KR101459616B1 - 고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명의 목적은 국내 고구마에서 발생하는 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)의 4종 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 서열번호 1 내지 8의 동시진단용 프라이머 및 이를 이용한 진단방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 국내 고구마에 발생하는 4종 바이러스(SPLCV, SPFMV, SPGV, SwPLV) 동시진단법은 한번의 RT-PCR 반응으로 바이러스 각각에 대한 진단뿐만 아니라 4종 바이러스에 대한 모든 조합의 복합감염의 경우에도 특이적으로 진단이 가능하다. 이 동시진단법의 사용으로 비용과 시간을 줄이는 경제성이 있으며, 고구마 바이러스 무병주 생산 개발 등 식물 품종 개발에 효과적으로 사용할 수 있다.

Description

고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법{Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same}
본 발명은 고구마 바이러스 진단용 프라이머 쌍 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)의 4종 바이러스를 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 서열번호 1내지 8로 표시되는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법과 진단용 키트에 관한 것이다.
일반적으로 고구마 바이러스병(Sweet potato virus disease, SPVD)은 Sweet potato feathery mottle virus (SPFMV)과 Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV)의 중복감염으로 인해 위축, 가는 잎, 기형 등의 병징을 보이게 되며, 이 바이러스병에 의하여 20～80% 수량 감수 및 상품의 질 저하 등의 피해가 큰 것으로 보고되었다(Gao 등, 2000; Gibson 등, 1998; Hahn, 1979; Karyeija 등, 1998; Karyeija 등, 2000; Wisler 등, 1998). 또한, 우량 건전 종자나 종묘로 수시로 갱신하지 않으면 SPFMV 에 의해 수량이 20～78％ 감소하고, 품질이 악화된다는 보고도 있다(Gao 등, 2000).
세계적으로 고구마에 발생하는 바이러스는 SPFMV, SwPLV, SPMMV 등 14여종 이상이고(Abad 등, 1992; Brunt 등, 1996; Colinet 등, 1994; Colinet 등, 1996; Fuentes 등, 1996; Moyer and Salazar, 1989), 이중에서 고구마에 문제가 되고 있으며, 명확하게 구명된 바이러스는 표 1과 같이 정리를 하였다.
고구마에 발생하는 주요 바이러스
바이러스명 약어 그룹 전염
Sweet potato feathery mottle virus SPFMV Potyviridae
(Potyvirus)		 진딧물
(비영속)
Sweet potato G virus SPGV Potyviridae
(Potyvirus)		 진딧물
(비영속)
Sweet potato mild specklin virus SPMSV Potyviridae
(Potyvirus)		 진딧물
(비영속)
Sweet potato latent virus SwPLV Potyviridae
(Potyvirus)		 진딧물
(비영속)
Sweet potato mild mottle virus SPMMV Potyviridae
(Ipomovirus)		 담배가루이
(영속)
Sweet potato chlorotic stunt virus SPCSV Closteroviridae (Crinivirus) 담배가루이
(반영속)
Sweet potato leaf curl virus SPLCV Geminiviridae
(Begomovirus)		 담배가루이
(영속)
SPFMV는 Potyviridae과 Potyvirus속에 속하는 바이러스로 크기가 830-850㎚이며, 진딧물에 의하여 비영속 전염을 한다. 이명으로 “Sweet potato chlorotic leaf spot virus”, “Sweet potato internal cork virus”, “Sweet potato russet crack virus” 및 “Sweet potato virus A” (Sheffield, 1953)가 있으며, 현재 공식적으로 “russet crack” 과 “Sweet potato vein-clearing virus” 등 2계통으로 분류가 되어 있다(Brunt 등, 1996).
SPGV는 SPFMV와 동일하게 Potyviridae과 Potyvirus속에 속하는 바이러스이지만, coat protein(CP)과 3'-noncoding region의 염기서열 분석 결과 상동성이 80%이하로 나타나서 이종의 바이러스로 분류가 되었다(Colinet 등, 1994).
Alvarez 등(1997)은 동일하게 SPFMV에 속하던 “Sweet Potato Chlorotic Dwarf disease” 계통을 염기서열 분석한 결과, SPFMV와는 63%, Sweet potato latent virus (SwPLV)는 68~70%, SPGV는 57%, 그리고 PVY와는 73%의 상동성을 보였기 때문에 새로이 Sweet potato mild speckling virus(SPMSV)로 명명하였다.
