CN111270012B

CN111270012B - 一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒

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Publication number: CN111270012B
Application number: CN202010160702.1A
Authority: CN
Inventors: 李�浩; 寇志华; 孙岩松; 周育森; 董雪; 王彦贺; 何雷; 赵忠鹏; 孙世慧; 谷宏婧
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2020-03-10
Filing date: 2020-03-10
Publication date: 2021-02-02
Anticipated expiration: 2040-03-10
Also published as: CN111270012A

Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒(2019‑nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒。本发明提供一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR‑Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白；a2)报告RNA，其由20个U组成；a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT‑RAA扩增引物，且所述RT‑RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域；本发明的CRISPR核酸检测试纸可通过CRISPR‑Cas13a系统实现对新型冠状病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到10copies/test。

Description

一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的CRISPR核酸检测试剂盒，属于分子诊断技术领域。

背景技术

新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)是由新型冠状病毒(2019-nCoV)引起、导致人类发生急性感染的乙类传染病，具有传染性强、临床救治能力薄弱、无批准上市的特效药物及无疫苗预防的特点。新型冠状病毒的检测技术包括病毒基因测序、IgM和IgG抗体的检测、荧光定量PCR、恒温扩增芯片核酸检测技术等。然而现有检测技术均存在一定的不足，胶体金法简单便携，但灵敏度不足；包括LAMP、RPA在内的恒温扩增法灵敏度很高，但在操作过程中易污染；荧光定量PCR法和病毒基因测序稳定、可靠、具有一定的灵敏度，但样本处理复杂，且对仪器要求高。

2017年4月，美国研究人员建立了一种灵敏度达到埃摩级(单拷贝)，特异性达到单碱基的核酸检测技术——基于CRISPR-Cas13a的核酸检测平台SHERLOCK(Specific HighSensitivity Enzymatic Reporter UnLOCKing)，利用Leptotrichia wadei Cas13a蛋白(LwCas13a)的非特异剪切活性，结合可以高效扩增目的片段的重组聚合酶扩增技术(Recombinase Polymerase Amplification，RPA)，实现了对痕量核酸快速、廉价、高灵敏的检测。2018年4月，美国研究人员将以上技术运用到社区现场检测中，发明了一种侧向流试纸，通过显线法显示目的核酸的存在，使此技术更加便捷。

发明内容

本发明一个目的是提供一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒。

本发明提供的试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；

所述用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统包括如下a1)-a3)；

a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白(氨基酸序列为序列6)，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；

所述crRNA的靶点序列为序列1；

a2)报告RNA，其由20个U组成，且所述报告RNA的序列两端分别标记FAM和生物素；

a3)用于扩增待测样本靶点序列的RT-RAA扩增引物，且所述RT-RAA扩增引物中的一条引物的5'末端具有被T7 RNA聚合酶识别的区域；

所述侧向流试纸依次包括样品板(含有加样孔)、与纳米金抗FITC抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；

所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG。

更进一步的，所述CRISPR-Cas13a系统还包括用于特异性扩增新型冠状病毒靶点序列的其他试剂，所述用于特异性扩增新型冠状病毒靶点序列的其他试剂包括如下试剂中的全部或部分：NTP(如NTP Mix)、T7 RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、MgCl₂溶液、 HEPES缓冲液、RNase free water，具体见实施例中的表7中组分。

上述试剂盒中，所述crRNA的核苷酸序列为序列2。

上述试剂盒中，所述RT-RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。

上述试剂盒中，所述CRISPR-Cas13a系统还包括a4)RNA聚合酶。

上述试剂盒中，所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体：

所述检测方法包括如下步骤:

b1、提取待测样本的核酸，所述RT-RAA扩增所需引物对待测样品核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；

上述RT-RAA扩增的反应条件为：37-42℃反应15-40分钟；

b2、将所述RT-RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告 RNA的体系中反应，得到反应产物；

上述反应的条件为：37℃，15-30分钟。

b3、将所述反应产物加入所述试纸条的样品板的加样孔中，静置观察；

静置时间为液体滴在试纸上2-5分钟；

若试纸没有T线显现且有C线显现，则待测样本含有或候选含有新型冠状病毒；若试纸有T线显现且有C线显现，则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒。

上述试剂盒中的用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统也是本发明保护的范围。

上述试剂盒或上述CRISPR-Cas13a系统或上述系统中的单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体在如下c1-c10任一中的应用也是本发明保护的范围：

c1)检测或辅助检测新型冠状病毒；

c2)制备检测或辅助检测新型冠状病毒产品；

c3)检测或辅助检测新型冠状病毒核酸；

c4)制备检测或辅助检测新型冠状病毒核酸产品；

c5)检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒；

c6)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒产品；

c7)检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸；

c8)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸产品；

c9)筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物；

c10)制备筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物产品。

本发明另一个目的是提供一种检测或辅助检测新型冠状病毒核酸的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

上述待测样本可为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液，也可为血液样本、器官(如肝、脾、肾等)组织样本、细胞等。

