CN115747351A

CN115747351A - 基于CRISPR/Cas12a方法检测志贺氏菌的试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN115747351A
Application number: CN202210260004.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋原; 郭德华; 徐之雯; 李健; 熊炜
Original assignee: Technical Center For Animal Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs
Current assignee: Technical Center For Animal Plant and Food Inspection and Quarantine of Shanghai Customs
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了基于CRISPR/Cas12a方法检测志贺氏菌的试剂盒及其使用方法，本发明所述的试剂盒包括CRISPR/Cas12a引物、crRNA或crRNA制备试剂、核酸扩增试剂、探针和Cas12a酶；所述CRISPR/Cas12a引物包括如SEQ ID NO.1所示序列的CRISPR/Cas12a上游引物，如SEQ ID NO.2所示序列的CRISPR/Cas12a下游引物。本发明的试剂盒及其使用方法对于志贺氏菌的检测具有快速、特异性强和灵敏度高等优点，其检测过程不需要特殊仪器,在疾病监测、临床诊断和食品安全监测等领域具有重要的应用价值。

Description

基于CRISPR/Cas12a方法检测志贺氏菌的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及基于CRISPR/Cas12a方法检测志贺氏菌的试剂盒及其使用方法。

背景技术

志贺氏菌(Shigella spp.)在分类学上属于肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，是一类具有高度传染性的革兰氏阴性菌，在自然界中有广泛的宿主，是引起人类肠道疾病的主要致病菌之一，具有很强的感染力和致病力，严重危害人们的身体健康。志贺氏菌主要存在于乳制品、肉制品以及蔬菜瓜果中，被志贺氏菌感染后会产生腹泻、发热、呕吐以及脱水等临床症状，严重可导致死亡。

1958年国际微生物学会将志贺氏菌分为A、B、C、D共四群48个血清型(包括亚型)。A群：痢疾志贺氏菌(S.dysenteriae)或志贺氏痢疾杆菌，该群志贺菌不发酵甘露醇，有13个血清型；B群：福氏志贺氏菌(S.flexneri)，该群志贺菌发酵甘露醇，该群抗原构造复杂，有群抗原和型抗原之分，根据型抗原的不同，分为6型，又根据群抗原的不同将型分为亚型；C群：鲍氏志贺氏菌(S.boydii)，发酵甘露醇，有18个血清型； D群：宋内氏志贺氏菌(S.sonnei)，发酵甘露醇，并迟缓发酵乳糖。

自1897年发现志贺氏菌以来，其分离培养与常规鉴定技术已经相当成熟。但是传统培养方法操作繁琐，耗时费力，不能满足现场快速检测的需要。免疫学方法能够实现快速检测，缩短了检测时间，但该方法的灵敏度较低。传统的检测方法整个过程步骤繁琐需要很多人力，且检测所需时间过长，已经远远不能满足对各种病原微生物的流行病学的研究，更做不到快速、简便、特异、敏感、低耗的快速诊断及检测志贺氏菌。因此，探究出一种快速灵敏、简便高效的检测志贺氏菌的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种用于检测志贺氏菌的试剂盒，用于对志贺氏菌进行快速、准确的检测。

本发明还提出上述试剂盒的使用方法。

根据本发明的一个方面，提出了一种用于检测志贺氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括 CRISPR/Cas12a引物、crRNA或crRNA制备试剂、核酸扩增试剂、探针和Cas12a酶；所述CRISPR/Cas12a引物包括如SEQ ID NO.1所示序列的CRISPR/Cas12a上游引物，如SEQ IDNO.2所示序列的CRISPR/Cas12a下游引物。

在本发明的一些实施方式中，所述crRNA制备试剂包括crDNA序列和crRNA转录试剂，所述crRNA制备试剂用于制备所述crRNA；所述crDNA序列包括如SEQ ID NO.3 所示序列的crDNA上游序列，如SEQ ID NO.4所示序列的crDNA下游序列。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述crRNA转录试剂包括缓冲液、NTP、T7 RNA聚合酶中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述核酸扩增试剂为RPA或RAA扩增试剂。

