KR101985654B1 - 패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 파파야잎말림바이러스(Papaya leaf curl virus, PaLCuV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 등대풀잎말림바이러스(Euphobia leaf curl virus, EuLCV) 및 동아시아시계초바이러스(East Asian Passiflora virus, EAPV)의 다중 진단이 가능한 패션프루트 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 다중 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트는 한번에 4조의 바이러스를 동시에 진단할 수 있어 바이러스 진단에 소요되는 시간 및 비용을 절감할 수 있어 경제적이며, 바이러스 무병주 생산에 기여할 수 있다.

Description

패션프루트 감염 바이러스 4종 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법{Primer set for multiple detection 4 kinds of virus infecting Passiflora edulis and method for detecting said viruses using the same}
본 발명은 패션프루트를 감염시키는 바이러스 4종을 동시에 진단할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
패션프루트를 감염시키는 바이러스는 전 세계적으로 약 20여 종이 알려져 있으며, 예를 들어 동부진딧물매개모자이크바이러스(Cowpea aphid-born mosaic virus, CABMV) 또는 패션프루트목질바이러스(Passionfruit woodiness virus, PWV) 등은 과실에 목질화를 일으킨다. 특히, 파파야잎말림바이러스 (Papaya leaf curl virus, PaLCuV), 오이모자이크바이러스 (Cucumber mosaic virus, CMV), 등대풀잎말림바이러스 (Euphobia leaf curl virus, EuLCV), 및 동아시아시계초바이러스 (East Asian Passiflora virus, EAPV)는 국내외에서 경제적으로 심각한 피해를 일으키는 패션프루트를 감염시키는 바이러스들이다. 이들은 패션프루트에 단독 또는 복합 감염되어 큰 피해를 준다. 이들의 병징으로는 주로 잎에 모자이크 및 잎말림 증상이 나타나며, 그 밖에도 잎의 얼룩, 과실의 목질화 또는 기형 등의 증상이 나타난다. 또한, 상기 바이러스들에 감염되면 과실의 품질이 저하되고 생산량에도 큰 영향을 끼친다.
PaLCuV는 Geminiviridae 과 Begomovirus 속에 속하며, 원형의 단일가닥 DNA를 가진다. PaLCuV는 쌍구형의 입자형태를 가지며, 직경은 18 nm이며, 게놈의 길이는 약 2.8kb이다. PaLCuV는 1998년 인도에서 첫 보고되었으며, 파파야를 자연기주로 하고, 실험 기주로 담배, 페튜니아 또는 토마토 등에서 감염이 가능함이 보고되어 있다. PaLCuV는 패션프루트의 잎에 잎말림 및 얼룩 증상 등을 일으킨다. PaLCuV의 매개충은 담배가루이(Bemisia tabaci)이며 접목으로도 전파되는 것으로 알려져 있다.
CMV는 Bromoviridae 과 Cucumovirus 속에 속하는 바이러스로, 3개의 단일 가닥 플러스-센스 RNA(single stranded plus-sense RNA)로 구성되어 있다. CMV의 RNA 1 및 2는 1a 및 2a 단백질을 만들며, 레플리카제(replicase) 복합체를 이루는데 관여한다. RNA 3는 3a 단백질을 만들며 바이러스 이동 단백질(viral movement protein, MP)로 알려져 있다. CMV는 약 80종의 진딧물에 의해 비영속 전염을 한다. CMV는 1916년 오이에서 처음 발견되었지만, 현재 온대 및 열대 등 모든 기후에서 전세계적으로 발생하는 것으로 알려져 있고, 약 1200종의 작물에 큰 경제적 손실을 일으킬 수 있다. CMV는 패션프루트에 잎의 황화반점 및 모자이크, 과실의 목질화 및 기형 등의 병징을 일으키며, 생육 불량 등을 일으킨다.
EuLCV는 Geminiviridae 과 Begomovirus 속에 속하며, 원형의 단일가닥 DNA를 가진다. EuLCV의 입자 모양은 쌍구형이고, 직경은 18nm이며, 게놈은 2.8kb이다. EuLCV는 담배(Nicotiana tabacum), 토마토 또는 독말풀과 포인세티아(Euphorbia pulcherrima)를 자연기주로 하며, 2014년에 대만에서 처음으로 패션프루트에서 감염이 보고되었다.