本发明所提供的检测或辅助检测新型冠状病毒的方法既可为非疾病诊断治疗方法，也可为疾病诊断治疗方法。其中，所述非疾病诊断治疗方法可如在细胞水平筛选新型冠状病毒防治药物时检测用药前后细胞内是否含有新型冠状病毒。

本发明基于CRISPR-Cas13a核酸检测技术，通过设计、构建、筛选，最终提供一段用于新型冠状病毒检测的靶点序列及能靶向该靶点序列的特异性crRNA，并提供一种基于消线法的侧向流试纸，该试纸可通过CRISPR-Cas13a系统实现对新型冠状病毒核酸的高灵敏、高特异、便捷检测，灵敏度达到10copies/test。

附图说明

图1为基于消线法侧向流试纸原理模式图。

图2为RT-RAA扩增引物组合F1-R1扩增效率最高。

图3为报告RNA(20U)对RNA酶最敏感。

图4为CRISPR核酸检测试纸检测新型冠状病毒的灵敏度可达到10copies/test。

图5为针对新型冠状病毒的CRISPR核酸检测试纸在检测其他病原时未出现交叉反应。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中涉及的试剂及其来源如下：SOC液体培养基(索莱宝，L1020-1L)、NTP mix(NEB，N0466S)，EDTA(赛默飞，15576028)、1M Tris pH 8.0(ENZO，JBS-CSS-353)，琼脂糖凝胶电泳DNA纯化回收试剂盒(天根生化，DP219-03)，T7转录试剂盒(T7 Quick HighYield RNA Synthesis kit，NEB，E2050S)，RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor， NEB，M0314L)，T7 RNA聚合酶(NEB，M0251S)，RNA纯化磁珠(Agencourt RNAClean XP，BeckmanCoulter，A63987)，ExTaq Mix(TaKaRa，RR001Q)，二硫苏糖醇(DTT，麦克林，D806827-5g)，氨苄西林钠(索莱宝，A6920-5g)，酵母提取物(索莱宝， Y8020-500g*30)，胰蛋白胨(OXOID，LP0042-500g)，Tris平衡酚(灏样生物， TBD0001HY)，RT-RAA扩增试剂盒(杭州众测，S003ZC)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天，P0012S)，报告RNA试剂盒(RNaseAlertTMQC System v2，赛默飞，4479769)，纳米金标兔抗FITC抗体(上海生工，D110003)，链亲和素(索莱宝，S9170-10mg)，羊抗兔IgG(赛默飞，N24916)，RNase A(赛默飞，PA126787)，HEPES缓冲液(索莱宝，YZ-B-HEPES250)，MgCl₂溶液(天根生化，RP107)。

下述实施例中的核苷酸序列如下：

序列1为crRNA的靶点序列；

序列2为crRNA序列；

序列3为新型冠状病毒N基因的核苷酸序列；

序列4为nCoVnp-F1引物序列；

序列5为nCoVnp-R1引物序列；

序列6为LwCas13a蛋白氨基酸序列。

实施例1、基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸检测试剂盒及检测方法一、基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸检测试剂盒

(一)mRNA标准品的制备

新型冠状病毒N基因为序列3，其中序列3第992-1019位为COVID-19crRNA的靶点序列。

mRNA由上述质粒的PCR扩增产物转录而成，以模拟病毒核酸，具体方法步骤如下：

(1)PCR扩增

以人工合成的序列3所示的DNA分子为模板，用如下表1所示的体系进行PCR扩增，得到PCR产物。

配制PCR反应体系如表1。

表1、PCR扩增体系

名称	体积
		序列3所示的DNA分子	2μL
nCoVnp-F1	2μL
		nCoVnp-R1	2μL
ExTaq Mix	25μL
		ddH<sub>2</sub>O	19μL
总体积	50μL

PCR反应条件：95℃5min热变性；95℃30s，55℃30s，72℃15s，共38个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存PCR产物。

(2)PCR产物的纯化

使用Tris平衡酚对步骤(1)获得的PCR产物进行纯化，具体步骤如下：Tris平衡酚取500μL，加入等体积的三氯甲烷，振荡混匀后短暂离心，弃上清；取150μL 酚氯仿混合液加入PCR产物中，混匀后12,000rpm离心1min；取上清液到一个新的 1.5mL离心管，加入无水乙醇使上清与乙醇比例为3:7，12,000rpm离心10min，弃上清；加入200μL 75％的乙醇，12,000rpm离心10min，弃上清(该步骤共进行三次)。得到的沉淀室温晾干(约10min)，加入50μL无RNA酶的水，得到纯化PCR产物； Nanodrop(赛默飞ND-1000)检测浓度为510.5ng/μL，-20℃保存。

(3)转录

取2μL步骤(2)获得的纯化PCR产物，使用T7转录试剂盒转录mRNA。mRNA转录体系如表2所示。

表2、mRNA转录体系

名称	体积
		NTP Mix	10μL
PCR产物	2μL
		T7 RNA聚合酶	2μL
无Nuclease水	6μL
		总体积	20μL

上述mRNA转录体系混匀后，37℃转录过夜，使用DNaseⅠ去除多余的DNA：上一步得到的转录产物加入20μL无RNase的水，加入2μL DNaseⅠ，混匀，37℃孵育 15min。