在本发明中，重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，RPA) 和重组酶介导的扩增技术(recombinase-aidamplification，RAA)均为常用的恒温扩增技术，在扩增过程中均使用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，在37℃恒温下进行核酸快速扩增。其不同点在于重组酶的来源不同，RPA体系的重组酶来源于T4噬菌体， RAA体系的重组酶来源于细菌或者真菌。在本发明的一些实例中，均可购买商业化的 RPA或RAA体系的核酸扩增试剂进行反应。

在本发明的一些实施方式中，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。其中，探针的核苷酸序列SEQ ID NO.5：CACCGACGGCGAGACCGACTTT。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述探针的两端分别连接荧光基团，所述荧光基团选自FAM、TAMRA、TET、HEX、Cy3、Cy5和ROX中的至少一种。

在本发明的一些更优选的实施方式中，所述探针的核苷酸序列为 FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMRA。根据本发明的再一个方面，提供了上述试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1、提取待检测样本的DNA；

S2、使用所述CRISPR/Cas12a引物和核酸扩增试剂所述对步骤S1中获得的DNA 进行核酸扩增反应，得到核酸扩增产物；

S3、将所述crRNA、探针和Cas12a酶与步骤S2中得到的核酸扩增产物混合，对所述核酸扩增产物进行CRISPR/Cas12a反应；

S4、通过荧光检测确定检测结果。

在本发明的一些实施方式中，步骤S3中所述crRNA还可以通过crRNA制备试剂将所述crDNA序列转录为所述crRNA；所述crRNA制备试剂包括crDNA序列和crRNA 转录试剂；所述crDNA序列包括如SEQ ID NO.3所示序列的crDNA上游序列，如SEQ ID NO.4所示序列的crDNA下游序列。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述将所述crDNA序列转录为所述crRNA，具体包括以下步骤：

将crDNA上下游序列退火形成双链；

将用T7转录试剂盒转录双链得到的crRNA纯化后即得到纯度较高crRNA。

在本发明的一些实施方式中，步骤S2中所述核酸扩增反应为重组酶介导等温核酸扩增反应，包括RPA扩增反应或RAA扩增反应。在本发明的一些实施方式中，步骤S3 中所述CRISPR/Cas12a反应的反应温度约为42℃，所述CRISPR/Cas12a反应的时间为 15～30min。

在本发明的一些实施方式中，步骤S4中所述检测结果根据是否出现“S”型扩增曲线判断。出现“S”型扩增曲线时，说明待测样本中含有志贺氏菌。

在本发明中，CRISPR/Cas12a作为一种新兴的生物技术，可以用于病原菌的快速恒温检测。Casl2a能在crRNA的引导下特异识别并裂解富含T核苷酸PAM序列的dsDNA，并在特定的位点裂解靶标链实现检测的目的。将RPA扩增技术与Casl2a偶联，使用RPA 扩增技术进行靶标DNA扩增,再加入CRISPR体系，Casl2a-crRNA复合物结合靶标DNA 后，激活了反式切割活性，切割体系中的标记荧光基团，产生荧光信号。该方法的主要特点在于高效快速、操作简单、特异性强、灵敏度高，适用于实时现场检测。高效、快速、高特异、高灵敏的扩增靶基因。

本发明针对动物性食品链中志贺氏菌进行检测，以核酸扩增技术为核心，通过建立一系列的核酸检测方法，建立一种更加快速、精确、稳定的检测方法。对方法的灵敏度、特异性和重复性进行分析，其检测灵敏度高，可在短时间内完全结果检测，准确性高。该方法具有快读、可定量、敏感度高等特点。

在本发明的一些具体的实施方式中，有益效果至少包括：

1)特异性强：设计的引物具有较高的特异性，目标菌株与其他菌株均被正确鉴定；

2)响应速度快：CRISPR/Cas12a技术能在30min内完成高效率的基因扩增；

3)灵敏度高：CRISPR/Cas12a扩增的灵敏度是普通RAA扩增的100倍，检测限可达10³CFU/mL。

4)结果判定简单：可根据荧光检测仪上的荧光曲线判定结果；

5)操作简便：只需要简单的恒温仪器设备即可。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例2中的分别利用设计合成的2对RAA引物检测志贺氏菌阳性质粒，质粒的浓度分别为10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL和0拷贝/μL。

