KR101546758B1 - 가루이 매개 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 - Google Patents

가루이 매개 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV), 토마토퇴록바이러스(ToCV) 및 담배잎말림바이러스(TbLCV)의 토마토에 발생하는 가루이 매개 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 바이러스 다중 진단 방법을 제공한다. 본 발명의 프라이머 세트는 한번에 3종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있어 바이러스 진단에 소요되는 시간 및 비용을 절감할 수 있어 경제적이며, 이를 통한 바이러스 유입 및 확산 등 바이러스 피해를 예방할 수 있다.

Description

가루이 매개 토마토 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 {Primer set for multiple detection tomato viruses that transmitted by whiteflies, and method for detecting said viruses using the same}
본 발명은 토마토에 발생하는 가루이 매개 바이러스의 다중 진단을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 토마토에 발생하는 3종의 가루이 매개 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법에 관한 것이다.
일반적으로 토마토에 걸리는 바이러스병 중 가루이가 매개하는 TYLCV, ToCV 그리고 TbLCV는 복합으로 감염되는 경우가 빈번하여 중복감염으로 인한 피해가 심각하다. 이 바이러스병에 의하여 토마토의 수량 감소 및 상품의 질 저하 등의 피해가 크며, 저항성품종의 건전 종자나 건전 육묘를 사용하지 않으면 바이러스병에 의해 수량이 감소하고 품질이 악화되는 등 농가의 경제적 피해를 입히게 된다.
세계적으로 토마토에 발생하는 바이러스는 TYLCV, ToCV, TbLCV이외에 100여종 이상이며, 이중에서 우리나라에서 토마토에 문제가 되고 있는 것이 명확하게 규명된 바이러스는 표 1과 같이 정리를 하였다.
토마토에 발생하는 주요 바이러스
바이러스명 약어 그룹 전염
Pepper mottle virus PepMoV Potyviridae
(Potyvirus)		 진딧물
(비영속)
Cucumber mosaic virus CMV Bromoviridae
(Cucumovirus)		 진딧물
(비영속)
Tomato spotted wilt virus TSWV Bunyaviridae
(Tospovirus)		 총채벌레
Tomato bushy stunt virus TBSV Tombusviridae
( Tombusvirus )
Tomato yellow leaf curl virus TYLCV Geminiviridae
( Begomovirus ) 		담배가루이
(영속)
Tobacco leaf curl virus TbLCV Geminiviridae
( Begomovirus ) 		담배가루이
(영속)
Tomato chlorosis virus ToCV Closterviridae
( Crinivirus ) 		가루이
(반영속)
TYLCV는 Geminiviridae과 Begonovirus속에 속하는 circular DNA 바이러스로 우리나라에서는 2008년 경상남도 통영에서 최초로 발견되었다. TYLCV는 우리나라 토마토 작물에 가장 큰 피해를 주는 바이러스 중에 하나로 가루이에 의해 영속 전반되기 때문에 짧은 시간에 전파가 가능하다. TYLCV의 자연상태에서의 기주는 토마토, 고추 그리고 애기아욱 등이 있다. TYLCV는 Bemisia tabaci에 의해 영속 전염되나 즙액이나 종자전염이 되지 않는 바이러스이다. TbLCV도 TYLCV와 마찬가지로 Geminiviridae과 Begonovirus속에 속하는 circular DNA 바이러스이다. TbLCV의 이명으로는 eggplant yellow mosaic virus, eupatorium yellow vein virus, honeysuckle yellow vein mosaic virus, tobacco cabbaging virus, tobacco curly leaf virus, tobacco frenching virus, tobacco leaf curl virus 1, tomato yellow dwarf virus, zinnia leaf curl virus가 있다. 기주식물로는 토마토와 인동덩굴, 등골나물아재비, 백일홍, 고추, 독말풀 등이 있으며, 병징은 잎이 말리고 잎의 황화증상이 가장 뚜렷한 병징이다. TbLCV의 경우 최근 우리나라에서 주로 인동덩굴에 많이 발생하고 있다. ToCV는 앞서 두 바이러스와 달리 Closterviridae과 Crinivirus속에 속하는 ssRNA 바이러스이다. ToCV는 올해 토마토에서 발생하여 문제가 되었다. 가루이 및 감염시료를 빠르게 방제함으로써 더 확산되지는 않았지만 TYLCV와 복합 감염되어 계속해서 문제가 될 가능성이 있다.