EAPV는 Potyviridae 과 Potyvirus 속에 속하는 바이러스로, 단일 가닥 플러스-센스 RNA로 구성되어 있다. EAPV의 길이는 675-905 nm이며, 게놈은 약 10 kb이다. EAPV는 진딧물에 의해 비영속 전염을 하며, 패션프루트에서 처음 발견되었다. EAPV는 패션프루트에서 잎의 얼룩, 모자이크, 과실의 기형 또는 목질화 등의 병징을 발생으키며, 생육 불량을 일으켜 패션프루트 재배에 큰 피해를 주고 있다.
바이러스는 크기가 1 ㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없으며, 육안으로 보기 위해서는 전자현미경을 필요로 한다. 그리고 아직까지도 바이러스에 직접 작용하는 약제방제법은 개발되어 있지 않은 실정이다. 바이러스 진단법으로 과거에는 전자현미경과 혈청학적 방법이 주로 사용되었다. 전자현미경을 이용한 방법은 바이러스의 존재를 확인할 수는 있지만 형태적 특징으로 종을 진단하기는 불가능하다. 혈청학적 방법 중 효소면역진단법(Enzyme-linked immunosorbent assay)은 가장 일반적으로 사용하여온 진단방법이나 PCR 진단법보다 검출감도가 약 1000배 정도 낮으며, 항체와 검사시료의 예상하지 못한 비특이적 반응으로 진단에 실패하는 경우가 종종 발생한다.
이러한 이유에서 정밀하고 신속한 진단은 바이러스병의 관리를 위한 선결요건이다. 한편 식물 바이러스에서 정밀진단용으로 흔히 사용되고 있는 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)법은 사용하는 프라이머가 진단의 특이성과 정밀도를 결정짓는다. 일반적으로 사용하는 프라이머의 경우는 바이러스의 유전자 클로닝을 목적으로 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많다. 그리고 식물체 또는 다른 바이러스에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합한 경우가 많이 있다. 또한 같은 시료에서 여러 종의 바이러스를 진단하기 위해서는 여러 종류의 프라이머를 사용하여 각각 역전사-중합효소연쇄반응을 함으로써 많은 진단비용과 노동력이 소요되는 문제점을 가지고 있다.
우리나라는 패션프루트 묘목을 대부분 수입에 의존하는데, 아직까지 패션프루트를 감염시키는 바이러스를 정확하게 진단하는 기술은 미비한 실정이다. 따라서, 패션프루트를 감염시키는 바이러스를 신속하고 정확하게 진단하는 기술의 개발이 필요하다.
본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 국내외적으로 패션프루트에 경제적으로 심각한 피해를 일으키는 파파야잎말림바이러스(Papaya leaf curl virus, PaLCuV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 등대풀잎말림바이러스(Euphobia leaf curl virus, EuLCV) 및 동아시아시계초바이러스(East Asian Passiflora virus, EAPV)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 설계하고, 상기 프라이머로 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 상기 바이러스에 대해서 민감도가 우수한 프라이머 세트를 선별하여 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 상기 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물을 이용하여 상기 바이러스들을 각각 또는 동시에 검출할 수 있는 바이러스 진단 방법 및 진단 키트를 제공하고자 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 프라이머쌍을 포함하는 파파야잎말림바이러스(Papaya leaf curl virus, PaLCuV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 등대풀잎말림바이러스(Euphobia leaf curl virus, EuLCV) 및 동아시아시계초바이러스(East Asian Passiflora virus, EAPV)로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 패션프루트 바이러스 진단용 다중 역전사 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
또한 본 발명은 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 파파야잎말림바이러스(Papaya leaf curl virus, PaLCuV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 등대풀잎말림바이러스(Euphobia leaf curl virus, EuLCV) 및 동아시아시계초바이러스(East Asian Passiflora virus, EAPV)의 패션프루트 바이러스 진단용 다중 역전사 PCR 프라이머 세트를 제공한다.
본 발명의 발명자들은 상기 4종 바이러스 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색하였다. 이후 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발한 다음 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하였다. 상기 프라이머들을 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 프라이머는 상기 바이러스에 대해서 종 특이적으로 RT-PCR 산물이 합성되도록 하기 위하여 개발되었다. 본 발명에서 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단대상이 되는 바이러스의 유전체 서열로부터 특이적인 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 바이러스 종 내의 모든 계통에 대해서 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종 또는 식물체 유래의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다. 일반적으로 사용하는 프라이머의 경우는 바이러스의 특정 유전자를 증폭하기 위하여 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많으며, 식물체 또는 다른 바이러스의 핵산에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합하다.
