP206、PP207、PP306、PP651、Psp231a、Pssy401、Pssy9220、psl、PTB2、PTB20、PTB42、PX1、PX3、PX10、PX12、PX14、PYO70、PYO71、R、SH6、SH133、tf、Ya5、Ya7、
Figure BDA0002518693810000314
ΦKf77、
Figure BDA0002518693810000318
OmnF82、
Figure BDA0002518693810000315
1、2、2、3、4、5、6、7、7、8、9、10、11、12、12B、13、14、15、14、15、15、16、17、18、19、20、20、21、21、22、23、23、24、25、31、53、73、119x、145、147、170、267、284、308、525、NN-Pseudomonas(5)、af、A7、B3、B33、B39、BI-1、C22、D3、D37、D40、D62、D3112、F7、F10、g、gd、ge、gf、Hwl2、Jbl9、KF1、L°、OXN-32P、06N-52P、PCH-1、PC13-1、PC35-1、PH2、PH51、PH93、PH132、PMW、PM13、PM57、PM61、PM62、PM63、PM69、PM105、PM113、PM681、PM682、PO4、PPl、PP4、PP5、PP64、PP65、PP66、PP71、PP86、PP88、PP92、PP401、PP711、PP891、Pssy41、Pssy42、Pssy403、Pssy404、Pssy420、Pssy923、PS4、PS-10、Pz、SD1、SL1、SL3、SL5、SM、
Figure BDA0002518693810000316
Figure BDA0002518693810000317
2、2F、5、7m、11、13、13/441、14、20、24、40、45、49、61、73、148、160、198、218、222、236、242、246、249、258、269、295、297、309、318、342、350、351、357-1、400-1、NN-Pseudomonas(6)、G10、M6、M6a、LI、PB2、Pssyl5、Pssy4210、Pssy4220、PYO12、PYO34、PYO49、PYO50、PYO51、PYO52、PYO53、PYO57、PYO59、PYO200、PX2、PX5、SL4、
Figure BDA0002518693810000321
和1214。
立克次体属的细菌被以下噬菌体感染：NN-Rickettsia(1)。
沙门氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：b、Beccles、CT、d、Dundee、f、Fels 2、GI、GUI、GVI、GVIII、k、K、i、j、L、O1(syn＝0-l)、(syn＝O1)、(syn＝O-I)、(syn＝7)、O2、O3、P3、P9a、P10、Sab3、Sab5、Sanl5、San17、SI、Taunton、Vil(syn＝Vil)、9、NN-Salmonella(1)、N1、N-5、N-10、N-17、N-22、11、12、16-19、20.2、36、449C/C178、966A/C259、a、B.A.O.R、e,G4、GUI、L、LP7、M、MG40、N-18、PSA68、P4、P9c、P22、(syn＝P22)、(syn＝PLT22)、(syn＝PLT22)、P22al、P22-4、P22-7、P22-11、SNT-1、SNT-2、SP6、ViIII、ViIV、ViV、ViVI、ViVII、Worksop、ε15、ε34、1、37、1(40)、
Figure BDA0002518693810000322
1、422、2、2.5、3b、4、5、6、14(18)、8、14(6,7)、10、27、28B、30、31、32、33、34、36、37、39、1412、SNT-3,7-11、40.3、c、C236、C557、C625、C966N、g、GV、G5、G173、h、IRA、Jersey、M78、P22-1、P22-3、P22-12、Sabl、Sab2、Sab2、Sab4、Sanl、San2、San3、San4、San6、San7、San8、San9、Sanl3、Sanl4、Sanl6、Sanl 8、Sanl9、San20、San21、San22、San23、San24、San25、San26、SasLl、SasL2、SasL3、SasL4、SasL5、S1BL、SII、ViII、
Figure BDA0002518693810000323
1、2、3a、3al、1010、NN-Salmonella(1)、N-4、SasL6和27。
沙雷氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：A2P、PS20、SMB3、SMP、SMP5、SM2、V40、V56、κ、DCP-3、(DCP-6、3M、10/la、20A、34CC、34H、38T、345G、345P、501B、SMB2、SMP2、BC、BT、CW2、CW3、CW4、CW5、L1232、L2232、L34、L.228、SLP、SMP A、V.43、σ、
Figure BDA0002518693810000324
ΦCP6-1、ΦCP6-2、ΦCP6-5、3T、5、8、9F、10/1、20E、32/6、34B、34CT、34P、37、41、56、56D、56P、60P、61/6、74/6、76/4、101/8900、226、227、228、229F、286、289、290F、512、764a、2847/10、2847/10a、L.359和SMB1。
志贺氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：Fsa、(syn＝a)、FSD2d、(syn＝D2d)、(syn＝W2d)、FSD2E、(syn＝W2e)、fv、F6、f7.8、H-Sh、PE5、P90、Sfll、Sh、SHIII、SHIV、(syn＝HIV)、SHVI、(syn＝HVI)、SHVIII、(syn＝HVIII)、SKγ66、(syn＝γ66)、(syn＝γ66)、(syn＝γ66b)、SKIII、(syn＝SIIIb)、(syn＝III)、SKIV、(syn＝SIVa)、(syn＝IV)、SKIVa、(syn＝SIVAn)、(syn＝IVA)、SKVI、(syn＝KVI)、(syn＝SVI)、(syn＝VI)、SKVIII、(syn＝SVIII)、(syn＝VIII)、SKVIIIA、(syn＝SVIIIA)、(syn＝VIIIA)、STVI、STIX、STXI、STXII、S66、W2、(syn＝D2c)、(syn＝D20)、
Figure BDA0002518693810000332
3-SO-R、8368-SO-R、F7、(syn＝FS7)、(syn＝K29)、F10、(syn＝FS10)、(syn＝K31)、II、(syn＝alfa)、(syn＝FSα)、(syn＝K18)、(syn＝a)、12、(syn＝a)、(syn＝K19)、SG35、(syn＝G35)、(syn＝SO-35/G)、SG55、(syn＝SO-55/G)、SG3201、(syn＝SO-3201/G)、SHII、(syn＝HII)、SHV、(syn＝SHV)、SHX、SHX、SKII、(syn＝K2)、(syn＝KII)、(syn＝SII)、(syn＝SsII)、(syn＝II)、SKIV、(syn＝SIVb)、(syn＝SsIV)、(syn＝IV)、SKIVa、(syn＝SIVab)、(syn＝SsIVa)、(syn＝IVa)、SKV、(syn＝K4)、(syn＝KV)、(syn＝SV)、(syn＝SsV)、(syn＝V)、SKX、(syn＝K9)、(syn＝KX)、(syn＝SX)、(syn＝SsX)、(syn＝X)、STV、(syn＝T35)、(syn＝35-50-R)、STVIII、(syn＝T8345)、(syn＝8345-SO-SR)、W1、(syn＝D8)、(syn＝FSD8)、W2a、(syn＝D2A)、(syn＝FS2a)、DD-2、Sf6、FS 1、(syn＝F1)、SF6、(syn＝F6)、SG42、(syn＝SO-42/G)、SG3203、(syn＝SO-3203/G)、SKF12、(syn＝SsF12)、(syn＝F12)、(syn＝F12)、STII、(syn＝1881-SO-R)、γ66、(syn＝γ66a)、(syn＝Ssγ66)、
Figure BDA0002518693810000331
Bll、DDVII、(syn＝DD7)、FSD2b、(syn＝W2B)、FS2、(syn＝F2)、(syn＝F2)、FS4、(syn＝F4)、(syn＝F4)、FS5、(syn＝F5)、(syn＝F5)、FS9、(syn＝F9)、(syn＝F9)、F11、P2-SO-S、SG36、(syn＝SO-36/G)、(syn＝G36)、SG3204、(syn＝SO-3204/G)、SG3244、(syn＝SO-3244/G)、SHI、(syn＝HI)、SHVII、(syn＝HVII)、SHIX、(syn＝HIX)、SHXI、SHXII、(syn＝HXII)、SKI、KI、(syn＝SI)、(syn＝SsI)、SKVII、(syn＝KVII)、(syn＝SVII)、(syn＝SsVII)、SKIX、(syn＝KIX)、(syn＝SIX)、(syn＝SsIX)、SKXII、(syn＝KXII)、(syn＝SVII)、(syn＝SsXII)、STI、SIII、STIII、STIV、STVII、S70、S206、U2-SO-S、3210-SO-S、3859-SO-S、4020-SO-S、
Figure BDA0002518693810000341
SHIII、(syn＝HIII)、SHXI、(syn＝HXI)和SXI、(syn＝KXI)、(syn＝SXI)、(syn＝SsXI)、(syn＝XI)。
金黄色葡萄球菌属的细菌被以下噬菌体感染：A、EW、K、Ph5、Ph9、Phl10、Phl3、P1、P2、P3、P4、P8、P9、P10、RG、SB-1、(syn＝Sb-1)、S3K、Twort、
Figure BDA0002518693810000342
06、40、58、119、130、131、200、1623、STC1、(syn＝stcl)、STC2、(syn＝stc2)、44AHJD、68、AC1、AC2、A6“C”、A9“C”、b581、CA-1、CA-2、CA-3、CA-4、CA-5、D11、L39x35、L54a、M42、N1、N2、N3、N4、N5、N7、N8、NIO、N11、N12、N13、N14、N16、Ph6、Phl2、Phl4、UC-18、U4、U15、SI、S2、S3、S4、S5、X2、Zl、
Figure BDA0002518693810000343