Potyviridae과 Potyvirus속에 속하는 또다른 바이러스인 Sweet potato latent virus(SwPLV)는 이명으로 “Sweet potato virus N”이며, 입자 크기는 700-750㎚인 사상형 바이러스이다. SwPLV는 CP와 3'-noncoding region의 염기서열 분석 결과만 보고되어 있을 뿐, 그 외의 바이러스 특성은 아직까지 구명이 되지 않았다(Brunt 등, 1996).
Sweet potato mild mottle virus(SPMMV)는 우간다의 빅토리아 지역에서 크게 문제가 된 바이러스로서 대부분 다른 고구마 바이러스에 비해 넓은 기주범위를 가지고 있다(Moyer 등, 1989). SPMMV는 "Sweet potato T virus" 및 "Sweet potato B virus"라는 이명을 가지고 있으며(Sheffield, 1953), Potyviridae과 Ipomovirus속에 속하는 바이러스로 크기는 800～950㎚로, 담배가루이에 의한 영속전염을 한다(Brunt 등, 1996).
Sweet potato chlorotic stunt virus(SPCSV)는 Closteroviridae과 Crinivirus속에 속하는 바이러스로 크기는 850㎚이며, 이전까지는 "Sweet potato sunken vein virus(SPSVV)"로 알려져 있었다. SPCSV는 담배가루이에 의해 반영속전염을 하며, 현재까지는 이스라엘과 나이제리아 지역에 한정적으로 분포된 것으로 보고되어 있다(Gibson 등, 1998; Winter 등, 1992).
Sweet potato leaf curl virus(SPLCV)는 미국, 이스라엘, 대만 및 일본 등에 보고되어 있으며(Chung 등, 1985; Osaki와 Inouye, 1991; Cohen 등, 1997; Lotrakul 등, 1998), Geminiviridae과 Begomovirus속에 속하는 바이러스로 담배가루이에 의해 영속전염을 하는 것으로 보고되어 있다(Brunt 등, 1996). 현재, SPLCV는 Ipomoea yellow vein virus(IYVV)와 게놈구조가 유사한 동일한 바이러스로 분류를 하였으나, IYVV가 담배가루이에 의해 전염되지 않는 원인에 관해서는 아직까지 명확히 구명되지 않았다(Banks 등, 1999; Lotrakul 등, 2001).
국내에서의 고구마 바이러스병은 현재까지 SPFMV, SwPLV, SPGV 및 SPLCV등 4종이 보고되어 있다(Kim 등, 1998; Park 등, 1994; Park 등, 1995; Ryu와 Choi, 2002; Yun 등, 2002; Choi 등, 2006). 2003년에서 2005년에 수집된 고구마 시료 179점과 2011년에 수집된 고구마 시료 126점 및 바이오에너지센터에 보존되고 있는 유전자원 452점에 대해 바이러스 7종에 대해 검정한 결과 [표 2]와 같은 분포를 보여주었다.
국내 고구마의 바이러스 발생 상황
mixed infection detected viruses genetic resources Field Samples
detected ratio 2011 2003-2005
detected ratio detected ratio
Quatre
infection		 SPLCV+SPFMV+SPGV+SwPLV 91 20.1 10 7.9 2 1.1
Triple
infection		 SPLCV+SPFMV+SPGV 111 24.6 12 9.5 6 3.4
SPLCV+SPFMV+SwPLV 10 2.2 1 0.8 0 0
SPLCV+SPGV+SwPLV 0 0 0 0 0 0
SPFMV+SPGV_SwPLV 27 5.9 29 23 2 1.1
Double
infection		 SPLCV+SPFMV 25 5.5 2 1.6 1 0.6
SPLCV+SPGV 17 3.8 1 0.8 0 0
SPLCV+SwPLV 1 0.2 0 0 0 0
SPFMV+SPGV 45 10 34 27 19 10.6
SPFMV+SwPLV 2 0.4 4 3.2 1 0.6
SPGV+SwPLV 3 0.7 0 0 0 0
Single
infection		 SPLCV 14 3.1 2 1.6 0 0
SPFMV 12 2.7 14 11.1 71 39.7
SPGV 20 4.4 2 1.6 29 16.2
SwPLV 1 0.2 0 0 0 0
NO detection 73 16.2 15 11.9 48 26.8
계 452 126 179
바이러스는 크기가 1 ㎛ 보다 작은 병원체로 광학현미경으로도 그 실체를 관찰할 수 없으며, 육안으로 보기 위해서는 전자현미경을 필요로 한다. 그리고 아직까지도 바이러스에 직접 작용하는 약제방제법은 개발되어 있지 않은 실정이다. 이러한 이유에서 정밀하고 신속한 진단은 바이러스병의 관리를 위한 선결요건이다.
