CN117568528A - 一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统 - Google Patents
一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117568528A CN117568528A CN202311391962.XA CN202311391962A CN117568528A CN 117568528 A CN117568528 A CN 117568528A CN 202311391962 A CN202311391962 A CN 202311391962A CN 117568528 A CN117568528 A CN 117568528A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- rpa
- primer
- crispr
- detection
- cas13a
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 241000540503 Goose astrovirus Species 0.000 title claims abstract description 27
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 16
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 claims abstract description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 28
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 15
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 15
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 14
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 claims description 12
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 244000309743 astrovirus Species 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 claims description 5
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 5
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 6-carboxyfluorescein Chemical compound C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C11OC(=O)C2=CC=C(C(=O)O)C=C21 BZTDTCNHAFUJOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 9
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 9
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 5
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 4
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000012125 lateral flow test Methods 0.000 description 3
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 2
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 2
- 101150009852 ORF2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 2
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 1
- 108010040467 CRISPR-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241001473386 H9N2 subtype Species 0.000 description 1
- 235000001018 Hibiscus sabdariffa Nutrition 0.000 description 1
- 240000004153 Hibiscus sabdariffa Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 235000004789 Rosa xanthina Nutrition 0.000 description 1
- 241000109329 Rosa xanthina Species 0.000 description 1
- 241001417494 Sciaenidae Species 0.000 description 1
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 101150098304 cas13a gene Proteins 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000007026 protein scission Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明公开了一种基于RPA‑CRISPR‑Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统。该检测包括基于RPA‑CRISPR‑Cas13a检测鹅星状病毒的引物探针组合：RPA扩增的引物对、crRN和RNA探针；所述RPA扩增的引物对包括正向引物RPA‑ORF2‑F和反向引物RPA‑ORF2‑R。所述鹅源星状病毒为鹅源星状病毒2型，其保藏编号为CCTCC NO：V201808。本发明建立的检测系统能够临栏检测(又称现场检测)，无需在标准专业实验室操作昂贵试验设备，推动了GAstV‑2诊断技术的发展，为防控GAstV‑2病提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及禽畜病毒检测技术领域，具体涉及一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统。
背景技术
鹅星状病毒II型(GAstV-2)是国内广泛分布的一种以雏鹅关节痛风和内脏痛风为特征的新兴病原体，给我国养鹅业造成了严重的经济损失。由于目前还没有预防GAstV-2感染的疫苗和特效药，该病呈广泛流行态势，因此开发灵敏、快速、特异且便捷的检测方法是成功预防和控制感染的关键。
目前，用于GAstV-2鉴定的技术包括病毒中和的血清学方法、酶联免疫吸附试验和免疫荧光抗体分析。尽管上述这些常规检测具有实用性，但敏感性不足，耗时长。此外，RT-PCR、巢氏RT-PCR以及灵敏度更高的实时荧光定量RT-PCR等核酸检测已被用于有效诊断GAstV-2感染，但考虑到需要昂贵仪器设备，限制了它们在实际领域或设备不足的实验室中的应用。因此，如何更加快速、简便、准确、灵敏地检测，是GAstV-2核酸检测未来的发展方向。
规律成簇间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced ShortPalindromic Repeats,CRISPR)及其相关蛋白(CRISPR-associated proteins，Cas)构成CRISPR-Cas系统在分子诊断中的应用已引起广泛关注。属于Ⅱ类CRISPR系统中的CRISPR-Cas13a，包括Cas13a蛋白和CRISPR RNA(crRNA)。Cas13a蛋白和crRNA可以在其靶标RNA被特异性识别的情况下产生切割活性，进而非特异性切割旁系RNA，并将其应用于核酸检测领域。其原理是靶标RNA与crRNA通过碱基配对结合，crRNA 5’末端的发夹结构被Cas13a蛋白的REC(crRNA识别)叶识别，Cas13a蛋白在靶标RNA存在下产生核糖核酸酶活性，活化的Cas13a以非特异性方式裂解单链旁系RNA。为提高RPA-CRISPR-Cas13a的灵敏度，将重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)、T7转录系统与Cas13a介导的切割活性相结合，可在极低拷贝水平检测到靶标核酸分子。申请号202110091225.2的专利公开了鹅源星状病毒核酸CRISPR-Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA，虽然也是采用CRISPR-Cas13a技术进行检测，但鹅源星状病毒分为I型和II型，该方法无法精确检测不同类型的GAstV。鉴于目前尚无CRISPR-Cas13a精确检测GAstV-2相关报道，所以需要开发一套基于RPA-RPA-CRISPR-Cas13a，用于GAstV-2ORF2基因的精确、快速检测。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统。本发明克服现有GAstV-2检测的缺陷和不足，开发适用于基层工作的快速、灵敏、特异的检测方法。本发明建立的检测系统能够临栏检测(又称现场检测)，无需在标准专业实验室操作昂贵试验设备，推动了GAstV-2诊断技术的发展，为防控GAstV-2病提供技术支持。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒的引物探针组合，包括RPA扩增的引物对、crRNA和RNA探针；