구체적으로 본 발명의 프라이머는 다음과 같은 방법으로 디자인 되었다. (a) 대상 바이러스의 유전자 중 대상이 되는 게놈을 선정; (b) 현재까지 알려진 대상 바이러스의 계통 및 분리주의 게놈서열에서 공통 염기서열을 탐색; (C) 유사 바이러스의 게놈과 동일 또는 유사한 서열을 배제; (d) 프라이머로 기능이 가능한 염기서열만을 선정하는 방법에 의해 프라이머를 디자인 했다. 디자인된 프라이머 중 RT-PCR에 의해 종 특이적인 증폭이 수행될 수 있으며, 비특이적 반응이 일어나지 않는 프라이머 쌍을 선정하였다.
본 발명에서 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 4개의 바이러스를 RT-PCR 전기영동 결과로 구별하기 위해서는 크기 구별이 또렷해야 하므로, 증폭되는 산물의 크기를 고려하여, 각 바이러스를 검출하는 프라이머 쌍을 선발하였다.
PaLCuV 검출용으로는 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍, CMV 검출용으로는 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍, EuLCV 검출용으로는 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 EAPV 검출용으로는 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하였다.
상기 선발한 프라이머 쌍들로 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV로 단독감염, 2종 복합감염, 3종 복합감염, 4종 복합 감염시킨 시료를 RT-PCR 실행하여, 그 산물을 전기영동 한 결과, 상기 4가지 바이러스들을 크기별로 뚜렷하게 구별할 수 있었다. 그러므로 상기 프라이머 쌍을 상기 4가지 바이러스들을 동시에 또는 각각 진단하는데 유용하게 쓸 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 패션프루트 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 세트를 포함하는 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV 다중 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 조성물은 RT-PCR 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액을 의미한다.
상기 키트는 RT-PCR 용 키트로서, 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 역전사 반응과 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함한다. 상기 키트에서 증폭반응을 수행하기 위한 시약은 역전사효소, DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한 RT-PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 나아가 필요한 경우 RNase 억제제, DEPC수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.
본 발명에서 'RT-PCR 키트'는 상기 RT-PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 RT-PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다.
상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명은, (a) 시료로부터 바이러스 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 RNA를 주형으로, 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 패션프루트 바이러스를 진단하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은 (a) 시료로부터 바이러스 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 RNA를 주형으로, 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV를 다중 진단하는 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 RNA 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 RNA 추출용 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 RT-PCR은 (a) 단계에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 쌍 중 역방향 프라이머를 프라이머로 하여, 역전사 효소를 이용한 역전사 반응을 통해 cDNA 가닥을 합성한 다음, PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행할 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함할 수 있다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전 변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 50-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다.
PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 패션프루트 바이러스 진단용 프라이머 세트는 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV를 각각 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 한번에 2종 이상의 바이러스를 동시에 진단할 수 있다.
상기 프라이머 세트를 통하여 패션프루트 바이러스 감염 여부를 조기에 진단할 수 있어 감염으로 인한 농가의 경제적 손실을 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 정확하고 특이적으로 패션프루트 바이러스를 진단할 수 있다.
본 발명의 다중 진단방법을 통하여 패션프루트 바이러스 진단에 소요되는 비용과 시간을 줄일 수 있어 경제적이며, 패션프루트 바이러스 무병주 생산 개발에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 패션프루트 감염 바이러스의 주요 병징을 나타낸 사진이다.
도 2는 PaLCuV 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과이다.
도 3은 CMV 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과이다.
도 4는 EuLCV 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과이다.
도 5는 EAPV 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과이다.
도 6은 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV의 단독 또는 2종 이상의 진단용 프라이머 조합의 RT-PCR 검정 결과이다 (M: 100bp 래더(ladder), 1: EAPV, 2: EuLCV, 3: CMV, 4: PaLCuV, 5: EAPV + EuLCV, 6: EAPV + CMV, 7: EAPV + PaLCuV, 8: EuLCV + CMV, 9: EuLCV + PaLCuV, 10: CMV + PaLCuV, 11: EAPV + EuLCV + CMV, 12: EAPV + EuLCV + PaLCuV, 13: EAPV + CMV + PaLCuV, 14: EuLCV + CMV + PaLCuV, 15. EAPV + EuLCV + CMV + PaLCuV, M: 100bp 래더)
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 패션프루트 바이러스 검정 체계 확립
국내외에서 패션프루트를 감염시키는 바이러스인 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV의 진단용 프라이머는 기존에 보고된 염기서열을 참조하여 설계하였으며, 합성된 프라이머는 대상 바이러스에 특이적으로 반응하는 프라이머만을 선발하였다.
1-1. PaLCuV 진단용 프라이머 선발
PaLCuV 진단용 프라이머는 V1, V2 및 C3 영역을 대상으로 크기가 569 bp 및 605 bp인 2쌍을 설계하였으며, 이를 표 1에 나타내었다. PaLCuV가 복합 감염된 시료를 대상으로 RT-PCR 검정 결과, 상기 2쌍 모두 PaLCuV 진단용 특이 프라이머로 선발하였다. 하기 표 2에 사용된 프라이머를 나타내었으며, RT-PCR 검정 결과를 도 2에 나타내었다.
프라이머 명칭 위치(locus) 서열 (5'→3') 예상된 크기
PaLCuV-m-1F 539-558 AAGGTCCTTTGTGTCTCCGA 569 bp
PaLCuV-m-1R 1108-1091 CGATGTATTAGTCGGAAC
PaLCuV-m-2F 254-271 CTGTCTTACGTGCAAGGA 605 bp
PaLCuV-m-2R 856-837 GCTTGCATATTGACCACCAG
Lane 샘플 No. 사용된 프라이머
1 1 PaLCuV-m-1F PaLCuV-m-1R
2 PaLCuV-m-2F PaLCuV-m-2R
1-2. CMV 진단용 프라이머 선발
CMV 진단용 프라이머는 coat protein(CP)을 대상으로 크기가 473 bp인 1쌍을 설계하였으며, 이를 표 3에 나타내었다. CMV에 단독 감염된 시료를 대상으로 RT-PCR 검정 결과, 상기 1쌍을 CMV 진단용 특이 프라이머로 선발하였으며, 그 결과를 표 4 및 도 3에 나타내었다.
프라이머 명칭 위치 서열(5'→3') 예상된 크기
CMV DP u1 1307-1325 CGTCGTGGTTCCCGCTCCG 473bp
CMV DP d2 1780-1761 AGCGCGCATCGCCGAAAGAT
Lane 샘플 No. 사용된 프라이머
1 1 CMV 1-2 u CMV 1-2 d
2 2
3 3
4 N
5 P
1-3. EuLCV 진단용 프라이머 선발
EuLCV 진단용 프라이머는 V2 영역을 대상으로 크기가 342 bp인 1쌍을 설계하였으며, 이를 표 5에 나타내었다. EuLCV에 감염된 시료를 대상으로 RT-PCR 검정 결과, 상기 1쌍을 EuLCV 진단용 특이 프라이머로 선발하였으며, 그 결과를 표 6 및 도 4에 나타내었다.
프라이머 명칭 위치(locus) 서열 (5'→3') 예상된 크기
EuLCV-F 26-46 AGTGGTCCCCCCTCCA(C)CTAAC 342 bp
EuLCV-R 367-348 CAGCCTCCGTCGAACCTTCG
Lane 샘플 No. 사용된 프라이머
1 1 EuLCV-F EuLCV-R
2 2
1-4. EAPV 진단용 프라이머 선발
EAPV 진단용 프라이머는 coat protein(CP) 영역을 대상으로 크기가 각각 231 bp 및 220 bp인 2쌍을 설계하였으며, 이를 표 7에 나타내었다. EAPV에 단독 감염된 시료를 대상으로 RT-PCR 검정 결과, 상기 2쌍을 EAPV 진단용 특이 프라이머로 선발하였으며, 그 결과를 표 8 및 도 5에 나타내었다.
프라이머 명칭 위치(locus) 서열 (5'→3') 예상된 크기
EAPV-IB-1F 9423-9433 CATTGATAATGGCACCTCACC 231bp
EAPV-IB-1R 9654-9635 AGCCAAACTCAAGTCCCTCA
EAPV-IB-2F 9320-9339 CGACCAAATCACAGTTCGAG 220bp
EAPV-IB-2R 9540-9521 CTGTCTCAGAGTGGGCTGAG
Lane 샘플 No. 사용된 프라이머
1 1 EAPV-IB-1F EAPV-IB-1R
2 1 EAPV-IB-2F EAPV-IB-2R
실시예 2: 패션프루트에 발생하는 바이러스 4종에 대한 다중 진단법 개발
패션프루트 바이러스 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV에 대해 디자인된 특이 진단용 프라이머들 중 선발하여 한번의 RT-PCR로 4종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 하기 표 9와 같은 다중 진단용 프라이머를 선발하였으며, 이를 이용하여 패션프루트 바이러스 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV를 한번에 진단할 수 있는 multiplex RT-PCR 방법을 개발하였다.
바이러스 프라이머 명칭 서열 (5'→3') 위치 예상된 크기 농도
PaLCuV PaLCuV-m-2F CTGTCTTACGTGCAAGGA(서열번호 1) 289-306 605bp 50pmol
PaLCuV-m-2R GCTTGCATATTGACCACCAG (서열번호 2) 893-873
CMV CMV 1-5 u CTTGTGCGTTTRATGGCTACGAAGGC (서열번호 3) 2646-3283 473bp 30pmol
CMV 1-5 d CACGGACCGAAGTCCTTCCGAAGAAA (서열번호 4) 3284-3259
EuLCV EuLCV-F AGTGGTCCCCCCTCCA(C)CTAAC (서열번호 5) 26-46 342bp 40pmol
EuLCV-R CAGCCTCCGTCGAACCTTCG (서열번호 6) 367-348
EAPV EAPV-IB-1F CATTGATAATGGCACCTCACC (서열번호 7) 9423-9433 231bp 40pmol
EAPV-IB-1R AGCCAAACTCAAGTCCCTCA (서열번호 8) 9654-9635
PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV의 진단을 위해 앞에서 각각 선발한 프라이머를 이용하였다. 패션프루트 시료는 병징이 있는 잎을 액체질소로 마쇄한 뒤, 바이러스 게놈 추출 키트 (Total RNA extraction kit, Intron Co.)를 이용하여 전체 게놈을 추출하였다.
원스텝 RT-PCR 방법으로, 게놈 주형 1 마이크로리터, 정방향 프라이머(30-50 pmol) 0.5 ul, 역방향 프라이머(30-50 pmol) 0.5 ul, 증류수 8 ul 및 RT-PCR 프리믹스 10 ul를 넣어 최종 20 ul의 반응액으로 실험하였다.
DNA 초기 변성 과정으로 94 ℃ 3분, [DNA 변성을 위해 94℃ 20초, 프라이머 바인딩(annealing)을 위해 55℃ 30초, DNA 사슬 신장을 위해 72℃ 1분]을 35회 반복한 후, 최종적으로 DNA 사슬 신장을 위해 72℃ 10분의 PCR 반응 조건으로 하여 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV 서열을 증폭한 산물을 1.2% 아가로스겔, 100mV, 1시간 30분 전기영동하여 확인하였다.
도 6에 나타난 실험 결과를 볼 때, 단독감염 및 복합감염 모두에서 정확한 반응을 나타냈으며, 증폭 서열의 크기도 뚜렷한 차이를 나타내어 밴드 확인으로 어떤 종의 바이러스가 감염되어 있는지 확인이 용이하였다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 패션프루트에 발생하는 바이러스 4종을 동시에 정확히 진단할 수 있음을 알게 되었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for multiple detection 4 kinds of virus infecting Passiflora edulis and method for detecting said viruses using the same <130> P16-282 / 2016-0493-10-A <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaLCuV-m-2F <400> 1 ctgtcttacg tgcaagga 18 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PaLCuV-m-2R <400> 2 gcttgcatat tgaccaccag 20 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV 1-5 u <400> 3 cttgtgcgtt tratggctac gaaggc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV 1-5 d <400> 4 cacggaccga agtccttccg aagaaa 26 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EuLCV-F <400> 5 agtggtcccc cctccaccta ac 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EuLCV-R <400> 6 cagcctccgt cgaaccttcg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAPV-IB-1F <400> 7 cattgataat ggcacctcac c 21 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAPV-IB-1R <400> 8 agccaaactc aagtccctca 20

Claims (6)

  1. 삭제
  2. 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 파파야잎말림바이러스(Papaya leaf curl virus, PaLCuV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 등대풀잎말림바이러스(Euphobia leaf curl virus, EuLCV) 및 동아시아시계초바이러스(East Asian Passiflora virus, EAPV)의 패션프루트 바이러스 진단용 다중 역전사 PCR 프라이머 세트.
  3. 제2항의 프라이머 세트를 포함하는 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV의 패션프루트 바이러스 진단용 키트.
  4. 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 파파야잎말림바이러스(Papaya leaf curl virus, PaLCuV), 오이모자이크바이러스(Cucumber mosaic virus, CMV), 등대풀잎말림바이러스(Euphobia leaf curl virus, EuLCV) 및 동아시아시계초바이러스(East Asian Passiflora virus, EAPV)의 다중 진단용 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 포함하는 키트.
  6. (a) 시료로부터 바이러스 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 RNA를 주형으로,
    서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 PaLCuV, CMV, EuLCV 및 EAPV로 이루어진 군에서 선택되는 둘 이상의 패션프루트 바이러스를 진단하는 방법.
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