한편 식물 바이러스에서 정밀진단용으로 흔히 사용되고 있는 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)법은 사용하는 프라이머가 진단의 특이성과 정밀도를 결정짓는다. 일반적으로 사용하는 프라이머의 경우는 바이러스의 유전자 클로닝을 목적으로 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많다. 그리고 식물체 또는 다른 바이러스에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합한 경우가 많이 있다. 또한 같은 시료에서 여러 종의 바이러스를 진단하기 위해서는 여러 종류의 프라이머를 사용하여 각각 역전사-중합효소연쇄반응을 함으로써 많은 진단비용과 노동력이 소요되는 문제점을 가지고 있다.
이에 본 발명자들은 4종 바이러스 내에서 지금까지 알려진 염기서열을 수집하여 종의 모든 계통과 분리주가 가지고 있는 공통 염기서열을 탐색한 후 이 공통 염기서열 중에서 유연관계가 있는 다른 바이러스가 가지고 있는 염기서열을 프라이머 설계 대상에서 제외시킴으로써 종 특이적 서열을 선발한 다음 이러한 종 특이적 염기서열로부터 프라이머로 최적의 조건을 가지는 서열을 종 특이적 프라이머로 설계하고 이 프라이머들을 조합별로 실제적인 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 거쳐 대상 바이러스 이외의 핵산과는 비특이적 반응이 없고, 대상 바이러스에 대해서는 민감도가 우수한 조합을 최종 선발하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스, 고구마 모틀 바이러스, 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a)단계의 RNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마 잎말림병 바이러스, 고구마 모틀 바이러스, 고구마 G 바이러스 및 고구마 잠재 바이러스로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 동시 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 프라이머 쌍을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계;(b) 상기 (a)단계의 RNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c)상기 (b)단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 표시되는 프라이머를 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 동시 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 프라이머는 상기 바이러스에 대해서 종 특이적으로 RT-PCR 산물이 합성되도록 하기 위하여 개발되었다. 본 발명에서 종 특이적이라는 의미는 해당 프라이머가 진단대상이 되는 바이러스의 유전체 서열로부터 특이적인 RT-PCR 산물을 합성할 수 있음을 의미하며, 진단대상이 되는 바이러스 종 내의 모든 계통에 대해서 공통적으로 작용해야 하고, 다른 유사 종 또는 식물체 유래의 핵산과의 비특이적 반응은 일어나지 않아야 한다. 일반적으로 사용하는 프라이머의 경우는 바이러스의 특정 유전자를 증폭하기 위하여 설계되어 종 특이적이지 못한 경우가 많으며, 식물체 또는 다른 바이러스의 핵산에 의한 비특이적 산물을 생산하는 경우가 있기 때문에 진단용으로 사용하기에는 부적합하다.
구체적으로 본 발명의 프라이머는 다음과 같은 방법으로 디자인 되었다. (a) 대상 바이러스의 유전자 중 대상이 되는 게놈을 선정;(b) 현재까지 알려진 대상 바이러스의 계통 및 분리주의 게놈서열에서 공통 염기서열을 탐색;(C) 유사 바이러스의 게놈과 동일 또는 유사한 서열을 배제;(d) 프라이머로 기능이 가능한 염기서열만을 선정하는 방법에 의해 프라이머를 디자인 했다. 디자인된 프라이머 중 RT-PCR에 의해 종 특이적인 증폭이 수행될 수 있으며, 비특이적 반응이 일어나지 않는 프라이머 쌍을 선정하였다.
본 발명의 프라이머는 PCR용 프라이머 쌍을 말하며, 보다 구체적으로는 이에 한정하지는 않으나 바이러스의 RNA 게놈에 대한 RT-PCR용 프라이머 쌍을 말한다. 본 발명의 프라이머 쌍은 정방향 프라이머와 역방향 프라이머를 포함하며, 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)를 진단할 수 있는 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 프라이머일 수 있다.
고구마 모틀 바이러스(SPFMV)를 검출하는 프라이머 쌍으로, 총 5개의 프라이머 쌍([표 3])을 선발하였다(실시예 <1-1>). 그러나 상기 프라이머 쌍 중에서 서열번호 13과 14로 표시되는 프라이머 쌍은 고구마 G 바이러스(SPGV)도 검출하여, 비특이적이었다(실시예 <1-2>).
고구마 G 바이러스(SPGV)를 검출하는 프라이머 쌍으로, 총 5개의 프라이머 쌍([표 4])을 설계하였고, 모두 다 SPGV와 반응을 하였다(실시예 <1-2>).
또한 고구마 잠재 바이러스(SwPLV)를 검출하는 프라이머 쌍으로, 총 4개의 프라이머 쌍([표 5])을 설계하였고, 그 중에서 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍과 서열번호 25와 26으로 표시되는 프라이머 쌍만 고구마 잠재 바이러스에 대해서 특이적이었다(실시예 <1-3>).
고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV)를 검출하는 프라이머 쌍으로 12개의 프라이머 쌍을 설계하였고, 그 중에서 9개 프라이머 쌍만 SPVCV에 반응하였다. SPLCV는 IYVV와 동일한 바이러스로서, 세계적으로 오직 3종의 계통에서만 전 염기서열이 분석되어 있으므로, 기존에 보고된 바이러스 전 영역의 염기서열 분석 및 특이 프라이머를 구축할 목적으로 프라이머를 설계하고자 했기에, 상기 9개 프라이머 쌍 중 이에 적합한 프라이머 쌍 6개를 선발하였다. 이는 [표 6]에 기재하였다(실시예 <1-4>).
상기 4개의 바이러스를 RT-PCR 전기영동 결과로 구별하기 위해서는 크기 구별이 또렷해야 하므로, 증폭되는 산물의 크기를 고려하여, 각 바이러스를 검출하는 프라이머 쌍을 선발하였다. 고구마 모틀 바이러스(SPFMV) 검출용으로는 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍(355bp), 고구마 G 바이러스(SPGV) 검출용으로는 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍(285bp), 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 검출용으로는 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍(183bp), 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV) 검출용으로는 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍(506 bp)을 이용하였다([표 7]).
상기 선발한 프라이머 쌍들로 SPFMV, SPGV, SPGV, SwPLV 로 단독감염, 2종 복합감염, 3종 복합감염, 4종 복합감염 시킨 시료를 RT-PCR 실행하여, 그 산물을 전기영동 한 결과 ([도 5]), 상기 4가지 바이러스들을 크기별로 뚜렷하게 구별할 수 있었다. 그러므로 상기 프라이머 쌍을 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV)들을 동시에 또는 각각 진단하는데 유용하게 쓸 수 있음을 알 수 있다.
따라서 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단용 키트를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 프라이머 쌍을 포함하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 동시 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.
상기 조성물은 RT-PCR 증폭 반응을 수행하기에 필요한 시약, 열 안정성 DNA 폴리머라아제, dNTP 및 2가 금속 양이온을 함유하는 용액을 의미한다.
상기 키트는 RT-PCR 용 키트로서, 서열번호 1과 2로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 3과 4로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 5와 6으로 표시되는 프라이머 쌍, 서열번호 7과 8로 표시되는 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 프라이머 쌍 및 역전사 반응과 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함한다. 상기 키트에서 증폭반응을 수행하기 위한 시약은 역전사효소, DNA 폴리머라제, dNTPs, 버퍼 등을 포함할 수 있다. 또한 RT-PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
본 발명은 (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계;(b) 상기 (a)단계의 RNA를 상기 프라이머 쌍을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및 (c)상기 (b)단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마 잎말림병 바이러스(SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(SPFMV), 고구마 G 바이러스(SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(SwPLV) 로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 바이러스 진단 방법을 제공한다.
상기 (a) 단계에서 RNA 추출은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 따라 수행될 수 있으며, 상업적으로 판매되는 RNA 추출용 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계에서 RT-PCR에서 분리된 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 쌍 중 역방향 프라이머를 프라이머로 하여, 역전사 효소를 이용한 역전사 반응을 통해 cDNA 가닥을 합성한 다음, PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행할 수 있다. PCR 반응은 PCR 반응에 필요한 당업계에 공지된 여러 가지 성분을 포함하는 PCR 반응 혼합액을 이용하여 수행될 수 있다. 상기 PCR 반응 혼합액에는 역전사 반응에 의해 합성된 cDNA와 본 발명에서 제공되는 프라이머 쌍 이외에 적당량의 DNA 중합효소, dNTP, PCR 완충용액 및 물을 포함한다. 상기 PCR 완충용액은 Tris-HCl, MgCl2, KCl 등을 포함한다. 이 때 MgCl2 농도는 증폭의 특이성과 수량에 크게 영향을 주며, 일반적으로 Mg2 +가 과량인 경우는 비특이적인 PCR 증폭산물이 증가하고, Mg2+가 부족한 경우 PCR 산물의 산출율이 감소한다. 상기 PCR 완충용액에는 적당량의 트리톤 X-100(Triton X-100)이 추가로 포함될 수도 있다. 또한 PCR은 94-95℃에서 주형 DNA를 전변성시킨 후, 변성(denaturation); 결합(annealing); 및 증폭(extension)의 사이클을 거친 후, 최종적으로 72℃에서 연장(elongation)시키는 일반적인 PCR 반응 조건에서 수행될 수 있다. 상기에서 변성 및 증폭은 94-95℃ 및 72℃에서 각각 수행될 수 있으며, 결합시의 온도는 프라이머의 종류에 따라 달라질 수 있으나, 바람직하게는 50-57℃이며, 보다 바람직하게는 50℃이다. 각 단계의 시간과 싸이클 수는 당업계에 일반적으로 행해지는 조건에 따라 정해질 수 있다.
상기 (c) 단계에서는 당업계에서 널리 공지된 방법에 따라 PCR 산물의 DNA를 크기별로 분리할 수 있다. 바람직하게는 아가로스 겔(agarose gel) 또는 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동 또는 형광분석장치(ABI prism 3100 genetic analyzer-electropherogram)에 의해 확인할 수 있다. 이 때, 형광분석장치를 이용하기 위해서는 당업계에 공지된 형광 다이(dye)를 붙인 프라이머쌍을 이용하여 상기 (b)단계에서 PCR을 수행한다. PCR 증폭 결과는 바람직하게는 아가로스 겔 전기영동에 의해 확인할 수 있다. 전기영동 후 에디듐 브로마이드(ethidium bromide) 염색으로 전기영동 결과를 분석할 수 있다. 일반적인 역전사 반응, PCR 수행 및 그 결과 분석 방법에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다.
본 발명은 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)의 4종 바이러스를 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 서열번호 1 내지 8로 표시되는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법과 진단용 키트에 관한 것으로서, 국내 고구마에 발생하는 4종 바이러스(SPLCV, SPFMV, SPGV, SwPLV)를 한번의 RT-PCR 반응으로 바이러스 각각에 대한 진단뿐만 아니라 4종 바이러스에 대한 모든 조합의 복합감염의 경우에도 특이적으로 진단이 가능하다. 이 동시진단법의 사용으로 비용과 시간을 줄이는 경제성이 있으며, 고구마 바이러스 무병주 생산 개발에 효과적으로 사용할 수 있다.
도 1은 SPFMV 진단용 프라이머 선별 결과에 관한 것이다. (각 lane 별 샘플과 프라이머 쌍은 하기 표와 같다.)
Figure 112012026303696-pat00001

도 2는 SPGV 단독 감염 시료를 SPGV 진단용 프라이머 쌍와 SPFMV 진단용 프라이머 쌍으로 RT-PCR을 시행한 결과이다.(각 lane 별 프라이머 쌍은 하기 표와 같다.)
Figure 112012026303696-pat00002

도 3은 SwPLV 진단용 프라이머 선별 결과에 관한 것이다.(각 Lane별 샘플과 프라이머 쌍은 하기 표와 같다.)
Figure 112012026303696-pat00003

도 4는 SPLCV 진단용 프라이머 선별 결과에 관한 것이다.(각 lane 별 프라이머 쌍을 하기 표에 기재하였다. lane 3, 7, 10 의 프라이머 쌍은 SPLCV 및 IYVV에 대해 특이성이 없어서 제외시켰다.)
Figure 112012026303696-pat00004

도 5는 고구마 바이러스 Multiplex RT-PCR 결과 전기영동 사진에 관한 것이다. (M : 100bp ladder, 1 : SwPLV, 2 : SPGV, 3 : SPFMV, 4 : SPLCV, 5 : SwPLV+SPGV, 6 : SwPLV+ SPFMV, 7 : SwPLV+SPLCV, 8 : SPGV+ SPFMV, 9 : SPGV+SPLCV, 10 : SPFMV+SPLCV, 11 : SwPLV+SPGV+ SPFMV, 12 : SwPLV+SPGV+SPLCV, 13 : SwPLV+SPFMV+SPLCV, 14 : SPGV+SPFMV+SPLCV, 15 : SPLCV+SPFMV+SPGV+SPLV)
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
고구마 바이러스 진단 체계 확립
<1-1> SPFMV 진단용 프라이머 선별
SPFMV(고구마모틀바이러스) 진단용 프라이머는 외피단백질(coat protein, CP) 및 RNA의 3’말단 지역을 대상으로 크기가 225~355bp인 5쌍을 설계하였다. 설계한 프라이머는 하기 [표 3]에 기재하였다.
SPFMV 진단용 프라이머
Primer name locus sequence expected size 서열번호
SPFMV 1-F 9073-9092 5' TACACACTGCTAAAACTAGG 3' (20-mer) 355bp 3
SPFMV 1-R 9428-9409 5' AGTTCATCATAACCCCATGA 3' (20-mer) 4
SPFMV 2-F 9465-9483 5' GGACCAAGCCCCATACAAT 3' (19-mer) 347bp 9
SPFMV 2-R 9812-9795 5' GGAATGGTTGCGGGTTGC 3' (18-mer) 10
SPFMV 3-F 9788-9807 5' GAGCTAAGCAACCCGCAACC 3' (20-mer) 225bp 11
SPFMV 3-R 10013-9994 5' TCATATGTTGACAAGAGTTG 3' (20-mer) 12
SPFMV 4-F 10127-10148 5' TGAATGGATTAATGGTTTGGTG 3' (22-mer) 261bp 13
SPFMV 4-R 10388-10370 5' GCATATCGCGCAAGACTCA 3' (19-mer) 14
SPFMV 5-F 10381-10402 5' CGATATGCATTTGATTTCTACG 3' (22-mer) 270bp 15
SPFMV 5-R 10651-10631 5' TTAAAGGCATACTAAAGATAA 3' (21-mer) 16
설계한 상기 프라이머들을 SPFMV에 감염된 두 샘플 583-1, 552-2를 대상으로 RT-PCR 검정해 본 결과, 5쌍 SPFMV를 모두 검출하였다. 결과는 [도 1]에서 확인할 수 있다.
아래 실시예에서 확인할 수 있듯이, SPFMV 4-F와 SPFMV 4-R로 이루어진 프라이머 쌍은 SPGV도 검출하므로 SPFMV 단독 검출용으로는 적합하지 않다.
<1-2> SPGV 진단용 프라이머 선별
SPGV 진단용 프라이머는 CP 및 RNA의 3’말단 지역을 대상으로 크기가 203~365bp인 5쌍을 설계하였다. 디자인한 프라이머 쌍은 하기 [표 4]에 기재하였다.
SPGV 진단용 프라이머 설계
Primer name locus sequence expected size 서열번호
SPGV 1-F 467-484 5' TGGCGCATCAAGGAAAAG 3' (18-mer) 313bp 17
SPGV 1-R 780-763 5' ACCTGGTGGTAATGGTCC 3' (18-mer) 18
SPGV 2-F 808-829 5' GAAATTCCGCAGCCAGAGTCAC 3' (22-mer) 203bp 19
SPGV 2-R 1011-990 5' TCCAACCGTACCAGCATTCACA 3' (22-mer) 20
SPGV 3-F 1061-1081 5' CAATGCCAAATGGAAGAATAG 3' (22-mer) 285bp 5
SPGV 3-R 1346-1325 5' GCATGATCCAATAGAGGTTTTA 3' (22-mer) 6
SPGV 4-F 1410-1431 5' GCGCAATAGGATCAAGGCATAC 3' (22-mer) 334bp 21
SPGV 4-R 1744-1723 5' ACACTGAAGGCGAAACTGAAAT 3' (22-mer) 22
SPGV 5-F 1546-1565 5' CAAATGAAAGCAGCAGCACT 3' (20-mer) 365bp 23
SPGV 5-R 1911-1892 5' ATCACGAACCAAAAAGGCTT 3'(20-mer) 24
SPGV에 단독 감염된 샘플을 대상으로 상기 [표 4]의 SPGV 진단용 프라이머와 [표 3]의 SPFMV 진단용 프라이머로 RT-PCR을 실시하였다. 그 결과, [표 4]의 프라이머 모두 SPGV를 검출하였는데, [표 3]의 SPFMV 검출용 SPFMV 4-F(서열번호 13)와 SPFMV 4-R(서열번호 14) 프라이머 세트 역시 SPGV를 검출하였다. 이는 [도 2]에서 확인할 수 있다.
<1-3> SwPLV 진단용 프라이머 선별
SwPLV는 세계적으로 염기서열 분석 결과가 많지 않았으며, 기존에 보고된 바이러스도 CP 및 RNA 3’말단 지역만을 염기서열 분석하였기 때문에, SPFMV 및 SPGV와 동일하게 CP 및 RNA 3’말단 지역을 대상으로 크기가 183~520bp인 4쌍을 설계하였다. 설계 프라이머는 하기 [표 5]에 기재하였다.
SwPLV 진단용 프라이머 설계
Primer name locus sequence expected size 서열번호
SwPLV 1-F 335-356 5' GGAGTCAGTTCAATCAATGGTA 3' (22-mer) 183bp 7
SwPLV 1-R 518-498 5' AGTGGCTTTATTGGGTATGAT 3' (21-mer) 8
SwPLV 2-F 470-490 5' GGGTGATGATGGACGGAGACA 3' (21-mer) 298bp 25
SwPLV 2-R 768-747 5' CCGATGATGTGTATTTGTGAGC 3' (22-mer) 26
SwPLV 3-F 757-777 5' ACACATCATCGGCTGTTCGGT 3' (21-mer) 319bp 27
SwPLV 3-R 1076-1056 5' GTGTGTGGTATAAGACAAAAA 3' (21-mer) 28
SwPLV-u1 24-47 5' TGGAAAAGTGGAAACGAAGAAGAA 3‘ (24-mer) 520bp 29
SwPLV-d1 544-523 5' GAAATGTTGGTGCTGCGAAATC 3'(22-mer) 30
SwPLV와 다른 바이러스가 복합 감염된 시료 2종(607-2, 618-2)을 대상으로 RT-PCR 검정 결과, SwPLV 1-F와 SwPLV 1-R로 이루어진 세트, SwPLV 2-F와 SwPLV 2-R로 이루어진 세트만이 SwPLV와 뚜렷한 반응을 한 반면에, 나머지 2종의 프라이머는 다른 바이러스와 비특이 반응을 보였으며, 반응 결과 다소 차이가 있어 진단용 특이 프라이머로 선발하기엔 적합하지 않았다(도 3).
<1-4> SPLCV 진단용 프라이머 선별
SPLCV는 IYVV와 동일한 바이러스 보고되어 있으며, 세계적으로 SPLCV와 IYVV 모두 오직 3종의 계통에서만 전 염기서열이 분석되어 있기 때문에, 기존에 보고된 바이러스의 전 영역의 염기서열 분석 및 특이 프라이머를 구축할 목적으로 프라이머를 설계하였다. 각각 SPLCV와 IYVV에 보고된 전 염기서열을 대상으로 모두 12종으로 프라이머를 설계하였다. 설계한 12쌍 프라이머로 SPLCV 및 IYVV 에 감염된 샘플을 RT-PCR 검정한 결과, [도 4]에서 확인할 수 잇듯이, lane 3, 7, 10에 적용한 3개의 프라이머 쌍은 SPLCV 및 IYVV에 대해 특이성이 없었다. 나머지 9개의 프라이머 쌍 중에서 전 염기서열 분석 및 특이 진단용 프라이머 쌍은 모두 6개를 선발하였는데, 이 6종의 프라이머 쌍을 하기 [표 6]에 기재하였다.
SPLCV 진단용 프라이머 설계
Primer name locus sequence expected size 서열번호
SPLCV 2-F 1970-1987 5' TGTGAGGGCCCAAAGACC 3'(18-mer) 401bp 31
SPLCV 2-R 2371-2352 5' TCGATAAGGACGGGGATACC 3'(20-mer) 32
SPLCV 3-F 1496-1513 5' TCCCCTGTGCGTGAATCC 3' (18-mer) 505bp 33
SPLCV 3-R 2001-1981 5' AACAGTATGGGCCAGGTCTTT 3'(21-mer) 34
SPLCV 5-F 631-650 5' ATGGGTATAGATGGGAAGGT 3' (20-mer) 424bp 35
SPLCV 5-R 1055-1036 5' TGCGAATCATAGAAATAAGC 3' (20-mer) 36
SPLCV 6-F 146-168 5' GGACCCTTTGCAGAACCCACTAC 3' (23mer) 574bp 37
SPLCV 6-R 720-699 5' TCTGTCACGAATCAACCAATAC 3' (22-mer) 38
IYVV 1-F 2315-2335 5' TCTGCCGTCGATCTGGAACTC 3'(21-mer) 506bp 1
IYVV 1-R 2821-2803 5' GTGCCCGCCTTTGGTGGAC 3'(19-mer) 2
IYVV 4-F 1232-1254 5' TTAAGGCGTTGCAAAATACCAGT 3'(23-mer) 501bp 39
IYVV 4-R 1733-1716 5' TAGATAAACCAGAGCAAGGAGCA 3'(23-mer) 40
<실시예 2>
고구마 발생 4종 바이러스에 대한 다중 진단법 개발
RT-PCR 산물의 크기에 따라 바이러스를 분류하여야 하기 때문에 검출 크기를 고려하여 하기 [표 7]과 같이 SPFMV, SPGV, SwPLV, SPLCV 진단용 프라이머를 선발하였다.
