JP2015062373A - 遺伝子組換えウイルスによる微生物の迅速検出法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1]試料中の微生物を検出する方法であって、該方法は、
(a)微生物に特異的に結合し、該微生物内で増殖するウイルスに標識酵素を発現する遺伝子を導入する工程;
(b)試料と上記(a)で得られたウイルスを混合し、該試料中の微生物に該ウイルスを感染させる工程;
(c)該微生物内で、該遺伝子産物である標識酵素を産生する工程;
(d)該標識酵素に対する基質を添加する工程;及び
(e)基質に基づく色の変化により、試料中に該微生物が存在するか否かを検出する工程
を含む方法。
[2]前記微生物が、エスケリッチア属(Escherichia)、クロストリジウム属(Clostridium)、リステリア属(Listeria)、カンピロバクター属(Campylobactor)、サルモネラ属(Salmonella)、赤痢菌属(Shigella)、ブドウ球菌属(Staphylococci)、ビブリオ属(Vibrio)、エルジニア属(Yersinia)、プレシモナス属(Plesimonas)、バチルス属(Bacilli)、及びアエロモナス属(Aeromonouos)からなる群から少なくとも1種選択される細菌;ストレプトミセス属(Streptomyces)、アクチノミセス属(Actinomyces)、ビフィオバクテリウム属(Bifidobacterium)、及びサーモビフィダ(Thermobifida)属からなる群から少なくとも1種選択される放線菌;クルイベロミシス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、サッカロミケス属(Saccharomyces)、カンジダ属(Candida)、及びロドトルラ属(Rhodotorula)からなる群から少なくとも1種選択される酵母;ビソクラミス属(Byssochlamys)、フサリウム属(Fusarium)、ゲオトリクム属(Geotricum)、ペニシリウム属(Penicillium)、リゾクトニア属(rhizoctonia)、及びスコプラリオプシス属(Scopulariopsis)からなる群から少なくとも1種選択されるカビ類;クロレラ、スピルリナ、アナベナ属(Anabaena)、ミクロキスティス(Microcystis)、及びアレクランドリウム属(Alexandrium)からなる群から少なくとも1種選択される藻類;又はそれらの組み合わせから選択される、上記[1]に記載の方法。
[3]前記微生物が、大腸菌、サルモネラ菌、及び/又は赤痢菌である、上記[2]に記載の方法。
[4]前記ウイルスが、T4、PP01、P2、T2、T7、λ、MV−L2、PRD1、PM2、MV−L1、φX174、fd、MS2、φ6、FELIX01、及び/又はG47を含む群又はそれらからなる群から選択される、上記[1]〜[3]に記載の方法。
[5]前記標識酵素が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素及び/又はリガーゼである、上記[1]〜[4]に記載の方法。
[6]前記標識酵素が、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、及び/又はムタロターゼである、上記[5]に記載の方法。
[7]上記[1]〜[6]に記載の方法において使用される、試料中の微生物に特異的に結合し、該微生物内で増殖するウイルスを含む検出試薬であって、ここで、該ウイルスが、検出に使用される基質に対する標識酵素を発現する遺伝子が導入されている検出試薬。
[8]上記[7]に記載の検出試薬、標識酵素に対する基質、及び使用説明書を含む、試料中の微生物を検出するためのキット。
前述の通り、本発明は、試料中の微生物を検出する方法であって、該方法は、
(a)微生物に特異的に結合し、該微生物内で増殖するウイルスに標識酵素を発現する遺伝子を導入する工程;
(b)試料と上記(a)で得られたウイルスを混合し、該試料中の微生物に該ウイルスを感染させる工程;
(c)該微生物内で、該遺伝子産物である標識酵素を産生する工程;
(d)該標識酵素に対する基質を添加する工程;及び
(e)基質に基づく色の変化により、試料中に該微生物が存在するか否かを検出する工程
を含む方法、該方法において使用されるウイルスを含む検出試薬、並びに該検出試薬、標識酵素に対する基質、及び使用説明書等を含むキットに関する。
(1)標識酵素を有するベクター(T4ce)の作製
遺伝子組換えにより、標識酵素としてペルオキシダーゼを発現するT4ファージを作製した。具体的には、野生型T4ファージのゲノム上のsoc遺伝子とmrh2遺伝子のN末端に対応するDNA断片(T4soc−mrh2)を以下のプライマー:
配列1:5’-TTCCGGAATTCCATGGCTAGTACTCGCGG-3’(配列番号1)(下線はEcoRIの制限部位を示す);
配列2:3’-TTAGGGCCCGGTTTAATCCAACGATTTAACAT-5’(配列番号2)(下線はApaIの制限部位を示す)
を用いて、野生型T4ファージの溶解物を鋳型として増幅した。この増幅断片をEcoRI/ApaIにより消化後、pCR2.1−TOPOクローニングベクター(Invitrogen,CA,USA)のEcoRI/ApaI部位に挿入し、プラスミドベクターpCR2.1−reg.1を得た。次に、野生型T4ファージのゲノムから以下のプライマー:
配列3:5’-CGGGGTACCAGAAAAATCATATGAAGTTGA-3’(配列番号3)(下線はKpnIの制限部位を示す);
配列4:3’-TTGCGAGCTCCTCCTTTATTTAAATTACATG-5’(配列番号4)(下線はSacIの制限部位を示す)
を用いてg69遺伝子を増幅した。この断片をKpnI/SacI消化後、ペルオキシダーゼ遺伝子が組み込まれた上記ベクターのKpnI/SacI部位に挿入した(pCR2.1−reg.1−reg.2ベクター)。続いて、ペルオキシダーゼ遺伝子を以下のプライマー:
配列5:5’-TTGCGAGCTCATGACACCGCTCGTTCATGT-3’(配列番号5)(下線はSacIの制限部位を示す);
配列6:3’-TTCCGGAATTCCTATAAACCTTGTTCCTC-5’(配列番号6)(下線はEcoRIの制限部位を示す)
を用いて増幅し、SacI/EcoRI消化後、上記pCR2.1−reg.1−reg.2ベクターのSacI/EcoRI部位に挿入し、pCR2.1−reg.1−ce−reg.2ベクターを得た。
上記で作製したpCR2.1−reg.1−ce−reg.2ベクターを用いて、ペルオキシダーゼ遺伝子を相同組換えにより野生型T4ファージのゲノムに導入した。具体的には、Gene Pulser II(Bio−Rad,CA,USA)を用いたエレクトロポレーション(1.8kV、25μF、200Ω)によって、pCR2.1−reg.1−ce−reg.2ベクターを大腸菌K12株にトランスフェクトし、形質転換体を得た。この形質転換体を50mg/Lアンピシリン含有のLB培地中で培養した。OD600が0.1に達したときに、野生型T4ファージを感染多重度(M.O.I)を0.1にして添加した。37℃、120rpmにて4時間インキュベーション後、培養物を0.45μmの濾過フィルター(Advantec,Tokyo,Japan)を通過させて濾過し、ファージ溶解物を得た。このファージ溶解物をSMバッファー(100mMのNaCl、10mMのMgSO4、0.01%ゼラチン、50mMのTris−HCl、pH=7.5)で希釈した。希釈された溶解物を0.7%寒天中でK12株と混合し、LBプレートに重ねた。標識酵素遺伝子を有する組換えT4ファージ(T4ce)は、ジゴキシゲニン(DIG)標識プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションによって単離した。プラークハイブリダイゼーションは、フィルターハイブリダイゼーション用のDIGアプリケーションマニュアル(Roche,Upper Bavaria,Germany)に従って行われた。DIG標識されたceプローブを用いたハイブリダイゼーションを37℃にて6時間行った。NBT/BCIPストック溶液(Rhoche,Upper Bavaria,Germany)を用いた発色アッセイにより、プローブ−標的ハイブリッドを検出した。また、得られた組換えT4ファージ(T4ce)のゲノム中に所望の標識酵素遺伝子が組み込まれていることを確認するために、プライマー(配列1〜6)を用いて対応する遺伝子断片の増幅をおこない、アガロースゲル上で遺伝子断片を分離後、検出されたバンドを野生型T4のバンドと比較することによって、標識酵素遺伝子を確認した(データ示さず)。
T4ceファージによって生成される標識酵素の活性を評価した。OD600が0.5(約1×108CFU/mL)に達するまで、大腸菌K12株を37℃にて培養した。次に、この培養物を2つに分注し、それぞれ5.0のM.O.IでT4ceファージ及び野生型T4ファージ溶液のいずれかと混合した。これらの培養物を37℃にて1時間培養し、0.45μmのメンブレンフィルターを通過させ、濾過物を得た。次に、過酸化水素水(最終濃度18.75mM)及びペルオキシダーゼに対する発色基質として3,3’−ジアミノベンジジン(DAB)(Sigma-Aldrichから入手)の溶液(最終濃度3.0mM)を上記培養物に添加し、発色させた。DABは、ペルオキシダーゼと反応して茶褐色に発色する。反応溶液を分光光度計で測定し、450nmでの吸光度の変化を経時的に観察した(図1A)。吸光度の変化は、T4ceファージ(黒四角)及び野生型T4ファージ(黒丸)のいずれの添加系においても見られたが、標識酵素が遺伝子導入されたT4ceファージを用いた反応系において、大腸菌K12株を顕著に検出することができた。また、これらの反応溶液の発色の差は肉眼で容易に観察することができた(図1B)。
(1)標識酵素を有するベクター(PP01ce)の作製
遺伝子組換えにより、標識酵素としてチトクロームcペルオキシダーゼを発現するPP01ファージを作製した。具体的には、野生型PP01ファージのゲノム上のsoc遺伝子とmrh2遺伝子のN末端に対応するDNA断片(PP01socmrh2)を以下のプライマー:
配列7:5’-TTCCGGAATTCCATGGCTAGTACTCGCGG-3’(配列番号7)(下線はEcoRIの制限部位を示す);
配列8:5’-TTAGGGCCCGGTTTAATCCAACGATTTAACAT-3’(配列番号8)(下線はApaIの制限部位を示す)
を用いて、野生型PP01ファージの溶解物を鋳型として増幅した。この増幅断片をEcoRI/ApaIにより消化後、pCR2.1−TOPOクローニングベクター(Invitrogen,CA,USA)のEcoRI/ApaI部位に挿入し、プラスミドベクターpCR2.1pp−reg.1を得た。次に、野生型PP01ファージのゲノムから以下のプライマー:
配列9:5’-CGGGGTACCGAAGAAATCTTTAAACTTTATTATCTG-3’(配列番号9)(下線はKpnIの制限部位を示す);
配列10:5’-GGACTAGTTCTCCTTTTATTTAAATTACATGAC-3’(配列番号10)(下線はSpeIの制限部位を示す)
を用いてg56遺伝子を増幅した。この断片をKpnI/SpeI消化後、チトクロームcペルオキシダーゼ遺伝子が組み込まれた上記ベクターのKpnI/SpeI部位に挿入した(pCR2.1pp−reg.1−reg.2ベクター)。続いて、チトクロームcペルオキシダーゼ遺伝子を以下のプライマー:
配列11:5’-GGACTAGTATGACACCGCTCGTTCATGT-3’(配列番号11)(下線はSpeIの制限部位を示す);
配列12:5’-TTCCGGAATTCCTATAAACCTTGTTCCTC-3’(配列番号12)(下線はEcoRIの制限部位を示す)
を用いて増幅し、SpeI/EcoRI消化後、上記pCR2.1pp−reg.1−reg.2ベクターのSpeI/EcoRI部位に挿入し、pCR2.1pp−reg.1−ce−reg.2ベクターを得た。
上記で作製したpCR2.1pp−reg.1−ce−reg.2ベクターを用いて、ペルオキシダーゼ遺伝子を相同組換えにより野生型PP01ファージのゲノムに導入した。具体的には、Gene Pulser II(Bio−Rad,CA,USA)を用いたエレクトロポレーション(1.8kV、25μF、200Ω)によって、pCR2.1pp−reg.1−ce−reg.2ベクターを大腸菌K12株にトランスフェクトし、形質転換体を得た。この形質転換体を50mg/Lアンピシリン含有のLB培地中で培養した。OD600が0.1に達したときに、野生型PP01ファージを感染多重度(M.O.I)を0.1にして添加した。37℃、120rpmにて4時間インキュベーション後、培養物を0.45μmの濾過フィルター(Advantec,Tokyo,Japan)を通過させて濾過し、ファージ溶解物を得た。このファージ溶解物をSMバッファー(100mMのNaCl、10mMのMgSO4、0.01%ゼラチン、50mMのTris−HCl、pH=7.5)で希釈した。希釈された溶解物を0.7%寒天中でK12株と混合し、LBプレートに重ねた。標識酵素遺伝子を有する組換えT4ファージ(T4ce)は、ジゴキシゲニン(DIG)標識プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションによって単離した。プラークハイブリダイゼーションは、フィルターハイブリダイゼーション用のDIGアプリケーションマニュアル(Roche,Upper Bavaria,Germany)に従って行われた。DIG標識されたceプローブを用いたハイブリダイゼーションを37℃にて6時間行った。NBT/BCIPストック溶液(Rhoche,Upper Bavaria,Germany)を用いた発色アッセイにより、プローブ−標的ハイブリッドを検出した。また、得られた組換えPP01ファージ(T4ce)のゲノム中に所望の標識酵素遺伝子が組み込まれていることを確認するために、上記(1)において利用した制限部位に対応する制限酵素によりPP01ceファージを制限処理し、プライマー(配列7〜12)を用いて対応する遺伝子断片の増幅をおこない、アガロースゲル上で遺伝子断片を分離後、検出されたバンドを野生型PP01のバンドと比較することによって、標識酵素遺伝子を確認した(データ示さず)。
PP01ceファージによって生成される標識酵素の活性を評価した。OD600が0.5(約1×108CFU/mL)に達するまで、大腸菌O157:H7を37℃にて培養した。次に、この培養物を2つに分注し、5.0のM.O.IでPP01ceファージ又は野生型PP01ファージ溶液のいずれかと混合した。これらの培養物を37℃にて1時間培養し、0.45μmのメンブレンフィルターを通過させ、濾過物を得た。次に、過酸化水素水(最終濃度360μM)及びチトクロームcペルオキシダーゼに対する発色基質としてウマ心臓由来のチトクロームc(Sigma-Aldrichから入手)の溶液(最終濃度19μM)を上記培養物に添加し、色の変化を観察した。チトクロームcは、ペルオキシダーゼと反応して赤褐色が退色する。反応溶液を分光光度計で測定し、550nmでの吸光度の変化を経時的に観察した(図2A)。吸光度の変化は、T4ceファージ(黒四角)及び野生型PP01ファージ(黒丸)のいずれの添加系においても見られたが、標識酵素が遺伝子導入されたPP01ceファージを用いた反応系において、大腸菌O157:H7を顕著に検出することができた。また、これらの反応溶液の色の差は肉眼で容易に観察することができた(図2B)。
市販の果汁飲料に非病原性大腸菌O157:H7を植菌し、果汁飲料中の大腸菌を実施例2で作製した遺伝子組換えウイルスによって検出できることを実証した。具体的には、市販のリンゴジュース0.425mLに、大腸菌O157:H7培養液(約1×108CFU/mL)を2.575mL添加し、混合した。次に、この果汁飲料を3つに分注し、そのうち2つには、5.0のM.O.IでPP01ceファージ及び野生型PP01ファージ溶液のいずれかと混合した。3つ目の果汁飲料は、ファージを添加しないブランクとして使用した。これらの果汁飲料を37℃にて1時間培養し、0.45μmのメンブレンフィルターを通過させ、濾過物を得た。次に、実施例2と同様に、過酸化水素水(950μM)及びチトクロームcペルオキシダーゼに対する基質としてウマ心臓由来のチトクロームcの溶液を上記培養物に添加し、色の変化を観察した。大腸菌を含む果汁飲料では赤褐色が退色し、基質の添加から約1分で、対照と比較して顕著な差が肉眼で観察され、550nmでの吸光度を測定した場合にも上記の色の差が顕著に現れた(図3)。このように、本発明の遺伝子組換えウイルスを用いた場合、飲料又は食品が微生物によって汚染されているかどうかを数分〜1時間以内で検出することができることが示唆された。
Claims (8)
- 試料中の微生物を検出する方法であって、該方法は、
(a)微生物に特異的に結合し、該微生物内で増殖するウイルスに標識酵素を発現する遺伝子を導入する工程;
(b)試料と上記(a)で得られたウイルスを混合し、該試料中の微生物に該ウイルスを感染させる工程;
(c)該微生物内で、該遺伝子産物である標識酵素を産生する工程;
(d)該標識酵素に対する基質を添加する工程;及び
(e)基質に基づく色の変化により、試料中に該微生物が存在するか否かを検出する工程
を含む方法。 - 前記微生物が、エスケリッチア属(Escherichia)、クロストリジウム属(Clostridium)、リステリア属(Listeria)、カンピロバクター属(Campylobactor)、サルモネラ属(Salmonella)、赤痢菌属(Shigella)、ブドウ球菌属(Staphylococci)、ビブリオ属(Vibrio)、エルジニア属(Yersinia)、プレシモナス属(Plesimonas)、バチルス属(Bacilli)、及びアエロモナス属(Aeromonouos)からなる群から少なくとも1種選択される細菌;ストレプトミセス属(Streptomyces)、アクチノミセス属(Actinomyces)、ビフィオバクテリウム属(Bifidobacterium)、及びサーモビフィダ(Thermobifida)属からなる群から少なくとも1種選択される放線菌;クルイベロミシス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、サッカロミケス属(Saccharomyces)、カンジダ属(Candida)、及びロドトルラ属(Rhodotorula)からなる群から少なくとも1種選択される酵母;ビソクラミス属(Byssochlamys)、フサリウム属(Fusarium)、ゲオトリクム属(Geotricum)、ペニシリウム属(Penicillium)、リゾクトニア属(rhizoctonia)、及びスコプラリオプシス属からなる群から少なくとも1種選択されるカビ類;クロレラ、スピルリナ、アナベナ属(Anabaena)、ミクロキスティス(Microcystis)、及びアレクランドリウム属(Alexandrium)からなる群から少なくとも1種選択される藻類;又はそれらの組み合わせから選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記微生物が、大腸菌、サルモネラ菌、及び/又は赤痢菌である、請求項2に記載の方法。
- 前記ウイルスが、T4、PP01、P2、T2、T7、λ、MV−L2、PRD1、PM2、MV−L1、φX174、fd、MS2、φ6、FELIX01、及び/又はG47を含む群又はそれらからなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識酵素が、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素及び/又はリガーゼである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記標識酵素が、ペルオキシダーゼ、オキシダーゼ、グリコシダーゼ、及び/又はムタロターゼである、請求項5に記載の方法。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法において使用される、試料中の微生物に特異的に結合し、該微生物内で増殖するウイルスを含む検出試薬であって、ここで、該ウイルスが、検出に使用される基質に対する標識酵素を発現する遺伝子が導入されている検出試薬。
- 請求項7に記載の検出試薬、標識酵素に対する基質、及び使用説明書を含む、試料中の微生物を検出するためのキット。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019509020A (ja) * | 2016-01-18 | 2019-04-04 | ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス | 感染性因子を使用する微生物の迅速検出のための方法およびシステム |
CN111788314A (zh) * | 2017-10-02 | 2020-10-16 | 奎多公司 | 用于抗微生物剂敏感性测试和细菌菌种确认的基于噬菌体的检测方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0634757B2 (ja) * | 1984-06-05 | 1994-05-11 | アマーシャム インターナショナル パブリック リミティド カンパニー | 環境中微生物の検出方法 |
JP2006158266A (ja) * | 2004-12-06 | 2006-06-22 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 微生物の計測方法 |
WO2014205221A2 (en) * | 2013-06-19 | 2014-12-24 | Sample6 Technologies, Inc. | Phage-based bacterial detection assay |
-
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Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0634757B2 (ja) * | 1984-06-05 | 1994-05-11 | アマーシャム インターナショナル パブリック リミティド カンパニー | 環境中微生物の検出方法 |
JP2006158266A (ja) * | 2004-12-06 | 2006-06-22 | Fuji Electric Holdings Co Ltd | 微生物の計測方法 |
WO2014205221A2 (en) * | 2013-06-19 | 2014-12-24 | Sample6 Technologies, Inc. | Phage-based bacterial detection assay |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2019509020A (ja) * | 2016-01-18 | 2019-04-04 | ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス | 感染性因子を使用する微生物の迅速検出のための方法およびシステム |
CN111788314A (zh) * | 2017-10-02 | 2020-10-16 | 奎多公司 | 用于抗微生物剂敏感性测试和细菌菌种确认的基于噬菌体的检测方法 |
JP2020535808A (ja) * | 2017-10-02 | 2020-12-10 | クイデル コーポレーション | 細菌種の抗菌薬感受性試験及び同定のためのファージに基づく検出方法 |
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