所述RPA扩增的引物对包括正向引物RPA-ORF2-F和反向引物RPA-ORF2-R，所述正向引物RPA-ORF2-F的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物RPA-ORF2-R的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述RNA探针为两端带有标记基团的单链RNA，其序列为rUrUrUrUrUrU
优选的，所述RNA探针为一端标记有荧光基团和另一端标记有荧光淬灭基团或生物素基团的单链RNA。
优选的，所述荧光基团为羧基荧光素或异硫氰酸荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞猝灭剂-1，所述生物素基团为Biotin。
本发明的第二方面，提供上述引物探针组合在制备检测或诊断鹅源星状病毒产品中的用途。
优选的，所述鹅源星状病毒为鹅源星状病毒2型，其保藏编号为CCTCC NO：V201808。
优选的，所述检测或诊断鹅源星状病毒产品为检测或诊断鹅源星状病毒的试剂盒、试纸条或荧光检测系统。
本发明的第三方面，提供一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒的荧光检测系统，所述荧光检测系统包括引物探针组合物，其RNA探针为5’端标记FAM、3’端标记BHQ-1的单链RNA。
本发明的第四方面，提供一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒的试纸条，所述试纸条包括引物探针组合物，其RNA探针为5’端标记FITC、3’端标记Biotin的单链RNA。
本发明的有益效果：
本发明基于RPA-CRISPR-Cas13a酶分子检测系统设计了一套特异性强，灵敏度高的GAstV-2检测系统，可在室温下50分钟内可检测到1copies/μL的GAstV-2DNA标准品，其性能可与RT-qPCR相媲美。该系统可通过便携式横向流量试纸条可实现临栏检测(又称现场检测)。该系统对GAstV-2的检测及后期流行病学调查提供技术支持，对GAstV-2病的防控具有指导意义。
附图说明
图1为基于RPA-CRISPR-Cas13a系统检测的示意图；
图2为GAstV-2crRNA的序列设计示意图；
图3为RPA引物扩增筛选的DNA凝胶电泳图(A)及3条crRNA对GAstV-2ORF2基因序列的阳性质粒CRISPR-Cas13a检测50min荧光值测定结果(B)；
图4为试纸条检测原理，(A)常规试纸条的检测原理，(B)基于RPA-CRISPR-Cas13a便携式试纸条横向流动检测的原理图；
图5为基于RPA-CRISPR-Cas13a系统荧光检测的特异性结果图，(A)各样品的荧光值随时间的变化，(B)各样品的最高荧光值对比；
图6为基于RPA-CRISPR-Cas13a系统荧光检测的敏感性结果图；(A)不同浓度的标准品质粒荧光值随时间的变化，(B)不同浓度的标准品质粒最高荧光值对比；
图7为基于RPA-CRISPR-Cas13a便携式试纸条检测的特异性结果图；
图8为基于RPA-CRISPR-Cas13a便携式试纸条检测的敏感性结果图；
图9为应用基于RPA-CRISPR-Cas13a系统检测临床样品的结果图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。
实施例1：GAstV-2荧光检测体系的构建
(1)RPA引物设计与筛选
鉴于星状病毒ORF2基因常用于星状病毒的遗传进化分析，选择二代测序技术获得保藏编号为CCTCC NO：V201808(参见申请号：CN201810494586.X公开的专利一种防治新型鹅星状病毒的灭活疫苗及其制备方法)的GAstV-2病毒分离株的全基因组序列中ORF2基因的保守核苷酸区作为RPA引物的附着位点。
RPA引物设计原则：
引物长度控制在30-50个碱基以内，过长或者过短均影响扩增效率；引物中避免出现回文序列等特殊序列；GC含量控制在30-70％之间，避免形成二级结构或者发卡结构；扩增目的片段大小最适为100-200bp左右。
按照以上RPA扩增引物设计原则设计5对特异性RPA引物序列，同时在NCBIPrimerBLAST上对所设计出的引物进行特异性筛选，并在正向引物的5’端添加T7 RNA聚合酶启动子，各RPA引物对序列设计如下：
正向引物RPA-ORF2-F1(如SEQ ID NO.1所示)：TAATACGACTCACTATAGGGGCCGAGAGGAAGCTTGAGAAAGAAGTGAAAGG；
反向引物RPA-ORF2-R1(如SEQ ID NO.2所示)：TTATGCTTCCGGTCGAGTGTGTCTGTTGAATTC；
正向引物RPA-ORF2-F2(如SEQ ID NO.7所示)：TAATACGACTCACTATAGGGATGGTTCGTGATCAGAAAATTGTTTGGTGCTG；
