KR20180052317A - 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents
메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 메르스 코로나바이러스의 실시간 검출을 위한 역전사 기반 등온 증폭 반응용 프라이머 세트, 이를 이용한 메르스 코로나바이러스 검출용 키트 및 메르스 코로나바이러스 검출방법에 관한 것이다. 본 발명의 프라이머 세트는 등온 증폭 방법에 사용되어 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 프로틴의 코딩 유전자의 특정 부위를 등온 조건에서 다량으로 증폭시킬 수 있으므로 중동 호흡기 증후군의 조기 진단 또는 메르스 코로나바이러스의 검출 용도로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 메르스 코로나바이러스의 실시간 검출을 위한 역전사 기반 등온 증폭 반응용 프라이머 세트, 이를 이용한 메르스 코로나바이러스 검출용 키트 및 메르스 코로나바이러스 검출방법에 관한 것이다.
2012년에 사우디아라비아에서 처음 발견된 메르스-코로나바이러스(MERS-CoV)는 중동 호흡기 증후군(메르스, MERS)의 원인균으로 주로 중동 지역에서 발견되었다. 메르스-코로나바이러스는 플러스 센스의 외가닥 RNA를 유전체로 지니고 있는 신종 베타-코로나바이러스로서, 중증 급성 호흡기 증후군(SARS)를 유발하는 사스-코로나바이러스(SARS-CoV)와 유사하지만 뚜렷한 차이를 나타낸다. 이 바이러스는 환자에게 감염되어 질환을 유발하며, 감염 후 증상이 없는 경우부터 경증 급성상기도 질환, 폐렴, 사망 등에 이르기까지 매우 다양한 임상적 증상을 나타낸다. 감염된 환자는 기침, 발열, 호흡곤란, 가래 등의 징후를 일으키며 일반적으로는 폐렴이 동반된다. 그 밖의 징후에는 두통, 오한, 근육통, 식욕부진, 오심, 구토, 설사 등이 있다. 합병증으로는 폐혈성 쇼크, 다발성 장기부전 등이 있으며 급성 신부전 또한 동반되며 이는 사스에서의 동반 사례보다 더 높다. 메르스 코로나바이러스는 기저질환을 보유하고 있는 환자에게서 사망 사례가 더 많은 것으로 보고되고 있다.
메르스-코로나바이러스에 대한 승인 받은 백신은 아직 없으며 현재 후보 백신만이 존재한다. 인증 받은 치료제 또한 없는 실정이다. 관련 바이러스 감염에 활용되는 물질을 활용하는 등의 감염 환자가 회복하는 데 도움 되는 치료법이 존재하지만 이는 빈혈이나 우울증 등의 부작용이 나타날 수 있어 관리가 필수이다. 때문에 이러한 메르스의 감염을 막기 위한 노력도 중요하지만 이를 조기에 진단하여 신속하게 대응하는 방안 또한 필요한 실정이다. 메르스-코로나바이러스의 감염을 진단하기 위한 검체는 객담, 폐조직 등이 있으며 증상이 발현된 이후 3일 이내에 검체를 채취하고 가급적이면 하기도에서 검체를 채취한다. 진단 방법에는 분자생물학적인 방법에 기초한 유전자 검사와 혈청학적인 방법에 기초한 검사 방법이 있으며 최근 들어서는 주로 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응(real time Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, qRT-PCR)을 활용하고 있다.
타깃 유전자로는 주로 ORF1b 유전자 부위와 뉴클레오캡시드 프로틴을 코딩하는 N 유전자 부위를 활용하며 이 부위에 대한 특이적 프라이머를 활용하여 증폭하여 검출을 수행한다. 그러나 이와 같은 경우 실시간으로 증폭 결과를 확인하기 위한 기술과 온도 변화 기술을 탑재한 값비싼 기기가 필요하며 이 방법을 활용할 수 있는 전문적인 인력이 필요하기 때문에 현장에서 실시간으로 진단하기에는 한계가 있다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 본 발명자들은 인간에게 중동 호흡기 증후군을 발생시키는 메르스 코로나바이러스의 실시간 검출을 위하여 등온에서 유전자를 증폭시킬 수 있는 프라이머 세트의 선정과 그 반응 조건에 대하여 연구한 결과 뉴클레오캡시드 단백질 코딩 유전자 부위를 등온으로 증폭시킬 수 있는 새로운 프라이머 세트를 개발하였다.
따라서 본 발명의 목적은 메르스 코로나바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 세트를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 프라이머 세트를 이용하여 메르스 코로나바이러스를 특이적으로 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머들로 이루어진 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명에 있어서 "프라이머"란 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점이 될 수 있는 짧은 핵산서열을 의미한다. 본 발명의 프라이머는 메르스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 프로틴을 코딩하는 유전자(N 프로틴의 코딩 부위)의 특정 부위를 증폭하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프라이머 세트는 역전사 등온 증폭 반응에 사용될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 등온 증폭 반응은 역전사 고리 매개 등온 증폭법(Reverse Transcription Loop-Medicated Isothermal Amplification, RT-LAMP)일 수 있다. 고리 매개 등온 증폭법은 기존의 중합효소연쇄반응법(PCR)과는 달리 strand displacement activity가 높은 Bst 중합효소를 사용하여 3단계의 온도변화 없이 일정한 온도에서 접합 및 신장이 가능하기 때문에 반응 시간이 짧고, 온도변화에 따른 핵산의 손실 및 손상이 없으며, 일정온도만 유지하면 되기 때문에 고가의 장비가 필요 없어 현장 활용성이 높다. 또한 증폭하고자 하는 유전자 서열의 6개 부위를 인지하는 특이적인 프라이머를 이용하기 때문에 표적 유전자에 대한 특이성이 매우 높은 장점이 있다.
