CN116083655B - 一种用于I-IV型登革病毒检测的DENV-crRNA及其试剂盒和应用 - Google Patents
一种用于I-IV型登革病毒检测的DENV-crRNA及其试剂盒和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种用于四种血清型(I‑Ⅳ型)登革病毒(DENV)检测的DENV‑crRNA，DENV‑crRNA序列如SEQ ID NO：1所示。还公开了DENV‑crRNA在I‑Ⅳ型DENV检测及其相关侦检处置技术与产品中的应用，以及一种基于CRISPR检测I‑Ⅳ型DENV的试剂盒，所述试剂盒包括DENV‑crRNA。本发明基于DENV‑crRNA，将RAA核酸扩增与CRISPR相结合，建立了I‑Ⅳ型DENV的快速检测技术体系及其试剂盒，具有简便快捷、特异性高、灵敏性高、稳定性高、价廉易用等优点，提高了I‑Ⅳ型DENV的检测效率，尚可应用于基层与现场，具有良好的实用价值和广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于核酸检测领域，涉及一种用于四种血清型(I-Ⅳ型)登革病毒(DENV)检测的DENV-crRNA及其试剂盒和应用，具体涉及一种基于CRISPR技术检测I-Ⅳ型登革病毒DENV-crRNA(CRISPR RNA)及其试剂盒和应用。
背景技术
登革热是由登革病毒(DENV)引起的一种严重的全球性流行的虫媒传染病，主要分布在热带、亚热带地区，最主要的传播媒介是埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Ae.albopictus)。登革病毒根据抗原不同分为4种血清型(I～IV型)，每种血清型均可引起登革热症状。对血清或白纹伊蚊进行登革病毒的精准检测，对疾病的诊断与流行研判及预警等均具有重要意义。
登革病毒的常见检测方法有：病毒分离培养、反转录聚合酶链式反应、血清学方法如中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等，杂交技术与基因芯片技术等也可用来测定登革病毒。
但是以上方法存在一定限制，如病毒分离培养方法培养周期长，利用PCR技术、血清学方法的诊断过程耗时，需要熟练、专业的操作人员以及特殊的仪器设备等，难以满足传染病防控中的快速侦检与预警需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于I-Ⅳ型登革病毒检测的DENV-crRNA。
本发明的目的还在于提供一种基于CRISPR检测I-Ⅳ型登革病毒的试剂盒。
本发明的最后一个目的在于提供上述用于I-Ⅳ型登革病毒检测的DENV-crRNA或试剂盒在制备I-Ⅳ型登革病毒检测产品中的应用。
本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于I-Ⅳ型登革病毒检测的DENV-crRNA，所述DENV-crRNA的序列如SEQ ID NO.1所示。
DENV-crRNA的序列具体如下：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUAUGCUGAAACGCGCGAGAAA(如SEQ ID NO：1所示)。
本发明中用于检测I-Ⅳ型登革病毒DENV的DENV-crRNA，包括与Cas蛋白结合的序列和与待测核酸杂交的登革病毒DENV特异性导向序列。
本发明所述DENV-crRNA，其DENV特异性导向序列含有23个碱基(见序列中的划线部分)，特异性筛选自I-Ⅳ型DENV基因组序列，用于特异性靶向识别来源于I-Ⅳ型DENV核酸扩增产物的待测核酸序列。
本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种基于CRISPR检测I-Ⅳ型登革病毒的试剂盒，包括上述DENV-crRNA。
进一步的，所述试剂盒还包括Cas12a蛋白、待测核酸和单链核酸检测器。
本发明所述Cas蛋白是指CRISPR-associated蛋白，当其与待检测特征序列(靶序列)结合，形成Cas蛋白-crRNA-靶序列的三元复合物时，能诱发其附带切割活性，即随机切割非靶向单链核苷酸(单链核酸检测器)。
优选的，本发明中Cas蛋白选自V型Cas蛋白，为Cas12家族中Cas12a，更优选为LbCas12a。
本发明待测核酸从待测样品中扩增获得，如采用特异性DENV引物对待测样品进行核酸扩增获得待测核酸。
其中待测样品主要为病人血清样品等，也可以是来自昆虫如埃及伊蚊和/或白纹伊蚊的组织研磨液等。
优选的，本发明核酸扩增选择重组酶介导链替换核酸扩增(RAA)，并提供扩增Ⅰ-Ⅳ型登革病毒(DENV)核酸序列的特异性引物对。
其余可用于本发明的核酸扩增方法还有聚合酶链式反应(PCR)、环介导的等温扩增(LAMP)和链置换扩增(SDA)等。
优选的，本发明所述待测核酸为登革病毒特异性的RT-RAA扩增产物，所述RT-RAA扩增产物采用登革病毒特异性RAA引物扩增获得，所述RAA引物为引物对D1、引物对D2、引物对D3或引物对D4，分别用于扩增四种血清型(Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ或Ⅳ型)登革病毒(DENV)，每对引物均包括上游引物和下游引物，其中所述引物对D1的上游引物如SEQ ID NO：2所示，所述引物对D1的下游引物如SEQ ID NO：3所示，所述引物对D2的上游引物如SEQ ID NO：4所示，所述引物对D2的下游引物如SEQ ID NO：5所示，所述引物对D3的上游引物如SEQ ID NO：6所示，所述引物对D3的下游引物如SEQ ID NO：7所示，所述引物对D4的上游引物如SEQ ID NO：8所示，所述引物对D4的下游引物如SEQ ID NO：9所示。
具体的：从5'-3'，引物对D1-引物对D4如下：
引物对D1上游引物(D1-dsDNA-44F)：
AAGCTTGCTTAACGTAGTTCTRACAGTTTTT(SEQ ID NO：2所示)；
引物对D1下游引物(D1-dsDNA-263R)：
GRAATCTTAGGAATGCTATRAAAGCCATCAC(SEQ ID NO：3所示)；
引物对D2上游引物(D2-dsDNA-88F)：
AGATCTCTGATGAATAACCAACGGRAAAAG(SEQ ID NO：4所示)；
引物对D2下游引物(D2-dsDNA-344R)：
CCTTCCAATCTCTTTCCTGAACCCTCTCAA(SEQ ID NO：5所示)；
引物对D3上游引物(D3-dsDNA-88F)：
AGATCTCTGATGAACAACCAACGGAARAAG(SEQ ID NO：6所示)；
引物对D3下游引物(D3-dsDNA-252R)：
AAAGCTATRAACGCCATAACCAATTTCATT(SEQ ID NO：7所示)；
引物对D4上游引物(D4-dsDNA-174F)：
CTGGAAAAATGAACCAACGAAAAAAGGTGG(SEQ ID NO：8所示)；
引物对D4下游引物(D4-dsDNA-405R)：
TTATTTTTCTTCAACTGTCCCCATCTCTTCA(SEQ ID NO：9所示)。
本发明将特异性的登革病毒(DENV)引物对D1-引物对D4分别应用于Ⅰ-Ⅳ型登革病毒(DENV)核酸待测样本，通过特异性的RAA扩增富集目标序列，Cas蛋白在DENV-crRNA引导下与扩增产物结合，激活Cas蛋白附带切割能力，切割体系中的单链核酸检测器，发出可检测信号，实现核酸分子的检测。
本发明所述单链核酸检测器包括但不限于单链DNA、单链RNA或者单链DNA-RNA杂交体的任意两种或三种的混合物。
本发明中检测信号的方式包括但不限于基于荧光信号的检测、基于视觉的检测(蓝光)或基于核酸检测试纸条的检测，均可用于待测核酸的定性/定量检测，其依据分别是报告基团信号的有无/强弱。
作为本发明一种优选的实施方式，当基于荧光信号检测时，本发明所述单链核酸检测器为FAM-TTATT-BHQ1。
作为本发明另外一种优选的实施方式，当基于核酸检测试纸条检测时，本发明所述单链核酸检测器为FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin。
优选的，本发明所述Cas12a蛋白：DENV-crRNA：待测核酸的摩尔比为10～15：5～10：1。
更佳的，本发明所述Cas12a蛋白：crRNA：待测核酸的摩尔比为15：10：1。
本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述用于I-Ⅳ型登革病毒检测的DENV-crRNA或试剂盒在制备I-Ⅳ型登革病毒检测产品中的应用。
本发明中的上述用于I-Ⅳ型登革病毒检测的DENV-crRNA或试剂盒还可以进一步应用于I-Ⅳ型登革病毒相关侦检处置技术方面。
本发明还提供了一种基于CRISPR技术检测I-Ⅳ型登革病毒(DENV)的方法，所述方法将待测核酸与Cas12a蛋白、DENV-crRNA和单链核酸检测器反应，检测由Cas12a蛋白切割单链核酸检测器产生的可检测信号，从而检测登革病毒(DENV)。
优选的，所述可检测信号包括为可检测的报告信号或荧光信号。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明利用特异性筛选的靶向I-Ⅳ型DENV基因组的DENV-crRNA进行引导，在通用性检测四种血清型DENV时均获得稳定的实验结果，操作简单，可扩展性强；
(2)本发明基于CRISPR的分子检测技术，利用DENV-crRNA引导、CRISPR相关蛋白(Cas)12a附带切割(Collateral cleavage)能力实现核酸分子检测，具有快速、廉价和敏感的检测特点，能通过肉眼观察结果；
(3)本发明快速样品处理方法与RAA相结合时，可以缩短检测时间并提高检测敏感性，RAA联合CRISPR Cas12a的检测方法准确、便携，可为快速检测DENV提供方法，具有快速简便、特异性高、检测灵敏度高等优点；
(4)本发明提供的基于CRISPR技术检测DENV的方法，可提高检测效率，具有广阔的应用前景。
(5)综上，本发明基于用于I-Ⅳ型登革病毒检测的DENV-crRNA，将RAA核酸扩增与CRISPR技术相结合，尤其是基于V型Cas酶的附带切割活性，建立并提供了一种I-Ⅳ型登革病毒(DENV)的快速检测技术体系及其试剂盒，具有简便快捷、特异性高、灵敏性高、稳定性高、价廉易用等优点，提高了I-Ⅳ型登革病毒(DENV)的检测效率，可应用于基层与现场，具有良好的实用价值和广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例3中2％的琼脂糖凝胶电泳检测纯化的DENV-crRNA条带；
图2为本发明实施例3中CRISPR Cas12a-DENV-crRNA体外切割单链核酸检测器的视觉(日光和蓝光)检测结果；
图3为本发明实施例3中CRISPR Cas12a-DENV-crRNA体外切割单链核酸检测器的核酸检测试纸条检测结果，其中a图为Ⅰ型DENV的检测结果，b图为Ⅱ-Ⅳ型DENV检测结果。
具体实施方式
下面对本发明较优的实施例作进一步的详细说明。实施例仅为示范性，并不对本发明的范围构成任何限制。
实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1
登革病毒(DENV)核酸释放
利用化学裂解与热裂解结合的方法，按照TCEP(100mM)：EDTA(1mM)：待测样本的体积为1：1：8配置反应体系，释放样本中DENV核酸。待测样本选择实验室保存的含DENV的血清样本80.00μL(对照组选择无DENV的血清样本)，加入1mM EDTA 10.00μL、100mM TCEP 10.00μL，充分混匀；99℃反应5min；待样品冷却后作为核酸模板，用于实施例2中RT-RAA核酸扩增。
配置反应体系如下表1所示：
表1反应体系
| 组分 | 体积 |
| TCEP(100mM) | 10.00μL |
| EDTA(1mM) | 10.00μL |
| 待测血清样本 | 80.00μL |
实施例2
登革病毒(DENV)的RT-RAA核酸扩增
针对DENV-1的特异性核酸待测核酸的扩增
RT-RAA扩增待测核酸。使用RT-RAA试剂盒(内含1×缓冲液V、RT基础单元、1×乙酸镁Ⅰ)，配置RT-RAA核酸扩增反应体系50μL，组分包括25.00μL缓冲液V、2.00μL初浓度为200nMRAA上游引物(引物对D1的上游引物D1-dsDNA-44F)(终浓度10μM)、2.00μL初浓度为200nM RAA下游引物(引物对D1的下游引物D1-dsDNA-263R)(终浓度10μM)、RT基础单元、5.00μL乙酸镁溶液Ⅰ、1.00μL核酸模板(实施例1获得)和15.00μL无核酸酶水。
37℃反应30min，得到Ⅰ型DENV的RT-RAA扩增产物，为待测核酸，用于实施例3中CRISPR Cas-crRNA核酸检测。
配置反应体系如下表2所示：
表2 RAA扩增反应体系
| 组分 | 体积 |
| 缓冲液V | 25.00μL |
| RAA上游引物(10μM) | 2.00μL |
| RAA下游引物(10μM) | 2.00μL |
| RT基础单元 | 1(管)干粉 |
| 乙酸镁溶液Ⅰ | 5.00μL |
| 无核酸酶水 | 15.00μL |
| 核酸模板 | 1.00μL |
| 总体积 | 50.00μL |
I-Ⅳ型DENV的RAA扩增引物对分别是引物对D1、引物对D2、引物对D3和引物对D4，特异性筛选自四种血清型的DENV基因组，所设计的具体的上下游引物序列如表3中所示。
引物D2、引物D3和引物D4分别用于Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型DENV的RT-RAA核酸扩增反应，步骤同上所述DENV-1的扩增。
表3引物序列
实施例3
CRISPR Cas-DENV-crRNA核酸检测
利用DENV-crRNA对待测核酸进行检测
(1)DENV-crRNA体外转录合成
DENV-crRNA，序列为其DENV特异性导向序列含有23个碱基(见序列中的划线部分)。通过对I-IV型DENV所有基因组生信分析，特异性筛选自I-Ⅳ型DENV基因组序列，用于特异性靶向识别来源于I-Ⅳ型DENV核酸扩增产物的待测核酸序列。
DENV-crRNA的序列具体如下：
UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUAAUAUGCUGAAACGCGCGAGAAA(如SEQ ID NO：1所示)。
使用DENV-crRNA合成试剂盒合成，本实施例采用南京诺唯赞生物科技股份有限公司T7 High Yield RNA Transcription kit试剂盒。利用T7启动子(TAATACGACTCACTATAGGG)+LbCasl2a的Scaffold序列(TAATTTCTACTAAGTGTAGAT)+靶点序列(AATATGCTGAAACGCGCGAGAAA)构成DENV-crRNA-F，反向互补为DENV-crRNA-R，如表4中所示；引物DENV-crRNA-F/R由生工生物工程(上海)股份有限公司合成合成；DENV-crRNA-F/R引物退火(55-70℃)反应30秒，得到DENV-crRNA的DNA双链转录模板。
表4 DENV-crRNA的上、下游引物序列
配制体外转录反应体系，含有2μL 10×Reacting Buffer、2μL ATP Solution、2μLGTP Solution、2μL CTP Solution、2μL UTP Solution、0.5μg上述DENV-crRNA的DNA双链转录模板、2μL T7 RNA Polymerase Mix、补充无核酸酶水至20μL，37℃反应16小时；反应完成后加1μL的DNase I，37℃反应15分钟，得到未纯化的crRNA。
(2)合成DENV-crRNA纯化与验证
使用酚/氯仿纯化法得到纯净的DENV-crRNA。20μL未纯化的DENV-crRNA(体外转录产物)中加入160μL无核酸酶水稀释，继续加入20μL 3M醋酸铵，吹打混匀；加入200μL苯酚/氯仿混合液(1：1)萃取，收集水相至新的无酶1.5mL离心管，用氯仿重复萃取两次；加入两倍体积无水乙醇，混匀，-20℃静置30分钟，4℃、12000rpm离心10分钟，弃去上清；加入500μL70％乙醇，混匀、离心、弃上清，开盖干燥5分钟，用20μL无核酸酶水溶解DENV-crRNA沉淀，保存至-80℃。用Nandrop 2000测量已纯化的DENV-crRNA浓度，并利用2％的琼脂糖凝胶电泳验证条带是否单一，结果如图1所示，DENV-crRNA条带单一。
(3)用于荧光信号检测的单链核酸检测器为5′-FAM-TTATT-BHQ1-3′，用于核酸检测试纸条的检测的单链核酸检测器为5′-FAM-TTTTTTTATTTTTTT(如SEQ ID NO：12所示)-Biotin-3′。
(4)构建Cas检测体系进行检测
本实施例采用苏州近岸蛋白质科技股份有限公司的LbaCas12a Nuclease试剂盒(内含10×Cas12a-ssDNA缓冲液II、LbaCas12a蛋白)，配制CRISPR Cas-DENV-crRNA核酸检测反应体系20μL，组分包括2μL 10×Cas12a-ssDNA缓冲液II、0.15μL LbaCas12a蛋白(终浓度2.5μg/μL)、1.00μL DENV-crRNA(终浓度1.65μM，上述步骤(2)获得)、0.5μL单链核酸检测器(终浓度10μM)、1.00μL待测核酸(终浓度165nM，实施例2获得)、添加无核酸酶水至20μL。推荐Cas 12a:DENV-crRNA:待测核酸摩尔比为15：10：1。反应在37℃下反应30分钟。
配置反应体系如下表5所示：
表5 Cas检测反应体系
(5)采用蓝光进行结果判读
反应体系中添加单链核酸检测器为FAM-TTATT-BHQ1。反应结束后可将样品置于440-485nm蓝光下读取结果，如图2中所示，日光下阴性对照和实验组Ⅰ-Ⅳ型DENV无现象；蓝光下阴性对照不发光，实验组Ⅰ-Ⅳ型DENV发出荧光，结果表明本发明可以实现对Ⅰ-Ⅳ型DENV的有效检测。
(6)采用试纸条进行结果判读
反应体系中添加单链核酸检测器为FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin。反应结束后，将PCR管试液补足无核酸水到50.00μL，采用含有6-羟基荧光素(6-FAM)抗体的免疫层析试纸条进行检测。本实施例使用北京艾克赛仑生物科技有限责任公司的Cas12/13专用核酸检测试纸条，如图3中a图和b图所示，实验组Ⅰ-Ⅳ型DENV(DENV-1-4)检测试纸条出现检测线(T)，阴性对照仅有控制线(C)，结果表明本发明可以实现对Ⅰ-Ⅳ型登革病毒(DENV-1-4)的有效检测。
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。
Claims (9)
1.一种用于I-Ⅳ型登革病毒检测的DENV-crRNA，其特征是：所述DENV-crRNA的序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种基于CRISPR检测I-Ⅳ型登革病毒的试剂盒，其特征是：包括权利要求1所述DENV-crRNA。
3.根据权利要求2所述的基于CRISPR检测I-Ⅳ型登革病毒的试剂盒，其特征是：还包括Cas12a蛋白、待测核酸和单链核酸检测器。
4.根据权利要求3所述的基于CRISPR检测I-Ⅳ型登革病毒的试剂盒，其特征是：所述Cas12a蛋白为LbCas12a蛋白。
5.根据权利要求3所述的基于CRISPR检测I-Ⅳ型登革病毒的试剂盒，其特征是：所述待测核酸为登革病毒的RT-RAA特异性扩增产物，所述RT-RAA特异性扩增产物采用登革病毒的RAA特异性引物扩增获得，所述RAA特异性引物为引物对D1、引物对D2、引物对D3或引物对D4，分别用于扩增四种血清型Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ或Ⅳ型登革病毒，每对引物均包括上游引物和下游引物，其中所述引物对D1的上游引物如SEQ ID NO：2所示，所述引物对D1的下游引物如SEQ ID NO：3所示，所述引物对D2的上游引物如SEQ ID NO：4所示，所述引物对D2的下游引物如SEQ ID NO：5所示，所述引物对D3的上游引物如SEQ ID NO：6所示，所述引物对D3的下游引物如SEQ ID NO：7所示，所述引物对D4的上游引物如SEQ ID NO：8所示，所述引物对D4的下游引物如SEQ ID NO：9所示。
6.根据权利要求3所述的基于CRISPR检测I-Ⅳ型登革病毒的试剂盒，其特征是：基于荧光信号检测时，所述单链核酸检测器为FAM-TTATT-BHQ1，基于核酸检测试纸条检测时，所述单链核酸检测器为FAM-TTTTTTTATTTTTTT-Biotin。
7.根据权利要求3所述的基于CRISPR检测I-Ⅳ型登革病毒的试剂盒，其特征是：所述Cas12a蛋白：DENV-crRNA：待测核酸的摩尔比为10～15：5～10：1。
8.权利要求1所述DENV-crRNA在制备I-Ⅳ型登革病毒检测产品中的应用。
9.权利要求2-7任一项所述试剂盒在制备I-Ⅳ型登革病毒检测产品中的应用。
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