ω、11、(syn＝cpl l)、(syn＝Pl-M15)、15、28、28A、29、31、31B、37、42D、(syn＝P42D)、44A、48、51、52、52A、(syn＝P52A)、52B、53、55、69、71、(syn＝P71)、71A、72、75、76、77、79、80、80a、82、82A、83A、84、85、86、88、88A、89、90、92、95、96、102、107、108、111、129-26、130、130A、155、157、157A、165、187、275、275A、275B、356、456、459、471、471A、489、581、676、898、1139、1154A、1259、1314、1380、1405、1563、2148、2638A、2638B、2638C、2731、2792A、2792B、2818、2835、2848A、3619、5841、12100、AC3、A8、A10、A13、b594n、D、M12、N9、N15、P52、P87、SI、S6、Z4、
Figure BDA0002518693810000344
3A、3B、3C、6、7、16、21、42B、42C、42E、44 47、47A、47C、51、54、54×1、70、73、75、78、81、82、88、93、94、101、105、110、115、129/16、174、594n、1363/14、2460和NN-Staphylococcus(1)。
链球菌属的细菌被以下噬菌体感染：EJ-1、NN-Streptococcus(1)、a、CI、FLOThs、H39、Cp-1、Cp-5、Cp-7、Cp-9、Cp-10、AT298、A5、a10/J1、a10/J2、a10/J5、a10/J9、A25、BT11、b6、CA1、c20-1、c20-2、DP-1、Dp-4、DTI、ET42、e10、FA101、FEThs、FK、FKK101、FKLIO、FKP74、FK11、FLOThs、FY101、fl、FIO、F20140/76、g、GT-234、HB3、(syn＝HB-3)、HB-623、HB-746、M102、O1205、
Figure BDA0002518693810000351
PST、PO、PI、P2、P3、P5、P6、P8、P9、P9、P12、P13、P14、P49、P50、P51、P52、P53、P54、P55、P56、P57、P58、P59、P64、P67、P69、P71、P73、P75、P76、P77、P82、P83、P88、sc、sch、sf、Sfil l、(syn＝SFil l)、(syn＝(pSFill)、
Figure BDA0002518693810000352
(syn＝(ΦSfil1)、sfil9、(syn＝SFil9)、
Figure BDA0002518693810000353
Figure BDA0002518693810000354
Sfi21、(syn＝SFi21)、(syn＝cpSFi21)、
Figure BDA0002518693810000355
STG、STX、st2、ST2、ST4、S3、
Figure BDA0002518693810000356
s265、Φ17、
Figure BDA0002518693810000357
Φ57、
Figure BDA0002518693810000358
Figure BDA0002518693810000359
ω1、ω2、ω3、ω4、ω5、ω6、ω8、ω10、1、6、9、10F、12/12、14、17SR、19S、24、50/33、50/34、55/14、55/15、70/35、70/36、71/ST15、71/45、71/46、74F、79137、79/38、80/J4、80/J9、80/ST16、80/15、80/47、80/48、101、103/39、103/40、121/41、121/42、123/43、123/44、124/44、337/ST17和NN-Streptococcus(34)。
梅毒螺旋体属的细菌被以下噬菌体感染：NN-Treponema(1)。
弧菌属的细菌被以下噬菌体感染：CTXΦ、fs、(syn＝sl)、fs2、lvpfs、Vfl2、Vf33、VPIΦ、VSK、v6、493、CP-T1、ET25、kappa、K139、Labol)、XN-69P、OXN-86、06N-21P、PB-1、P147、rp-1、SE3、VA-1、(syn＝VcA-1)、VcA-2、VcA-1、VP1、VP2、VP4、VP7、VP8、VP9、VP10、VP17、VP18、VP19、X29、(syn＝29d'Herelle)、1、ΦHAWI-1、ΦHAWI-2、ΦHAWI-3、ΦHAWI-4、ΦHAWI-5、ΦHAWI-6、ΦHAWI-7、ΦHAWI-8、ΦHAWI-9、ΦHAWI-10、ΦΗC1-1、ΦΗC1-2、ΦΗC1-3、ΦΗC1-4、ΦΗC2-1、ΦΗC2-2、ΦΗC2-3、ΦΗC2-4、ΦΗC3-1、ΦΗC3-2、ΦΗC3-3、ΦΗD1S-1、ΦΗD1S-2、ΦΗD2S-1、ΦΗD2S-2、ΦΗD2S-3、ΦΗD2S--4、ΦΗD2S-5、ΦΗDO-1、ΦΗDO-2、ΦΗDO-3、ΦΗDO-4、ΦΗDO-5、ΦΗDO-6、ΦKL-33、ΦKL-34、ΦKL-35、ΦKL-36、ΦKW1Η-2、ΦKW1Η-3、ΦKW1Η-4、ΦΜΑRQ-1、ΦΜΑRQ-2、ΦΜΑRQ-3、ΦΜΟΑΤ-1、ΦO139、ΦΡΕL1Α-1、ΦΡΕL1Α-2、ΦΡΕL8Α-1、ΦΡΕL8Α-2、ΦΡΕL8Α-3、ΦΡΕL8C-1、ΦΡΕL8C-2、ΦΡΕL13A-1、ΦΡΕL13Β-1、ΦΡΕL13Β-2、ΦΡΕL13Β-3、ΦΡΕL13Β-4、ΦΡΕL13Β-5、ΦΡΕL13Β-6、ΦΡΕL13Β-7、ΦΡΕL13Β-8、ΦΡΕL13Β-9、ΡΕL13Β-10、
Figure BDA0002518693810000361
Φ16、
Figure BDA0002518693810000362
1-11、5、13、14、16、24、32、493、6214、7050、7227、II、(syn＝组11)、
Figure BDA0002518693810000363
V、VIII、NN-Vibrio(13)、KVP20、KVP40、nt-1、06N-22P、P68、el、e2、e3、e4、e5、FK、G、J、K、nt-6、N1、N2、N3、N4、N5、O6N-34P、OXN-72P、OXN-85P、OXN-100P、P、Ph-1、PL163/10、Q、S、T、
Figure BDA0002518693810000364
1-9、37、51、57、70A-8、72A-4、72A-10、110A-4、333、4996、1、(syn＝组I)、III、(syn＝组III)、VI、(syn＝A-Saratov)、VII、IX、X、NN-Vibrio(6)、pAl、7、7-8、70A-2、71A-6、72A-5、72A-8、108A-10、109A-6、109A-8、110A-1、110A-5、110A-7、hv-1、OXN-52P、P13、P38、P53、P65、P108、P111、TP1、VP3、VP6、VPI2、VP13、70A-3、70A-4、70A-10、72A-1、108A-3、109-B1、110A-2、149、
Figure BDA00025186938100003610
IV、(syn＝IV组)、NN-Vibrio(22)、VP5、VP11、VP15、VP16、al、a2、a3a、3b、353B和NN-Vibrio(7)。
鼠疫耶尔森氏菌属的细菌被以下噬菌体感染：H、H1、H-2、H-3、H-4、Lucas 110、Lucas 303、Lucas 404、YerA3、YerA7、YerA20、YerA41、3/M64-76、5/G394-76、6/C753-76、8/C239-76、9/F18167、1701、1710、PST、1/F2852-76、D'Hérelle、EV、H、Kotljarova、PTB、R、Y、YerA41、
Figure BDA0002518693810000365
3、
Figure BDA0002518693810000366
4/C1324-76、7/F783-76、903、1/M6176和Yer2AT。
在另一个实施方式中、使用至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或更多数量的上述噬菌体的组合来实践所述方法。本领域技术人员认识到，取决于所用噬菌体的特定组合，可以控制转化效率，例如提高或抑制转化效率。
特别地，细菌菌种(和相应的宿主特异性噬菌体)包括Aeromonas hydrophila(PM2)、Bacillus anthracis(γ)、Bacillus subtilus(SPP1)、Bordetella pertussis(见Pereversev等人Zh Mikrobiol 5：54-57，1981)、Borrelia burgdorferi(
Figure BDA00025186938100003611
见Eggers等人，J Bacteriol 183：4771-4778，2001)、Brucella abortus(TB；212；371)，Campylobacter jejuni
Figure BDA0002518693810000367
Clostridium perfringes
Figure BDA0002518693810000368
Enterococcusfaecalis(cpFCl)、Enterococcus faecium(ENB6)、Escherichia coli(PI；T1；T3、T4、T5；T7，KH1，
Figure BDA0002518693810000369
lambda；
Figure BDA0002518693810000371
mu)、Klebsiella pneumoniae(60；92)、Listeriamonocytogenes(A511、A118；243；H387；2389；2671；2685；4211)、Mycobacterium leprae(mycobacteriophage，L5)、Mycobacterium tuberculosis(LG；DSGA)、Pseudomonasaeruginosa(E79，G101；B3；pp.7)、Salmonella anatum(E5)、Salmonellabovismorbiflcans(98)、Salmonella choleraesuis(102)、Salmonella enteritidis(L；P22；102；FO；IRA；
Figure BDA0002518693810000372
)、Salmonella Newington(E34)、Salmonella schottmulleri(31；102；F0；14)、Salmonella typhi(163；175；Vil；ViVI；8；23；25；46；175；F0)、Serratiamarcescens(S24VA)、Shigella dysenteriae(
Figure BDA0002518693810000373
P2；2；37)，Shigella flexneri(Sf6)，Staphylococcus aureus(K；PI；P14；UC18；15；17；29；42D；47；52；53；79；80；81；83A；92；Twort、
Figure BDA0002518693810000374
)、Streptococcus pneumoniae(Dp-1；Cp-1；HB-3；EJ-1；MM1；VOl)、Streptococcus pyogenes(
Figure BDA0002518693810000375
1A；IB；T12；12/12；113；120；124；P58；H4489a)、Vibriocholerae(138；145；149；163)和Yersinia pestis(A1122；R；Y；PI)。在美国专利公开号2009-0155768中提供了附加信息。