상기 본 발명의 프라이머 세트에서 6개의 프라이머는 메르스 코로나바이러스의 N 프로틴의 코딩 부위 중 각각 6곳의 표적서열을 인식한다. 즉, 서열번호 1의 프라이머와 서열번호 2의 프라이머는 외부 프라이머(outer primer), 서열번호 3의 프라이머와 서열번호 4의 프라이머는 내부 프라이머(inner primer), 서열번호 5의 프라이머와 서열번호 6의 프라이머는 증폭반응을 가속화시켜주는 루프 프라이머(loop primer)로 각각 작용한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 키트를 제공한다. 상기 키트는 본 발명의 프라이머 세트 이외에도 검체의 핵산 시료로부터 메르스 코로나바이러스를 검출하기 위한 물질, 예컨대 등온 증폭 반응을 위한, bst 중합효소, 등온 증폭 효소 버퍼, dNTP, 역전사 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 키트에는 검출의 편의성을 높이기 위한 검출용 표지 화합물이 더 함유될 수 있으며, 이러한 검출용 표지 화합물은 증폭과정에서 증폭산물에 포함되거나 증폭산물에 물리적으로 삽입되어 통상적인 방식으로 증폭산물의 밀도, 농도, 양 등을 확인할 수 있는 화합물일 수 있다. 이러한 키트의 다른 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자들에 의하여 적절히 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 검체로부터 얻은 핵산 시료를 주형으로 하고, 상기 프라이머 세트를 이용하여 역전사 등온 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스의 검출방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 핵산 시료는 RNA 시료이며, 본 발명이 속하는 기술분야에 공지된 통상의 방법을 이용하여 검체로부터 수득할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 역전사 등온 증폭 반응은, 서열번호 1의 프라이머(F3 프라이머) 및 서열번호 2의 프라이머(B3 프라이머)가 각 5 uM; 서열번호 3의 프라이머(FIP 프라이머) 및 서열번호 4의 프라이머(BIP 프라이머)가 각 20 uM; 및 서열번호 5의 프라이머(LF 프라이머) 및 서열번호 6의 프라이머(LB 프라이머)가 각 5 uM의 농도로 포함된 반응액을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 반응액은 4 유닛의 bst 중합 효소 1 μL를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 역전사 등온 증폭 반응의 증폭 산물을 검출하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 검출방법은 아가로오즈 겔 전기영동과 SYBR® Green I과 같은 형광 물질을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 역전사 등온 증폭 반응은, (a) 상기 핵산 시료, 상기 본 발명의 프라이머 세트, 등온 증폭 효소 버퍼, dNTP, M-MLV 역전사 효소 및 bst 중합 효소를 포함하는 반응액을 준비하는 단계; (b) 상기 반응액을 63℃에서 60분간 반응시키는 증폭 단계; 및 (c) 상기 증폭의 중단을 위해 80℃에서 10분간 반응시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a)단계의 반응액은, 등온 증폭 효소 버퍼 2.5 μL, 서열번호 1의 F3 프라이머 및 서열번호 2의 B3 프라이머 각 5 uM, 서열번호 3의 FIP 프라이머 및 서열번호 4의 BIP 프라이머 각 20 uM, 서열번호 5의 LF 프라이머 및 서열번호 6의 LB 프라이머 각 5 uM, 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1 μL, 주형 RNA 1 μL, M-MLV 역전사 효소 1 μL(100 unit) 및 bst 중합 효소 1 μL (4 유닛)를 증류수에 혼합하여 총 25 μL가 되도록 준비될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 방법은 (a)단계의 반응액을 혼합시킨 후 스핀 다운하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트는 등온 증폭 방법에 사용되어 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 프로틴의 코딩 유전자의 특정 부위를 등온 조건에서 다량으로 증폭시킬 수 있다. 또한 본 발명의 프라이머 세트를 활용하여 메르스 코로나바이러스 유전자의 특정 유전자를 검출할 수 있는 등온 증폭 방법은 기존에 활용되고 있는 실시간 중합효소 연쇄 반응과 비슷하거나 상향의 효율성을 보이며 고가의 기기와 전문적인 인력이 필요치 않고 실시간 중합효소 연쇄 반응 방법의 반응 시간보다 훨씬 적은 시간을 소요한다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트와 이를 활용한 본 발명의 검출방법은 중동 호흡기 증후군의 조기 진단 또는 메르스 코로나바이러스의 검출 용도로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 실시간 현장 검출을 위한 등온 증폭 방법인 고리 매개의 등온 증폭 방법(Loop-mediated isothermal amplification)의 수행을 위한 메르스 코로나바이러스의 표적 부위이다. 메르스 코로나바이러스의 구조적 단백질을 코딩하고 있는 유전자들 중 뉴클레오캡시드 프로틴(N 프로틴)을 코딩하는 부위이며, 정확한 검출 표적 위치는 28828-29018 베이스 페어(base-pair, bp) 영역(약 191 bp)이다.
도 2는 N 프로틴의 코딩 유전자 부위에서도 특정한 부위를 선정하기 위하여 초기 중동에서 발생한 프로토 타입과 국외에서 발견된 바이러스들과의 서열을 비교한 결과이다.
도 3은 메르스 코로나바이러스의 특이적인 부위를 증폭시킨 결과이다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 1: 증폭을 확인한 결과이다. (가)의 경우 증폭 부위는 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 프로틴 코딩 부위에 포함되는 28561-29340 bp, 크기는 780 bp이며, 그 부위를 특정하게 증폭시킬 수 있는 특이적 프라이머가 활용되었다. (나)의 경우 증폭 부위는 등온 증폭 방법 결과가 수행되는 부위인 28828-29018 bp, 크기는 191 bp이고 등온 증폭 방법 방법으로 증폭되는 부위의 양쪽 말단 프라이머인 F3 프라이머와 B3 프라이머가 활용되었다.