본 발명은 상기와 같은 기술적 과제를 해결하기 위하여, 국내 토마토에 발생하는 바이러스 3종, 토마토황화잎말림바이러스(Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV), 토마토퇴록바이러스(Tomato chlorosis virus, ToCV), 및 담배잎말림바이러스(Tobacco leaf curl virus, TbLCV)를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 설계하고, 상기 프라이머로 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 상기 바이러스에 대해서 민감도가 우수한 프라이머 세트를 선별하여 제공하고자 한다.
본 발명은 또한 상기 프라이머 세트를 포함하는 프라이머 조성물을 이용하여 상기 바이러스들을 각각 또는 동시에 검출할 수 있는 바이러스 진단 방법 및 진단 키트를 제공하고자 한다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, 가루이 매개 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공한다.
상기 가루이 매개 바이러스는 토마토에 발생하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV), 토마토퇴록바이러스(ToCV) 또는 담배잎말림바이러스(TbLCV)를 포함한다.
본 발명의 발명자들은 가루이 매개에 의해 토마토에 발생하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV), 토마토퇴록바이러스(ToCV) 및 담배잎말림바이러스(TbLCV)의 감염여부를 동시에 진단할 수 있는 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트를 제공하고자 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 발명자들은 상기 3종 바이러스 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색한 후 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발한 다음 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하고 이 프라이머들을 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 프라이머는 상기 바이러스에 대해서 종 특이적으로 RT-PCR 산물이 합성되도록 하기 위하여 개발되었다. 본 발명에서 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단대상이 되는 바이러스의 유전체 서열로부터 특이적인 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 바이러스 종 내의 모든 계통에 대해서 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종 또는 식물체 유래의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다. 일반적으로 사용하는 프라이머의 경우는 바이러스의 특정 유전자를 증폭하기 위하여 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많으며, 식물체 또는 다른 바이러스의 핵산에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합하다.
구체적으로 본 발명의 프라이머는 다음과 같은 방법으로 디자인 되었다. (a) 대상 바이러스의 유전자 중 대상이 되는 게놈을 선정;(b) 현재까지 알려진 대상 바이러스의 계통 및 분리주의 게놈서열에서 공통 염기서열을 탐색;(C) 유사 바이러스의 게놈과 동일 또는 유사한 서열을 배제;(d) 프라이머로 기능이 가능한 염기서열만을 선정하는 방법에 의해 프라이머를 디자인 했다. 디자인된 프라이머 중 RT-PCR에 의해 종 특이적인 증폭이 수행될 수 있으며, 비특이적 반응이 일어나지 않는 프라이머 쌍을 선정하였다.
본 발명에서 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형 (template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 상기 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 4개의 바이러스를 RT-PCR 전기영동 결과로 구별하기 위해서는 크기 구별이 또렷해야 하므로, 증폭되는 산물의 크기를 고려하여, 각 바이러스를 검출하는 프라이머 쌍을 선발하였다.
TYLCV 검출용으로는 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍(238bp), ToCV 검출용으로는 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍(442bp), 및 TbLCV 검출용으로는 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍(706bp)을 이용하였다.
상기 선발한 프라이머 쌍들로 TYLCV, ToCV, 및 TbLCV 단독감염, 2종 복합감염, 3종 복합감염시킨 시료를 RT-PCR 실행하여, 그 산물을 전기영동 한 결과, 상기 3가지 바이러스들을 크기별로 뚜렷하게 구별할 수 있었다. 그러므로 상기 프라이머 쌍을 상기 3가지 바이러스들을 동시에 또는 각각 진단하는데 유용하게 쓸 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 TYLCV, ToCV, 및 TbLCV을 동시에 진단할 수 있는 다중 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 TYLCV, ToCV, 및 TbLCV 다중 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 조성물은 RT-PCR 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액을 의미한다.
상기 키트는 RT-PCR 용 키트로서, 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 역전사 반응과 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함한다. 상기 키트에서 증폭반응을 수행하기 위한 시약은 역전사효소, DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한 RT-PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다. 나아가 필요한 경우 RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수도 있다.
