CN116356082A - 一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及牛腺病毒检测技术领域，具体为一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒及其检测方法。包括：核酸扩增引物组、crRNA和探针，本发明设计的引物组具有极高的特异性及灵敏度，能够准确检测BAV‑3，且对其它类别常见牛病病毒检测呈阴性；本发明的检测方法利用CRISPR/Cas12a技术能在30~40分钟内完成高效率的基因扩增，CRISPR/Cas12a扩增的灵敏度是普通RPA或者RAA扩增的10~100倍，检测限可达10²CFU/μL，时间短、操作方便、灵敏度高、结果判断简单。

Description

一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及牛腺病毒检测技术领域，具体为一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

牛腺病毒3型（Bovine adenovirus type 3，BAV-3）属于腺病毒科，哺乳动物腺病毒属，病毒基因组为双链DNA，长度约为34kb，病毒衣壳为二十面体。流行病学调查发现，BAV-3在国内外牛群中的流行非常普遍，某些牧场的牛只阳性率高达90%以上。

BAV-3主要通过呼吸道或者消化道传播，病毒主要侵害血管，尤其是毛细血管、小静脉内皮细胞和上皮细胞。1~4周龄犊牛易感本病，表现为肺炎、腹泻、肺肠炎、结膜炎和多发性关节炎，通常体温升高，发病率高达70%~80%。病理学监测可见细支气管呈增生性炎症并有坏死，细支气管阻塞导致肺泡塌陷。在细支气管上皮细胞、中隔细胞和支气管淋巴结中有核内包涵体。

BAV-3能在犊牛肾细胞和睾丸单层细胞中生长繁殖，并产生腺病毒的特征性病变，形成嗜碱性或嗜酸性包涵体、核内包涵体，影响某些细胞的生长。BAV-3在室温条件下可以存活1~4个月，对干燥和冻融具有较高的抵抗力。血清中BAV-3的存在会对血清质量、细胞培养、体外试验结果造成严重影响，因此，在胎牛血清中检测本病毒极为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒及其检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒，包括：核酸扩增引物组、crRNA和探针；

所述核酸扩增引物组的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

优选的，所述的crRNA由crDNA引物对转录生成，所述crDNA引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述的荧光淬灭基团选自MGB、BHQ或TMARA中的任意一种。

一种牛腺病毒3型快速检测方法，其为利用上述优选的2项所述的试剂盒对待测样本进行牛腺病毒3型检测。

优选的，具体步骤为：

S1、提取待检测样本的DNA；

S2、使用所述的核酸扩增引物组对步骤S1中提取的DNA进行核酸扩增反应，得到核酸扩增产物；

S3、使用所述的crDNA引物对转录生成crRNA；

S4、将所述的探针、步骤S2中得到的核酸扩增产物、步骤S3中得到的crRNA和Cas12a酶混合，反应条件为：反应温度为37℃，反应时间为30~40分钟；

S5、通过荧光检测确定检测结果。

与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明设计的引物组具有极高的特异性及灵敏度，能够准确检测BAV-3，且对其它类别常见牛病病毒检测呈阴性；本发明的检测方法利用CRISPR/Cas12a技术能在30~40分钟内完成高效率的基因扩增，CRISPR/Cas12a扩增的灵敏度是普通RAA或者RPA扩增的10~100倍，检测限可达10²CFU/μL，时间短、操作方便、灵敏度高、结果判断简单。

crRNA合成成本高、合成周期长、不易长期保存，本发明是自行设计含有T7启动子的crDNA，crDNA可以长期保存，以crDNA为模板通过H7 RNA合成试剂盒转录获得crRNA，降低了生产成本，提高了检测效率，方便进行大规模推广应用。

本发明的作用机理为：CRISPR/Cas12a作为一种新兴的生物技术，可以用于病原的快速恒温检测。Casl2a能在crRNA的引导下特异识别并裂解富含T核苷酸PAM序列的dsDNA，并在特定的位点裂解靶标链实现检测的目的。将RPA扩增技术与Cas12a偶联，使用RPA扩增技术进行靶标DNA扩增，再加入CRISPR体系，Cas12a-crRNA复合物结合靶标DNA后，激活了反式切割活性，切割体系中的标记荧光基团，产生荧光信号。该方法的主要特点在于高效快速、操作简单、特异性强、灵敏度高，适用于实时现场检测扩增靶基因。

RPA扩增产物为目的基因序列，crRNA可以与RPA扩增产物结合按照碱基配对原则形成三链结构，该三链结构可以与Cas12a结合激活Cas12a的非特异核酸酶切活性，可以切割探针（例如FAM标记的常规任意短DNA序列），从而释放荧光信号。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为本发明实施例1中RPA检测BAV-3阳性样本的凝胶电泳图；

图2为本发明实施例2中RPA检测BAV-3不同浓度质粒的凝胶电泳图；

图3为本发明实施例3中RPA检测BAV-3和其他7种牛常见病毒的凝胶电泳图；

图4为本发明实施例4中RPA-CRISPR检测BAV敏感性试验的检测荧光实验图；

图5为本发明实施例5中CRISPR检测BAV-3特异性试验的检测荧光实验图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中，实验材料来源为：

BAV-3、BVDV1、BVDV2、IBRV、BPV3、BRSV、BRV、BLV 可以通过ATCC（美国模式培养物集存库）、中国兽医药品监察所或者武汉大学菌株保存库购买和获取；

DNA提取试剂盒（Magen（美基生物）公司MagPure Viral Nucleic Acid KF Kit，货号：MD5412-02）；

RPA试剂盒（TWIST公司TwistAmp Basic Kit，货号：TABAS03KIT）；

pMD19T质粒（购自宝生物工程（大连）有限公司）；

H7 RNA合成试剂盒（NEB公司HiScribe T7 High Yeild RNA Synthesis Kit，货号：E2040S）；

crRNA纯化试剂盒（ZYMO公司RNA Clean&Concentrator -5，货号：R1015）；

Cas12a试剂盒（Novaprotein（近岸蛋白）公司，货号：E737-YH01）。

术语或简称：

BAV-3：牛腺病毒3型；

BVDV1：牛病毒性腹泻粘膜病1型；

BVDV2：牛病毒性腹泻粘膜病2型；

IBRV：牛传染性鼻气管炎病毒；

BPV3：牛细小病毒3型；

BRSV：牛呼吸道合胞体病毒；

BRV：牛呼肠孤病毒；

BLV：牛白血病病毒；

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeatsequences）序列：成簇的、规律间隔的短回文重复序列；

“crRNA”是指CRISPR RNA；

重组酶聚合酶扩增技术（recombinase polymerase amplification，RPA）和重组酶介导的扩增技术（recombinase-aidamplification，RAA）均为常用的恒温扩增技术，在扩增过程中均使用重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶，在37℃恒温下进行核酸快速扩增。其不同点在于重组酶的来源不同，RPA体系的重组酶来源于T4噬菌体，RAA体系的重组酶来源于细菌或者真菌。在本发明的一些实例中，均可购买商业化的RPA或RAA体系的核酸扩增试剂进行反应。

实施例1：RPA-CRISPR检测的引物组及其检测方法

1、核酸扩增引物组、crDNA引物对的设计与合成

从NCBI下载31个不同国家和地区分离的代表性的BAV-3全基因组序列，利用Vector NTI Suite软件分析BAV-3全基因组的保守序列，设计合成核酸扩增引物组、crDNA引物对、包含目的基因的模板序列和探针序列。

核酸扩增引物组的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，具体为：

5'-gcagcaccgtatgctgtgaagcaggaggagaa-3'。

核酸扩增引物组的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，具体为：

5'-acaaattctatgtggggctcgtcgtcctcaaag-3'。

crDNA引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，具体为：

5'-gaaattaatacgactcactataggg-3'。

crDNA引物对的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，具体为：

5'-cttaattttgcgctccgcctttacatctacaacagtagaaattccctatagtgagtcgtattaatttc-3'，该下游引物从3'开始与crDNA引物对的上游引物核苷酸序列从5'开始一一互补对应，剩余的序列中包含了crDNA模板的核苷酸序列，该crDNA模板的核苷酸序列如SEQ IDNO：5所示，具体为：5'-cttaattttgcgctccgcctttac-3'，转录生成的crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，具体为：5'-cuuaauuuugcgcuccgccuuuac-3'。

探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，具体为：FAM-tcttgctaaaatacca-MGB，

荧光报告基团可以是FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，此处用FAM，荧光淬灭基团，可以是MGB、BHQ或TMARA等，此处用MGB。

包含目的基因的模板核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示，具体为：

5'-gcgagaacgcgcagcaccgtatgctgtgaagcaggaggagaagcctttagtaaaggcggagcgcaaaattaagcgcggctccagaaagcgggccttgtcaggcgttgacgttcctctgcccgatgacggctttgaggacgacgagccccacatagaatttgtgtctgcgccgcgtcggccctaccagtggaagggcaggcgggtgcgccgggt-3'，该模板包含了核酸扩增引物组的上下游引物序列和crRNA相结合的序列（具体为5'-gtaaaggcggagcgcaaaattaag-3'）。

BAV-3基因组的特征：经生物信息学分析，BAV-3不同毒株主要表现为单个碱基突变或多了碱基连续突变，这些突变不影响PCR扩增产物的限制性酶切多态性分析电泳的结果。引物、探针及包含目的基因的模板序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，利用H7 RNA合成试剂盒按照说明书操作，利用crDNA引物对转录生成crRNA，使用crRNA纯化试剂盒对crRNA纯化后，-80℃保存。

2、RPA扩增

采用由生工生物工程（上海）股份有限公司合成的包含目的基因的模板序列作为模板，同时设置阴性对照，利用上述的核酸扩增引物组分别进行RPA扩增。RPA扩增体系采用RPA试剂盒，具体过程如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液41.5μL、核酸扩增引物组的浓度为10μM的上下游引物各2μL、包含目的基因的模板2μL、最后再加入醋酸镁溶液2.5μL，总反应体系50μL。RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在39℃条件下，扩增15分钟。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结果表明，核酸扩增引物组的扩增效率较高，详见图1，其中，M：DNA分子质量标准DL2000；孔1：阳性样本；2：阴性对照。

3、CRISPR/Cas12a方法的建立

使用Cas12a试剂盒进行Cas12a酶反应，将上述利用核酸扩增引物组的扩增产物做为CRISPR/Cas12a的DNA模板，在八连管中，依次加入双蒸水14μL、10×Cas12a Buffer（Novaprotein（近岸蛋白）公司Cas12a试剂盒自带缓冲液，货号：E737-YH01，也可以自行配置。）2μL、纯化的crRNA1μL、上述RPA扩增体系扩增获得的扩增产物2μL、10μmol/L探针0.5μL以及10µM Cas12a酶0.5μL，总反应体系为20μL。加完体系立即置于恒温扩增仪上37℃收集荧光信号30分钟。

实施例2：RPA方法进行灵敏度测试

将目的基因的RPA扩增产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，胶回收纯化后利用T4连接酶16℃、10小时连接PMD19T载体，将连接产物转化TOP10感受态细胞后利用氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆，经菌落PCR鉴定后，将阳性质粒送生工生物公司测序确认。

以构建好的阳性质粒作为模板，同时设置空白对照，利用核酸扩增引物组进行RPA扩增。RPA扩增体系如下：具体过程包括，向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液41.5μL、核酸扩增引物组的浓度为10μM的上下游引物各2μL、分别为1×10⁷拷贝/μL、1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10⁰拷贝/μL浓度的阳性质粒作为模板2μL、最后再加入醋酸镁溶液2.5μL，总反应体系50μL。RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在39℃条件下，扩增15分钟。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。电泳结果表明，RPA检测的灵敏度达到1×10³拷贝/μL。

图2表示RPA方法检测BAV-3不同浓度质粒，其中，M：DNA分子质量标准DL2000；孔1-8：质粒浓度分别为1×10⁷拷贝/μL、1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10⁰拷贝/μL。

实施例3：RPA方法进行特异性测试

将BAV-3和另外7种牛病病原（BVDV1、BVDV2、IBRV、BPV3、BRSV、BRV和BLV）的阳性核酸利用RPA方法进行扩增。每种牛病病原阳性核酸采用DNA提取试剂盒进行提取。RPA扩增体系如下：向含有冻干酶粉的RPA反应管中加入再水化缓冲液41.5μL、核酸扩增引物组的浓度为10μM的上下游引物各2μL、分别为BAV-3和另外7种牛病病原（BVDV1、BVDV2、IBRV、BPV3、BRSV、BRV和BLV）的阳性核酸作为模板2μL、最后再加入醋酸镁溶液2.5μL，总反应体系50μL。RPA的反应条件：将上述RPA反应体系充分混匀，在39℃条件下，扩增15分钟。扩增产物以1.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

图3显示本发明建立的RPA方法检测BAV-3的特异性，其中，孔1为BAV-3阳性样本，孔2至孔8分别为BVDV1、BVDV2、IBRV、BPV3、BRSV、BRV和BLV。证明本实施例的检测方法对于BAV-3的检测特异性良好，能够区分BAV-3以及其它常见牛病病毒。

实施例4：CRISPR/Cas12a方法进行灵敏度测试

为测试建立的CRISPR方法的敏感性，将阳性质粒进行定量并梯度稀释，制备浓度分别为1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10⁰拷贝/μL、0拷贝/μL的模板。

将阳性质粒梯度稀释后，按照实施例1中CRISPR/Cas12a方法，加入2μL10×Cas12aBuffer，1μL crRNA，0.5μ探针(10µM)，0.5μL Cas 12a酶(10µM)以及不同浓度的阳性质粒，加水至反应总体系为20μL，37℃恒温扩增仪收集荧光信号40分钟。

图4显示CRISPR检测BAV-3的敏感性，结果显示，CRISPR检测模板的下限量为10²拷贝/µL。其中，孔1至孔8的模板浓度分别为1×10⁶拷贝/μL、1×10⁵拷贝/μL、1×10⁴拷贝/μL、1×10³拷贝/μL、1×10²拷贝/μL、1×10¹拷贝/μL、1×10⁰拷贝/μL、0拷贝/μL。证明本实施例的检测方法对于BAV-3的检测灵敏度高。

实施例5：CRISPR/Cas12a方法进行特异性试验分析

将BAV-3和另外7种牛病病原（BVDV1、BVDV2、IBRV、BPV3、BRSV、BRV和BLV）的阳性核酸利用CRISPR/Cas12a进行检测。CRISPR/Cas12a体系及反应条件：加入2µL10×Cas12Buffer，1µL crRNA，0.5µL探针(10µM)，0.5µL Cas 12a酶(10µM)以及2µL RPA扩增产物，加水至反应总体系为20µL，37℃恒温扩增仪收集荧光信号30分钟，通常反应30分钟内荧光强度低于40000结果判定为阴性。由图5可以看出，反应约5分钟后荧光强度逐渐升高，阳性样品的荧光值随着反应时间的延长逐渐呈指数函数式升高，其他病毒样品的荧光值无指数函数式升高，并且荧光值低于40000。

图5显示CRISPR检测BAV-3的特异性，其中，孔1为BAV-3阳性样本，孔2至孔8分别为BVDV1、BVDV2、IBRV、BPV3、BRSV、BRV和BLV。证明本实施例的检测方法对于BAV-3的检测特异性高，能够区分BAV-3以及其它常见牛病病毒。

实施例6：CRISPR检测BAV-3与发表文献方法的一致性

为了验证建立的CRISPR方法的可靠性，将本发明建立的方法与文献《Isolation,identification, and complete genome sequence of a bovine adenovirus type 3from cattle in China》中的PCR方法进行比较。将本发明建立的CRISPR方法用于检测48份核酸，其中含有13份核酸为实施例3提取保存的牛腺病毒3型阳性DNA样本。结果显示，经CRISPR检测13份阳性核酸呈显著荧光信号扩增，而所有阴性样品均未检测到荧光信号，特异性高（100%），灵敏度较好（100%），k值为1.00，说明本研究建立RPA-CRISPR方法的检测结果与已发表文献中的PCR检测结果完全一致。CRISPR与PCR检测结果对比见表1 CRISPR与文献中的方法检测BAV-3结果的一致性比较。

表1

通过与标准中的荧光PCR方法比较，本实施例建立的CRISPR方法的特异性为： 35/(35+0)=100.00%；灵敏性为：13/(13+0)=100.00%；Po=(13+35)/48=100.00%；Pe=13/48×35/48+35/48×35/48=72.92%；k=(Po-Pe)/(1-Pe)=1.00。

从上述结果可知，使用本发明的引物、试剂和方法检测BAV-3阳性样本的特异性高、灵敏度高，具有很好的检测效果，能够准确、有效地检测该病毒，对疾病防治和血清生物制品的质量控制有重要价值。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒，其特征在于，包括：核酸扩增引物组、crRNA和探针；

所述核酸扩增引物组的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

2.根据权利要求1所述的一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒，其特征在于，所述的crRNA由crDNA引物对转录生成，所述crDNA引物对的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求1所述的一种牛腺病毒3型快速检测试剂盒，其特征在于，所述探针的5’端连接荧光报告基团，3’端连接荧光淬灭基团，所述的荧光报告基团选自FAM、HEX、ROX或CY5中的任意一种，所述的荧光淬灭基团选自MGB、BHQ或TMARA中的任意一种。

4.一种牛腺病毒3型快速检测方法，其特征在于，其为利用权利要求2～3任一项所述的试剂盒对待测样本进行牛腺病毒3型检测。

5.根据权利要求4所述的一种牛腺病毒3型快速检测方法，其特征在于，具体步骤为：

S1、提取待检测样本的DNA；

S2、使用所述的核酸扩增引物组对步骤S1中提取的DNA进行核酸扩增反应，得到核酸扩增产物；

S3、使用所述的crDNA引物对转录生成crRNA；

S4、将所述的探针、步骤S2中得到的核酸扩增产物、步骤S3中得到的crRNA和Cas12a酶混合，反应条件为：反应温度为37℃，反应时间为30~40分钟；

S5、通过荧光检测确定检测结果。

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