图2为本发明实施例5中CRISPR/Cas12a方法的建立，其中曲线1、2分别为福氏志贺氏菌CMCC(B)51573、痢疾志贺氏菌ATCC 13313，曲线3为阴性对照；

图3为本发明实施例6中CRISPR/Cas12a灵敏度检测实验结果，其中曲线1-6分别对应福氏志贺氏菌CMCC(B)51573的菌液浓度10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹CFU/mL，曲线7为空白对照；

图4为本发明实施例7中CRISPR/Cas12a方法对常见致病菌特异性验证实验，其中曲线1、2分别为福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌，曲线3-8分别为单核增生李斯特菌、大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌以及空白对照的扩增结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

在本发明的一个实施例中，检测志贺氏菌的CRISPR/Cas12a引物及crDNA序列，其序列如表1所示：

表1.用于志贺氏菌CRISPR/Cas12a扩增的引物

在本发明的一个实施例中，一种非诊断和治疗目的的用于检测志贺氏菌的CRISPR/Cas12a的方法，包括如下步骤：

步骤1)采用试剂盒法提取待测样品的DNA；

步骤2)先将crDNA上下游序列退火形成双链。将用T7转录试剂盒转录双链得到的crRNA纯化后即得到纯度较高crRNA。T7转录体系如表2所示；

表2.T7转录体系

crDNA	2μL
		10×buffer	2μL
NTP mix	2μL
		T7 RNA Polymerase mix	2μL
Nuclease-free Water	12μL

步骤3)用上述CRISPR/Cas12a引物组合物进行RAA反应；

步骤4)RAA扩增产物加入到CRISPR/Cas12体系中，荧光检测仪42℃检测扩增结果的荧光曲线，反应体系如表3所示；

表3.CRISPR/Cas12反应体系

DNA模板	2μL
		10×buffer	2μL
crRNA	1μL
		10μmol/L探针	0.5μL
Cas12a酶	0.5μL
		ddH<sub>2</sub>O	14μL

步骤5)结果判断：根据是否出现“S”型扩增曲线判断扩增结果。

实施例1 RAA引物、crRNA的设计与合成

鉴于志贺氏菌与其他食源性细菌的同源性较高，发明人通过对志贺氏菌ipaH基因序列进行比，经过大量的筛选，共设计出了2套扩增引物及相应的crDNA。引物序列见表4。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表4志贺氏菌RAA扩增引物

实施例2 RAA扩增方法的灵敏度检测

使用实施例1中的2套引物进行RAA扩增方法的灵敏度检测，具体过程为：

S1、梯度模板的制备：志贺氏菌ipaH基因阳性质粒由本实验室构建，利用Nanodrop2000检测质粒浓度后，将质粒分别稀释为10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/μL、10⁵拷贝/μL、 10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL、10⁰拷贝/μL和0拷贝/μL。

S2、RAA扩增：利用实施例1设计的两对引物，模板为上述不同浓度稀释的质粒，进行RAA扩增。按照50μL反应体系，每支冻干粉中加上下游引物各2μL(10μM)，水化缓冲液41.5μL，模板2μL，醋酸镁2.5μL。反应条件为37℃30min。

S3、扩增产物纯化：将2组扩增产物分别加入苯酚氯仿后震荡并10000g，离心5min。

S4、吸取步骤S3中2组水相成分利用1％琼脂糖凝胶电泳分析扩增。结果如图1 所示，图中M为DL2000，1-8和9-16泳道的质粒浓度分别为10⁷拷贝/μL、10⁶拷贝/ μL、10⁵拷贝/μL、10⁴拷贝/μL、10³拷贝/μL、10²拷贝/μL、10¹拷贝/μL和0拷贝 /μL。9-16为Shigella Cas12F和Shigella Cas12 R扩增产物，1-8为Shigella Cas12 F 2 和Shigella Cas12 R2扩增产物。图中结果显示：采用引物Shigella Cas12 F和SHIGELLA Cas12 R电泳法检测到阳性质粒的最低拷贝数为10⁴拷贝/μL，采用引物Shigella Cas12 F2和Shigella Cas12 R2电泳法检测到阳性质粒的最低拷贝数为10⁵拷贝/μL，引物 Shigella Cas12 F2和Shigella Cas12R2的扩增效率高于引物Shigella Cas12 F1和Shigella Cas12 R1。