본 발명에서 'RT-PCR 키트'는 상기 RT-PCR 조성물을 동결 건조된 형태로 플라스틱 튜브에 담아 제조될 수 있으며, 상기 키트는 RT-PCR 조성물 외에, 분석에 사용되는 적절한 시약 및 도구를 더 포함할 수 있으며, 이러한 시약 및 도구로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제 등이 포함될 수 있다.
상기 적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS, 불용성 담체, 예를 들어 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시 예들에 따르면, (a) 시료로부터 바이러스 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 RNA를 주형으로, 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 TYLCV, ToCV, 및 TbLCV을 동시에 진단할 수 있는 토마토 바이러스 다중 진단 방법을 제공한다.
바람직하게, 본 발명은 (a) 시료로부터 바이러스 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계의 RNA를 주형으로, 서열번호 1의 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 TYLCV, ToCV, 및 TbLCV를 다중 진단하는 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 RNA 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 RNA 추출용 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 RT-PCR에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 쌍 중 역방향 프라이머를 프라이머로 하여, 역전사 효소를 이용한 역전사 반응을 통해 cDNA 가닥을 합성한 다음, PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행할 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2 , KCl 등을 포함할 수 있다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2 +가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 50-57℃이며, 보다 바람직하게는 55℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다.
PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명에 따른 토마토에 발생하는 가루이 매개 바이러스 진단용 프라이머 세트는 TYLCV, ToCV, 및 TbLCV를 각각 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 한번에 3종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있다.
상기 프라이머 세트를 통하여 토마토에 발생하는 가루이 매개 바이러스 감염 여부를 조기에 진단할 수 있어 감염으로 인한 농가의 경제적 손실을 방지할 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 정확하고 특이적으로 바이러스를 진단할 수 있다.
본 발명의 다중 진단방법을 통하여 바이러스 진단에 소요되는 비용과 시간을 줄일 수 있어 경제적이며, 토마토 바이러스 무병주 생산 개발에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 토마토 바이러스,TYLCV, ToCV 및 TbLCV의 주요 병징을 보여주는 그림이다.
도 2는 TYLCV 프라이머로 설계된 TYLCV-M-1F/1R 및 TYLCV-M-2F/2R의 PCR 결과를 나타낸다.
도 3은 ToCV 프라이머 조합의 PCR 결과를 나타낸다.
도 4는 TbLCV 프라이머 세트의 PCR 결과를 나타낸다.
도 5는 선별한 3세트의 프라이머로 토마토 바이러스 3종을 검정한 RT-PCR 결과를 나타낸다. (M; 100bp ladder, lane 1,8,15; TYLCV, lane 2,9,16; ToCV, lane 3,10,17; TbLCV, lane 4,11,18; TYLCV+ToCV, lane 5,12,19; ToCV+TbLCV, lane 6,13,20; TYLCV+TbLCV, lane 7,14,21; TYLCV+ToCV+TbLCV)
도 6은 최종 선발된 프라이머 세트를 이용하여 토마토 바이러스 Multiplex RT-PCR 전기영동 결과를 나타낸 사진이다.(M: 100bp ladder, 1: TYLCV, 2: ToCV, 3: TbLCV, 4: TYLCV+ToCV, 5: TYLCV+TbLCV 6: ToCV+TbLCV, 7: TYLCV+ToCV+TbLCV)
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시 예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시 예들에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 실시 예들은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 토마토에 발생하는 가루이 매개 바이러스 검정 체계 확립을 위한 3종 바이러스 진단용 프라이머 선발
국내 토마토에 발생하는 주요 가루이 매개 바이러스인 TYLCV, ToCV, TbLCV의 진단용 프라이머는 기존에 NCBI에 등록된 염기서열을 참조하여 설계를 하였으며, 프라이머는 대상바이러스에 특이적으로 반응하는 프라이머 만을 선발하였다.
하기 표 2 내지 표 5에 1차 선발된 TYLCV, ToCV, 및 TbLCV 특이적 프라이머를 나타내었다.
TYLCV 프라이머 세트
Primer name locus sequence expected size
TYLCV-M-1F 262 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' (28-mer) 238bp
TYLCV-M-1R 499 5' ATCAGGGCTTCGATACATTC 3' (20-mer)
TYLCV-M-2F 262 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' (28-mer) 179bp
TYLCV-M-2R 440 5' ATGATCGTCGCTTGTTTGTGCC 3' (22-mer)
상기 설계된 표 2의 TYLCV 프라이머 세트 중에서, 특이성이 높은 TYLCV-M-1F/1R을 TYLCV를 포함하는 토마토 바이러스의 다중 진단을 위한 프라이머 세트로 선발하였으며, PCR 결과를 도 2에 나타냈다.