反向引物RPA-ORF2-R2(如SEQ ID NO.8所示)：TGCAGCCAGCTGTAGTGGCGTGTTCGGTGGAA；
正向引物RPA-ORF2-F3(如SEQ ID NO.9所示)：TAATACGACTCACTATAGGGTAAGCTTGTACAGCTAACACAGCCAAATGTGA；
反向引物RPA-ORF2-R3(如SEQ ID NO.10所示)：AAGGTTATATTTGCATTGTATCTTGACCTG；
正向引物RPA-ORF2-F4(如SEQ ID NO.11所示)：TAATACGACTCACTATAGGGTCAGACCAGAAATGGGTGTGGCTCTGGGCTG；
反向引物RPA-ORF2-R4(如SEQ ID NO.12所示)：CCGCTGTTGGATCAAAAAGCGAAGTGACATC；
正向引物RPA-ORF2-F5(如SEQ ID NO.13所示)：TAATACGACTCACTATAGGGCTGCGTGTGAATACCAGTACAACATCTACT；
反向引物RPA-ORF2-R5(如SEQ ID NO.14所示)：TAGTCAGAGGTCTTGAGTGAGACTGCTAGGT；
分别用5对RPA引物扩增含有GAstV-2ORF2基因序列的阳性质粒，通过DNA凝胶电泳分析各对引物核酸扩增情况，如图3A所示，最终选择扩增效果最好的引物对RPA-ORF2-F1/RPA-ORF2-R1作为RPA扩增引物。
(2)设计crRNA
CRISPR-Cas13a检测方法的核心在于crRNA，故crRNA质量与检测方法的灵敏度、精准度直接相关。为了筛选效率最高的crRNA，针对GAstV-2高度保守的ORF2靶标区域，我们设计合成了3条crRNA，各crRNA序列信息如表1所示。cRNA设计不能与RPA引物重叠。crRNA的间隔区序列(长度为28nt)是转录的靶点单链RNA(ssRNA)上任意位置的反向互补序列，随后，通过将间隔区序列连接到5’重复序列(长度为36nt)，产生了完整的crRNA(图2，表1)。为了通过体外转录从DNA模板产生crRNA，将T7 RNA聚合酶的启动子序列连接到crRNA序列上游以使T7能够转录，将整个序列排序为DNA的反向补体就是crRNA体外转录单链DNA模板(表1)。
表1 crRNA、crRNA体外转录模板和T7启动子核苷酸序列
注：下划线是5’重复序列(长度为36nt)；根据WIPOST.26标准的规定，表中RNA序列中的尿嘧啶“U”在序列表中用“T”表示。
(3)体外转录并纯化crRNA
将T7-3G寡核苷酸和crRNA体外转录单链DNA模板退火生成T7体外转录所需双链DNA。如表2所示，使用Standard Taq Buffer(New England Biolabs,cat.no.B9014S)配制退火反应体系，按照反应条件：37℃孵育30分钟，95℃孵育5分钟，以每分钟5℃的速度降至25℃进行退火。利用T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(New England Biolabs,cat.no.E2050S)，参照表3配制体外转录的反应体系。反应液离心混匀，按照体外转录条件：37℃孵育4小时进行cRNA的合成。反应结束后，加入1μL DNaseⅠ(上海尚宝生物科技有限公司，货号T11015，规格1mL)至反应体系中，混匀后置于37℃孵育20分钟，以去除反应残留的DNA。使用Agencourt RNAClean XP Kit(Beckman Coulter,cat.no.B9014S)，按照说明书对crRNA进行纯化。
表2退火反应体系
表3体外转录反应体系
(4)筛选crRNA
通过在罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪上反应50min，进行CRISPR-Cas13a荧光检测，如图3B所示，在3条crRNA中，crRNA1荧光值最高，说明扩增效果最好，灵敏度最高。
(5)合成靶点cDNA
采用商品化RNA提取试剂盒(TransGen,cat.no.EC301-11)提取SDPY毒株(即保藏编号为CCTCC NO：V201808的GAstV-2毒株)总RNA；利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit(KANGWEI,cat.no.CW2569M)将RNA反转录成cDNA。
(6)制备靶标阳性质粒标准品
设计GAstV-2ORF2基因的正向和反向引物，通过PCR扩增ORF2基因组，扩增产物经凝胶提取试剂盒(Omega Bio-tek,cat.no.D2500-02)纯化后，按照经典的分子克隆操作方法，将其连接到pMD18-T载体上得到重组质粒pMD18-T-ORF2，随后将重组质粒pMD18-T-ORF2转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，测序筛选阳性克隆并使用TIANprep Mini Plasmid Kit(TIANGEN,cat.no.DP105)提取质粒，利用DS-11分光光度计测量质粒浓度，根据公式计算pMD18-T-ORF2质粒标准品的拷贝数。