特别地，表1至3提供了特定宿主特异性噬菌体及其特异性宿主的代表性示例，包括它们介导其作用的受体。另见Bertozzi等人，FEMS Microbiology Letters，363，1-11，2016。
表1.革兰氏阳性菌的细胞壁中的受体。宿主名称按字母顺序排列。
Figure BDA0002518693810000376
Figure BDA0002518693810000381
表2.革兰氏阴性菌的细胞壁中的受体。宿主名称按字母顺序排列。
Figure BDA0002518693810000382
Figure BDA0002518693810000391
表3.除细胞壁之外的细菌复合物中的受体。宿主名称按字母顺序排列。
Figure BDA0002518693810000392
Figure BDA0002518693810000401
D.噬菌体包装位点
噬菌体包装位点是噬菌体基因组上用于将基因组包装到病毒体中的特异性DNA序列。将质粒工程改造以包含噬菌体包装位点，以便将质粒包装到转导颗粒中。宿主特异性噬菌体(及其包装位点)包括但不限于SPP1(SPP1pac位点)、P1(P1pac位点)、T1(T1pac位点)、T7(T7串联体连接点)、λ(cos位点)、mu(mu pac位点)、P22(P22pac位点)、
Figure BDA0002518693810000402
(
Figure BDA0002518693810000403
pac位点)、Sf6(Sf6pac位点)、149(149pac位点)和A1122(A1122-串联体连接点)。对于大多数噬菌体，包装位点称为pac位点。在某些情况下，包装位点称为串联体连接点(concatemerjunction)(如T7串联体连接点)。在每种情况下，包装位点都与噬菌体基因组中天然存在的相邻序列不同。
对于某些噬菌体，包装位点可能是未知的。在这些情况下，可以利用包装含有功能性噬菌体pac位点的质粒的特性来确定pac位点。例如，包装噬菌体λ所需的DNA序列是通过将λ噬菌体基因组DNA的限制性小片段(small restriction fragments)掺入质粒中来确定(Hohn等人，PNAS USA 80：7456-7460，1983)。引入体内包装菌株后，定量评估包装/转导的效率。使用类似的策略，已经确定了许多噬菌体的pac位点：λ(Miwa等人，Gene 20：267-279，1982)；Mu(Croenen等人，Virology 144：520-522，1985)；丝状噬菌体，包括f1、fd、M13和Ike(Russel等人，J Virol.，63：3284-3295，1989)；P22(Petri等人，Gene 88：47-55，1990；Wu等人，Mol.Microbiol 45：1631-1646，2002)；T7(Chung等人，J Mol Biol 216：927-938，1990)以及T3(Hashimoto等人，Virology 187：788-795，1992)。
该方法的实施方式包括噬菌体包装序列及其功能片段。这些核酸实施方式可以是如至少9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850和900个核苷酸的长度，只要该核苷酸片段可以介导质粒DNA包装入噬菌体衣壳(根据其介导包装从而产生功能性转导颗粒的能力来判断)。将包含噬菌体包装位点或其片段的核酸掺入质粒。
E.标记基因构建体
基因技术被广泛用于监测细胞基因的表达(Naylor等人，Biochem Pharm 58：749-757，1990)。优选地，标记分子是编码可检测产物，如蛋白质或酶的基因。特别优选地，标记不是由噬菌体、人或细菌天然表达的分子。例如，标记可以是异源真核蛋白质、不同细菌菌种的蛋白质或病毒蛋白质。在一些实施方式中，标记是基于植物的酶或非编码RNA。在一些实施方式中，标记是基因或由基因编码的产物，其中该基因衍生自非人类动物。
在一个实施方式中，标记是水解酶。
本方法部分地包括确定样品中至少一种标记或指示物的存在(或不存在)或水平(例如浓度)或活性(例如酶活性)。正如本文中使用的，术语“标记”或“指示物”是指编码核酸(如mRNA)、肽或蛋白质的核苷酸序列，其允许确定或确认载体已被正确地转染或转导，并且其序列正确表达。标记还可以指通过在重组或工程噬菌体中表达异源基因而产生的核酸、肽、蛋白质或酶。标记可以是编码蛋白质的核苷酸序列或编码抗生素抗性的基因，用于选择携带载体的细胞。正如本文中使用的，术语“检测至少一种标记的存在”包括通过使用本领域技术人员已知的任何定量或定性测定来确定每种目标标记的存在。在某些情况下，确定特定性状、变量、基因型和/或生化或血清学物质(如蛋白质或抗体)的存在或不存在的定性测定适用于检测每种目标标记。在某些其他情况下，确定DNA、RNA、蛋白质、抗体或活性的存在或不存在的定量测定适用于检测感兴趣的每个标记。正如本文中使用的，术语“检测至少一种标记的水平”包括通过使用本领域技术人员已知的任何直接或间接定量测定来确定每种目标标记的水平。在某些情况下，确定例如DNA、RNA、蛋白质、抗体或活性的相对或绝对量的定量测定适用于检测每种目标标记的水平。本领域技术人员将理解，可用于检测标记水平的任何测定法也可用于检测标记的存在或不存在。
在一些实施方式中，标记是可表示其存在的报告分子(reporter molecule)，如经由其发光特性或其进行酶促反应的能力。在另一个实施方式中，标记与报告分子结合以表示标记的水平或活性。
(i)报告基因(reporters)
在一个实施方式中，报告分子是一种被称为报告基因的基因，其编码可检测蛋白的表达。常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶(CAT)、13-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白(GFP)。通常，报告基因具有基因表达后背景活性低和检测信号灵敏的优点。例如，萤光素酶和GFP作为基因表达的非侵入性标记的发展，再加上使用灵敏的电荷耦合器件(CCD)成像相机和荧光显微镜进行检测的简便性，允许了甚至可以在单细胞水平下关于基因表达的时间和空间信息。
萤光素酶基因及其作为报告基因的用途的综述提供了已知的萤光素酶基因、cDNA、蛋白质以及下述的相应GENBANK登录号的列表：Vibrio harveyi(登录号M10961和AAA88685)、Vibrio harveyi(登录号M10961和AAA88686)、Vibrio harveyi(登录号M28815和AAA27531)、Vibrio fischeri(登录号X06758和CAA29931)、Vibrio fischeri(登录号X06797和CAA29932)、Vibrio fischeri(登录号AF170104(包括其变体))、Photorhabdusluminescens(登录号M62917)、Photinus pyralis(M15077和AAA29795)、Luciola cruciate(登录号M26194和AAA29135)、Vargula hilgendorfii(登录号E02749、M25666和AAA30332)，Aequorea victoria(登录号M16103、AAA27719、M11394、AAA27716、M16104、AAA27717、M16105、AAA27718、L29571、AAA27720和E02319)；Oplophorus gracilorostris(登录号AB030246、BAB13776、AB030245和BAB13775)；Renilla muelleri(登录号AY015988和AAG54094)；和Renilla reniformis(登录号：M63501和AAA29804)。参见Greer等人，Luminescence 17：43-74，2002)。Greer还提供了大量可用于成像的构建体和载体(请参见表2，第48-52页)。这些载体适合在金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和其他细菌中表达。在已知的萤光素酶中有原核萤光素酶(Lux)和真核萤光素酶(Luc、Rue及其调节蛋白)，它们均常用于活细胞中萤光素酶表达的成像。
在另一个实施方式中，报告分子包括在细菌中表达的β-半乳糖苷酶报告基因(Miller等人，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory，冷泉港，纽约；Sambrook等人，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，冷泉港，纽约)。由细菌菌落表达的β-半乳糖苷酶活性通过在含有X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-吡喃半乳糖苷)的培养基上进行蓝色着色来检测。氯霉素乙酰转移酶(CAT)也适合用作细菌中的报告基因。CAT由细菌抗药性基因编码(Kondo等人，J Bacteriol 88：1266-1276)。它通过在两个羟基之一或两个处乙酰化药物来灭活氯霉素。在典型的CAT测定中，将细胞提取物在含有14C或3H标记的氯霉素和正丁酰基辅酶A的反应混合物中温育。CAT将辅因子的正丁酰基部分转移到氯霉素中。反应产物用二甲苯萃取，且正丁酰氯霉素主要分配进入二甲苯相中，而未改性的氯霉素则主要保留在水相中。使用闪烁计数器测量分配到二甲苯相中的放射性标记的氯霉素。
大肠杆菌的phoA编码的细菌碱性磷酸酶只有在已经跨过细胞膜转运到周质空间时才具有酶活性(Gibson等人，Appl and Env Microbiol 68：928-932，2002)。已经利用该性质来工程改造PhoA蛋白作为亚细胞定位的分子传感器。已开发出另一种源自革兰氏阳性菌粪肠球菌的细菌碱性磷酸酶(PhoZ)(Lee等人，J Bacteriol 181：5790-5799，1999)，作为在革兰氏阳性菌中高度活跃的报告基因(Granok等人，J Bacteriol 182：1529-1540，2000；Lee等人，J Bacteriol 181：5790-5799，1999)。与PhoA一样，PhoZ的碱性磷酸酶活性取决于其从细胞质中的输出。在碱性磷酸酶确定中，碱性磷酸酶水解例如为4-硝基苯基磷酸酯(4NPP)的底物以产生发色团(例如4-硝基苯酚，4NP)。
报告基因允许更简单的操作程序(例如减少纯化或细胞裂解)，它们适用于大规模、高通量的筛选测量，并且与细菌系统相容。报告基因可以是天然存在的基因，也可以是通过基因操作(例如重组DNA技术或诱变)产生的基因。报告基因是含有编码区和任何相关表达序列如启动子、转译起始序列和调节序列的核酸区段。
(ii)启动子
在一些实施方式中，噬菌体衍生的启动子与标记或报告基因连接。在一些实施方式中，使用细菌特异性的启动子。
报告基因通常与控制和指导RNA合成的启动子序列连接。本领域技术人员将理解，启动子序列可以选自各种细菌菌种表达的大量细菌基因。根据要检测的目标细菌来选择启动子。关于在大肠杆菌中实现基因高水平表达的策略的综述，参见Makrides等人，Microbiol Rev 60：512-538，1996。在大肠杆菌中有效的示例性启动子序列是T7启动子，但是可以使用在原核细胞中起作用的任何启动子或增强子。有用的启动子包括但不限于lac启动子(大肠杆菌)、trp启动子(大肠杆菌)、araBAD启动子(大肠杆菌)、lac杂种启动子(大肠杆菌)、trc杂种启动子(大肠杆菌)、PL(X)、SP6和T7。