ToCV 프라이머 세트
Primer name locus sequence expected size
ToCV-M-1F 4004 5' TACTCGTGAAGAAATTGAAAGTTA 3' (24-mer) 432bp
ToCV-M-1R 4435 5' CTAAGTTCTGCACCTCGTCATCTA 3' (24-mer)
ToCV-M-2F 1488 5' GTTAGCGTCTATAAAGGAAGAGAC 3' (24-mer) 571bp
ToCV-M-2R 2058 5' GTACTTTGAATAGTCAACATCTGC 3' (24-mer)
ToCV-M-3F 3237 5' AAGATCCGCGCTAATGCTAA 3' (24-mer) 442bp
ToCV-M-3R 3678 5' GTATGAAGGCCGGTTGAAAA 3' (24-mer)
ToCV-M-4F 3235 5' AGAAGATCCGCGCTAATGCTAA 3' (22mer) 479bp
ToCV-M-4R 3713 5' GAACAACCAAATGACACAGCA 3' (20mer)
ToCV-R2-1F 96 5’ GTTCAGTGTCGACCTTATCA 3‘ (20mer) 457bp
ToCV-R2-5'rv 552 5’ GAAAGTTTCCATCTGACCAC 3‘ (20mer)
ToCV-R2-1F 96 5’ GTTCAGTGTCGACCTTATCA 3‘ (20mer) 331bp
ToCV-R2-5'RV 426 5’ GGTACCAACTTGCCGACTTC 3‘ (20mer)
ToCV-R2-1F 96 5’ GTTCAGTGTCGACCTTATCA 3‘ (20mer) 500bp
ToCV-R2-5'r 595 5’ ACGCGAGAGGAAGACTAAACC 3‘ (21mer)
ToCV-R2-1F 96 5’ GTTCAGTGTCGACCTTATCA 3‘ (20mer) 318bp
ToCV-R2-5'R 414 5’ CCGACTTCGAAAGTGCAGAG 3‘ (20mer)
ToCV-R2-2F 3071 5’ CGATCCTCGGTGATTCTATC 3‘ (20mer) 431bp
ToCV-R2-1R 3502 5’ GCCCCTTCATCTCTTTAGCA 3‘ (20mer)
ToCV-R2-3F 5802 5’ CAGTCCGGATGTGAAGATGA 3‘ (20mer) 621bp
ToCV-R2-2r 6423 5’ ATACTGTCCGGTCTCGTCC 3‘ (19mer)
ToCV-R2-3F 5802 5’ CAGTCCGGATGTGAAGATGA 3‘ (20mer) 572bp
ToCV-R2-2R 6373 5’ AAACTCCCCTGCGACATAAG 3‘ (20mer)
ToCV-R2-3'FW 7564 5’ TCACCAGTGGACCACAAGAC 3‘ (20mer) 886bp
ToCV-R2-3r 8450 5’ CCAAAGGAAGGAAACATTATCA 3‘ (22mer)
ToCV-R2-3'FW 7564 5’ TCACCAGTGGACCACAAGAC 3‘ (20mer) 648bp
ToCV-R2-3R 8212 5’ CCACCTAAAATGACCTGACC 3‘ (20mer)
상기 설계된 표 3의 ToCV 프라이머 세트로 실시한 PCR 결과를 도 3에 나타냈다. 그 중에서 특이성이 높은 ToCV-M-3F/3R, ToCV-M-4F/4R 및 ToCV-R2-1F/5‘R를 포함하는 토마토 바이러스의 다중 진단을 위한 프라이머 세트로 선발하였다.
TbLCV 프라이머 세트
Primer name locus sequence expected size
TbLCV-M-1F 894 5' TAAAGAGGTTCTGGAAGTTGAATC 3' (24-mer) 706bp
TbLCV-M-1R 1599 5' CTACGGCTCACTCTACTCAGGTA 3' (23-mer)
상기 표 4에 설계된 프라이머 세트를 TbLCV 진단을 위한 프라이머 세트로 선정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타냈다.
실시예 2. 토마토 바이러스 3종 동시 진단을 위한 프라이머 선정
상기 1차로 선발된 3종 프라이머 테스트를 바탕으로 최종 프라이머 조합이 될 후보 3개의 세트를 선발하였다.
3종 다중 진단을 위한 후보 프라이머 세트
　 Virus primer name star loci length(bp) Seq product size
Set1 TYLCV TYLCV-M-1F 262 28 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' 238
TYLCV-M-1R 499 20 5' ATCAGGGCTTCGATACATTC 3'
ToCV ToCV-R2-1F 53 20 5' TAATTACCCCACCGTCACTA 3' 447
ToCV-R2-5'R 499 19 5' CACACTGCATCCCTGAACC 3'
TbLCV TbLCV-M-1F 894 24 5' TAAAGAGGTTCTGGAAGTTGAATC 3' 706
TbLCV-M-1R 1599 23 5' CTACGGCTCACTCTACTCAGGTA 3'
Set2 TYLCV TYLCV-M-1F 262 28 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' 238
TYLCV-M-1R 499 20 5' ATCAGGGCTTCGATACATTC 3'
ToCV ToCV-M-4F 3235 22 5' AGAAGATCCGCGCTAATGCTAA 3' 479
ToCV-M-4R 3713 20 5' GAACAACCAAATGACACAGCA 3'
TbLCV TbLCV-M-1F 894 24 5' TAAAGAGGTTCTGGAAGTTGAATC 3' 706
TbLCV-M-1R 1599 23 5' CTACGGCTCACTCTACTCAGGTA 3'
Set3 TYLCV TYLCV-M-1F 262 28 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' 238
TYLCV-M-1R 499 20 5' ATCAGGGCTTCGATACATTC 3'
ToCV ToCV-M-3F 3237 24 5' AAGATCCGCGCTAATGCTAA 3' 442
ToCV-M-3R 3678 24 5' GTATGAAGGCCGGTTGAAAA 3'
TbLCV TbLCV-M-1F 894 24 5' TAAAGAGGTTCTGGAAGTTGAATC 3' 706
TbLCV-M-1R 1599 23 5' CTACGGCTCACTCTACTCAGGTA 3'
상기 3가지 조합의 프라이머 3종류에 대해 RT-PCR 선발 과정을 거쳤으며, 이를 도 5에 나타냈다.
상기 표 5에 나타난 바와 같이, ToCV의 단독 감염이나 ToCV+TbLCV의 경우 TYLCV 사이즈의 밴드가 희미하게 나타났다.(lane 5 및 19)
이것은 ToCV의 경우 TYLCV와 복합감염이 많기 때문에, 적은 양의 TYLCV가 있어 단독 검정에서 detection이 되지 않았던 것들이 최적의 PCR조건에서 TYLCV가 일부 검출되었기 때문이다.
따라서, 최종적으로 가장 최적의 프라이머 세트로 조합3의 프라이머 세트를 선정하였다.
최종 선정된 3종 다중 진단을 위한 프라이머 세트
　 Virus primer name star loci length
(bp)		 Seq Seq. No. product size
Set3 TYLCV TYLCV-M-1F primer 262 28 5' CACGATTTAATTAGGGATCTTATATCTG 3' 1 238
TYLCV-M-1R primer 499 20 5' ATCAGGGCTTCGATACATTC 3' 2
ToCV ToCV-M-3F primer 3237 24 5' AAGATCCGCGCTAATGCTAA 3' 3 442
ToCV-M-3R primer 3678 24 5' GTATGAAGGCCGGTTGAAAA 3' 4
TbLCV TbLCV-M-1F primer 894 24 5' TAAAGAGGTTCTGGAAGTTGAATC 3' 5 706
TbLCV-M-1R primer 1599 23 5' CTACGGCTCACTCTACTCAGGTA 3' 6
실시예 3. 토마토 발생 3종 바이러스에 대한 다중 진단법 개발
본 발명의 토마토 다중 바이러스 진단을 위한 RT-PCR 과정은 하기와 같다.
국내에 분포된 토마토 바이러스에 TYLCV, ToCV 및 TbLCV에 대해 디자인된 특이 진단용 프라이머들 중 선발하여 한번의 RT-PCR로 3종의 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 multiplex RT-PCR 방법을 개발하였다
TYLCV, ToCV 및 TbLCV는 앞에서 각각 선발한 프라이머 조합 3을 이용하였다.
토마토 시료는 병징이 있는 잎, 줄기 및 열매를 액체질소로 마쇄한 뒤, 바이러스 게놈 추출 키트를 이용하여 전체 게놈을 추출하였다. 추출된 게놈을 주형으로 다음과 같은 방법으로 RT-PCR 하였다.
역전사(RT)과정으로, 게놈 주형 1 마이크로리터, 3'-프라이머 각각 32 pmol 혼합물 0.5 마이크로리터, 10mM dNTPs 0.5 마이크로리터, 1㎍/ml BSA 0.1마이크로리터, 8U/ul RNase inhibitor 0.2 마이크로리터, 5x RT buffer, 4mM 소듐 피로포스페이트 0.5 마이크로리터, AMV 역전사 효소를 넣어 최종 5 마이크로리터 반응액을 50℃에서 30분간 항온처리하여 실시한 다음 94℃에서 5분간 변성시켰다. 중합효소 연쇄반응은 역전사 반응액 5 마이크로리터에 여 실시한 다음 94℃에서 10 분간 변성시켰다. 중합효소연쇄반응(Polymerase chain reaction)은 역전사 반응액 5 ㎕에 12.5 pmole 정방향 프라이머(forward primer), 5U Taq DNA 중합효소, 5배 중합효소연쇄반응 완충액(100 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, 15 mM MgCl 2 , pH 8.3) 5㎕를 첨가하고 증류수를 첨가하여 반응액을 25 ㎕로 만들었다. 이 반응액을 초기 변성과정으로 94℃ 3분 반응시키고, 94℃ 20초, 57℃ 30 초, 72℃ 60 초로 35회 증폭시켰으며, 마지막에는 72℃에서 5 분간 처리하였다. RT-PCR 산물은 1.5% 아가로스겔, 100V 조건에서 1시간동안 전기영동을 하여 확인하였다.
그 결과는 도 6에 나타냈다. 단독감염 및 복합 감염 모두에서 정확한 반응을 나타냈다. 따라서, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 토마토에 발생하는 바이러스 3종을 동시에 정확히 진단할 수 있음을 알게 되었다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for multiple detection tomato viruses that transmitted by whiteflies, and method for detecting said viruses using the same <130> P13-272 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYLCV-M-1F primer <400> 1 cacgatttaa ttagggatct tatatctg 28 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TYLCV-M-1R primer <400> 2 atcagggctt cgatacattc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToCV-M-3F primer <400> 3 aagatccgcg ctaatgctaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ToCV-M-3R primer <400> 4 gtatgaaggc cggttgaaaa 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TbLCV-M-1F primer <400> 5 taaagaggtt ctggaagttg aatc 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TbLCV-M-1R primer <400> 6 ctacggctca ctctactcag gta 23

Claims (7)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는,
    가루이 매개 바이러스 다중 진단용 프라이머 세트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 가루이 매개 바이러스는 토마토에 발생하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV), 토마토퇴록바이러스(ToCV) 또는 담배잎말림바이러스(TbLCV)인 것을 특징으로 하는 다중 진단용 프라이머 세트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 다중 진단용 프라이머 세트는 토마토에 발생하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV), 토마토퇴록바이러스(ToCV) 및 담배잎말림바이러스(TbLCV)의 감염여부를 동시에 진단하는 다중 진단용 프라이머 세트.
  4. 제1항의 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는, TYLCV, ToCV, 및 TbLCV의 다중 진단을 위한 가루이 매개 바이러스 다중 진단용 키트.
  5. 서열번호 1 내지 6의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 토마토황화잎말림바이러스(TYLCV), 토마토퇴록바이러스(ToCV) 및 담배잎말림바이러스(TbLCV)의 다중 진단용 조성물.
  6. 제5항의 조성물을 포함하는 키트.
  7. (a) 시료로부터 바이러스 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 RNA를 주형으로,
    서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 서열번호 4로 표시되는 프라이머 쌍, 및 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하는 단계를 포함하는 TYLCV, ToCV, 및 TbLCV을 다중 진단하는 진단 방법.
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