(7)合成荧光检测的RNA报告探针
在RNA序列两端分别标记FAM荧光基团和BHQ1荧光淬灭基团，即可构成荧光检测的RNA报告探针。其序列(如SEQ ID NO.4所示)为：FAM-rUrUrUrUrUrU-BHQ1，由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。
(8)基于RPA-CRISPR-Cas13a系统的核酸检测体系
表4 RPA-CRISPR-Cas13a检测体系
将上述60μL混合液加到装有TwistAmp Basic Kit(TwistAmp,cat.no.TABAS03KIT，含RPA冻干真空包装组分)反应管中，在冰盒上反复重悬RPA冻干真空包装组分至完全溶解。
实施例2：RPA-CRISPR-Cas13a系统荧光检测的特异性测试
测试对象：坦布苏病毒(TMUV)、呼肠孤病毒(ARV)、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2-AIV)。
使用商品化RNA提取试剂盒(TransGen,cat.no.EC301-11)提取上述病毒和GAstV-2(SDPY毒株)的RNA，利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit(KANGWEI,cat.no.CW2569M)将RNA反转录成cDNA。将反转录的cDNA作为模板，参照实施例1的步骤(7)在冰盒上配制反应体系。
按照反应条件：37℃孵育50分钟，每5分钟记录一次荧光信号，在罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪上进行RPA-CRISPR-Cas13a系统荧光检测的特异性测试。结果如图5所示，GAstV-2样品的荧光值随时间快速升高，且与TMUV、ARV、H9N2-AIV有极显著差异(P＜0.001)。以上结果表明，本发明建立的检测GAstV-2方法具有很强的特异性，与其他病毒没有交叉反应。
实施例3：RPA-CRISPR-Cas13a系统荧光检测的敏感性测试
以10倍梯度稀释的pMD18-T-ORF2标准品质粒(107copies/μL～100copies/μL)为模板，参照实施例1的步骤(7)在冰盒上配制反应体系。按照反应条件：37℃孵育50分钟，每5分钟记录一次荧光信号。在罗氏LightCycler96实时荧光定量PCR仪上进行RPA-CRISPR-Cas13a系统荧光检测的敏感性测试。结果如图6所示，随着稀释度的升高，荧光值下降，当质粒标准品稀释至100copies/μL时，与阴性对照相比，荧光值具有极显著差异(P＜0.001)。以上结果表明，本发明建立的检测GAstV-2方法最低检测限为100copies/μL。
实施例4：GAstV-2检测试纸条的构建
与实施例1的区别在于：步骤(6)合成横向流动试纸条检测的RNA报告探针：
在RNA序列两端分别标记FITC荧光基团和Biotin生物素，即可构成横向流动试纸条检测的RNA报告探针。其序列(如SEQ ID NO.4所示)为：FITC-rUrUrUrUrUrU-Biotin，由湖南艾科瑞生物工程有限公司合成。
(7)RPA-CRISPR-Cas13a检测体系同实施例1的表4。
如图4B所示，试纸条的山羊抗兔IgG抗体以条带状固定在硝酸纤维素膜上(检测线)，当在样品结合垫滴加样品后，若样品中鹅星状病毒2型浓度较高时，crRNA与RPA扩增产物互补结合，激活Cas13a蛋白切割活性，对荧光生物素RNA探针进行切割，在试纸层析作用下，向吸水纸方向迁移，当金纳米颗粒标记的兔抗异硫氰酸荧光素(FITC)单克隆抗体与切割的荧光生物素探针FITC末端形成结合物，移动至固定的山羊抗兔IgG抗体区域时，结合物又与之发生特异性结合而被聚集在检测线上，最终形成一条红色沉淀线，可通过肉眼观察到显色结果。若样品中存在较少鹅星状病毒2型或不存在鹅星状病毒2型时，金纳米颗粒标记的兔抗FITC的单克隆抗体、荧光生物素探针与生物素-配体结合，三者形成结合物，形成一条红色沉淀线；金纳米颗粒标记的兔抗FITC单克隆抗体与切割的荧光生物素探针FITC末端形成的结合物继续移动至山羊抗兔IgG抗体区域时，又与之发生特异性结合而被聚集在检测线上，最终在质控线和检测线处形成两条红色沉淀线，可通过肉眼观察到显色结果。
结果判读：
如图4B所示：若待测样品检测线位置出现红色条带或待测样品检测线和阴性样品控制线位置均出现红色条带时，则表示待测样品为GAstV-2阳性；若待测样品检测线位置不出现红色条带，在控制线上出现红色条带，则表示待测样品为GAstV-2阴性；若待测样品检测线位置和控制线位置均未出现红色条带，则表示所用的试纸条或反应液可能已经损坏、失效或检测过程中操作有误。本发明的质控线与传统意义上的质控线存在区别，如图4B第一个试纸条所示：当检测线出现条带而质控线未出现条带并不是表示试纸异常，而是表示样品中的病毒含量高；图4B的第二个试纸条表示被测样品中靶标浓度较低。