通过对RAA扩增方法的灵敏度检测以及引物的筛选，选择引物对Shigella Cas12F2 和Shigella Cas12 R2作为最佳引物用于试剂盒中。

实施例3试剂准备

一、本发明实施例所用试剂为市售商品，所用序列如表1所示进行商业合成。

志贺氏菌的CRISPR/Cas12a引物及crDNA序列浓度都为100μM；交由上海生物工程有限公司合成。

二、crRNA的制备

将crDNA上下游序列(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)等比例混合在95℃变性5 分钟，室温孵育5分钟使其延伸形成双链。双链crDNA用T7转录试剂盒体外转录为 crRNA，转录体系为无核酸酶的水12μL、10×Reaction Buffer 2μL、dNTP mix 2μL(10Mm)、crDNA 2μL以及T7 RNA聚合酶，总反应体系20μL。将上述体系混合后 37℃孵育3小时。所制备的crRNA的序列为： 5’-AAUUUCUACUGUUGUAGAUACUGUUGCUGCUGAUGCCACUGAG-3’

转录结束后，加入1μL DNase I 37℃孵育15分钟去除痕量残留DNA，使用天漠RNA纯化试剂盒纯化后即得到纯度较高的crRNA，置于-80℃备用。

实施例4 RAA扩增

一、志贺氏菌RAA扩增

1)细菌培养及菌液的倍比稀释：将福氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌接种到营养肉汤中，摇床37℃，180rpm过夜培养得到菌液。用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS，0.1M，pH＝7.4) 10倍梯度稀释，制备不同浓度的活菌溶液，取适宜的3个连续梯度稀释液进行涂布平板计数。

2)目标DNA的提取：吸取1mL步骤1)中稀释的活菌溶液滴加到1.5mL离心管内，12000r/min离心2min，弃去上清液，用细菌总DNA分离试剂盒提取靶标DNA，储存在-20℃保存备用。

3)以福氏志贺氏菌CMCC(B)51573和痢疾志贺氏菌ATCC 13313的DNA作为模板，同时设置空白对照，利用实施例3中的CRISPR/Cas12a引物进行RAA扩增。

RAA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RAA反应管中加入再水化缓冲液41.5μL、上下游引物各2μL(10μM)、模板2μL、最后再加入醋酸镁溶液2.5μL，总反应体系50μL。

RAA的反应条件：将上述RAA反应体系充分混匀，在3℃条件下，扩增15min。

实施例5 CRISPR/Cas12a方法的建立

志贺氏菌的CRISPR/Cas12a方法的建立：

将上述实施例4中的福氏志贺氏菌和痢疾志贺氏菌的RAA产物做为 CRISPR/Cas12a的DNA模板。在八连管中，依次加入14μL的双蒸水、2μL 10×Buffer、实施例4纯化的crRNA 1μL、2μL实施例4的得到的RAA产物、10μmol/L探针0.5μL 以及0.5μL Cas12a酶，总反应体系为20μL。本实施例中使用的探针为 FAM-CACCGACGGCGAGACCGACTTT-TAMRA，其中，FAM和TAMRA为荧光基团。在另一些实施例中，荧光基团还可以选择TET、HEX、Cy3、Cy5和ROX。

加完体系立即置于恒温扩增仪上42℃收集荧光信号30分钟。实验结果如图2所示，其中曲线1、2分别为福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌，曲线3为阴性对照。由实验结果可知，福氏志贺氏菌、痢疾志贺氏菌均检测出较强的荧光信号，阴性对照无荧光信号，证明本方法对于单核细胞增生李斯特菌具有较好的检测准确性，检测时间短，操作方便快速。

实施例6 CRISPR/Cas12a方法的灵敏度测试

对所建立的志贺氏菌的CRISPR/Cas12a方法进行灵敏度测试：

将福氏志贺氏菌的菌液梯度稀释后，提取其靶标DNA，按照实施例5的方法，加入2μL 10×Cas12 buffer，1μL crRNA，0.5μL探针(10μM)，0.5μL Cas 12a酶(10μM) 以及不同浓度志贺氏菌靶标DNA，加水至反应总体系为20μL，42℃恒温扩增仪收集荧光信号30分钟。

实验结果如图3所示，由结果可知，本发明CRISPR/Cas12a法的检测下限可以达到10³CFU/mL，证明其具有较高的检测灵敏度。

实施例7 CRISPR/Cas12a方法的特异性分析

对所建立的志贺氏菌的CRISPR/Cas12a方法进行特异性试验分析：

本实施例中采用的菌株均由上海海关动植物与食品检验检疫技术中心提供，具体信息如表5所示。

表5.用于CRISPR/Cas12a特异性分析的菌株

将表5所列菌株按照实施例4所述细菌培养及提取细菌DNA作为CRISPR/Cas12a 反应模板。按照实施例5的方法，进行CRISPR/Cas12a扩增。

CRISPR/Cas12a扩增体系及扩增条件：加入2μL 10×Cas12 buffer，1μL crRNA，0.5 μL探针(10μM)，0.5μL Cas 12a酶(10μM)以及不同菌株的靶标DNA，加水至反应总体系为20μL，42℃恒温扩增仪收集荧光信号30分钟。

实验结果如图4所示，从结果中可以知道，只有阳性对照志贺氏菌的扩增结果呈阳性，其他常见致病菌的检测结果与空白对照的扩增结果无差异，呈现阴性。该结果表明，本发明CRISPR/Cas12a引物、crDNA以及CRISPR/Cas12a方法的特异性良好。

由上述实施例可知，本发明的检测方法具有快捷迅速、操作简单、特异性强、灵敏度高等优点，适用于实时现场检测。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

序列表

<110> 上海海关动植物与食品检验检疫技术中心

<120> 基于CRISPR/Cas12a方法检测志贺氏菌的试剂盒及其使用方法

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctggaaaaac tcagtgcctc tgcggagc 28

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

actttatccc gggcaatgtc ctccaga 27

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaattaata cgactcacta taggg 25

<210> 4

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctcagtggca tcagcagcaa cagtatctac aacagtagaa attccctata gtgagtcgta 60

ttaatttc 68

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgacggc gagaccgact tt 22

Claims

1.一种基于CRISPR/Cas12a方法检测志贺氏菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CRISPR/Cas12a引物、crRNA或crRNA制备试剂、核酸扩增试剂、探针和Cas12a酶；

所述CRISPR/Cas12a引物包括如SEQ ID NO.1所示序列的CRISPR/Cas12a上游引物，如SEQ ID NO.2所示序列的CRISPR/Cas12a下游引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA制备试剂包括crDNA序列和crRNA转录试剂，所述crRNA制备试剂用于制备所述crRNA；

所述crDNA序列包括如SEQ ID NO.3所示序列的crDNA上游序列，如SEQ ID NO.4所示序列的crDNA下游序列。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述crRNA转录试剂包括缓冲液、NTP、T7RNA聚合酶中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸扩增试剂为RPA或RAA扩增试剂。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的核苷酸序列为SEQ ID NO.5。

6.权利要求1所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、提取待检测样本的DNA；

S2、使用所述CRISPR/Cas12a引物和核酸扩增试剂所述对步骤S1中获得的DNA进行核酸扩增反应，得到核酸扩增产物；

S4、通过荧光检测确定检测结果。

7.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤S3中所述crRNA还可以通过crRNA制备试剂将所述crDNA序列转录为所述crRNA；所述crRNA制备试剂包括crDNA序列和crRNA转录试剂；

8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述将所述crDNA序列转录为所述crRNA，具体包括以下步骤：

将crDNA上下游序列退火形成双链；

9.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤S2中所述核酸扩增反应为重组酶介导等温核酸扩增反应，包括RPA扩增反应或RAA扩增反应。

10.根据权利要求6所述的使用方法，其特征在于，步骤S3中所述CRISPR/Cas12a反应的反应温度约为42℃，所述CRISPR/Cas12a反应的时间为15～30min。