도 4는 등온 증폭 방법의 수행을 위한 메르스 코로나바이러스의 특이적인 프라이머 세트의 표적 부위에서의 검출 부위를 표시한 그림이다.
도 5는 메르스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 코딩 유전자의 특정 부위를 증폭한 이중 가닥 DNA를 활용하여 등온 증폭 프라이머의 선별을 위한 4가지 프라이머 세트의 효용성을 검증한 결과이다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 1, 2: 프라이머 세트 4, 레인 3, 4: 프라이머 세트 3, 레인 5, 6: 프라이머 세트 2, 레인 7, 8: 프라이머 세트 1을 활용하여 등온 증폭 시킨 결과이며 레인 1, 3, 5, 7의 경우 주형 가닥을 포함 하지 않고 실험을 수행하였으며, 레인 2, 4, 6, 8은 주형 가닥을 포함하여 실험하였다.
도 6은 이중 가닥 DNA를 활용하여 등온 증폭 방법 프라이머의 표적 부위 검출 가능성을 확인한 결과이다. 왼쪽 결과는 아가로오즈 전기영동 결과이며, 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 N: 표적 물질이 포함되지 않는 네거티브 컨트롤을 나타내며 레인 P1: 등온 증폭 방법 프라이머를 활용한 등온 증폭 결과를 나타낸다. 오른쪽은 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 아래는 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위는 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
도 7은 등온 증폭 방법 방법의 수행을 위한 Bst 중합 효소의 농도를 결정하기 위한 실험 결과를 나타낸다. RNA를 게놈으로 지닌 메르스 코로나바이러스의 검출을 위해 사용되는 M-MLV 역전사 효소의 양을 100 유닛으로 고정하여 수행하였으며, 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea), 레인 1, 6: Bst 중합효소 1 유닛, 레인 2, 7: Bst 중합효소 2 유닛, 레인 3, 8: Bst 중합효소 4 유닛, 레인 4, 9: Bst 중합효소 6 유닛, 레인 5, 10: Bst 중합효소 8 유닛을 사용한 결과이며, 레인 1~5는 주형 가닥 미포함이고 레인 6~10은 주형 가닥을 포함한 결과이다. 아래는 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위 그림은 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
도 8은 등온 증폭 방법 반응을 시간 별로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 1: 30분, 레인 2: 40분, 레인 3: 50분, 레인 4: 60분, 레인 5: 90분, 레인 6: 120분 수행 결과를 나타낸다. 아래는 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위 그림은 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
도 9는 프라이머 세트의 민감성을 확인하기 위해 메르스 코로나바이러스의 PFU 별로 등온 증폭 실험을 수행한 결과이다. 메르스 코로나바이러스 RNA를 활용하여 역전사-등온 증폭 방법을 수행한 결과이며, 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea), 레인 1~5: 주형 가닥의 농도가 103~10-1 PFU/μL의 증폭 결과이며, 레인 6: 주형 가닥이 포함되어 있지 않은 네거티브 컨트롤이다.
도 10은 메르스 코로나 바이러스의 검출을 위한 등온 증폭 프라이머 세트의 특이성을 검증한 실험이다. 메르스 코로나 바이러스 외 총 6가지의 바이러스 RNA를 활용하여 등온 증폭 과정을 수행하였으며, T는 표적 물질, 즉 RNA를 말하며 P는 프라이머 세트이다. +의 경우 첨가를, -의 경우 제외를 나타낸다.
도 11은 기존에 검출을 위해 활용되고 있는 중합 효소 연쇄 반응과 실시간 중합 효소 연쇄 반응의 효율과 등온 증폭 방법 증폭의 효율을 비교한 결과이다. 103 PFU/μL 주형 가닥부터 10-1 PFU/μL 주형 가닥까지 수행한 결과이다. (가)는 상기 도 9와 같은 결과이며, (나)는 메르스 코로나바이러스 RNA를 활용하여 역전사-중합 효소 연쇄 반응을 수행한 결과이다. 레인 설명은 (가)와 같다. (다)는 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 결과를 나타낸 그림이다.
도 12는 도 11에서 나타낸 역전사 등온 증폭 방법과 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응, 역전사 중합 효소 연쇄 반응의 효율성을 비교한 도면으로 (가)는 증폭의 민감도를 나타내는 표이며 (나)는 증폭 시간에 대해 비교한 그림이다.
도 2는 N 프로틴의 코딩 유전자 부위에서도 특정한 부위를 선정하기 위하여 초기 중동에서 발생한 프로토 타입과 국외에서 발견된 바이러스들과의 서열을 비교한 결과이다.
도 3은 메르스 코로나바이러스의 특이적인 부위를 증폭시킨 결과이다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 1: 증폭을 확인한 결과이다. (가)의 경우 증폭 부위는 메르스 코로나 바이러스의 뉴클레오캡시드 프로틴 코딩 부위에 포함되는 28561-29340 bp, 크기는 780 bp이며, 그 부위를 특정하게 증폭시킬 수 있는 특이적 프라이머가 활용되었다. (나)의 경우 증폭 부위는 등온 증폭 방법 결과가 수행되는 부위인 28828-29018 bp, 크기는 191 bp이고 등온 증폭 방법 방법으로 증폭되는 부위의 양쪽 말단 프라이머인 F3 프라이머와 B3 프라이머가 활용되었다.
도 4는 등온 증폭 방법의 수행을 위한 메르스 코로나바이러스의 특이적인 프라이머 세트의 표적 부위에서의 검출 부위를 표시한 그림이다.
도 5는 메르스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질 코딩 유전자의 특정 부위를 증폭한 이중 가닥 DNA를 활용하여 등온 증폭 프라이머의 선별을 위한 4가지 프라이머 세트의 효용성을 검증한 결과이다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 1, 2: 프라이머 세트 4, 레인 3, 4: 프라이머 세트 3, 레인 5, 6: 프라이머 세트 2, 레인 7, 8: 프라이머 세트 1을 활용하여 등온 증폭 시킨 결과이며 레인 1, 3, 5, 7의 경우 주형 가닥을 포함 하지 않고 실험을 수행하였으며, 레인 2, 4, 6, 8은 주형 가닥을 포함하여 실험하였다.
도 6은 이중 가닥 DNA를 활용하여 등온 증폭 방법 프라이머의 표적 부위 검출 가능성을 확인한 결과이다. 왼쪽 결과는 아가로오즈 전기영동 결과이며, 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 N: 표적 물질이 포함되지 않는 네거티브 컨트롤을 나타내며 레인 P1: 등온 증폭 방법 프라이머를 활용한 등온 증폭 결과를 나타낸다. 오른쪽은 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 아래는 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위는 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
도 7은 등온 증폭 방법 방법의 수행을 위한 Bst 중합 효소의 농도를 결정하기 위한 실험 결과를 나타낸다. RNA를 게놈으로 지닌 메르스 코로나바이러스의 검출을 위해 사용되는 M-MLV 역전사 효소의 양을 100 유닛으로 고정하여 수행하였으며, 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea), 레인 1, 6: Bst 중합효소 1 유닛, 레인 2, 7: Bst 중합효소 2 유닛, 레인 3, 8: Bst 중합효소 4 유닛, 레인 4, 9: Bst 중합효소 6 유닛, 레인 5, 10: Bst 중합효소 8 유닛을 사용한 결과이며, 레인 1~5는 주형 가닥 미포함이고 레인 6~10은 주형 가닥을 포함한 결과이다. 아래는 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위 그림은 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
도 8은 등온 증폭 방법 반응을 시간 별로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 1: 30분, 레인 2: 40분, 레인 3: 50분, 레인 4: 60분, 레인 5: 90분, 레인 6: 120분 수행 결과를 나타낸다. 아래는 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위 그림은 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
도 9는 프라이머 세트의 민감성을 확인하기 위해 메르스 코로나바이러스의 PFU 별로 등온 증폭 실험을 수행한 결과이다. 메르스 코로나바이러스 RNA를 활용하여 역전사-등온 증폭 방법을 수행한 결과이며, 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea), 레인 1~5: 주형 가닥의 농도가 103~10-1 PFU/μL의 증폭 결과이며, 레인 6: 주형 가닥이 포함되어 있지 않은 네거티브 컨트롤이다.
도 10은 메르스 코로나 바이러스의 검출을 위한 등온 증폭 프라이머 세트의 특이성을 검증한 실험이다. 메르스 코로나 바이러스 외 총 6가지의 바이러스 RNA를 활용하여 등온 증폭 과정을 수행하였으며, T는 표적 물질, 즉 RNA를 말하며 P는 프라이머 세트이다. +의 경우 첨가를, -의 경우 제외를 나타낸다.
도 11은 기존에 검출을 위해 활용되고 있는 중합 효소 연쇄 반응과 실시간 중합 효소 연쇄 반응의 효율과 등온 증폭 방법 증폭의 효율을 비교한 결과이다. 103 PFU/μL 주형 가닥부터 10-1 PFU/μL 주형 가닥까지 수행한 결과이다. (가)는 상기 도 9와 같은 결과이며, (나)는 메르스 코로나바이러스 RNA를 활용하여 역전사-중합 효소 연쇄 반응을 수행한 결과이다. 레인 설명은 (가)와 같다. (다)는 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응 결과를 나타낸 그림이다.
도 12는 도 11에서 나타낸 역전사 등온 증폭 방법과 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응, 역전사 중합 효소 연쇄 반응의 효율성을 비교한 도면으로 (가)는 증폭의 민감도를 나타내는 표이며 (나)는 증폭 시간에 대해 비교한 그림이다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
<실시예 1>
메르스 코로나바이러스의 검출을 위한 표적 부위 선정 및 서열 부위 증폭
메르스 코로나바이러스를 조기에 검출하고 중동 호흡기 증후군의 조기 진단을 위한 표적 부위를 선정하기 위하여 문헌 조사를 수행하였다. 그 결과, 중동 호흡기 질환의 확인 진단법에서 주로 활용되는 메르스 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 프로틴을 코딩하는 유전자(N 프로틴의 코딩 부위)을 선정하였다. 또한 초기 중동에서 발생한 프로토 타입과 국외에서 발견된 바이러스들과의 서열을 비교하여 N 프로틴의 코딩 유전자 부위에서도 특정한 부위를 선정하였다(도 1 및 도 2). 각 서열 정보는 미국 국립 생물 정보 센터(National Center for Biotechnology Information, NCBI)의 데이터베이스에서 제공하는 국내에서 발견된 메르스 코로나바이러스의 서열 정보를 획득하였다.
<실시예 2>
고리 기반의 등온 증폭 과정을 수행하기 위한 표적 물질 생성
본 발명을 위하여 선정된 코로나바이러스의 표적 부위의 검출을 위해 활용된 바이러스는 국내에서 발견된 메르스 코로나바이러스(GeneBank: KT029139)를 분양받아 Vero E6 Cells에서 배양하여 사용하였으며, Qiagen사의 QIAampViral RNA Mini kit로 RNA를 추출하여 활용하였다.
프라이머 선별을 위한 특이적으로 증폭된 주형 가닥을 생성하기 위해 특이적 프라이머[정방향(forward) 프라이머: GAGCTTAGGCTCTTTAGTAAG, 역방향(reverse) 프라이머: TTTTTTTTTTTTGCAAATCATCTAATTAGCCTAA]를 활용하여 전체 유전체 중 28561-29340 bp 영역의 약 780 bp의 이중 가닥 DNA를 증폭하였다. PCR 증폭 조건은 우선 42℃에서 30분 동안 역전사를 수행하고, 95℃에서 5분간 변성시키고, 95℃에서 30 초, 60℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 40 주기 반복한 후, 72℃에서 5 분간 추가로 신장시켰다. 그 결과는 2% 아가로오즈 겔 전기영동으로 결과를 확인하였다(도 3).
<실시예 3>
고리 기반의 등온 증폭에 활용되는 프라이머 세트의 선정
상기 선정된 부위에 대한 프라이머 세트를 선별하기 위하여 총 4가지의 프라이머 세트 후보군을 디자인하였다. 프라이머 선정을 위해 문헌 조사를 수행하였으며 이론적으로 다음과 같은 조건에서 프라이머 세트를 구성하였다(도 4). 각 프라이머 서열의 길이는 15-25 bp, Tm값은 60 ℃에서 66 ℃, GC 포함을 40에서 65퍼센트로 설정하여 주형 가닥에 특이적으로 부착되어 등온 증폭이 가능한 프라이머 세트의 4가지 후보군을 디자인하였다.
| 후보군 | 명칭 |
올리고뉴클레오타이드
서열
(5'에서 3') |
유전체에서의 영역 |
|
프라이머
후보군 1 ( P1 ) |
MERcv -F3-1 | GGAATGGAATTAAGCAACTGGC | 28828-28849 |
| MERcv -B3-1 | CGCGAATTGTGTAACAATAGCT | 28997-29018 | |
| MERcv - FIP -1 | ACAGCCCGGAATGGGAG-GTGGTACTTCTACTACACTGGAA | 28896-28912+28856-28878 | |
| MERcv - BIP -1 | TAAGGATGGCATCGTTTGGGT-TCATTGTTAGGGTTCCGCG | 28913-28933+28975-28993 | |
| MERcv -LF-1 | TGCTGCTTCGGGTCCAG | 28879-28895 | |
| MERcv -LB-1 | GCGCCACTGATGCTCCTTC | 28945-28963 | |
|
프라이머
후보군 1- T4 ( P1 / T4 ) |
MERcv -F3-1 | GGAATGGAATTAAGCAACTGGC | 28828-28849 |
| MERcv -B3-1 | CGCGAATTGTGTAACAATAGCT | 28997-29018 | |
| MERcv - FIP -1- T4 | ACAGCCCGGAATGGGAG-( TTTT )-GTGGTACTTCTACTACACTGGAA | 28896-28912+(T4 space)+28856-28878 | |
| MERcv - BIP -1- T4 | TAAGGATGGCATCGTTTGGGT-( TTTT )-TCATTGTTAGGGTTCCGCG | 28913-28933+(T4 space)+28975-28993 | |
| MERcv -LF-1 | TGCTGCTTCGGGTCCAG | 28879-28895 | |
| MERcv -LB-1 | GCGCCACTGATGCTCCTTC | 28945-28963 | |
|
프라이머
후보군 2 ( P2 ) |
MERcv -F3-2 | TGGAATTAAGCAACTGGCTCC | 28832-28852 |
| MERcv -B3-2 | CGGGCGCGAATTGTGT | 29007-29022 | |
| MERcv - FIP -2 | AGCCCGGAATGGGAGTG-CAGGTGGTACTTCTACTACACT | 28894-28910+28853-28874 | |
| MERcv - BIP -2 | TTAAGGATGGCATCGTTTGGGT-TCATTGTTAGGGTTCCGCG | 28912-28933+28975-28993 | |
| MERcv -LF-2 | CTGCTTCGGGTCCAGTTCC | 28875-28893 | |
| MERcv -LB-2 | GCGCCACTGATGCTCCTTC | 28945-28963 | |
|
프라이머
후보군 2- T4 ( P2 / T4 ) |
MERcv -F3-2 | TGGAATTAAGCAACTGGCTCC | 28832-28852 |
| MERcv -B3-2 | CGGGCGCGAATTGTGT | 29007-29022 | |
| MERcv - FIP -1- T4 | AGCCCGGAATGGGAGTG-( TTTT )-CAGGTGGTACTTCTACTACACT | 28894-28910+(T4 space)+28853-28874 | |
| MERcv - BIP -1- T4 | TTAAGGATGGCATCGTTTGGGT-( TTTT )-TCATTGTTAGGGTTCCGCG | 28912-28933+(T4 space)+28975-28993 | |
| MERcv -LF-2 | CTGCTTCGGGTCCAGTTCC | 28875-28893 | |
| MERcv -LB-2 | GCGCCACTGATGCTCCTTC | 28945-28963 |
각 세트의 효율을 실험하기 위하여 각기 프라이머 세트를 활용한 고리 기반 등온 증폭 실험을 수행하였으며, 그와 같은 등온 증폭 수행 과정은 다음과 같다; 등온 증폭 효소 버퍼 2.5 μL, 각 프라이머 세트; 5 uM의 F3 프라이머, B3 프라이머, 20 uM의 FIP 프라이머, BIP 프라이머, 5 uM의 LF 프라이머, LB 프라이머, 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1 μL, 주형 1 μL을 넣어 총 24 μL가 되도록 증류수로 채웠다. 그 다음 95℃에서 5분간 끓인 후 실온에서 5분간 식힌 다음, bst 중합 효소(NEB, england) 1 μL (8 unit)을 넣고 63℃에서 1시간 동안 반응을 수행하였고 반응의 중단을 위하여 80℃에서 10분 동안 반응하였다.
그 결과는 2% 아가로오즈 겔 전기영동과 SYBR® Green I을 활용하여 형광 및 육안 관찰을 통하여 확인하였다(도 5). 도 5는 상기 표 1의 4가지 프라이머 세트 후보군들에 대하여 등온 증폭 시킨 결과이며, 각각의 레인이 나타내는 것은 다음과 같다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea), 레인 1, 2: 프라이머 세트 4, 레인 3, 4: 프라이머 세트 3, 레인 5, 6: 프라이머 세트 2, 레인 7, 8: 프라이머 세트 1을 활용하여 등온 증폭 시킨 결과. 상기 레인 1, 3, 5, 7의 경우 주형 가닥을 포함 하지 않고 실험을 수행하였으며, 레인 2, 4, 6, 8은 주형 가닥을 포함하여 실험하였다.
도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 실험군에서 모두 증폭 양상을 나타냈지만 그 중에서도 특히 8번의 경우가 가장 큰 증폭 양상을 나타내었다. 따라서, 위 4가지 후보군 중 가장 뛰어난 증폭 효율을 보인 1번 후보군을 본 발명의 프라이머 세트로 선정하였다(표 2).
| 프라이머 명칭 | 서열목록 | 올리고뉴클레오타이드 서열 ( 5에서3 ) | 유전체에서의 영역 |
| MERcv -F3 | 서열번호 1 | GGAATGGAATTAAGCAACTGGC | 28828-28849 |
| MERcv -B3 | 서열번호 2 | CGCGAATTGTGTAACAATAGCT | 28997-29018 |
| MERcv - FIP | 서열번호 3 | ACAGCCCGGAATGGGAGGTGGTACTTCTACTACACTGGAA | 28896-28912+28856-28878 |
| MERcv - BIP | 서열번호 4 | TAAGGATGGCATCGTTTGGGTTCATTGTTAGGGTTCCGCG | 28913-28933+28975-28993 |
| MERcv -LF | 서열번호 5 | TGCTGCTTCGGGTCCAG | 28879-28895 |
| MERcv -LB | 서열번호 6 | GCGCCACTGATGCTCCTTC | 28945-28963 |
<
실시예
4>
선정된
프라이머
세트를 활용한 고리 기반 등온 증폭
상기 실시예 3에서 메르스 코로나바이러스의 검출을 위하여 선정된 프라이머 세트를 이용하여 등온 증폭을 다음과 같이 수행하였다(도 6). 등온 증폭 효소 버퍼 2.5 μL, 각 프라이머 세트; 5 uM의 F3 프라이머, B3 프라이머, 20 uM의 FIP 프라이머, BIP 프라이머, 5 uM의 LF 프라이머, LB 프라이머, 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1 μL, 주형 1 μL을 넣어 총 24 μL가 되도록 증류수로 채웠다. 그 다음 95℃에서 5분간 끓인 후 실온에서 5분간 식힌 다음, bst 중합 효소(NEB, england) 1 μL (8 unit)을 넣고 63℃에서 1시간 동안 반응을 수행하였고 반응의 중단을 위하여 80℃에서 10분 동안 반응하였다.
그 후 2% 아가로오즈 겔 전기영동과 SYBR® Green I을 활용하여 형광 및 육안 관찰로 결과를 확인하였다. 도 6은 이중 가닥 DNA를 활용하여 등온 증폭 방법 프라이머의 표적 부위 검출 가능성을 확인한 결과이며. 왼쪽 결과는 아가로오즈 전기영동 결과이다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 N: 표적 물질이 포함되지 않는 네거티브 컨트롤을 나타내며 레인 P1: 등온 증폭 방법 프라이머를 활용한 등온 증폭 결과를 나타낸다. 오른쪽은 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 아래는 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위는 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
도 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 표적 물질이 포함되지 않은 혼합액에서는 등온 증폭되지 않았으나 표적 물질이 포함되었을 때 등온 증폭 과정이 일어났음을 알 수 있다.
<
실시예
5>
본 발명의
프라이머
세트를 이용한 최적의
역전사
고리 매개 등온 증폭(RT-LAMP) 반응 조건의 수립
<5-1> 효소 농도 조건 수립
반응액은 등온 증폭 효소 버퍼 2.5 μL, 각 프라이머 세트; 5 uM의 F3 프라이머, B3 프라이머, 20 uM의 FIP 프라이머, BIP 프라이머, 5 uM의 LF 프라이머, LB 프라이머, 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1 μL, 주형 RNA 1 μL, M-MLV 역전사 효소 1 μL(100 unit), bst 중합 효소를 넣어 총 25 μL가 되도록 증류수로 채웠다. 이 때, bst 중합 효소는 1, 2, 4, 6, 8 유닛을 포함하였으며 반응액을 충분히 섞어준 후 스핀 다운하여 63℃에서 1시간 동안 반응 후 증폭의 중단을 위해 80℃에서 10분간 반응하였다. 그 결과는 2% 아가로오즈 겔 전기영동과 SYBR® Green I을 활용하여 형광 및 육안 관찰을 통하여 확인하였다(도 7).
도 7은 본 발명의 역전사 등온 증폭 방법 방법의 수행을 위한 Bst 중합 효소의 최적 농도를 결정하기 위한 실험 결과를 나타낸다. RNA를 게놈으로 지닌 메르스 코로나바이러스의 검출을 위해 사용되는 M-MLV 역전사 효소의 양을 100 유닛으로 고정하여 수행하였으며, 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea), 레인 1, 6: Bst 중합효소 1 유닛, 레인 2, 7: Bst 중합효소 2 유닛, 레인 3, 8: Bst 중합효소 4 유닛, 레인 4, 9: Bst 중합효소 6 유닛, 레인 5, 10: Bst 중합효소 8 유닛을 사용한 결과이며, 레인 1~5는 주형 가닥 미포함이고 레인 6~10은 주형 가닥을 포함한 결과이다. 도 7은 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위 그림은 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
실험 결과, bst 중합 효소의 양이 4 유닛일 때부터 증폭이 일어났으며 그 이후의 농도에서는 프라이머들 끼리의 증폭 양상을 나타냈음을 알 수 있다. 따라서 bst 중합 효소의 최적 농도는 4 유닛으로 결정되었다.
<5-2> 시간 조건 수립
반응액은 등온 증폭 효소 버퍼 2.5 μL, 각 프라이머 세트; 5 uM의 F3 프라이머, B3 프라이머, 20 uM의 FIP 프라이머, BIP 프라이머, 5 uM의 LF 프라이머, LB 프라이머, 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1 μL, 주형 RNA 1 μL, M-MLV 역전사 효소 1 μL (100 유닛), bst 중합 효소 1 μL (4 유닛)을 넣어 총 25 μL가 되도록 증류수로 채웠다. 반응액을 충분히 섞어준 후 스핀 다운하여 63℃에서 30분, 40분, 50분, 60분, 90분, 120분 반응 후 증폭의 중단을 위해 80℃에서 10분간 반응하였다. 그 결과는 2% 아가로오즈 겔 전기영동과 SYBR® Green I을 활용하여 형광 및 육안 관찰을 통하여 확인하였다(도 8).
도 8은 등온 증폭 방법 반응을 시간 별로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea)이며, 레인 1: 30분, 레인 2: 40분, 레인 3: 50분, 레인 4: 60분, 레인 5: 90분, 레인 6: 120분 수행 결과를 나타낸다. 도 8은 SYBR® Green I을 활용한 관찰 결과로 위 그림은 자외선(UV)을 쬐어 주었을 때의 결과를 나타내며, 아래 그림은 백열등 아래에서 관찰한 결과이다.
관찰 결과, 60분의 증폭 시간을 주어야 증폭 양상이 효율적으로 일어남을 알 수 있다.
<
실시예
6>
선정된
프라이머
세트와 그 활용 조건에 대한 특이성 및 민감성 확인
본 발명의 프라이머 세트가 가지는 민감성을 확인하기 위하여 메르스 코로나바이러스의 pfu 별 RNA를 활용한 역전사 등온 증폭 과정을 수행하였다. 메르스 코로나바이러스의 pfu는 103부터 10-1까지 1/10으로 희석하여 활용하였다. 각 반응액은 등온 증폭 효소 버퍼 2.5 μL, 각 프라이머 세트; 5 uM의 F3 프라이머, B3 프라이머, 20 uM의 FIP 프라이머, BIP 프라이머, 5 uM의 LF 프라이머, LB 프라이머, 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1 μL, 주형 RNA 1 μL, M-MLV 역전사 효소 1 μL (100 유닛), bst 중합 효소 1 μL (4 유닛)을 넣어 총 25 μL가 되도록 증류수로 채웠다. 반응액을 충분히 섞어준 후 스핀 다운하여 63℃에서 60분 반응 후 증폭의 중단을 위해 80℃에서 10분간 반응하였다. 그 결과는 2% 아가로오즈 겔 전기영동과 SYBR® Green I을 활용하여 형광 및 육안 관찰을 통하여 확인하였다(도 9).
도 9는 본 발명의 프라이머 세트의 민감성을 확인하기 위해 메르스 코로나바이러스의 PFU 별로 메르스 코로나바이러스 RNA를 활용하여 역전사-등온 증폭 방법을 수행한 결과이며, 레인 M: DNA 사이즈 마커(Elpisbio, Korea), 레인 1~5: 주형 가닥의 농도가 103~10-1 PFU/μL의 증폭 결과이며, 레인 6: 주형 가닥이 포함되어 있지 않은 네거티브 컨트롤이다. 수행 결과, 메르스 코로나바이러스의 100까지 증폭이 일어남을 확인할 수 있었다.
또한 본 발명의 프라이머 세트와 상기 수립된 역전사 고리 매개 등온 증폭 조건이 가지는 특이성을 확인하기 위하여 메르스 코로나바이러스 외 다른 6종의 바이러스(229E, MPV, 인플루엔자-B1, 인플루엔자-B2, 인플루엔자-A(H1), 인플루엔자-A(H3))의 RNA를 활용하여 역전사 등온 증폭을 다음과 같이 수행한 후 그 결과를 비교하였다. QIAampViral RNA Mini kit (QIAGEN, Valencia, California)를 사용하여 각 바이러스들의 RNA가 추출되었고 추출된 RNA가 표적 물질로 활용되었다. 각 반응액은 등온 증폭 효소 버퍼 2.5 μL, 각 프라이머 세트; 5 uM의 F3 프라이머, B3 프라이머, 20 uM의 FIP 프라이머, BIP 프라이머, 5 uM의 LF 프라이머, LB 프라이머, 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1.5 μL, 주형 RNA 1 μL, M-MLV 역전사 효소 1 μL (100 유닛), bst 중합 효소 1 μL (4 유닛)을 넣어 총 25 μL가 되도록 증류수로 채웠다. 반응액은 튜브 내에서 63℃의 항온 수조에서 60분 동안 수행되었으며, 그 결과는 2% 아가로오즈 겔 전기영동을 활용하여 확인하였다(도 10).
도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 역전사 등온 증폭은 MERS-CoV(메르스 코로나바이러스)의 시료에 대해서만 특이적으로 증폭 반응을 일으키는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 메르나 코로나바이러스 검출방법은 특이성을 갖는 것으로 볼 수 있다.
<
실시예
7>
기존 활용 중인 진단 방법과의 효용성 비교
상기 본 발명의 역전사 등온 증폭 반응의 증폭 효율성을 확인하기 위하여, 기존에 활용되고 있던 역전사 중합 효소 연쇄 반응(RT-PCR) 및 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)과 함께 비교 실험을 수행하였다.
각 방법에서의 주형은 메르스 코로나바이러스 RNA를 103 PFU/μL부터 10-1 PFU/μL까지 활용하였고 이를 통하여 민감성을 비교하였다. 역전사 중합 효소 연쇄 반응은 엔지노믹스 사의 TOPscriptTM One-step RT PCR Kit와 5 uM의 F3, B3 프라이머 각 1 μL 씩을 활용하였다. 반응 온도 조건은 우선 42℃에서 30분 동안 역전사를 수행하고, 95℃에서 10분간 변성시키고, 95℃에서 30 초, 60℃에서 30 초, 그리고 72℃에서 30초간 반응을 35 주기 반복한 후, 72℃에서 5 분간 추가로 신장시켰다. 그 후 2% 아가로오즈 겔 전기영동을 활용하여 결과를 확인하였다. 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응(qRT-PCR)은 엔지노믹스 사의 TOPreal™ One-step RT qPCR Kit (SYBR Green, low Rox)와 F3, B3 프라이머 각 1 μL 씩을 활용하였고, 상기 역전사 중합 효소 연쇄 반응과 반응 온도 조건은 같으며 이 결과는 바이오라드 사의 CFX96 TouchTM Real-time PCR detection system을 활용하여 관찰 및 분석하였다.
도 11 및 도 12는 기존에 검출을 위해 활용되고 있는 중합 효소 연쇄 반응과 실시간 중합 효소 연쇄 반응의 효율과 등온 증폭 방법 증폭의 효율을 비교한 결과이다.
도 11에서 알 수 있는 바와 같이, 역전사 등온 증폭 방법의 경우 100 PFU/μL까지 증폭 반응이 일어났으며, 역전사 중합 효소 연쇄 반응은 101 PFU/μL까지는 제대로 증폭되었으나 100 PFU/μL이 포함되었을 때는 증폭 양상이 약해진다. 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응의 경우 100 PFU/μL까지 확인이 가능하다.
도 12는 상기 역전사 등온 증폭 방법과 실시간 역전사 중합 효소 연쇄 반응, 역전사 중합 효소 연쇄 반응의 효율성을 비교한 도면으로, (가) 증폭 민감도의 경우 역전사 등온 증폭 방법이 가장 민감하였으며, (나) 시간의 경우에도 등온 증폭 방법이 가장 적은 시간에 증폭되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Primer set for detection of MERS-coronavirus and uses thereof
<130> PN1610-358
<160> 6
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<223> MERcv-B3 primer
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<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERcv-FIP primer
<400> 3
acagcccgga atgggaggtg gtacttctac tacactggaa 40
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERcv-BIP primer
<400> 4
taaggatggc atcgtttggg ttcattgtta gggttccgcg 40
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERcv-LF primer
<400> 5
tgctgcttcg ggtccag 17
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MERcv-LB primer
<400> 6
gcgccactga tgctccttc 19
Claims (10)
- 서열번호 1 내지 서열번호 6의 염기서열을 갖는 프라이머들로 이루어진 메르스 코로나바이러스 검출용 프라이머 세트.
- 제1항에 있어서,
상기 프라이머 세트는 역전사 등온 증폭 반응(Reverse Transcription Loop-Medicated Isothermal Amplification, RT-LAMP)에 사용되는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트. - 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 메르스 코로나바이러스 검출용 키트.
- 검체로부터 얻은 핵산 시료를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트를 이용하여 역전사 등온 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 메르스 코로나바이러스의 검출방법.
- 제4항에 있어서,
상기 역전사 등온 증폭 반응은, 서열번호 1의 프라이머(F3 프라이머) 및 서열번호 2의 프라이머(B3 프라이머)가 각 5 uM; 서열번호 3의 프라이머(FIP 프라이머) 및 서열번호 4의 프라이머(BIP 프라이머)가 각 20 uM; 및 서열번호 5의 프라이머(LF 프라이머) 및 서열번호 6의 프라이머(LB 프라이머)가 각 5 uM의 농도로 포함된 반응액을 사용하여 수행하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제5항에 있어서,
상기 반응액은 4 유닛의 bst 중합 효소 1 μL를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 역전사 등온 증폭 반응의 증폭 산물을 검출하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제4항에 있어서,
상기 역전사 등온 증폭 반응은,
(a) 상기 핵산 시료, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트, 등온 증폭 효소 버퍼, dNTP, M-MLV 역전사 효소 및 bst 중합 효소를 포함하는 반응액을 준비하는 단계;
(b) 상기 반응액을 63℃에서 60분간 반응시키는 증폭 단계; 및
(c) 상기 증폭의 중단을 위해 80℃에서 10분간 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 (a)단계의 반응액은, 등온 증폭 효소 버퍼 2.5 μL, 서열번호 1의 F3 프라이머 및 서열번호 2의 B3 프라이머 각 5 uM, 서열번호 3의 FIP 프라이머 및 서열번호 4의 BIP 프라이머 각 20 uM, 서열번호 5의 LF 프라이머 및 서열번호 6의 LB 프라이머 각 5 uM, 10 mM의 dNTP 2 μL, 100 mM의 MgSO4 1 μL, 주형 RNA 1 μL, M-MLV 역전사 효소 1 μL(100 unit) 및 bst 중합 효소 1 μL (4 유닛)를 증류수에 혼합하여 총 25 μL가 되도록 준비하는 것을 특징으로 하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 (a)단계의 반응액을 혼합시킨 후 스핀 다운하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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