实施例5：基于RPA-CRISPR-Cas13a系统便携式试纸条检测的特异性测试
以反转录的病毒cDNA作为模板，参照实施例4步骤(7)在冰盒上配制反应体系。37℃孵育50分钟后，将反应混合物与80μL的HybriDetect Assay Buffer孵育5分钟后，使用横向流动试纸条进行RPA-CRISPR-Cas13a系统便携式试纸条检测的特异性测试。
结果如图7所示，仅在检测GAstV-2的试纸条上出现测试带的显色，其他病毒样品的试纸条均未显示任何阳性条带。以上结果表明，本发明建立的检测GAstV-2方法具有很强的特异性，与其他病毒没有交叉反应。
实施例12：基于RPA-CRISPR-Cas13a系统便携式试纸条检测的敏感性测试
以10倍梯度稀释的pMD18-T-ORF2标准品质粒(107copies/μL～100copies/μL)为模板，参照实施例4步骤(7)在冰盒上配制反应体系。37℃孵育50分钟，再将反应混合物与80μL的HybriDetect Assay Buffer孵育5分钟后，使用横向流动试纸条进行RPA-CRISPR-Cas13a系统便携式试纸条检测的敏感性测试。
结果如图8所示，本发明建立的检测GAstV-2方法最低检测限为100copies/μL。
应用例：临床样品的RPA-CRISPR-Cas13a检测应用
分别使用实施例1的荧光检测系统以及RT-PCR(参见Yang J,Tian J,Tang Y,DiaoY.Isolation and genomic characterization of gosling gout caused by a novelgoose astrovirus.Transbound Emerg Dis.2018Dec；65(6):1689-1696.doi:10.1111/tbed.12928.Epub 2018Jun 19.PMID:29920970)、荧光定量PCR(参见Yin D,Yang J,TianJ,He D,Tang Y,Diao Y.Establishment and application of a TaqMan-based one-stepreal-time RT-PCR for the detection of novel goose-origin astrovirus.J VirolMethods.2020Jan；275:113757.doi:10.1016/j.jviromet.2019.113757.Epub 2019Oct24.PMID:3166933)对24份疑似GAstV-2感染的鹅的泄殖腔拭子进行检测，并比较检测结果。
结果如图9所示，16份样本经RPA-CRISPR-Cas13a、RT-qPCR和RT-PCR检测GAstV-2阳性。其余8例GAstV-2阴性标本中，有3例经RPA-CRISPR-Cas13a和RT-qPCR检测出GAstV-2阳性。以上结果表明，RPA-CRISPR-Cas13a与RT-qPCR在临床样本上的一致性为100％，且RPA-CRISPR-Cas13a的总体敏感性高于RT-PCR。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒的引物探针组合，其特征在于，包括RPA扩增的引物对、crRNA和RNA探针；
所述RPA扩增的引物对包括正向引物RPA-ORF2-F和反向引物RPA-ORF2-R，所述正向引物RPA-ORF2-F的序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物RPA-ORF2-R的序列如SEQ ID NO.2所示；
所述crRNA的序列如SEQ ID NO.3所示；
所述RNA探针为两端带有标记基团的单链RNA，其序列为rUrUrUrUrUrU。
2.根据权利要1所述的引物探针组合，其特征在于，所述RNA探针为一端标记有荧光基团和另一端标记有荧光淬灭基团或生物素基团的单链RNA。
3.根据权利要1所述的引物探针组合，其特征在于，所述荧光基团为羧基荧光素或异硫氰酸荧光素；所述荧光淬灭基团为黑洞猝灭剂-1，所述生物素基团为Biotin。
4.权利要求1～3任一项所述的引物探针组合在制备检测或诊断鹅源星状病毒产品中的用途。
5.根据权利要4所述的用途，其特征在于，所述鹅源星状病毒为鹅源星状病毒2型，其保藏编号为CCTCC NO：V201808。
6.根据权利要4所述的用途，其特征在于，所述检测或诊断鹅源星状病毒产品为检测或诊断鹅源星状病毒的试剂盒、试纸条或荧光检测系统。
7.一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒的荧光检测系统，其特征在于，所述荧光检测系统包括1～3任一项所述的引物探针组合物，其RNA探针为5’端标记FAM、3’端标记BHQ-1的单链RNA。