根据启动子序列在目标病原细菌中实现可检测的表达水平的能力来选择启动子序列。在优选的实施方式中，报告基因优选与从要检测的病原性细菌宿主获得的启动子偶联。组成启动子将以恒定速率表达报告基因，而与生理需求或底物浓度无关。可替代地，使用诱导型启动子来控制报告基因表达的时机可能是有利的。对于可诱导的启动子，如lac和trp操纵子，通常抑制表达，并可以在所需时间诱导表达。在没有乳糖的情况下，lac启动子被lac阻遏蛋白抑制。诱导可以通过添加乳糖或IPTG来实现，从而防止阻遏物与lac操纵子结合。类似地，嘴唇启动子受到与trp操纵子结合的色氨酸-阻遏物复合物的负调控。对于trp操纵子，可以通过去除色氨酸或添加β-吲哚丙烯酸来诱导基因表达。
(iii)细菌特定的复制起点
质粒中使用的复制起点可以是中等拷贝数，例如来自pBR322的colEl ori(每细胞15-20拷贝)或R6K质粒(每细胞15-20拷贝)，或者它们可以是高拷贝数，例如pUC oris(每细胞500-700拷贝)、pGEM oris(每细胞300-400拷贝)，pTZ oris(每细胞>1000拷贝)或pBluescript oris(每细胞300-500拷贝)。复制起点可在大肠杆菌或任何其他原核物种(如Bacillus anthracis或Yersinia pestis)中起作用。
质粒复制取决于宿主酶以及质粒编码的和质粒控制的顺式和反式决定簇。例如，某些质粒具有在几乎所有革兰氏阴性菌中都能识别的决定簇，并在复制起始和调控过程中在每个宿主中正确发挥作用。其他质粒仅在某些细菌中具有这种能力(Kues等，MicrobiolRev 53：491-516，1989)。质粒通过三种通用机制复制，即θ类型、链置换和滚动圆(rollingcircle)(由Del Solar等人，Microbio and Molec Biol Rev 62：434-464，1998综述)。
对于通过θ类型机制进行的复制，复制起点可以定义为(i)可以支持质粒自主复制的最小顺式作用区域，(ii)DNA链融化以启动复制过程的区域，或(iii)开始合成前导链的碱基。复制起点包含质粒和/或宿主编码的蛋白质相互作用所需的位点。经历θ类型复制的质粒还包括pPS10、RK2(含有oriV)、RP4、R6K(含有oriy)、ColE1和CoIE2。ColEl是一类通过θ类型机制复制的小型多拷贝质粒的原型。C61E1复制的起点跨越约1kb的区域(Del Solar等人，1998)。
通过链置换机制进行复制的质粒的例子是IncQ家族的混杂质粒，其原型是RSF1010。该家族的成员需要三种质粒编码的蛋白质来启动DNA复制。这些蛋白质促进复合起点区域的起始，并且通过链置换机制向任一方向进行复制。复制起点已定义为当第二个质粒反式提供RSF110复制蛋白(RepA、RepB和RepC)时能够支持双向复制的最小区域。最小ori区域包括三个相同的20bp迭代子以及一个174bp的区域，该区域包含一个富含GC的片段(28bp)和一个富含AT的片段(31bp)(Del Solar等人，1998)。
通过滚动圆(RC)机制进行的复制是单向的，并且由于前导链的合成和落后链的合成是不耦合的，因此被认为是不对称过程。RC复制基础的分子机制的研究主要是通过葡萄球菌质粒pT181、pC221、pUBHO、pC194以及链球菌质粒pMV158及其Amob衍生物pLS1进行的。经历RC复制的其他质粒或噬菌体包括但不限于pS194、fd、
Figure BDA0002518693810000451
pE194和pFX2(Del Solar等人，1998)。
原核生物具有染色体DNA的环状分子，通常具有单个复制起点。例如，大肠杆菌和其他细菌复制的染色体起点称为oniC。本方法预想使用本领域已知的复制起点，所述复制起点已从物种特异性质粒DNA(例如上文讨论的ColE1、R1、pT181等)、噬菌体(例如
Figure BDA0002518693810000461
和M13)和细菌染色体复制起点(例如oriC)。
(iv)抗生素抗性基因
转导颗粒的质粒DNA将可选地具有抗生素抗性基因，以促进质粒的分子生物学克隆并允许选择由质粒转化的细菌。抗生素抗性基因是本领域众所周知的，包括但不限于氨苄青霉素抗性(Ampr)、氯霉素抗性(Cmr)、四环素抗性(Tetr)、卡那霉素抗性(Kanr)、潮霉素抗性(hyg或hph基因)和霉素抗性(Zeor)。优选地，抗生素抗性基因保护细菌免受除其抗药性或敏感性之外的药物(或不同于该药物)的抗微生物作用或细胞毒性作用。在另一个实施方式中，抗生素抗性基因保护细菌免受药物的抗微生物作用或细胞毒性作用，该药物与正在测试其抗性或敏感性的药物相同。
F.制造转导颗粒的方法
通过修饰天然存在的噬菌体以携带能够将目标细菌转化为易于识别的表型的基因(以下称为报告基因)，来获得本发明方法中使用的转导颗粒或重组噬菌体。转导颗粒必须能够以使细菌宿主能够以可检测的方式表达基因功能的方式特异性地将报告基因引入目标细菌宿主。存在大量噬菌体，并且可以基于所需宿主范围和噬菌体携带和转导目的基因的能力来选择用于修饰的噬菌体。特别地，噬菌体必须足够大以容纳报告基因、相关的启动子区域、噬菌体包装位点和可能包括的任何其他DNA区域。修饰的噬菌体通常保持未修饰的噬菌体的正常宿主范围特异性，尽管特异性的一些改变是可以接受的，只要它不影响确认所选目标细菌的能力即可。
待修饰的噬菌体可以是温和的或毒性的，优选是温和的。噬菌体的修饰产生了转导颗粒，其仍然能够将报告基因引入目标细菌宿主。报告基因是质粒或其他自我复制性游离单位的一部分，它将在受感染的宿主中持续表达。
报告基因的转导可以通过报告基因的瞬时表达(即，来自细胞不稳定遗传的报告基因的表达)来进行。在这种情况下，噬菌体转导的DNA可能无法在整个测试期间完整保存。但是，在DNA降解之前，通过噬菌体转导的报告基因的转录将足够有效，以确保在测试期结束之前细菌已组装了功能性报告基因。因此，即使细菌降解了噬菌体DNA，也可以通过测定来检测细菌。
可用于本方法中的噬菌体可获自微生物库，例如American Type CultureCollection，P.O.Box 1549，Manassas，Va.，20108，USA。毒性噬菌体可作为无细菌的裂解物获得，而溶原性噬菌体通常可作为受感染的宿主细胞获得。可以通过常规重组DNA技术修饰从任何来源获得的野生型噬菌体，以便引入能够产生感兴趣的可检测表型的所需报告基因。在引入之前，感兴趣的报告基因将与合适的基因盒上的启动子区域结合。可以通过常规重组DNA技术在合适的宿主(如大肠杆菌)中构建基因盒。报告基因和启动子区域均应选择在目标宿主中起作用，并且盒可以可选地包括第二报告基因，例如抗生素抗性、重金属抗性等，以促进体外操纵。
报告基因(或多个基因，如果不是单一基因系统的话)能够在目标细菌宿主中表达可筛选表型。如下文中所使用的，短语“可筛选表型”旨在表示一种特征或性状，即使所有细胞在混合培养物中正常生长和繁殖时，该特征或性状也可以使表达该表型的细胞与不表达该表型的其他细胞区分开。即，当感染的目标细胞存在于不表达表型的活的、通常增殖的非目标细菌的混合群体中时，可以进行特征或性状的检测。优选地，可筛选表型将包含可目视检测的特征，即可以在目标细胞和非目标细胞的混合群体中直接或间接观察到的特征。该表型通常将是不可选择的，即在特定条件下提供存活或优先生长(阳性选择)或在特定条件下提供生长抑制或杀死的表型。该方法不需要将样品中存在的目标细菌与可能存在于样品中的非目标细菌分离或相对于其富集，原因是当目标细菌仅包含存在的活细菌的一部分时，可以观察到该性状。
报告基因可以自身编码可筛选表型，或者可以是编码表型的多基因系统的一部分，其中其他基因存在于或单独引入待检测的宿主中。例如，转导颗粒可以携带lacZα基因，该lacZα基因在宿主中需要互补的lacZβ基因或lacZΔM15缺失才能表达。
合适的可筛选表型包括生物发光、荧光、酶催化的颜色产生(如使用碱性磷酸酶)。这些表型中的每一个可以通过常规的可视化技术来观察，所述常规的可视化技术提供完成信号产生反应所必需的化学试剂。在一些实施方式中，可筛选表型是异源水解酶，其催化底物水解成可检测产物，例如荧光团或发色团。在一些实施方式中，可筛选表型是异源的非编码RNA，其可以被特异性结合所得扩增子的探针扩增和检测。在一些实施方式中，可以通过RT-HDA检测异源非编码RNA。
对于噬菌体，可以通过将噬菌体包装位点与质粒或盒附接在DNA构建体中来包装质粒或报告基因盒。可以从噬菌体基因组获得包装位点，并将其克隆到携带报告基因、启动子区域和可选的第二报告基因的质粒中。然后可以将质粒转移到合适的细菌宿主中。细菌宿主然后将产生具有包装在噬菌体外壳内的质粒和/或标记基因盒的转导颗粒，所述噬菌体外壳能够将质粒DNA插入其宿主范围的细菌中。通过同时用质粒和噬菌体感染合适的宿主，将质粒转置(transpose)到所需的噬菌体中。温育宿主细胞并收集转导颗粒。一部分的噬菌体将携带质粒。可以通过常规技术将转导颗粒与噬菌体分离。
宿主特异性噬菌体包装位点基本上与在噬菌体基因组中与其相邻的天然序列分离。正如本文中使用的，关于噬菌体包装位点的术语“基本上分离”是指它们不在其自然环境中。即，包装位点不在自然界中发现的全长噬菌体基因组核酸序列中。可以通过实验技术，例如使用限制性核酸内切酶和通过聚合酶链反应进行克隆或扩增，从全长噬菌体基因组序列中分离包装位点。包装位点也可以合成生产。
噬菌体包装位点是核酸片段，其全部或部分缺少自然界中通常与其相关的序列；或天然存在的序列，但具有与其相关的异源序列。它是与噬菌体基因组分离的片段。
正如本文中使用的，在噬菌体包装位点的上下文中的短语“功能等同物”是指在定性上与野生型噬菌体包装位点相同的包装位点。因此，如果分离的噬菌体包装位点引导DNA的包装，则如果DNA片段也以相同的方式引导DNA的包装，则DNA片段将是功能等同的。根据该方法，片段不需要是功能上的等价物。因此，具有核苷酸取代、缺失和/或添加的核苷酸的噬菌体包装位点可以是分离的噬菌体包装位点的功能等同物。
G.使用噬菌体的方法
可以使用由完全完好的噬菌体或其变体组成的转导噬菌体颗粒来实施前述实施方式，其包含最小的结构元件以允许将颗粒转导到宿主细胞中。在某些情况下，可能会感染生物样品并直接观察其变化和表型，尽管在其他情况下，最好首先对样品中存在的细菌进行大量培养。获取样品的方法和(如果需要)制备大量培养物的方法将根据生物样品的性质而有所不同，标准微生物学和细菌学教科书(例如Bergey's Manual of DeterminativeBacteriology，第8版)，Buchanan和Gibbons(编辑)Williams&Wilkens Co.，巴尔的摩(1974)；Manual of Methods for General Bacteriology，Gerhardt等人(编辑)，Am.Soc.Microbiology，华盛顿(1981)；和Manual of Clinical Microbiology(第8版)，Patrick，R等人(编辑)，Am.Soc.Microbiology，华盛顿(2003)中详细描述了用于制备各种样品类型的合适技术。
噬菌体本身可以以多种形式添加到样品中。它可以以干燥状态添加。噬菌体可以混合或悬浮在液体试剂混合物中。可以将其悬浮在装有样品的小瓶中。它也可以采用任何其他合适的形式。添加到样品中的噬菌体有时在本文中称为“亲代噬菌体”。一旦与噬菌体接触，该样品被称为噬菌体暴露样品。
可以将噬菌体暴露的样品温育预定时间。温育时间应足够长，以使被感染的目标细菌(如果存在于暴露的样品中)产生噬菌体标记。噬菌体暴露的样品处于有利于目标细菌噬菌体感染的条件下。这可以通过多种方式来完成。例如，可以将亲代噬菌体混合到试剂中，当将其添加到样品中时，产生有助于感染的测试样品。可以以许多不同的方式制备样品以建立有利于噬菌体感染的条件。
假设样品中有目标细菌，则测试样品将包含噬菌体标记。亲代噬菌体通过将自身附着于目标细菌的细胞壁并注射病毒核酸以产生被感染的细菌来感染目标细菌。然后，重组噬菌体标记基因在感染的细菌中大量表达。如果细菌具有代谢活性，例如正在生长或分裂，则每个后代将包含标记基因的其他副本(或被噬菌体感染)，从而产生更大的信号。相反，如果细菌处于静止状态或死亡，则会生成较小的信号。
可以经由多个处理步骤的实施来分析标记。在一实施方式中，该方法涉及裂解细菌。在一实施方式中，将微生物溶菌酶添加至暴露于噬菌体的样品。在一个实施方式中，裂解涉及向暴露于噬菌体的样品中添加氯仿、用酸处理暴露于噬菌体的样品、或以其他方式物理处理暴露于噬菌体的样品。
与其他方法相反，不需要后代噬菌体的产生、宿主的破裂、后代噬菌体向测试样品中的释放以及随后的几轮细菌感染。此外，尽管许多现有技术方法依赖于检测完好的子代噬菌体，但是本公开内容的实施方式涉及检测过表达的标记蛋白，所述标记蛋白不是由细菌或噬菌体或受细菌感染的宿主(例如人)天然表达的。在其他实施方式中，标记基因的产物可以赋予某些表型，例如抗生素抗性或增强的生长特性，可以对其进行功能筛选。
在一个实施方式中，噬菌体标记是样品中目标细菌的存在的间接指示剂。当噬菌体标记是亲代噬菌体的成分时，可以控制暴露样品中亲代噬菌体的初始浓度，以使产生的背景信号在测定中不可检测。因此，如果样品中不存在目标细菌，则不会发生感染，不会表达重组噬菌体标记基因，且也不会合成新的噬菌体标记。在一个实施方式中，使用已知缺乏目标细菌类型的对照样品进行阴性对照，以证实所用噬菌体在测定中不产生背景信号。本公开内容的其他方面可以提供阴性对照的用途，以用于识别背景信号，该背景信号可与源自包含目标细菌的暴露样品的任何信号区分开。
在某些实施方式中，一旦制备了生物学样品(有或没有大量培养物的生长)，通常将其在促进颗粒与细菌结合和遗传物质注射的条件(通常在支持细菌快速生长的温度下(例如35℃至40℃)，而不搅拌足以允许感染的时间(例如15分钟至120分钟))下暴露于转导颗粒。感染后，将细胞温育以允许报告基因的表达，并如下所述检测报告基因的表达。
所述方法适用于均质分离物以及异源细菌样品，其包括例如多种细菌。术语“多种”是指两种或更多种单元，例如细菌菌种，尽管各种单元不必在结构和/或功能上不同。在某些实施方式中，可以例如使用适合于特定种群的特定营养培养基来筛选样品以提供均匀的细菌菌种群。
与旨在产生被转导的细菌细胞的同源菌落的常规噬菌体转导技术相反，该方法不需要以任何方式分离被转导的细菌。相反，可以在生物样品的未选择部分中检测到由报告基因或其产物赋予的可筛选表型(如可目视观察到的性状)，在该部分中将存在活的、通常增殖的非目标细菌。筛选无需选择即可进行，因为不需要分离转导的细菌。
在一些实施方式中，该方法包括分析样品中是否存在标记核酸或其产物。用于检测标记核酸或其产物的合适方法是本领域已知的，并且可以将根据样品的性质而变化。
在一些实施方式中，通过进行上述抗生素处理、噬菌体转化和检测步骤，提供了确定细菌对抗生素的敏感性或抗性的方法。抗生素处理和噬菌体转化的这些步骤可以以任何顺序或同时进行。在一实施方式中，抗生素治疗和噬菌体转化的步骤顺序进行。正如本文中使用的，术语“顺序”是指步骤是按顺序进行的，例如以几分钟、几小时、几天或几周的间隔进行。如果合适的话，这些步骤可以以规则的重复周期进行。在另一个实施方式中，抗生素处理步骤和噬菌体转化步骤一起进行，然后进行确定步骤。H.
检测方法
检测报告基因或其产物的方法可以是间接的或直接的。间接检测可以包括将报告基因或其产物与样品中的其他组分分离，或将样品中的报告基因或其产物浓缩，然后在纯化或浓缩的样品中检测报告基因或其产物。可以以释放状态(如在含有噬菌体的培养基中)或以结合形式(如包含在细胞溶质中或整合到基因组中的细菌内部)检测报告基因或其产物。在一些实施方式中，报告分子可以是具有酶促活性(例如CAT活性或AP活性)的蛋白质，如前所述。在这种情况下，使用酶促技术确定报告分子活性。在一些实施方式中，报告分子是水解物，其催化底物水解成可检测的分子。
在一个实施方式中，使用质谱法检测报告蛋白或其片段。特别地，可以使用将色谱步骤与质谱步骤联系起来的技术。一般而言，报告蛋白或其片段的存在可以使用液相色谱法随后通过质谱法确定。
在一些实施方式中，液相色谱是高效液相色谱(HPLC)。HPLC的非限制性示例可包括分配色谱、正相色谱、置换色谱、反相色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱、生物亲和色谱、水性正相色谱或超快液相色谱。在一实施方式中，液相色谱可以是超快液相色谱。
在一些实施方式中，质谱可以是恒定中性损失质谱。在其他实施方式中，质谱可以是串联质谱(MS/MS)。在不同的实施方式中，质谱可以是基质辅助的激光解吸/电离(MALDI)。在一个具体的实施方式中，质谱可以是电喷雾电离质谱(ESI-MS)。
在示例性实施方式中，该方法包括液相色谱法，随后进行串联质谱法。在一个特别示例性的实施方式中，该方法包括液相色谱，然后如实施例中所述进行串联质谱。在另一个示例性实施方式中，该方法包括液相色谱，然后进行恒定中性损失质谱分析。在一个特别示例性的实施方式中，该方法包括液相色谱，然后如实施例中所述进行恒定中性损失质谱分析。在又一示例性实施方式中，该方法包括液相色谱，然后进行电喷雾电离质谱(ESI-MS)。
在上述每个实施方式中，液相色谱法随后用质谱法可确定样品中报告蛋白或其片段的存在，或者液相色谱法随后用质谱法可确定样品中报告蛋白或其片段的存在。样品中报告蛋白或其片段的存在和数量。在优选的实施方式中，液相色谱法接着质谱法可以用于确定样品中报告蛋白或其片段的存在。
在另一个实施方式中，可以使用细胞计数技术检测报告蛋白或其片段。尽管已经在其他地方报告了进行培养细菌的细胞计数测量的方法(Martinez等人，Cytometry(1982)3(2)：129-33；Suller等人，J Antimicrob Chemother(1997)40(l)：77-83；和Roth等人，Appl Environ Microbiol(1997)63(6)：2421-31)，它们不涉及噬菌体报告蛋白的检测。细胞计数检测方法可适用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，例如Escherichia coli(Martinez，同上)、Bacillus cereus(Roth，同上)、S.aureus(Suller等人，J AntimicrobChemother(1997)40(l)：77-83)、Staphylococcus epidermidis(Cohen等人，J ClinMicrobiol(1989)27(6)：1250-6)、Streptococcus pyogenes(Cohen，同上)、Klebsiellapneumoniae(Cohen，同上)、Pseudomonas aeruginosa(Cohen，同上)、P.stutzeri(Cohen，同上)、Proteus mirabilis(Cohen，同上)和Enterobacter spp.(Cohen，同上)。
在前述实施方式中，该方法利用了宿主特异性重组或工程噬菌体。例如，能够感染Yersinia pestis的经遗传修饰的
Figure BDA0002518693810000531
可用于特异性检测Yersinia pestis。为了检测多种目标细菌类型，可以将对每种目标细菌类型特异性的一种噬菌体添加到单个测试样品中，或单独添加到其划分中。
I.水解酶
在本文描述的方法的一些实施方式中，重组或工程改造的噬菌体可以包含用于编码水解酶的基因，其可以与目标细菌菌种、噬菌体、非人类动物、人类、或其组合异源。为了本公开内容的目的，水解酶可以是催化特定底物的一个或多个化学键的水解的任何酶。合适的底物的示例包括但不限于化合物，例如蛋白质、多肽、淀粉、脂肪、磷酸酯和核酸。
在一些实施方式中，水解酶可以选自纤维素酶、角质酶、酯酶、脂肪酶、磷酸酯酶、限制性核酸内切酶和蛋白酶。在一些实施方式中、水解酶可以选自胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、弹性蛋白酶、DNase I、分散酶、纤溶酶、菠萝蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、神经氨酸酶、磷脂酶、胆固醇酯酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、纤维蛋白溶酶、沙雷菌蛋白酶、胰酶、淀粉酶、溶菌酶、组织蛋白酶-G、碱性和酸性磷酸酶、酯酶、脱羧酶、磷脂酶D、P-木糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶、硫代葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酸酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-果糖呋喃糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酸酶和PMN白细胞丝氨酸蛋白酶。其他合适的水解酶对本领域技术人员将是明显的。
在工程或重组噬菌体中编码的水解酶优选是异源的，并且通常未见于人、细菌或工程或重组噬菌体中。使用此类异源基因和酶使得本公开方法的测试系统与目标细菌菌种的天然组分的交叉反应的可能性最低。
在本文公开的方法的一些实施方式中，仅在特定细菌-噬菌体相互作用时才产生由工程改造或重组噬菌体编码的水解酶。因此，当产生酶时，它是目标细菌菌种的存在的阳性指示。随着工程或重组噬菌体的扩增和细胞裂解的发生，酶在溶液中释放，随后它可以与底物相互作用。可替代地，可以将酶与信号序列融合以从细胞分泌酶。
J.底物
可以设计仅与目标细菌菌种与工程或重组噬菌体相互作用时才产生的选择的异源酶特异性相互作用的底物。可以将设计的底物包含在用于培养细菌的试剂配方中。在底物催化或水解时，产生可检测的信号。在一些实施方式中，底物是分子内淬灭的酶特异性底物。分子内淬灭的酶特异性底物可包含淬灭的信号传导分子(例如荧光团或发色团)、淬灭分子(即淬灭剂)和底物接头。底物接头将信号分子桥接至淬灭剂，并使两者紧密相邻。
图1描绘了分子内淬灭的酶特异性底物的一个实施方式的图示。在此图示中，一种或多种淬灭剂(深色圈)通过底物接头(白带形状)连接到信号传导分子(带有向外延伸的辐射线的浅色圈)。在一些实施方式中，一种或多种底物接头可将一种或多种淬灭剂与一种或多种信号传导分子连接。在一些实施方式中，单个信号传导分子通过单个底物接头连接至单个淬灭剂。在一些实施方式中，多个信号传导分子通过单个底物接头连接至多个淬灭剂。
在一些实施方式中，仅当彼此非常接近(例如约3nm至约5nm)时，淬灭剂才淬灭荧光或比色信号。在桥联底物发生水解时，淬灭剂和信号分子不再紧密结合，并且淬灭作用降低或消除。当信号分子是荧光团或发色团时，未淬灭的信号分子可以通过测量荧光或比色信号来检测。当信号高于预定阈值时，表明存在目标细菌菌种。相反，如果不存在目标细菌菌种，则噬菌体将不会扩增，并且信号不会超过预定阈值。
在一些实施方式中，可以通过使用目前公开的酶特异性底物来检测目标细菌菌种的敏感性。在一些实施方式中，在有效量的对抗生素或抗微生物剂敏感的目标细菌菌种存在下，温育的目标细菌菌种不会以足以产生可检测信号或高于预定阈值的可检测信号的量扩增重组或工程改造噬菌体。当未检测到信号或信号低于预定阈值时，表明对抗微生物剂敏感。如果目标细菌菌种对抗生素或抗微生物剂具有抗性或不敏感，则将产生高于预定阈值的可检测信号。因此，阴性或阳性结果可表明细菌菌种对抗生素或抗微生物剂的敏感性。
合适的信号分子对本领域技术人员将是明显的。例如，荧光团和淬灭剂的组合可以选自下表4中列出的一对。
表4：荧光团-淬灭剂组合的实例
荧光团 激发 发射 淬灭剂 吸光度
Alexa 405 401nm 422nm DABCYL 390-510nm
FAM 494nm 519nm BHQ-1 480-580nm
Cy3 548nm 561nm BHQ-2 560-670nm
Cy5 647nm 665nm BHQ-3 620-730nm
K.解旋酶依赖性扩增(HAD)
当标记是编码异源非编码RNA的基因时，可以使用逆转录酶解旋酶依赖性扩增(RT-HDA)来检测或测量标记的水平或活性。将RT-HDA应用于本方法的过程在本领域普通技术人员的能力范围内。这样的方法在美国专利号7,282,328、7,662,594、7,829,284、8,685,648、9,303,288、9,121,054中有所描述，其内容通过引用整体并入本文。可以获得使用HDA的商业方法和仪器，例如Quidel(加利福尼亚州圣地亚哥)出售的Solana系统。
RT-HDA可以将工程菌噬菌体产生的信号放大高达约109倍，这使得RT-HDA适合用于检测低水平的标记。感染目标细胞后，会产生独特、稳定的自剪裁RNA，裂解后可通过RT-HDA检测。RT-HDA可以使用已优化用于RNA模板检测的试剂的预定混合物(逆转录酶、解旋酶、DNA聚合酶、RNase HII、缓冲液、dNTP和辅因子)。在一些实施方式中，将使用标准软件将对每个非编码RNA具有特异性的引物设计为跨越内含子连接。在一些实施方式中，非编码RNA是自剪接的。另外，RT-HDA可以使用探头。在一些实施方式中，探针可以大约18-20个碱基长，被设计成与非编码RNA和/或对应于非编码RNA的cDNA的剪接连接位点重叠(且因此对于RNA是唯一的，并且是噬菌体DNA缺失)，并具有对每种细菌菌种特异性的荧光团/淬灭剂对，它们将以不同的波长发出荧光。然后可以评估培养分离株的检测和药敏分析。
在一些实施方式中，使用等温HDA。该技术在65℃的恒定温度下的指数扩增过程中使用DNA解旋酶分离DNA链。因此，仪器成本大大低于需要温度循环的PCR。像PCR一样，HDA依赖于2个引物，且可以适应多种形式的基于探针的检测。在临床样品中常见的抑制剂存在下，选定的酶能够扩增目标序列。HDA可以比DNA更快地扩增RNA，因为DNA解旋酶可以解开RNA：DNA和DNA：DNA双链体，同时发生逆转录和扩增反应。
在示例性的实施方式中，通过RT-HDA以以下方式分析已经被工程改造的噬菌体转化的培养物，所述工程改造的噬菌体具有编码非编码RNA的异源基因。感染后，非编码RNA标记被表达并从细胞中释放出来。非编码RNA可以是包含两个或更多个剪接的内含子的自剪接RNA。然后使用逆转录酶转录非编码RNA，以生成cDNA扩增子。解旋酶和其他转录辅助蛋白可以解开RNA：DNA和DNA：DNA双链，以帮助转录和扩增。重复该循环，直到产生足够量的扩增子。分子内淬灭的探针用于检测扩增子。探针可以包含淬灭剂、信号传导分子(如荧光团或发色团)和核酸接头。核酸接头结合信号传导分子和淬灭剂，并充当将淬灭剂和信号传导分子紧密相邻(例如，约3至约5nm)的桥。接头是设计成在跨越非编码RNA和/或cDNA扩增子的剪接的内含子接头的序列位置的位点上结合扩增子的核酸。接头核酸可在内含子连接位点具有单个RNA碱基，以帮助接头的快速切割。裂解后，信号分子和淬灭剂不再紧密靠近，并且淬灭减轻。RNase可用于裂解包含一个或多个RNA碱基的核酸接头。然后可以检测信号传导分子的信号作用。在一些实施方式中，通过荧光或比色法测量来检测信号。
在根据本文描述的方法的一个实施方式的第一示例性工作流程中，获得了包含细菌的样品。如上所述，样品可以来自受试者、食品、环境等。如果需要或期望，可以对样品进行加工或处理。将样品的等份试样在抗生素存在下温育或培养，并且可选地，将样品的等份试样在不含抗生素的情况下温育或培养。同时或依次将样品等份试样与对样品中的细菌具有特异性的重组或工程噬菌体一起温育或培养。如上所述，工程改造的噬菌体包含异源标记。然后，分析与抗生素和工程噬菌体温育产生的培养物，以确定标记的存在或不存在(定量或定性)，并报告结果或数据。
在根据本文所述方法的另一个实施方式的第二示例性工作流程中，获得了包含细菌的样品。如果需要或期望，可以对样品进行加工或处理。准备包含有或没有抗生素的液体介质的容器。将样品的等份试样放入每个容器中并混合。然后，将每个容器在所需温度下温育所需时间，并且在该实施方式中，将每个容器在35℃下温育2小时。温育后可以再次混合容器，然后将工程改造的噬菌体引入容器中，混合，然后温育以产生继代培养物。然后分析等份试样的继代培养物是否存在异源标记(定量或定性)。
上述的第一和第二工作流程是示例性的，用于进行本文所述的方法和确定以筛选针对细菌样品、细菌菌株或细菌菌株混合物的候选抗生素的功效。通常，该方法包括使细菌样品与测试抗生素接触以获得原代培养物，并与缺乏该测试抗生素的溶媒接触以得到对照原代培养物。使包含编码异源报告基因表达的核酸序列的特异性噬菌体与原代培养物和对照原代培养物接触，以获得包含经测试抗生素处理的细菌的第一继代培养物和包含未经测试抗生素处理的细菌的第二继代培养物；在第一和第二继代培养物中检测报告基因或其产物的水平或活性，其中与第二继代培养物相比，第一继代培养物中的报告基因或其产物的水平或活性降低(或不存在)，这表明测试化合物是抗生素。该方法还用于筛选针对多种细菌菌株的单一测试抗生素。所述方法还用于抗生素或候选抗生素的最小抑制浓度(MIC)和/或筛选以确定临床抗生素化合物的功效。
正如本文中使用的，术语“最小抑制浓度”是指将抑制微生物的可见生长的抗生素的最低浓度。该术语还涵盖使用本文所述的方法和测定来影响细菌细胞死亡或抑制细胞壁修复的最低浓度的抗生素。在一个实施方式中，本文描述的方法和测定允许确定针对细菌菌株的抗生素或候选抗生素的最小抑制浓度。在一个实施方式中，抗生素的最小抑制浓度可以通过测量与未暴露于抗生素的样品或暴露于不同浓度的相同抗生素的样品中的相同细菌细胞相比的、暴露于抗生素的样品中的细菌细胞的响应的调节(如报告基因染色的摄取或挤出、形态改变、代谢改变等)来确定。
最小抑制浓度是临床相关值，其指示待施用至受试者以诱导细菌细胞死亡和/或减轻细菌介导的疾病的至少一种症状的抗生素的最小有效剂量。临床上，最小抑制浓度不仅用于确定受试者将接受的抗生素的量，而且还用于确定要使用的优选抗生素。还可以确定候选抗生素的最小抑制浓度，以允许如功效确定和剂量信息以用于临床试验。
本方法可用于体外诊断，因为它们允许确定细菌对抗生素和其他杀菌剂的敏感性。通过在暴露于转导颗粒之前将细菌与待筛选的抗生素或杀菌剂进行短暂的温育，细胞的代谢活性将被停止，并且防止表型的改变。在如上所述使用转导颗粒初步证实细菌的存在之后，这样的测试将是有用的。然后可以将确定对细菌性感染致命的抗生素和杀菌剂用于受试者的治疗。对有用的抗生素和杀菌剂的这种快速和早期检测对于治疗严重的细菌感染可能是极宝贵的。
在一个实施方式中，该诊断方法可以包括使罹患或疑似罹患细菌性疾病的受试者的样品与一种或多种如本文所述的重组噬菌体接触；检测并可选地量化由噬菌体表达的标记的存在或不存在；将标记的存在与细菌性疾病(例如S.aureus)的病原体相关联，从而诊断受试者中的细菌性疾病。“受试者”是指脊索动物门的任何成员，包括但不限于人类和其他灵长类，包括非人类灵长类，例如黑猩猩和其他猿类和猴子；牲畜，例如牛、羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；鸟类，包括家禽、野生鸟类和野味鸟类，例如鸡、火鸡和其他鸡、鸭、鹅等。该术语涵盖成人和新生儿。
在某些实施方式中，在对细菌性疾病做出阳性诊断之后，可以根据标准临床程序可选地对受试者进行治疗、控制和随访。例如，可以用有效量的药剂(例如抗生素)来治疗受试者。为了本方法的目的，试剂的“有效量”将是在受试者中产生针对病原体试剂例如S.aureus反应的量。在这方面，患有咽炎的受试者可以用青霉素G苄星霉素(penicillin Gbenzathine)和/或阿莫西林治疗。如果发现受试者对治疗无反应，则可以使用上述方法分析病原体的抗生素抗性。如果对耐药菌株做出了阳性确认，则可以用第二种抗生素或更高剂量的抗生素，或两种或更多种抗生素的组合治疗受试者。
类似地，本方法可用于检测抗生素的存在(如动物产品中的抗生素残留)。在这种方法中，将待分析物质的提取物添加到对所讨论的抗生素敏感的细菌菌株的培养物中，并且将混合物温育预先确定如果存在给定量的抗生素则足以杀死该菌株的时间段。此时，添加对该菌株特异性的转导颗粒，并进行如本文所述的测定。如果存在给定量的抗生素，则该细菌菌株的细胞将死亡并且读数将为阴性(即荧光素酶测定法中没有发光)。如果给定量的抗生素不存在或低于MIC，则细菌将存活并且读数为阳性(即发光)。
在具体的实施方式中，提供了一种用于在噬菌体特异性的基础上测定先前已经变得对转导颗粒敏感的细菌的方式。即在第一步中，例如通过转化修饰目标细菌，使其含有或表达目的噬菌体的细胞特异性受体。在第二步中，将经修饰的(或标记的)细菌引入或混合到要对其进行追踪的样品环境中。样品环境可以是细菌存在的任何环境，包括室外(如土壤、空气或水)；在活的宿主(如植物、动物、昆虫)上；在设备(如制造、加工或包装设备)上；和临床样品中。然后，使用对所引入的受体特异性的噬菌体进行本文所述的噬菌体测定，并且可以监测或量化所标记的细菌的存在。
鉴于以下非限制性的实施例，进一步描述了前述实施方式。
实施例
本文所述的结构、材料、组成和方法旨在作为本发明的代表性实例，并且应理解，本发明的范围不受实施例范围的限制。本领域技术人员将认识到，可以对所公开的结构、材料、组成和方法进行改变来实施本发明，并且这种变化被认为在本发明的范围内。
实施例1
表达异源标记的重组噬菌体的构建。
在这项研究中，制备了由目标细胞、噬菌体载体或细菌感染的宿主非天然产生的分子(标记)，然后特异性检测异源分子(标记)。
重组噬菌体的构建：通过经由重组质粒介导的同源重组，将编码异源标记的DNA序列插入到编码衣壳蛋白(cps)的核酸序列下游的噬菌体基因组的强表达区域中来构建重组噬菌体。位于cps上游的强启动子在感染后噬菌体基因组的表达过程中被选择性激活，产生相应mRNA转录本的许多拷贝。重组噬菌体的构建使用编码报告基因的核酸的融合产物来完成，具有合适的转译信号(核糖体结合位点、中间区域、起始密码子)。代表性的方法在Loessner等人，Appl.Environ.Microbiol.,62(4)：1133-40，1996和美国专利号5,824,468中描述。
质粒载体电转化为电转感受态E.coliK1菌株(ATCC菌株23503)：通过在37℃下在Luria-Bertani(LB)肉汤中生长至0.8的光密度(OD)，然后在15％甘油中洗涤若干次，使该菌株成为电转感受态。用可从Bio-RadLabs(Hercules，CA)获得的GENE PULSER完成电转化。
用天然型噬菌体感染转化的E.coliK1菌株：感染宿主细菌后，至少少量的天然噬菌体将与质粒中luxAB侧翼的衣壳序列部分进行同源重组，从而将luxAB转移形成重组噬菌体。在LB-氨苄青霉素培养基中，转化的细菌在37℃下生长至光密度(OD)为0.4。以大约每10个细菌1个噬菌体的感染复数(MOI)添加噬菌体K1-5，并且监测OD直到裂解发生。通过0.45微米硝化纤维素膜(购自马萨诸塞州贝德福德的Millipore Corp.)过滤收集裂解物。
将裂解物用系列稀释液铺板并以噬菌斑形成到生长于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体琼脂上的野生型E.coliKl(ATCC 23503)上，并通过分析噬菌斑的报告基因活性来筛选重组Kl-5噬菌体。可以通过对噬菌体基因组进行测序来确认已经产生了包含正确整合的报告基因序列的重组噬菌体。借助于商业测序仪(Commonwealth Biotechnologies，Richmond，VA)完成测序。
最后，通过荧光或比色法检测表达的标记。
实施例2
使用DNA转座创建重组噬菌体
如Goryshin等人，J.Biol.Chem.，273(13)：7367-7374，1998中所述，使用可商购的EZ::TNTM转座酶系统(Epicenter Technologies，Madison，Wis)构建含有异源报告核酸的噬菌体。然后，将末端结合了ME的EZ：：TNTM转座体电转化为具有电转感受态的E.coli K1菌株(ATCC菌株23503)。通过在LB介质中在37℃下生长至光密度(OD)为0.8，然后在15％甘油中洗涤多次，使该菌株具有电适应性。使用可从Bio-Rad Laboratories(Hercules，CA)获得的BIORAD GENE PULSER完成电转化。
用天然的K1-5型噬菌体感染转化的E.coli K1菌株。在LB-氨苄青霉素培养基中，转化的细菌在37℃下生长至OD值为0.4。以大约每10个细菌1个噬菌体的感染复数添加噬菌体K1-5，并且监测OD直到裂解发生。在转座体电转化的宿主细菌感染后，至少少量的天然K1-5噬菌体将通过无害位置处的随机转座接受异源报告基因，这不会影响噬菌体的噬菌斑形成能力。通过0.45微米硝化纤维素膜(购自Millipore Corp.,Bedford,MA过滤收集裂解物。
使用标准方法，如荧光法、比色法等在裂解物中筛选报告基因产物的活性。
实施例3
使用重组噬菌体筛选从受试者获得的样品
识别出表现出细菌性感染症状(例如发烧、头痛、腹痛和恶心)的受试者(例如人类患者)，并从该受试者中采集至少以下样品之一：0.01mL脑脊液(CSF)样品、1.0mL痰样品以及1.0mL血液样品。当收集全部三个样品时，将每个样品用4.0mL的LB肉汤稀释，从而促进各个样品中存在的所有细菌的生长，并在37℃下温育4小时。温育后，将每个样品按100等份分配到96孔板的30个孔中。将血液样品的等份试样添加到孔1至30中，将CSF样品的等份试样添加到孔31至60中，并将痰样品的等份试样添加到孔61至90中。孔91至93用作阳性对照，而孔94至96用作阴性对照。当同时筛选对一种或多种抗微生物剂的敏感性时，某些孔将含有抗生素或抗生素的组合，而有些孔则不含抗生素。
获得以下五个重组噬菌体：Kl-5::luxAB噬菌体，其感染E.coli Kl细菌；EBN6::luxAB噬菌体，感染肠球菌；Twort：：luxAB噬菌体，感染葡萄球菌；Sp6::luxAB噬菌体，感染沙门氏菌；和RZh::luxAB噬菌体，感染链球菌。噬菌体可使用实施例1中所述的方案从其他来源获得或原位改造。
将相当于约3×108个噬菌体/mL的重组噬菌体悬浮液添加至30个孔的组的六个单独的孔中，所述孔分别对应于从患者收集的三个样品中的每个。下表5中提供了用于同时识别上述三个样品和抗微生物敏感性的96孔板的示例性配置。每个工程改造噬菌体都表达一个独特的标记，每个标记都有特异性活性。通过较小的调整，该系统适用于多重检测，例如，其中多个样品一起或同时处理。后一种系统对于确认与特定疾病的发病机理有关的细菌病原体群特别有用。例如，与尿路感染(UTI)相关的病原体，例如E.coli、Klebsiella、Enterobacter、Pseudomonas、Staphylococcus、Proteus都可以使用多重阵列格式进行确认和表征。
表5：96孔板的示例性配置
Figure BDA0002518693810000621
Figure BDA0002518693810000631
实施例4
分析存在标记的孔
进一步分析实施例3中的孔中的每个样品中是否存在由其中应用的重组噬菌体编码的异源标记。通过在孔1至96的每个溶液中使用探针来检测标记的存在。在培养物温育预定时间后添加探针。可替代地，可在探针存在下温育培养物。
水解酶标记分析
通过将特定的荧光团与特定的淬灭剂连接来设计水解酶的探针。例如，一种探针将FAM与BHQ-1结合在一起，BHQ-1的荧光激发波长为494nm，且荧光发射波长为519nm。淬灭剂和荧光团通过连接肽紧密相邻地连接在一起(如3至5nm)。当通过肽连接在一起时，淬灭剂和荧光团的紧密邻近降低了荧光团的荧光性质。使用具有相应淬灭剂的特定荧光团或发色团创建其他探针，并且每个探针都具有选自肽、碳水化合物和核酸的独特接头。如果在给定的培养物中存在对该接头特异性的相应水解酶标记，则每个唯一的接头都将被水解。
将探针添加到96孔板的孔1至93中，并允许温育持续预定时间。在预定的时间后，将96孔板引入荧光计，并根据探针中使用的特定荧光团获取荧光和发射光谱。对于FAM探针，在494nm处获取激发光谱，且在519nm处获取发射光谱。
当存在水解酶标记时，相应的特异性接头被水解并检测荧光。阈值荧光量的检测指示标记的存在。在没有标记的孔91至93和没有标记或探针的孔94至96中未检测到荧光。通过相应的噬菌体转化其中具有目标细菌菌种且不存在抗生素的孔，并产生水解酶标记。水解酶裂解底物接头，并且减少或消除了荧光团的淬灭。检测到荧光并指示和识别目标细菌菌种的存在。不存在目标细菌菌种的孔无法进行噬菌体感染，因此不会产生可转化为荧光信号的标记。除产生荧光信号的抗生素外，还存在目标细菌菌种的孔表明目标细菌菌种不敏感或对抗生素没有抗性。除不产生荧光信号或产生减弱的荧光信号的抗生素之外，还存在目标细菌菌种的孔表明目标细菌菌种对抗生素敏感。下面的表6提供了孔1至6的示例性测定。
表6：基于噬菌体的测定的示例性结果
孔 样品 噬菌体 抗生素 荧光团 519nm处的发射 标示
1 血液 K1-5::luxAB 无 FAM 是 存在E.coli K1
2 血液 K1-5::luxAB β-内酰胺 FAM 是 抗E.coli K1
3 血液 K1-5::luxAB 氟喹诺酮 FAM 否 E.coli K1敏感
4 血液 K1-5::luxAB 氨基糖苷 FAM 是 抗E.coli K1
5 血液 K1-5::luxAB 四环素 FAM 否 E.coli K1敏感
6 血液 K1-5::luxAB 多粘菌素 FAM 否 E.coli K1敏感
非编码RNA标记分析
可替代地，当标记编码独特的非编码RNA时，跨越非编码RNA位点的每个内含子剪接的五个独特探针被设计为带有荧光团/淬灭剂对，它们将以不同的波长发射荧光。创建一个探针，该探针具有ROX荧光团和BHQ-2淬灭剂，该探针通过对应于跨非编码RNA内含子剪接点的序列的核酸探针连接在一起。核酸接头具有至少一个RNA碱基。ROX的荧光发射波长为625nm。
优化了探针内的荧光团和淬灭剂之间的间距，以最小化背景荧光(<3.4nm距离)，以提供大于95％的信号抑制。将单个RNA碱基定位在每个探针中，以最大程度地利用RNaseHII对其进行切割。如果需要，可以考虑多个RNA碱基。
在由Quidel，Corp.销售的SOLANA系统上使用RT-HDA测试实施例3的孔中非编码RNA的存在。酶的主要混合物(逆转录酶、聚合酶、解旋酶和RNase HII)被加入培养物中以分离其中存在的任何非编码RNA。使用酶混合物扩增非编码RNA，并通过添加相应的探针并测量正确的波长(例如对于基于ROX的探针为625nm)的荧光发射来检测标记或其扩增子。与以上表6中提供的实施例类似地进行结果的解释。
其他实施方式：通过用说明书中其他地方描述的大致或具体描述的反应物和/或操作条件代替前述实施例中使用的反应物和/或操作条件，可以以相似的成功重复前述实施例。
根据前面的描述，本领域技术人员可以容易地确定所述方法的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以进行各种改变和修改以使其适应各种用途和条件。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文描述的那些类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是在前面的段落中描述了合适的方法和材料。另外，材料、方法和实施例仅是说明性的，并不意图是限制性的。在发生冲突的情况下，以包括定义的本说明书为准。
本文引用的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有公开的外国专利和专利申请均通过引用并入本文。本文引用的所有公开的参考文献、文件、手稿、科学文献均通过引用并入本文。与科学数据库(如NCBI、GENBANK、EBI)有关的所有标识符和登录号通过引用并入本文。

Claims (37)

1.一种用于同时确认细菌菌种并确定所述细菌菌种对测试抗微生物剂的敏感性的方法，包括：
(a)提供对所述细菌菌种特异性的转化噬菌体，其中所述转化噬菌体是具有用于编码标记的基因的工程或重组噬菌体，所述基因对于人类和细菌菌种都是异源的；
(b)通过在不存在所述测试抗微生物剂的情况下培养所述细菌菌种，以产生原代无测试抗微生物剂的培养物并在存在所述转化噬菌体的情况下培养所述原代无测试抗微生物剂的培养物来制备第一培养物；
(c)通过在存在所述测试抗微生物剂的情况下培养所述细菌菌种，以产生原代包含测试抗微生物剂的培养物来制备第二培养物；在存在所述转化噬菌体的情况下培养原代包含测试抗微生物剂的培养物；和
(d)分析所述第一培养物和所述第二培养物以确定在所述第一培养物和所述第二培养物中的每一个中的所述标记的水平或活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，检测所述第一培养物中的所述标记提供了所述细菌菌种作为对所述转化噬菌体是特异性的细菌菌种的阳性确认。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二培养物中的所述标记的水平或活性比与所述第一培养物中的所述标记的水平或活性降低表明所述细菌菌种对所述测试抗微生物剂敏感。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二培养物中的所述标记的水平或活性与所述第一培养物中的所述标记的水平或活性一致或比所述第一培养物中的所述标记的水平或活性增高表明所述细菌菌种对所述测试抗微生物剂不敏感或是对所述测试抗微生物剂具有抗性的。
5.一种用于在有需要的受试者中诊断细菌性疾病的方法，包括：
(a)提供包含细菌菌种的受试者样品；
(b)培养所述受试者样品以产生多种原代细菌培养物；
(c)提供多个转化噬菌体，每个转化噬菌体都对不同的细菌菌种具有特异性，其中每个转化噬菌体是具有编码独特标记的基因的工程或重组噬菌体，所述基因对于人类和细菌都是异源的；
(d)在存在(c)的转化噬菌体的情况下培养(a)的原代细菌培养物以提供多个继代细菌培养物，其中所述转化噬菌体在所述继代细菌培养物之间变化；
(e)分析所述继代细菌培养物以确定所述继代细菌培养物中独特标记的存在或不存在；
(f)将所述独特标记的检测与细菌菌种的存在相关联；和
(g)将细菌菌种的存在与细菌性疾病相关联。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述细菌菌种选自由革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌组成的组。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述细菌选自由鲍曼不动杆菌(Acinetobacterbaumannii)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、布鲁氏菌(Brucella aborus)、狗布鲁氏菌(Brucella canis)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏菌(Brucella suis)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉热衣原体(Chlamydia psittaci)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、肉毒杆菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)、肠杆菌属(Enterobacter sp.)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、耐万古霉素的粪肠球菌(vancomycin-resistantEnterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、产肠毒素性大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli(ETEC))、进入致病性大肠杆菌(enteropathogenic Escherichia coli)、大肠杆菌0157:H7(E.coli 0157.H7)、土拉弗朗西斯菌(Francisella tularensis)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、钩端螺旋体(Leptospira interrogans)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)、变形杆菌(Proteus)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、立克次氏菌(Rickettsia rickettsii)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)、宋内志贺菌(Shigella sonnei)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA))、耐万古霉素的金黄色葡萄球菌(vancomycin-resistant Staphylococcus aureus(VSA))、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、梅毒螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibriocholerae)和鼠疫杆菌(Yersinia pestis)或其组合组成的组。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述细菌选自由炭疽杆菌(Bacillusanthracis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、德氏乳杆菌(Lactobacillusdelbrueckii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)、克雷伯氏菌(Klebsiella)、沙门氏菌(Salmonella)、志贺氏菌(Shigella)以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)组成的组。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述噬菌体是裂解性噬菌体；温和或溶原性噬菌体；或丝状噬菌体。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述噬菌体是选自由T4、T7、T3和MS2组成的组的裂解性或生产性噬菌体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中，所述温和或溶原性噬菌体是λ噬菌体。
12.根据权利要求9所述的方法，其中，所述噬菌体是选自由f1、fd和M13组成的组的丝状噬菌体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述基因是真菌、植物或昆虫来源的。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述标记是水解酶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，所述水解酶选自由纤维素酶、角质酶、酯酶、脂肪酶、磷酸酯酶、限制性核酸内切酶和蛋白酶组成的组。
16.根据权利要求15所述的方法、其中，水解酶选自由胶原酶、透明质酸酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、弹性蛋白酶、DNase I、分散酶、纤溶酶、菠萝蛋白酶、梭菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、神经氨酸酶、磷脂酶、胆固醇酯酶、枯草杆菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶原激活剂、链激酶、尿激酶、纤维蛋白溶酶、沙雷菌蛋白酶、胰酶、淀粉酶、溶菌酶、组织蛋白酶-G、碱性和酸性磷酸酶、酯酶、脱羧酶、磷脂酶D、P-木糖苷酶、β-D-岩藻糖苷酶、硫代葡萄糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、α-D-半乳糖苷酶、α-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酸酶、α-D-甘露糖苷酶、β-D-甘露糖苷酶、β-D-果糖呋喃糖苷酶、β-D-葡萄糖苷酸苷酶和PMN白细胞丝氨酸蛋白酶组成的组。
17.根据权利要求13至16中任一项所述的方法，其中，分析培养物以确定所述水解酶的水平或活性包括检测对所述水解酶特异性的底物的水解。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述底物是分子内淬灭的荧光团或分子内淬灭的发色团。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，所述分子内淬灭的荧光团或所述分子内淬灭的发色团是具有下式的化合物：
Q-S-F
其中，
S包含对水解酶特异性的底物；
F是荧光团、化学发光分子或发色团；和
Q是淬灭剂；
其中S在Q和F之间形成链，并且S的水解切断所述链，从而减轻了Q对F的淬灭作用。
20.根据权利要求19所述的方法，其中，F是发色团，并且检测所述底物的水解包括检测可目视颜色变化或获取比色或光谱学读数。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，F是荧光团，并且检测所述底物的水解包括检测荧光或获取荧光读数。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，F选自由Alexa 405、FAM、Cy3以及Cy 5组成的组，并且Q选自由DABCYL、BHQ-1、BHQ-2以及BHQ-3组成的组。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，F是化学发光分子，并且检测所述底物的水解包括进行化学发光测定。
24.根据权利要求13至23中任一项所述的方法，其中，所述底物包含核酸序列，并且所述水解酶是对所述核酸序列特异性的限制性核酸内切酶。
25.根据权利要求13至23中任一项所述的方法，其中，所述底物包含多肽，所述水解酶是蛋白酶，并且所述多肽对所述蛋白酶是特异性的。
26.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，所述标记是与人类和所述目标物种都异源的非编码核糖核酸(RNA)。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述非编码RNA是自剪接的。
28.根据权利要求27所述的方法，其中，所述非编码RNA包含两个或更多个剪接的内含子。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的方法，其中，分析培养物以确定所述非编码RNA的水平或活性包括扩增所述非编码RNA。
30.根据权利要求29所述的方法，其中，通过逆转录酶解旋酶依赖性扩增(RT-HDA)扩增所述非编码RNA，从而产生对应于所述非编码RNA的互补脱氧核糖核酸(cDNA)扩增子。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述非编码RNA被扩增至少约10,000倍、至少约100,000倍、至少约1×106倍、至少约1×107倍、至少约1×108倍、至少约1×109倍、或至少约1×1010倍。
32.根据权利要求30或31所述的方法，进一步包括经由与所述cDNA扩增子特异性结合的分子内淬灭的探针检测所述cDNA扩增子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中，所述分子内淬灭的探针在与对应于所述非编码RNA的剪接点的位点重叠的区域结合所述cDNA扩增子。
34.根据权利要求32或33所述的方法，其中，所述分子内淬灭的探针包含荧光团，所述荧光团经由长度为约15至约30个碱基的核酸接头与淬灭剂连接。
35.根据权利要求34所述的方法，还包括通过使RNase与所述分子内淬灭的探针接触而使所述荧光团与所述淬灭剂断开连接。
36.根据权利要求35所述的方法，其中，所述RNase是RNase HII。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的方法，还包括检测荧光或获取荧光读数。
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