(4)mRNA的纯化

按照Agencourt RNA Clean XP说明书(Beckman Coulter)纯化步骤(3)转录获得的mRNA，具体步骤如下：磁珠振荡混匀，向转录产物中加入1.8倍体积的磁珠，吹打10次或涡旋30s以混匀磁珠和转录体系，室温静置5min。将反应体系放到磁力架，静置5-10min以分离磁珠。轻轻吸出体系中的液体，避免磁珠被吸出，向磁珠中加入200μL 70％的乙醇(无RNase水配制)，室温孵育30s，吸出乙醇；重复此过程清洗磁珠，共3次。室温晾干体系，去除体系中的乙醇，约10min。加入50μL RNase-free 水，涡旋30s或用移液器吹打10次，吸出上清液，放入无RNase的1.5mL离心管中， Nanodrop测定纯化得到的mRNA浓度为1999.7ng/μL，-80℃分装备用。

(二)RT-RAA扩增所需引物及其扩增产物的制备

根据国家基因组科学数据中心(NGDC)中公布的2019-nCoV病毒核酸序列(https://bigd.big.ac.cn/search？dbId＝2019nCoVR&q＝2019-nCoV&page＝1)，根据序列比对分析结果在相对保守的N基因选择设计相应的引物。

1、RT-RAA扩增引物的设计

根据参考文献(PMID:27246147)中的RPA引物设计旨在用于CRISPR检测的新型冠状病毒特异性RT-RAA引物，在所述引物的5’端具有一段T7转录序列，使得 RT-RAA扩增得到的双链DNA(dsDNA)可以被T7 RNA聚合酶识别并且进行转录。引物序列如表3所示，由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

表3、2019nCoV-RT-RAA扩增引物

2、RT-RAA扩增产物的获得

以mRNA标准品作为模板，采用nCoVnp-F1和nCoVnp-R1为引物，利用RT-RAA扩增试剂盒进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。

上述RT-RAA扩增体系如表4所示。

表4、RT-RAA扩增体系

名称	体积
		模板	2μL
nCoVnp-F(10μM)	2μL
		nCoVnp-R(10μM)	2μL
A Buffer(试剂盒内组分)	41.5μL
		总体积	47.5μL

具体扩增操作步骤如下：将混合好的表3所示的47.5μL溶液加入到装有冻干粉的基础反应单元中，使冻干粉充分重溶均匀。向每个反应管管盖上加入2.5μL B Buffer 溶液(试剂盒内组分)，合上管盖，上下颠倒5-6次混匀，快速离心10秒钟。将上述反应管放置在42℃条件下反应30分钟，得到RT-RAA扩增产物。

(三)crRNA的制备

根据国家基因组科学数据中心(NGDC)中公布的2019-nCoV病毒核酸序列(https://bigd.big.ac.cn/search？dbId＝2019nCoVR&q＝2019-nCoV&page＝1)，根据序列比对分析结果在相对保守的N基因设计相应的crRNA，crRNA制备所需引物为如下表5 所示，

表5、制备crRNA所需模板与引物序列

crRNA的制备方法如下：

将表5所示的引物序列用ddH₂O稀释成10μM，根据表6配制PCR反应体系。PCR反应条件如下：95℃5min热变性；95℃30s，55℃30s，72℃15s，共38个循环；72℃自动延伸10min；4℃保存，得到PCR产物。

表6.制备crRNA的PCR反应体系

PCR产物的纯化、转录以及crRNA的纯化同上述(一)中mRNA制备的方法，最终得到浓度为3060.3ng/μL crRNA。获得的crRNA序列具体如下：

GGGAUUUAGACUACCCCAAAAACGAAGGGGACUAAAACuccaauuugauggcaccuguguagguca(序列2)，其中，序列2第1-38位为用于与Cas13a蛋白结合的锚定序列；序列2第39-66位为靶向新型冠状病毒靶点序列的向导序列。

crRNA靶点序列如下：tgacctacacaggtgccatcaaattgga(序列1)，位于新型冠状病毒基因组(GenBank ID：MN908947.3)第29265-29292位(序列3第992-1019位)。

制备出的crRNA，用于后续CRISPR-Cas13a检测。

(四)LwCas13a蛋白

LwCas13a蛋白氨基酸序列为序列6。

LwCas13a蛋白的表达、纯化及活性鉴定参见发明名称为“一种有效以Cas13a为基础的抗登革病毒的核酸靶点及其应用”，公布号为CN108715849A的专利文件中的方法。具体步骤如下：

1、LwCas13a蛋白诱导表达、纯化及鉴定

LwCas13a表达质粒Addgene-PC013-Twinstrep-SUMO-huLwCas13a自Addgene平台获取，将LwCas13a表达质粒转入Rosetta(DE3)感受态细胞中，TB液体培养基37℃、 200rpm培养14h以上，1:100接入新的Amp⁺抗性TB培养基中，37℃、300rpm培养至 OD600＝0.6左右，加入IPTG使终浓度为500uM，18℃、200rpm培养16h。离心收集菌体经超声破碎后收集蛋白上清，并利用LwCas13a蛋白所带的His标签通过Ni柱 (HisTrap HP column，GE HealthcareLife Science)进行初步纯化，利用SUMO将所带标签部分进行酶切，再利用LwCas13a蛋白的等电点特性通过阳离子交换柱 (UniGel-50SP，Nano-Micro Tech)进行第二次纯化，实验过程中利用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定每一步得到的蛋白，进行蛋白大小分析，同时利用His标签抗体进行蛋白的初步鉴定，以确定诱导的蛋白为目的蛋白。

2、LwCas13a蛋白浓度及活性鉴定

使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测LwCas13a蛋白浓度，利用报告RNA试剂盒(RNaseAlert^TMQC System v2)，检测490nm激发、520nm波长下的发射光的荧光值，判断体系中的Cas13a蛋白是否被激活。即在靶点RNA、与靶点对应的crRNA的存在下， Cas13a蛋白是否能被激活并剪切体系中的报告RNA，使其发出荧光，同时设置非特异性靶点进行特异性检测，以及人细胞总RNA作为背景RNA，检测体系是否会受到背景 RNA的干扰。检测结果发现，本发明纯化得到纯度较高的LwCas13a蛋白，并且无RNase 的污染，该蛋白与crRNA结合形成的复合体，可被特异的靶序列激活，并剪切体系中的报告RNA，从而发出荧光信号，该蛋白可用于后续的检测实验。

在蛋白终浓度为45nM时即可检测到明显的荧光信号变化，即LwCas13a蛋白的工作浓度为45nM(与表7中一致)。

(五)报告RNA

报告RNA为序列两端标记FAM和生物素的20U(天一辉远生物科技有限公司合成)。

(六)基于消线法的侧向流试纸的制备

基于消线法的侧向流试纸(如图1所示)按流动方向排序依次包括样品板、纳米金标兔抗FITC抗体(包被浓度为0.01mg/ml)、链亲和素线、抗体捕获线、吸收板五个部分，由硝酸纤维素膜、金垫、吸水纸、玻璃纤维、胶板、塑料卡壳组成。链亲和素线 (T线)包被浓度为1.5mg/ml，抗体捕获线(C线)包被羊抗兔IgG(二抗)浓度为1mg/ml。

(七)基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸试剂盒的制备

本发明提供的基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸试剂盒包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统及上述(一)中六制备的基于消线法的侧向流试纸；

上述用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统包括单独包装的上述二制备的RT-RAA扩增所需引物、上述三制备的crRNA、上述四制备的LwCas13a蛋白和上述五制备的报告RNA，还包括CRISPR-Cas13a反应的如下试剂中的全部或部分：NTP(如NTP Mix)、 T7RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、MgCl₂溶液、HEPES缓冲液、RNase free water。

二、基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸的检测方法的确定

本发明检测原理如下：

先用RT-RAA扩增所需引物对待测样本进行扩增，得到RT-RAA扩增产物；再将RT-RAA 扩增产物、crRNA、LwCas13a蛋白在含有报告RNA的CRISPR-Cas13a检测体系中反应，得到反应产物；再将反应产物点在侧向流试纸的加样孔中，反应产物流经纳米金标兔抗 FITC抗体时，体系中的报告RNA的FAM端会标记上用于显现的纳米金；流经链亲和素线时，若待测样本中含有新型冠状病毒靶点，则crRNA、LwCas13a蛋白和RT-RAA扩增产物形成复合体，且激活LwCas13a蛋白活性，使其切割体系中的RNA(包括报告RNA)，报告 RNA被剪切时，其FAM端不受生物素端的影响，不显示第一条线(“T”线)；若待测样本中不含有新型冠状病毒靶点，则crRNA、LwCas13a蛋白形成复合体，不激活LwCas13a 蛋白活性，无法切割报告RNA，报告RNA未被剪切时，FAM端随生物素端同时被拦截在链亲和素线(生物素和链亲和素结合)，其上标记的纳米金显现于第一条线(“T”线)；流经抗体(抗FITC抗体)捕获线时，无论报告RNA是否被剪切，报告RNA的FAM端均有机会到达抗体捕获线，纳米金标兔抗FITC抗体与羊抗兔IgG抗体结合，即其上标记的纳米金应该显现于第二条线(“C”线)。(图1)

具体方法如下：

1、RT-RAA扩增

提取待测样本的核酸，用上述一的(七)制备的试剂盒中的RT-RAA扩增所需引物nCoVnp-F1和nCoVnp-R1对待测样品核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物；

2、CRISPR-Cas13a系统检测体系的配制及反应

将RT-RAA扩增产物、上述(一)的七制备的试剂盒中的crRNA(序列2)、上述(一) 的七制备的试剂盒中的LwCas13a蛋白(序列6)和上述(一)的七制备的试剂盒中的报告RNA(20U)按照如下表7所示的体系配制：

表7、CRISPR-Cas13a系统检测体系

名称	用量
		RT-RAA产物	5μL
LwCas13a蛋白(浓度45nM)	2μL
		NTP Mix	4μL
T7 RNA聚合酶	1μL
		RNA酶抑制剂(Murine RNase inhibitor)	2μL
MgCl<sub>2</sub>溶液	10mM
		HEPES缓冲液	20mM
crRNA	22.5nM
		报告RNA	2nM
RNase free water	Up to 50μL
		总体积	50μL

将表7中的RT-RAA产物替换为ddH₂O，且保持其他试剂组分不变，即为阴性对照。

将表7配制的反应体系的反应管盖上管盖，上下颠倒5-6次混匀，低速离心10 秒钟，将上述反应管放置在37℃条件下反应30分钟，得到反应产物。

3、试纸条检测

将上述2得到的反应产物全部加入上述(一)的七制备的试剂盒中的试纸条的样品板的加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察。

结果判定：

若试纸没有“T”线显现且有“C”线显现，则待测样本含有或候选含有新型冠状病毒；若试纸有“T”线显现且有“C”线显现，则待测样本不含有或候选不含有新型冠状病毒；若试纸没有“C”线显现，则试纸失效，需更换试纸重新实验。

实施例2、基于CRISPR-Cas13a系统的检测方法的条件优化和摸索

一、最优RT-RAA扩增引物的筛选

以实施例1中的一(一)中制备的mRNA标准品为模板，用实施例1的(二)的1 的方法进行RT-RAA扩增，引物分别为表3所示的各引物组合(组合形式如图2所示)，得到RT-RAA扩增产物。

设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

取20μL扩增产物，加入20μL的三氯甲烷：Tris平衡酚＝1：1与反应后产物等量混匀，振荡后离心10min，弃去上清的混合液中，振荡混匀，10000rpm离心10min，吸取上清10μL，加入3μL 6*Loading Buffer，混匀后琼脂糖凝胶电泳。

检测如图2所示，结果显示，反向引物R1在与正向引物F1、F2、F3组合时扩增效率较高，而与其他正向引物组合时扩增效率欠佳；同时，正向引物F1在与反向引物 R1、R4组合时扩增效率较高，而与其他反向引物组合时扩增效率欠佳，考虑到F1与 R4扩增产物片段较长，不利于扩增效率的提高。

于是F1和R1组合作为最佳扩增引物用于针对2019-nCoV病毒的RT-RAA扩增。

二、最优报告RNA筛选

为筛选出最适配CRISPR侧向流试纸检测的报告RNA，通过RNA修饰的方法合成了 3种含有不同碱基种类和个数报告RNA，报告RNA具体序列见表8，且两端分别标记FAM 和生物素。

表8、报告RNA序列

名称	序列	碱基数
			5U	UUUUU	5
6A	AAAAAA	6
			20U	UUUUUUUUUUUUUUUUUUUU	20

分别向3种报告RNA(2nM，48μL)中加入RNA酶(RNase A，赛默飞，PA126787) 2μL，总反应的体积为50μL，37℃孵育10分钟，得到反应产物。

将上述反应产物滴加入实施例1的二(六)的试纸条检测中的试纸加样孔中，静置2-5分钟肉眼观察。

结果如图3所示，5U和6A的报告RNA被RNaseA剪切前后CRISPR检测试纸上的 “T”线差异较弱，而20U的报告RNA被RNaseA剪切前后CRISPR检测试纸上的“T” 线差异较强。

因此选择20U的报告RNA作为后续检测体系中的报告RNA。

从上述结果可以看出，实施例1的(二)的方法就是最优检测方法。

实施例3、基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸的检测方法的灵敏度检测

将实施例1的一的(一)制备的mRNA标准品利用无RNA酶的水进行10倍系列梯度稀释，得到含有不同浓度新型冠状病毒基因mRNA的溶液，按照实施例1中二的方法检测，将表7中的RT-RAA产物替换含有不同浓度新型冠状病毒基因mRNA的溶液，使 mRNA在反应体系中的浓度为10⁵-10^-1copies/test，同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

检测结果如图4所示，10⁵-10¹copies/test组“T”线消失且“C”线显现；10⁰ copies/test组、10^-1copies/test组和阴性对照组“T”线和“C”线均显现。判定10⁵-10¹ copies/test组为阳性，10⁰copies/test组、10^-1copies/test组和阴性对照组为阴性，说明本方法的灵敏度为10copies/test。

实施例4、基于CRISPR-Cas13a系统的新型冠状病毒核酸的检测方法的特异性检测

以日本脑炎病毒(JEV)、立克次氏体(RIC)、乙肝病毒(HBV)、埃博拉病毒 (EBOV)、单增李斯特菌(LM)、H7N9流感病毒(H7N9)、呼吸道合胞病毒(RSV)、森林脑炎病毒(TBEV)、SARS病毒(SARS)、中东呼吸综合症冠状病毒(MERS)病原核酸为模板，按照实施例1中二的方法检测不同病毒核酸，以验证本发明方法的特异性。具体步骤如下：

一、RT-RAA扩增

分别提取新型冠状病毒(2019-nCoV)、日本脑炎病毒(JEV)、立克次氏体(RIC)、乙肝病毒(HBV)、埃博拉病毒(EBOV)、单增李斯特菌(LM)、H7N9流感病毒(H7N9)、呼吸道合胞病毒(RSV)、森林脑炎病毒(TBEV)、SARS病毒(SARS)、中东呼吸综合症冠状病毒(MERS)的核酸作为模板，用实施例1的(一)试剂盒中的RT-RAA扩增所需引物nCoVnp-F1和nCoVnp-R1对待测样品核酸进行RT-RAA扩增，得到RT-RAA扩增产物。

二、CRISPR-Cas13a系统检测体系的配制及反应

与实施例1的二相同。

三、试纸条检测

与实施例1的二相同。

同时设置水为模板的扩增产物作为阴性对照。

结果如图5所示，新型冠状病毒(2019-nCoV)的“T”线消失且“C”线显现，为阳性；其他各组“T”线和“C”线均显现，为阴性。

说明本发明的基于CRISPR-Cas13a系统检测新型冠状病毒核酸的方法具有很高的特异性，检测过程中不存在交叉反应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120>一种用于检测新型冠状病毒（2019-nCoV）的CRISPR核酸检测试剂盒

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<400>1

tgacctacac aggtgccatc aaattgga 28

<210>2

<211>66

<212>RNA

<213> Artificial Sequence

<400>2

gggauuuaga cuaccccaaa aacgaagggg acuaaaacuc caauuugaug gcaccugugu 60

agguca 66

<210>3

<211>1260

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<400>3

atgtctgata atggacccca aaatcagcga aatgcacccc gcattacgtt tggtggaccc 60

tcagattcaa ctggcagtaa ccagaatgga gaacgcagtg gggcgcgatc aaaacaacgt 120

cggccccaag gtttacccaa taatactgcg tcttggttca ccgctctcac tcaacatggc 180

aaggaagacc ttaaattccc tcgaggacaa ggcgttccaa ttaacaccaa tagcagtcca 240

gatgaccaaa ttggctacta ccgaagagct accagacgaa ttcgtggtgg tgacggtaaa 300

atgaaagatc tcagtccaag atggtatttc tactacctag gaactgggcc agaagctgga 360

cttccctatg gtgctaacaa agacggcatc atatgggttg caactgaggg agccttgaat 420

acaccaaaag atcacattgg cacccgcaat cctgctaaca atgctgcaat cgtgctacaa 480

cttcctcaag gaacaacatt gccaaaaggc ttctacgcag aagggagcag aggcggcagt 540

caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 600

agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 660

ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 720

caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 780

aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 840

caaacccaag gaaattttgg ggaccaggaa ctaatcagac aaggaactga ttacaaacat 900

tggccgcaaa ttgcacaatt tgcccccagc gcttcagcgt tcttcggaat gtcgcgcatt 960

ggcatggaag tcacaccttc gggaacgtgg ttgacctaca caggtgccat caaattggat 1020

gacaaagatc caaatttcaa agatcaagtc attttgctga ataagcatat tgacgcatac 1080

aaaacattcc caccaacaga gcctaaaaag gacaaaaaga agaaggctga tgaaactcaa 1140

gccttaccgc agagacagaa gaaacagcaa actgtgactc ttcttcctgc tgcagatttg 1200

gatgatttct ccaaacaatt gcaacaatcc atgagcagtg ctgactcaac tcaggcctaa 1260

<210>4

<211>55

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<400>4

aattctaata cgactcacta tagggaacta atcagacaag gaactgatta caaac 55

<210>5

<211>30

<212>DNA

<213> Artificial Sequence

<400>5

cttattcagc aaaatgactt gatctttgaa 30

<210> 6

<211> 1152

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 6

Met Lys Val Thr Lys Val Asp Gly Ile Ser His Lys Lys Tyr Ile Glu

1 5 10 15

Glu Gly Lys Leu Val Lys Ser Thr Ser Glu Glu Asn Arg Thr Ser Glu

20 25 30

Arg Leu Ser Glu Leu Leu Ser Ile Arg Leu Asp Ile Tyr Ile Lys Asn

35 40 45

Pro Asp Asn Ala Ser Glu Glu Glu Asn Arg Ile Arg Arg Glu Asn Leu

50 55 60

Lys Lys Phe Phe Ser Asn Lys Val Leu His Leu Lys Asp Ser Val Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Asn Arg Lys Glu Lys Asn Ala Val Gln Asp Lys Asn Tyr

85 90 95

Ser Glu Glu Asp Ile Ser Glu Tyr Asp Leu Lys Asn Lys Asn Ser Phe

100 105 110

Ser Val Leu Lys Lys Ile Leu Leu Asn Glu Asp Val Asn Ser Glu Glu

115 120 125

Leu Glu Ile Phe Arg Lys Asp Val Glu Ala Lys Leu Asn Lys Ile Asn

130 135 140

Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Glu Glu Asn Lys Ala Asn Tyr Gln Lys Ile

145 150 155 160

Asn Glu Asn Asn Val Glu Lys Val Gly Gly Lys Ser Lys Arg Asn Ile

165 170 175

Ile Tyr Asp Tyr Tyr Arg Glu Ser Ala Lys Arg Asn Asp Tyr Ile Asn

180 185 190

Asn Val Gln Glu Ala Phe Asp Lys Leu Tyr Lys Lys Glu Asp Ile Glu

195 200 205

Lys Leu Phe Phe Leu Ile Glu Asn Ser Lys Lys His Glu Lys Tyr Lys

210 215 220

Ile Arg Glu Tyr Tyr His Lys Ile Ile Gly Arg Lys Asn Asp Lys Glu

225 230 235 240

Asn Phe Ala Lys Ile Ile Tyr Glu Glu Ile Gln Asn Val Asn Asn Ile

245 250 255

Lys Glu Leu Ile Glu Lys Ile Pro Asp Met Ser Glu Leu Lys Lys Ser

260 265 270

Gln Val Phe Tyr Lys Tyr Tyr Leu Asp Lys Glu Glu Leu Asn Asp Lys

275 280 285

Asn Ile Lys Tyr Ala Phe Cys His Phe Val Glu Ile Glu Met Ser Gln

290 295 300

Leu Leu Lys Asn Tyr Val Tyr Lys Arg Leu Ser Asn Ile Ser Asn Asp

305 310 315 320

Lys Ile Lys Arg Ile Phe Glu Tyr Gln Asn Leu Lys Lys Leu Ile Glu

325 330 335

Asn Lys Leu Leu Asn Lys Leu Asp Thr Tyr Val Arg Asn Cys Gly Lys

340 345 350

Tyr Asn Tyr Tyr Leu Gln Val Gly Glu Ile Ala Thr Ser Asp Phe Ile

355 360 365

Ala Arg Asn Arg Gln Asn Glu Ala Phe Leu Arg Asn Ile Ile Gly Val

370 375 380

Ser Ser Val Ala Tyr Phe Ser Leu Arg Asn Ile Leu Glu Thr Glu Asn

385 390 395 400

Glu Asn Asp Ile Thr Gly Arg Met Arg Gly Lys Thr Val Lys Asn Asn

405 410 415

Lys Gly Glu Glu Lys Tyr Val Ser Gly Glu Val Asp Lys Ile Tyr Asn

420 425 430

Glu Asn Lys Gln Asn Glu Val Lys Glu Asn Leu Lys Met Phe Tyr Ser

435 440 445

Tyr Asp Phe Asn Met Asp Asn Lys Asn Glu Ile Glu Asp Phe Phe Ala

450 455 460

Asn Ile Asp Glu Ala Ile Ser Ser Ile Arg His Gly Ile Val His Phe

465 470 475 480

Asn Leu Glu Leu Glu Gly Lys Asp Ile Phe Ala Phe Lys Asn Ile Ala

485 490 495

Pro Ser Glu Ile Ser Lys Lys Met Phe Gln Asn Glu Ile Asn Glu Lys

500 505 510

Lys Leu Lys Leu Lys Ile Phe Lys Gln Leu Asn Ser Ala Asn Val Phe

515 520 525

Asn Tyr Tyr Glu Lys Asp Val Ile Ile Lys Tyr Leu Lys Asn Thr Lys

530 535 540

Phe Asn Phe Val Asn Lys Asn Ile Pro Phe Val Pro Ser Phe Thr Lys

545 550 555 560

Leu Tyr Asn Lys Ile Glu Asp Leu Arg Asn Thr Leu Lys Phe Phe Trp

565 570 575

Ser Val Pro Lys Asp Lys Glu Glu Lys Asp Ala Gln Ile Tyr Leu Leu

580 585 590

Lys Asn Ile Tyr Tyr Gly Glu Phe Leu Asn Lys Phe Val Lys Asn Ser

595 600 605

Lys Val Phe Phe Lys Ile Thr Asn Glu Val Ile Lys Ile Asn Lys Gln

610 615 620

Arg Asn Gln Lys Thr Gly His Tyr Lys Tyr Gln Lys Phe Glu Asn Ile

625 630 635 640

Glu Lys Thr Val Pro Val Glu Tyr Leu Ala Ile Ile Gln Ser Arg Glu

645 650 655

Met Ile Asn Asn Gln Asp Lys Glu Glu Lys Asn Thr Tyr Ile Asp Phe

660 665 670

Ile Gln Gln Ile Phe Leu Lys Gly Phe Ile Asp Tyr Leu Asn Lys Asn

675 680 685

Asn Leu Lys Tyr Ile Glu Ser Asn Asn Asn Asn Asp Asn Asn Asp Ile

690 695 700

Phe Ser Lys Ile Lys Ile Lys Lys Asp Asn Lys Glu Lys Tyr Asp Lys

705 710 715 720

Ile Leu Lys Asn Tyr Glu Lys His Asn Arg Asn Lys Glu Ile Pro His

725 730 735

Glu Ile Asn Glu Phe Val Arg Glu Ile Lys Leu Gly Lys Ile Leu Lys

740 745 750

Tyr Thr Glu Asn Leu Asn Met Phe Tyr Leu Ile Leu Lys Leu Leu Asn

755 760 765

His Lys Glu Leu Thr Asn Leu Lys Gly Ser Leu Glu Lys Tyr Gln Ser

770 775 780

Ala Asn Lys Glu Glu Thr Phe Ser Asp Glu Leu Glu Leu Ile Asn Leu

785 790 795 800

Leu Asn Leu Asp Asn Asn Arg Val Thr Glu Asp Phe Glu Leu Glu Ala

805 810 815

Asn Glu Ile Gly Lys Phe Leu Asp Phe Asn Glu Asn Lys Ile Lys Asp

820 825 830

Arg Lys Glu Leu Lys Lys Phe Asp Thr Asn Lys Ile Tyr Phe Asp Gly

835 840 845

Glu Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly

850 855 860

Met Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile

865 870 875 880

Ser Leu Lys Glu Leu Lys Glu Tyr Ser Asn Lys Lys Asn Glu Ile Glu

885 890 895

Lys Asn Tyr Thr Met Gln Gln Asn Leu His Arg Lys Tyr Ala Arg Pro

900 905 910

Lys Lys Asp Glu Lys Phe Asn Asp Glu Asp Tyr Lys Glu Tyr Glu Lys

915 920 925

Ala Ile Gly Asn Ile Gln Lys Tyr Thr His Leu Lys Asn Lys Val Glu

930 935 940

Phe Asn Glu Leu Asn Leu Leu Gln Gly Leu Leu Leu Lys Ile Leu His

945 950 955 960

Arg Leu Val Gly Tyr Thr Ser Ile Trp Glu Arg Asp Leu Arg Phe Arg

965 970 975

Leu Lys Gly Glu Phe Pro Glu Asn His Tyr Ile Glu Glu Ile Phe Asn

980 985 990

Phe Asp Asn Ser Lys Asn Val Lys Tyr Lys Ser Gly Gln Ile Val Glu

995 1000 1005

Lys Tyr Ile Asn Phe Tyr Lys Glu Leu Tyr Lys Asp Asn Val Glu

1010 1015 1020

Lys Arg Ser Ile Tyr Ser Asp Lys Lys Val Lys Lys Leu Lys Gln

1025 1030 1035

Glu Lys Lys Asp Leu Tyr Ile Arg Asn Tyr Ile Ala His Phe Asn

1040 1045 1050

Tyr Ile Pro His Ala Glu Ile Ser Leu Leu Glu Val Leu Glu Asn

1055 1060 1065

Leu Arg Lys Leu Leu Ser Tyr Asp Arg Lys Leu Lys Asn Ala Ile

1070 1075 1080

Met Lys Ser Ile Val Asp Ile Leu Lys Glu Tyr Gly Phe Val Ala

1085 1090 1095

Thr Phe Lys Ile Gly Ala Asp Lys Lys Ile Glu Ile Gln Thr Leu

1100 1105 1110

Glu Ser Glu Lys Ile Val His Leu Lys Asn Leu Lys Lys Lys Lys

1115 1120 1125

Leu Met Thr Asp Arg Asn Ser Glu Glu Leu Cys Glu Leu Val Lys

1130 1135 1140

Val Met Phe Glu Tyr Lys Ala Leu Glu

1145 1150

Claims

1.一种用于检测新型冠状病毒的试剂盒，包括用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统和与其配套使用的侧向流试纸；

a1)单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体；

所述crRNA的靶点序列为序列1；

所述基于消线法的侧向流试纸依次包括样品板、与纳米金抗FITC抗体、链亲和素线、抗体捕获线和吸收板；

所述抗体捕获线包被的抗体为羊抗兔IgG；

所述crRNA的核苷酸序列为序列2；所述RT-RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述CRISPR-Cas13a系统还包括a4)RNA聚合酶。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：

所述试剂盒还包括记载如下检测方法的可读载体：

所述检测方法包括如下步骤:

b2、将所述RT-RAA扩增产物、所述crRNA、所述LwCas13a蛋白在含有所述报告RNA的体系中反应，得到反应产物；

4.权利要求1-3中任一所述试剂盒中的用于检测新型冠状病毒的CRISPR-Cas13a系统；

所述crRNA的靶点序列为序列1；

所述crRNA的核苷酸序列为序列2；

所述RT-RAA扩增引物由序列4所示的单链DNA分子和序列5所示的单链DNA分子组成。

5.权利要求1-3中任一所述试剂盒或权利要求4中的CRISPR-Cas13a系统或所述系统中的单独包装的crRNA和LwCas13a蛋白，或crRNA和LwCas13a蛋白复合体在如下c1-c5任一中的应用：

c1)制备检测或辅助检测新型冠状病毒产品；

c2)制备检测或辅助检测新型冠状病毒核酸产品；

c3)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒产品；

c4)制备检测或辅助检测待测样本中是否含有新型冠状病毒核酸产品；

c5)制备筛选或辅助筛选新型冠状病毒防治药物产品。

6.一种检测或辅助检测新型冠状病毒核酸的方法，所述方法为非疾病诊断治疗方包括如下步骤：