8.一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒的试纸条，其特征在于，所述试纸条包括1～3任一项所述的引物探针组合物，其RNA探针为5’端标记FITC、3’端标记Biotin的单链RNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311391962.XA CN117568528A (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311391962.XA CN117568528A (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117568528A true CN117568528A (zh) | 2024-02-20 |
Family
ID=89863383
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311391962.XA Pending CN117568528A (zh) | 2023-10-25 | 2023-10-25 | 一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117568528A (zh) |
-
2023
- 2023-10-25 CN CN202311391962.XA patent/CN117568528A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111074000B (zh) | 一种区分asfv野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量pcr检测材料及试剂盒 | |
| CN110777220B (zh) | 一种引物组、探针、rpa试纸条试剂盒、鉴别方法 | |
| CN112538550B (zh) | 基于RT-RPA和CRISPR/Cas的DHAV-1和DHAV-3检测体系及应用 | |
| CN110453014A (zh) | 检测鸡传染性支气管炎病毒的引物和探针组合以及试剂盒和检测方法 | |
| CN113564280A (zh) | 一种用于检测禽腺病毒i群12个血清型的raa引物及其检测方法 | |
| CN110408727B (zh) | 一种检测j亚群禽白血病病毒的cpa引物组、cpa核酸试纸条试剂盒及其应用 | |
| CN113777141B (zh) | 电化学生物传感器及其制备方法和检测新型冠状病毒的方法 | |
| CN113667668B (zh) | 基于CRISPR/Cas系统的HBV检测 | |
| CN116356079A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas12a可视化检测盖塔病毒试剂盒及应用 | |
| WO2022257663A1 (zh) | 一种检测筛查新冠病毒n501y突变的方法及试剂盒 | |
| CN116411141A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR/Cas12a可视化检测猪A群轮状病毒试剂盒及应用 | |
| CN115852052A (zh) | 一种检测CymRSV的实时荧光定量PCR引物探针组合及其方法 | |
| CN116287427A (zh) | Raa-lfd检测鸭坦布苏病毒的引物和探针组合及其应用 | |
| CN117568528A (zh) | 一种基于RPA-CRISPR-Cas13a检测鹅星状病毒2型的检测系统 | |
| CN116064905A (zh) | 用于检测大丽轮枝菌的引物组合、试剂盒及应用 | |
| CN113249378A (zh) | 检测ALV-A/B/J的RPA特异性引物对、crRNA片段及其应用 | |
| CN107988429B (zh) | 一种检测狂犬病毒的试剂及其应用 | |
| CN116083655B (zh) | 一种用于I-IV型登革病毒检测的DENV-crRNA及其试剂盒和应用 | |
| CN114292963B (zh) | 鸭坦布苏病毒核酸CRISPR-Cas13a检测系统及RPA引物对和crRNA | |
| CN117265186B (zh) | 一种检测穿山甲东阳病毒的TaqMan荧光定量PCR引物组、试剂盒及方法 | |
| CN116732204B (zh) | 同时检测多种病原的多重lamp引物组、检测方法和试剂盒 | |
| CN117587168B (zh) | LAMP-CRISPR/Cas12a可视化鉴别RHDV 1型和2型的试剂盒及方法 | |
| CN107513585A (zh) | 一种鹅多瘤病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 | |
| CN115747218A (zh) | 用于猴痘病毒核酸检测的crRNA及试剂盒 | |
| CN113249527A (zh) | 检测禽网状内皮组织增生症病毒的rpa特异性引物对及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |