CN111321234B

CN111321234B - 一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用

Info

Publication number: CN111321234B
Application number: CN202010083137.3A
Authority: CN
Inventors: 马龙; 满淑丽
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-02-08
Filing date: 2020-02-08
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2040-02-08
Also published as: CN111321234A

Abstract

本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas13a检测微生物的方法，首先对待测细菌进行前处理，提取其基因组，通过PCR扩增以及体外转录两步得到RNA，称作target RNA。当target RNA存在时可以激发Cas13a‑crRNA复合物的附属切割能力，即切割无关单链RNA。在此RNA一端修饰荧光基团，另一端修饰淬灭基团。当Cas13a‑crRNA复合物检测到相应的Target RNA时，能够切割荧光探针，导致荧光值增加，荧光值的增长与待测细菌存在线性对应关系，利用此来检测微生物。本方法具有出色的可靠性、极高的灵敏性、高度的特异性、易于实施和检测所需时间短的特点，其对微生物的检测具有巨大潜力。

Description

一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用

技术领域

本发明属于食品安全检测生物技术领域，尤其是一种基于CRISPR-Cas13a系统灵敏、特异性的检测金黄色葡萄球菌的方法及应用。

背景技术

进入21世纪以来，食源性疾病已成为影响公众健康的重要因素，根据世界卫生组织(WHO)统计，全球每年有近15亿人感染食源性疾病，其中70％是由食品中致病微生物污染引起的。江南大学食品安全风险治理研究院联合多家大学发布的《中国食品安全发展报告(2018)》指出，目前我国食品安全还存在四大主要风险，其中微生物污染问题最为严重，占抽检发现的不合格样品总量的32.74％，较2016年上升了4.84％。食品安全问题备受各级政府、学术界和民间的重视。致病微生物由于个体微小，世代时间非常短，能够通过形成菌膜等方式逃脱消毒剂和杀菌剂等消杀处理，因此分布很广。其中由于致病菌引起的污染在食品污染中最为常见，常见的致病菌有沙门氏菌、弯曲菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、蜡样芽孢杆菌、肉毒梭菌、单核细胞增生李斯特菌以及致病性大肠杆菌等。

为了防止疾病暴发并为消费者提供安全的食物，需要快速灵敏地检测食品中的致病微生物含量。传统检测方法依赖于微生物培养，然后进行生化鉴定和抗菌药敏试验。然而，这种方法耗时、周期长，一般要经过前增菌、选择性增菌、选择性平板分离、生化鉴定、血清学鉴定5个步骤，往往需要4到7天，甚至更长时间才能做出最终鉴定。近年来兴起的方法，如基因测序、NMR(核磁共振)、MS(质谱)、DNA微阵列、组学方法等需要大型昂贵仪器，实验周期长，不利于快速现场即时检验。此外，基于抗原-抗体反应的免疫学方法也层出不穷，并且部分已经应用到实际，但其也存在成本高，抗体制备周期长，某些剧毒性物质不能够通过免疫动物的方式制备抗体，交叉反应性带来的假阳性、抗体的不稳定性等诸多困扰。因此开发能够平衡快速、靶向、可视化、集成化、高精准度、高特异性、搭建周期短等特点的新型食品安全检测体系迫在眉睫。

微生物簇规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR相关的(CRISPR-Cas)自适应免疫系统是细菌和古细菌在与噬菌体的生存斗争中进化出的获得性免疫系统。最近，CRISPR-Cas系统由于其除了能进行crRNA介导的目标核酸切割之外(cis-cleavage)，还具有目标切割激活的核酸附属切割活性(又称trans-cleavage)，因此作为用于核酸靶向的快速、精确和强大的检测平台而受到欢迎。Zhang等人将Cas13a的附带效应与等温扩增相结合，建立了基于CRISPR的诊断程序，并形成了特异性高灵敏度酶报告基因解锁(SHERLOCK)平台，从而以对摩尔的敏感性和单碱基错配特异性成功检测出Zika和登革热病毒的特定菌株。此外，CRISPR-Cas13a还被用于检测高浓度的禽流感A(H7N9)病毒，埃博拉病毒，爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)、microRNA和植物基因等。

通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术环境压力胁迫问题的不足之处，提供一种基于CRISPR-Cas13a系统灵敏、特异性的检测微生物的方法及应用，该方法能够检测微生物的基因组DNA(gDNA)浓度，特别是金黄色葡萄球菌。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，所述方法通过两步扩增即PCR扩增以及将PCR产物进行转录扩增得到RNA，称其为target RNA，即目标RNA，设计crRNA的核酸序列，利用Cas13a-crRNA复合物检测target RNA；

具体的步骤为：target RNA存在时能够激发Cas13a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链RNA；在此情况下，若选择合成一条RNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporter RNA，即报告RNA，reporter RNA就能被Cas13a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测细菌的浓度能够成线性关系，能够检测和定量细菌。

而且，通过两步扩增待检测细菌的DNA来得到target RNA，当Cas13a-crRNA检测到相应的target RNA时，即target RNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与微生物浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定细菌；

或者，所述方法检测限为2CFU/mL；检测动态区间为10⁰到10⁷CFU/mL；检测所需时间从样品制备直到得到结果总共需要3-4小时。

而且，步骤如下：

⑴样品简单前处理，裂解微生物细胞，释放基因组DNA(gDNA)；

⑵PCR扩增，对微生物特异性基因片段进行扩增；

⑶体外转录，将扩增后的DNA转录为RNA，即为target RNA；

⑷荧光检测，即可检测目的基因组微生物DNA浓度。

而且，所述步骤⑵中微生物特异性基因片段为金葡菌的nuc基因。

而且，所述crRNA的核苷酸序列为SEQ NO.1，所述Target RNA的核苷酸序列为SEQNO.2，PCR引物序列分别为SEQ NO.3和SEQ NO.4，所述reporter RNA核苷酸序列为SEQNO.5。

而且，所述微生物为金黄色葡萄球菌。

而且，具体步骤如下：

⑴蛋白表达：

取转化表达质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a到2(DE3)PlysS感受态细胞中，涂布至含有200μg/mL氨苄霉素的LB平板，用于蛋白表达；挑取单菌落至含有200μg/mL氨苄霉素的50mL LB培养基中，37℃，140rpm培养过夜；按1：50接种新鲜的LB液体培养基中，该培养基含Amp 200μg/mL，于37℃，140rpm培养2-4h，当OD₆₀₀＝0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，于16℃，120rpm条件下诱导表达26h；将诱导后的菌液4℃，8000rpm离心15min，弃上清，-20℃保存；

⑵蛋白纯化：

纯化过程均在4℃下进行；在收集到的菌体中加入裂解缓冲液重悬菌体，加入蛋白酶抑制剂1mM和溶菌酶0.5mg/mL，4℃冰浴30min后进行超声破碎，具体条件为：Φ6变幅杆，P＝30％，开3s，关7s；将破碎后得到的样品于4℃20000×g离心30min，上清液使用0.4μm滤膜过滤；将过滤得到的上清加入到含Ni Sepharose 6FF的50mL离心管中，晃动混匀，在4℃滚轴上孵育3h，使His-tag蛋白与Ni-beads充分结合；用洗涤缓冲液洗涤蛋白质结合的Ni-beads，并用洗脱缓冲液洗脱；将洗脱的蛋白质用缓冲液透析，并用Millipore超滤管浓缩；测定蛋白浓度最终保存于-80℃备用；

其中，所述裂解缓冲液的配方为：50mM Na-P，pH8.0,0.3M NaCl,2mM DTT；所述洗脱缓冲液的配方为：50mM Na-P，pH8.0,0.3M NaCl，2mM DTT，200mM咪唑；所述保存缓冲液的配方为：50mM Na-P，pH8.0,0.3M NaCl，2mM DTT；

⑶crRNA转录和纯化

转录并纯化crRNA，测定RNA浓度，最终于储存-80℃；

⑷金黄色葡萄球菌检测标准曲线的绘制

①金黄色葡萄球菌的培养与计数

将保存的金黄色葡萄球菌的甘油菌通过三区划线接种于含有LB固体培养基的平板中，并于37℃生化培养箱中培养12h；从平板上挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中，于摇床37℃140rpm培养12个小时；取1mL过夜摇取的菌液，使用生理盐水10倍梯度稀释，并取3个连续梯度稀释液分别涂布于Baird-Parker固体平板培养基中，一式三份，并于37℃生化培养箱中培养48h；选择菌落数在20-200CFU之间的平板计算菌落总数；

②金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取

取1mL过夜培养的菌液，12000rpm离心2min收集菌体，提取金葡菌基因组；

③PCR扩增金葡菌nuc基因

将提取好的金葡菌gDNA进行10倍梯度稀释，稀释好的样品作为模版加入到PCR体系中，对金葡菌nuc基因进行扩增，反应体系如下：

反应条件如下：

④PCR样品的体外转录

转录体系为：

样品混匀后37℃孵育60min，然后75℃灭活15min，灭活后冷却至室温备用；

⑤使用酶标仪测定不同金葡菌浓度时CRISPR-Cas13a系统的荧光值

每个100μL反应体系均包括5nM纯化的LwCas13a，25nM crRNA，100nM淬灭reporterRNA，2μL鼠RNA酶抑制剂和4μL不同浓度的体外转录产物，反应buffer成分为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl₂，pH 7.3；

在37℃下测定荧光值的变化，其中参数设置为激发波长为484nm和发射波长为529nm，每30s测量一次荧光强度，共测定1h；测量结束后将不同的细菌浓度表示为log^CFU/mL并对其对应的荧光增长值绘制成图表；每个数据点进行三次重复测试，将最低可检测细菌量定义为分析灵敏度；

⑸CCB-Detection系统检测金黄色葡萄球菌

提取金黄色葡萄球菌的基因组，提取后的基因组使用金葡菌nuc基因的上、下游引物进行PCR扩增，并经过体外转录以及使用酶标仪测定其引起的CRISPR-Cas13a系统荧光值的增长，即可检测金黄色葡萄球菌。

而且，所述步骤⑷②中提取金葡菌基因组的具体步骤为；

在收集的菌体中加入500μL的Buffer BS重悬细胞、加入50μL的20mg/mL溶菌酶和10μL的1mg/mL溶葡萄球菌酶，充分吸打混匀，于37℃水浴温育60min，每隔20min颠倒混匀一次；12,000rpm离心5min，弃上清；加入180μL的Buffer GL、20μL的20mg/mL Proteinase K和10μL的10mg/ml RNase A，充分吸打混匀，于56℃水浴温育30min；待溶液呈透明、澄清状时加入200μL的Buffer GB和200μL的无水乙醇，充分混匀，进行柱式DNA提取。

如上所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法在分子检测方面的应用。

如上所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法在微生物检测方面的应用。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法为一种基于CRISPR-Cas13a系统的检测的荧光检测方法，可以将该方法命名为CCB-Detection，应用此方法仅需样品简单前处理、PCR扩增、体外转录及荧光检测4步，即可检测目的基因组DNA(gDNA)浓度，更重要的是，该方法只需改变核酸序列，即可以实现对不同微生物的检测，极大地拓宽了CRISPR-Cas13a在分子检测领域的应用。

2、本发明经过一系列实验建立起来CCB-Detection系统检测微生物的方法，检测的标准曲线的相关系数R²值为0.994，线性良好，由此标准曲线检测出的微生物拷贝数较准确。

3、本发明建立的检测方法检测限度低，最低检测限度为2CFU/mL，并且能够检测上至2×10⁷CFU/mL，检测范围较宽。中国食品安全标准中规定食品中金黄色葡萄球菌菌落数不能超过100CFU/mL，本发明的检测限低于国家规定标准，具备对食品进行检测的能力。

4、本发明建立起来的检测方法特异性强，以检测金葡菌为例，对于Escherichiacoli、Salmonella spp.、Pihiapastoris、Agrobacterium tumefaciens等微生物及宫颈癌细胞Hela没有明显的荧光增长，证明本发明对金葡菌有良好的选择性，而不会被其他微生物影响。

5、本发明检测时间短，全过程仅需要约4小时即可完成(图1)。

6、本发明设计的荧光探针，不仅可以准确地检测金黄色葡萄球菌的含量，仅需要简单设计引物序列，即可用于检测其他病原体。该检测方法准确，检测范围较宽，方法简单快捷，易操作。

7、经过与其他传统检测方法的比较，本发明设计具有操作方法简单、灵敏度高等优点。同时与其他等温扩增方法(RPA、LAMP等)相比，本发明设计极大的缩减了检测成本，因此便于大宗样品的检测。

8、本发明方法利用存在于瓦氏单胞菌(Leptotrichia wadei)中的CRISPR-Cas13a(LwCas13a)系统结合PCR扩增技术直接以高灵敏度和特异性检测金黄色葡萄球菌nuc基因，并将此方法命名为CCB-Detection，其检测限低至2个拷贝。此外，证明了CCB-Detection检测策略在复杂生物样品中检测金黄色葡萄球菌的实际应用能力。该方法具有出色的可靠性、灵敏性、特异性和易于实施的特点，有望为食源性致病微生物的检测提供巨大潜力。

9、本发明中CCB-Detection系统检测金黄色葡萄球菌的方法的原理为：Cas13a-crRNA复合物仅当存在能与crRNA互补结合的特异性Target RNA存在时，才会激发Cas13a的附属切割活性，即可以切割其他的单链无关RNA(ssRNA)。若在无关RNA一端修饰FAM荧光基团，另外一端修饰淬灭集团BHQ1(即reporter RNA)时，就可以将切割效应转化为荧光信号输出。当Cas13a-crRNA检测到相应的Target RNA时，就可以切割荧光探针，使荧光基团FAM远离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加。简单地说，荧光值的变化与Target RNA浓度，即金葡菌基因组DNA(gDNA)的浓度成具有线性关系，从而可以将金葡菌gDNA的浓度即金葡菌拷贝数(CFU/mL)转化成相应的荧光信号。

附图说明

图1为本发明中基于CCB-Detection系统检测微生物的模式原理图，其中，上图为CCB-Detection检测流程图，下图为crRNA和target RNA结合位点示意图；

图2为本发明中基于CCB-Detection系统应用于检测的可行性分析图；

图3为本发明中基于CCB-Detection系统对RNA浓度依赖性分析图，其中，A：时间扫描图，B：RNA浓度与荧光强度点线图；

图4为本发明中基于CCB-Detection系统检测的灵敏度分析图；

图5为本发明中基于CCB-Detection系统检测金黄色葡萄球菌的标准曲线图，其中，A：时间扫描图，B：Log^CFU/mL与荧光强度的线性拟合标准曲线；

图6为本发明中基于CCB-Detection系统检测金黄色葡萄球菌的选择性分析图，其中Δ荧光强度为样品的荧光强度-无targetRNA对照的荧光强度；

图7为本发明中CCB-Detection系统检测自然腐败牛奶(复杂微生环境)中的检测图；

图8为本发明中CCB-Detection系统与其他检测方法的比较图，其中，A：金葡菌测试片法，B：传统培养法，C：qPCR法，D：CCB-Detection，E：紫外透射光法成像，F：紫外透射光法的灰度分析。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，所述方法通过两步扩增即PCR扩增以及将PCR产物进行转录扩增得到RNA，称其为targetRNA，即目标RNA，设计crRNA的核酸序列，利用Cas13a-crRNA复合物检测targetRNA；

具体的步骤为：targetRNA存在时能够激发Cas13a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链RNA；在此情况下，若选择合成一条RNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporterRNA，即报告RNA，reporterRNA就能被Cas13a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测细菌的浓度能够成线性关系，能够检测和定量细菌。

较优地，通过两步扩增待检测细菌的DNA来得到targetRNA，当Cas13a-crRNA检测到相应的targetRNA时，即targetRNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与微生物浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定细菌；

或者，所述方法检测限低，为2CFU/mL；检测动态区间宽，为10⁰到10⁷CFU/mL；检测所需时间短，从样品制备直到得到结果总共需要3-4小时，大大低于目前通用流行方法及国家标准中的方法。

较优地，步骤如下：

⑴样品简单前处理，裂解微生物细胞，释放基因组DNA(gDNA)；

⑵PCR扩增，对微生物特异性基因片段进行扩增；

⑶体外转录，将扩增后的DNA转录为RNA，即为target RNA；

⑷荧光检测，即可检测目的基因组微生物DNA浓度。

较优地，所述步骤⑵中微生物特异性基因片段为金葡菌的nuc基因。

较优地，所述crRNA的核苷酸序列为SEQ NO.1，所述Target RNA的核苷酸序列为SEQ NO.2，PCR引物序列分别为SEQ NO.3和SEQ NO.4，所述reporter RNA核苷酸序列为SEQNO.5。

较优地，所述微生物为金黄色葡萄球菌。

较优地，具体步骤如下：

⑴蛋白表达：

⑵蛋白纯化：

⑶crRNA转录和纯化

转录并纯化crRNA，测定RNA浓度，最终于储存-80℃；

⑷金黄色葡萄球菌检测标准曲线的绘制

①金黄色葡萄球菌的培养与计数

②金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取

③PCR扩增金葡菌nuc基因

反应条件如下：

④PCR样品的体外转录

转录体系为：

⑤使用酶标仪测定不同金葡菌浓度时CRISPR-Cas13a系统的荧光值

⑸CCB-Detection系统检测金黄色葡萄球菌

较优地，所述步骤⑷②中提取金葡菌基因组的具体步骤为；

如上所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法能够应用在分子检测方面中。

如上所述的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法能够应用在微生物检测方面中。

进一步地，更为具体操作步骤如下：

1、蛋白表达：

取1μl转化表达质粒(pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a，Plasmid#90097)到Rosetta^TM2(DE3)PlysS感受态细胞中，涂布至含有200μg/mL氨苄霉素(Amp)的LB平板，用于蛋白表达。挑取单菌落至含有200μg/mL氨苄霉素(Amp)的50mL LB培养基中，37℃，140rpm培养过夜。按1：50接种新鲜的LB液体培养基中(含Amp 200μg/mL)，于37℃，140rpm培养2-4h，当OD₆₀₀＝0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于16℃，120rpm条件下诱导表达26h。将诱导后的菌液4℃，8000rpm离心15min，弃上清，-20℃保存。

2、蛋白纯化：

纯化过程均在4℃下进行。在收集到的菌体中加入适量裂解缓冲液(50mM Na-PpH8.0,0.3M NaCl,2mM DTT)重悬菌体，加入蛋白酶抑制剂(1mM)和溶菌酶(0.5mg/mL)。4℃冰浴30min后进行超声破碎，具体条件为：Φ6变幅杆，P＝30％，开3s，关7s。将破碎后得到的样品于4℃20000×g离心30min，上清液使用0.4μm滤膜过滤。将过滤得到的上清加入到含NiSepharose 6FF(GE Healthcare)的50mL离心管中，轻轻晃动混匀，在4℃滚轴上孵育3h，使His-tag蛋白与Ni-beads充分结合。用洗涤缓冲液(50mM Na-P pH8.0,0.3M NaCl,2mM DTT，50mM咪唑)洗涤蛋白质结合的Ni-beads，并用洗脱缓冲液(50mM Na-P pH8.0,0.3M NaCl,2mM DTT,200mM咪唑)洗脱。将洗脱的蛋白质用缓冲液(50mM Na-P pH8.0,0.3M NaCl,2mMDTT)透析，并用Millipore超滤管浓缩。测定蛋白浓度最终保存于-80℃备用。

3、crRNA转录和纯化

所用的crRNA可以使用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NewEngland Biolabs)试剂盒由DNA模版转录而来。根据制造商操作手册，将转录体系缩放至30μL(NTP Buffer Mix 10μL，DNA模版2μL，T7 RNAPolymerase Mix 2μL)，并37℃下与T7聚合酶一起温育过夜。根据产品手册，使用Monarch RNACleanup Kit(New England Biolabs)纯化crRNA，并使用Eppendorfbasic测定RNA浓度，最终于储存-80℃。

4、使用酶标仪检测Cas13a系统荧光强度

每个100μL反应体系均包括5nM纯化的LwCas13a，25nM crRNA，100nM淬灭reporterRNA，2μL鼠RNA酶抑制剂(New England Biolabs)和4μL不同浓度的体外转录产物，反应buffer成分为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl₂(pH 7.3)。在37℃下使用200Pro plate reader(Tecan,Switzerland)测定荧光值的变化，其中参数设置为激发波长为484nm和发射波长为529nm，每30s测量一次荧光强度，共测定1h。

5、Cas13a检测可行性分析

为了验证Cas13a是否具有所描述的核酸特异性识别引发的附属切割能力，我们进行了可行性验证实验，如图2所示，当且仅当Cas13a、crRNA以及与crRNA互补的target RNA同时存在时才会产生强烈的荧光信号，初步证明了本发明方法的可行性，具有特异性识别能力。

6、Cas13a检测target RNA的依赖性

本发明能够定量检测金葡菌的前提为，随着target RNA浓度的不断升高，荧光强度同时增大。因此，我们在检测体系中加入了不同浓度的target RNA(0-10nM)，如图3A所示，荧光信号随target RNA浓度的增大而不断增强，同时，当target RNA浓度在0-1nM时，target RNA浓度与荧光强度初步存在线性关系(图3B)，因此证明此方法可以用于定量检测。

7、金黄色葡萄球菌检测标准曲线的绘制

(1)金黄色葡萄球菌的培养与计数

将保存的金黄色葡萄球菌的甘油菌通过三区划线接种于含有LB固体培养基的平板中，并于37℃生化培养箱中培养12h。从平板上挑取单菌落接种于5mL液体LB培养基中，于摇床37℃140rpm培养12个小时。取1mL过夜摇取的菌液，使用生理盐水10倍梯度稀释，并取适宜的3个连续梯度稀释液分别涂布于LB固体平板培养基中(一式三份)，并于37℃生化培养箱中培养12h。选择菌落数在20-200CFU之间的平板计算菌落总数。

(2)金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取

取1mL过夜培养的菌液，12000rpm离心2min收集菌体，并使用TaKaRa MiniBESTBacteria Genomic DNAExtraction Kit Ver.3.0试剂盒提取金葡菌基因组。简单地说，在收集的菌体中加入500μL的Buffer BS重悬细胞、加入50μL的溶菌酶(20mg/mL)和10μL溶葡萄球菌酶(1mg/mL)，充分吸打混匀，于37℃水浴温育60min(每隔20min颠倒混匀一次)。12,000rpm离心5min，弃上清。加入180μL的Buffer GL、20μL的Proteinase K(20mg/mL)和10μL的RNase A(10mg/ml)，充分吸打混匀，于56℃水浴温育30min。待溶液应呈透明、澄清状时加入200μL的Buffer GB和200μL的无水乙醇，充分混匀。后面按照说明书要求进行柱式DNA提取。

(3)PCR扩增金葡菌nuc基因

反应条件如下：

(4)PCR样品的体外转录

转录过程使用NEB HiScribe T7 QuickHighYieldRNA Synthesis Kit转录试剂盒，根据产品手册将转录体系缩放为：

样品混匀后37℃孵育60min，然后75℃灭火15min，灭活后冷却至室温备用。

(5)使用酶标仪测定不同金葡菌浓度时CRISPR-Cas13a系统的荧光值

按照步骤4所述方法，将上述转录后的RNA添加到检测体系中，测定法荧光强度。测量结束后将不同的细菌浓度表示为(logCFU/mL)并对其对应的荧光增长值绘制成图表。每个数据点进行三次重复测试，将最低可检测细菌量定义为分析灵敏度。图4为经过PCR与未经PCR的过程检测的灵敏度分析，经过分析，经过PCR以后可以将检测线从10⁹提升到10⁰aM，证明PCR可以有效提高Cas13a系统的灵敏度。图5为CCB-Detection检测金葡菌的时间扫描图和线性拟合标准曲线图，证明检测的标准曲线的相关系数R²值为0.994，线性良好，由此标准曲线检测出的金葡菌拷贝数较准确，且最低检测限为2CFU/mL。

8、CCB-Detection系统检测金黄色葡萄球菌的选择性实验

使用TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0试剂盒提取Staphylococcus aureus,Escherichia coli,Salmonella spp.,Pihia pastoris,Agrobacterium tumefaciens等微生物的基因组。使用康为世纪Universal GenomicDNAKit提取Hela细胞中的基因组DNA。提取后的基因组使用金葡菌nuc基因的上、下游引物进行PCR扩增，并经过体外转录以及使用酶标仪测定其引起的CRISPR-Cas13a系统荧光值的增长。如图6所示，在所有基因组DNA样品中只有金葡菌的基因组能够导致明显的荧光信号的增加，其他gDNA对荧光影响并不大，这个结果证明该测金葡菌体系对于其他干扰基因组具有良好的选择性。

9、CCB-Detection系统检测金黄色葡萄球菌的选择性实验

对于加标回收实验：首先使用ddH₂O将牛奶、果汁和啤酒稀释100倍，无需其他预处理。然后，将这些已确认的金黄色葡萄球菌阴性样品掺入不同数量的金黄色葡萄球菌细胞(使用传统平板计数法计算的密度)。将样品以12000rpm离心2分钟，然后将细菌沉淀首先重悬于含有200μg/mL溶葡萄球菌素和溶菌酶的TEX缓冲液(10mM Tris-HCl 1mM EDTA和1％TritonX-100，pH 8.0)中。混合均匀后在37℃下孵育0.5小时。将终浓度为0.5mg/mL的蛋白酶K和0.1mg/mL的RNaseA添加到每种样品混合物中，并在56℃孵育30分钟。最后，将每个样品在95℃下孵育10分钟以进行酶变性，随后将其用于CCB-Detection的检测，最终实验结果如表1所示。对于检测自然腐败牛奶(复杂微生物)环境中的检测：将新鲜的牛奶暴露在自然环境中，每隔24小时取样，连续5天。其中一部分用于平板计数，一部分按照上述方法用于CCB-Detection的检测，检测结果如图7所示，证明CCB-Detection对于复杂样本同样具有良好的检测效果，并于传统平板计数法相比，二者没有显著性差异(P>0.05)。

表1实际食品样品中金葡菌的回收率(CFU/mL)(平均值±标准偏差)

10、传统平板培养法、金葡菌测试片、qPCR、CCB-Section以及紫外透射光可视化检测金葡菌的比较

对于常规的基于平板培养的金黄色葡萄球菌计数，将细菌在LB(Luria-Bertani)肉汤培养基中培养12小时。使用无菌的生理盐水将细胞悬浮液进行10倍梯度稀释。将每种稀释液50μL一式两份铺在Baird-Parker固体琼脂培养皿上，然后在37℃下孵育48小时以使细菌生长。对菌落计数并记录两次平行培养皿的平均数。对于2SA检测片法，按照制造商的规程将每种稀释液1mL铺在膜上(良润，中国)，然后在37℃下孵育24小时以使细菌生长。对于qPCR实验，每个反应均在20μL反应中进行，其中包含10μL 2×SYBR Green qPCRMaster Mix(Bimake.com，美国)，0.5μL金黄色葡萄球菌gDNA(模板)，0.4μL 50×ROX染料，200nM上、下游引物。使用AppliedBiosystems StepOne^TM实时PCR系统，其中循环条件为95℃预变性20min，变性95℃变性3s，60℃进行退火和延伸30s，进行40个循环。将不同的细菌浓度(表示为log^CFU/mL)与相应的Cq值作图。其中用水代替DNA模板的为阴性对照。对于紫外透射光荧光可视化检测，首先使用基于CCB-Detection的检测方法制备的样品，然后使用MiniChemi^TM成像系统(SageCreation，中国)，在535nm激发下可视化检测，并捕获相应图像，检测结果见图8。同时，将CCB-Detection的检测成本与其他方法进行了比较，如表2所示，与其他检测方法相比CCB-Detection测试价格更加低廉，更适用于大宗样品的检测。

表2CCB-Detection检测成本计算及与其他方法的比较

本发明中使用到的序列有：

SEQ NO.1:nuc crRNA：GGG GAU UUA GAC UAC CCC AAAAAC GAA GGG GAC UAA AACUAAAUG CAC UUG CUU CAG GAC CAUAUU U

SEQ NO.2:nuc target RNA：GGG CAC CUG AAA CAAAGC AUC CUAAAAAAG GUG UAGAGAAAU AUG GUC CUG AAG CAA GUG CAU UUA CGAAAAAAA UGG UAG AAA AUG CAA AGA AAAUUG AAG UCG AGU UUG ACA AAG GUC AAA GAAC UGA UAA AUAUGGACG UGG CUUAGC G

SEQ NO.3:nuc target F：TAATAC GAC TCA CTATA ggg CAC CTGAAA CAAAGC ATCCTAAA

SEQ NO.4:nuc target R：CGC TAA GCC ACG TCC ATATT

SEQ NO.5:reporter RNA：6-FAM-UUGGCGUAAUCAUGGUCAUA-BHQ-1

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例和附图所公开的内容。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 67

<212> DNA/RNA

<213> crRNA的核苷酸序列(Unknown)

<400> 1

ggggauuuag acuaccccaa aaacgaaggg gacuaaaacu aaaugcacuu gcuucaggac 60

cauauuu 67

<210> 2

<211> 152

<212> DNA/RNA

<213> Target RNA的核苷酸序列(Unknown)

<400> 2

gggcaccuga aacaaagcau ccuaaaaaag guguagagaa auaugguccu gaagcaagug 60

cauuuacgaa aaaaauggua gaaaaugcaa agaaaauuga agucgaguuu gacaaagguc 120

aaagaacuga uaaauaugga cguggcuuag cg 152

<210> 3

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> PCR引物序列1(Unknown)

<400> 3

taatacgact cactataggg cacctgaaac aaagcatcct aaa 43

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> PCR引物序列2(Unknown)

<400> 4

cgctaagcca cgtccatatt 20

<210> 5

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> reporter RNA核苷酸序列(Unknown)

<400> 5

amuuggcgua aucaugguca uabh 24

Claims

1. 一种不以疾病的诊断和治疗为目的的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述方法通过两步扩增即PCR扩增以及将PCR产物进行转录扩增得到RNA，称其为target RNA，即目标RNA，设计crRNA的核酸序列，利用Cas13a-crRNA复合物检测targetRNA；

具体的步骤为：target RNA存在时能够激发Cas13a-crRNA复合物的核酸特异性识别引发的附属切割能力，即切割无关单链RNA；在此情况下，若选择合成一条RNA，将其一端修饰荧光基团，另外一端修饰淬灭基团，制备成reporter RNA，即报告RNA，reporter RNA就能被Cas13a酶切，产生增强的荧光信号进行输出；此荧光信号的变化和待检测细菌的浓度能够成线性关系，能够检测和定量细菌；

通过两步扩增待检测细菌的DNA来得到target RNA，当Cas13a-crRNA检测到相应的target RNA时，即target RNA和crRNA能够互补配对，就能够切割荧光探针，使荧光基团FAM脱离猝灭基团BHQ1，造成BHQ1对FAM荧光的猝灭被解除，FAM荧光值增加能够与微生物浓度成线性关系，能够特异性地检测和定量特定细菌；

所述方法检测限为2CFU/mL；检测动态区间为10⁰到10⁷ CFU/mL；检测所需时间从样品制备直到得到结果总共需要3-4小时；

步骤如下：

⑴样品简单前处理，裂解微生物细胞，释放基因组DNA(gDNA)；

⑵PCR扩增，对微生物特异性基因片段进行扩增；

⑶体外转录，将扩增后的DNA转录为RNA，即为target RNA；

⑷荧光检测，即可检测目的基因组微生物DNA浓度；

所述步骤⑵中微生物特异性基因片段为金葡菌的nuc基因；

所述crRNA的核苷酸序列为SEQ NO .1，所述Target RNA的核苷酸序列为SEQ NO .2，PCR引物序列分别为SEQ NO .3和SEQ NO .4，所述reporter RNA核苷酸序列为SEQ NO .5；

所述微生物为金黄色葡萄球菌；

具体步骤如下：

⑴蛋白表达：

取转化表达质粒pC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a到2(DE3)PlysS感受态细胞中，涂布至含有200μg/mL氨苄霉素的LB平板，用于蛋白表达；挑取单菌落至含有200μg/mL氨苄霉素的50mL LB培养基中，37℃，140rpm培养过夜；按1：50接种新鲜的LB液体培养基中，该培养基含Amp 200μg/mL，于37℃，140rpm培养2-4h，当OD600＝0 .6～0 .8时加入终浓度为0.5mM的异丙基-D-1-硫代吡喃半乳糖苷，于16℃，120rpm条件下诱导表达26h；将诱导后的菌液4℃，8000rpm离心15min，弃上清，-20℃保存；

⑵蛋白纯化：

纯化过程均在4℃下进行；在收集到的菌体中加入裂解缓冲液重悬菌体，加入蛋白酶抑制剂1mM和溶菌酶0 .5mg/mL，4℃冰浴30min后进行超声破碎，具体条件为：Φ6变幅杆，P＝30％，开3s，关7s；将破碎后得到的样品于4℃ 20000×g离心30min，上清液使用0 .4μm滤膜过滤；将过滤得到的上清加入到含Ni Sepharose 6FF的50mL离心管中，晃动混匀，在4℃滚轴上孵育3h，使His-tag蛋白与Ni-beads充分结合；用洗涤缓冲液洗涤蛋白质结合的Ni-beads，并用洗脱缓冲液洗脱；将洗脱的蛋白质用缓冲液透析，并用Millipore超滤管浓缩；测定蛋白浓度最终保存于-80℃备用；

其中，所述裂解缓冲液的配方为：50mM Na-P，pH8 .0 ,0 .3M NaCl ,2mM DTT；所述洗脱缓冲液的配方为：50mM Na-P，pH8 .0 ,0 .3M NaCl，2mM DTT，200mM咪唑；所述保存缓冲液的配方为：50mM Na-P，pH8 .0 ,0 .3M NaCl，2mM DTT；

⑶crRNA转录和纯化

转录并纯化crRNA，测定RNA浓度，最终于储存-80℃；

⑷金黄色葡萄球菌检测标准曲线的绘制

①金黄色葡萄球菌的培养与计数

②金黄色葡萄球菌基因组DNA的提取

③PCR扩增金葡菌nuc基因

反应条件如下：

；

④PCR样品的体外转录

转录体系为：

；

⑤使用酶标仪测定不同金葡菌浓度时CRISPR-Cas13a系统的荧光值

每个100μL反应体系均包括5nM纯化的LwCas13a，25nM crRNA，100nM淬灭reporterRNA，2μL鼠RNA酶抑制剂和4μL不同浓度的体外转录产物，反应buffer成分为40mM Tris-HCl，60mM NaCl，6mM MgCl2，pH 7 .3；

在37℃下测定荧光值的变化，其中参数设置为激发波长为484nm和发射波长为529nm，每30s测量一次荧光强度，共测定1h；测量结束后将不同的细菌浓度表示为logCFU/mL并对其对应的荧光增长值绘制成图表；每个数据点进行三次重复测试，将最低可检测细菌量定义为分析灵敏度；

⑸CCB-Detection系统检测金黄色葡萄球菌

2.根据权利要求1所述的不以疾病的诊断和治疗为目的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法，其特征在于：所述步骤⑷②中提取金葡菌基因组的具体步骤为；在收集的菌体中加入500μL的Buffer BS重悬细胞、加入50μL的20mg/mL溶菌酶和10μL的1mg/mL溶葡萄球菌酶，充分吸打混匀，于37℃水浴温育60min，每隔20min颠倒混匀一次； 12 ,000rpm离心5min，弃上清；加入180μL的Buffer GL、20μL的20mg/mL Proteinase K和10μL的10mg/mlRNase A，充分吸打混匀，于56℃水浴温育30min；待溶液呈透明、澄清状时加入200μL的Buffer GB和200μL的无水乙醇，充分混匀，进行柱式DNA提取。

3.如权利要求1至2任一项所述的不以疾病的诊断和治疗为目的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法在分子检测方面的应用。

4.如权利要求1至2任一项所述的不以疾病的诊断和治疗为目的基于CRISPR-Cas13a系统检测微生物的方法在微生物检测方面的应用。