고구마 바이러스 다중진단용 프라이머
Virus Primer name Sequence (5`→3`) Loci Product size 서열번호
SPLCV IYVV 1-F TCTGCCGTCGATCTGGAACTC 2315-2335 506bp 1
IYVV 1-R GTGCCCGCCTTTGGTGGAC 2821-2803 2
SPFMV SPFMV 1-F TACACACTGCTAAAACTAGG 9073-9092 355bp 3
SPFMV 1-R AGTTCATCATAACCCCATGA 9428-9409 4
SPGV SPGV 3-F CAATGCCAAATGGAAGAATAG 1061-1081 285bp 5
SPGV 3-R GCATGATCCAATAGAGGTTTTA 1346-1325 6
SwPLV SwPLV 1-F GGAGTCAGTTCAATCAATGGTA 335-356 183bp 7
SwPLV 1-R AGTGGCTTTATTGGGTATGAT 518-498 8
상기 선발된 프라이머 쌍들을 이용하여 단독감염, 2종 복합감염, 3종 복합감염, 4종 복합감염 이병주에 대해 RT-PCR 진단을 실시하였다.
고구마 시료는 병징이 있는 잎의 잎자루 및 하단 줄기 표피를 액체질소로 마쇄한 뒤, 바이러스 게놈 추출 키트(Intron, Viral gene-spin kit)를 이용하여 전체 게놈을 추출하였다. 역전사(RT)과정으로, 게놈 주형 1 마이크로리터, 3'-프라이머 각각 32 pmol 혼합물 0.5 마이크로리터, 2.5mM dNTPs 0.5 마이크로리터, 10mg/ml BSA 0.1 마이크로리터, 40U/ul RNase inhibitor 0.2 마이크로리터, 5x RT buffer, AMV 역전사 효소를 넣어 최종 5 마이크로리터 반응액으로 42 ℃에서 30분 반응한다. 이 과정에서 만들어진 cDNA를 이용하여, 5'-프라이머 각각 32 pmol 혼합액 0.5 마이크로리터, 10mg/ml BSA 0.1 마이크로리터, 2.5 mM dNTPs 1.5 마이크로리터, 25mM MgCl2 2.5ul, 5X PCR buffer, Taq polymerase를 넣어 최종 25 마이크로리터 반응액을 만들어 PCR를 수행하는데, DNA 초기 변성 과정으로 94 ℃ 3분, [DNA 변성을 위해 94 ℃ 30초, 프라이머 바인딩(annealing)을 위해 50 ℃ 30초, DNA 사슬 신장을 위해 72 ℃ 1분]을 35회 반복한 후, 최종적으로 DNA 사슬 신장을 위해 72 ℃ 10분의 PCR 반응 조건으로 하여 SPFMV, SPGV, SwPLV 및 SPLCV서열을 증폭한 산물을 1% 아가로스겔, 100mV, 1시간 30분 전기영동하여 확인하였다.
그 결과는 [도 5]에서 확인할 수 있다. 단독감염 및 복합 감염 모두에서 정확한 반응을 나타냈으며, 증폭 서열의 크기도 뚜렷한 차이를 나타내어서 밴드의 위치만 확인하여도 어떤 종의 바이러스가 감염되어 있는지 쉽게 확인할 수 있었다.
상기 RT-PCR산물의 염기서열 분석결과, NCBI에 등록된 염기서열과 98~99%의 상동성을 보였다(표 8).
다중 진단용 프라이머를 이용한 증폭산물의 염기서열 분석결과
대상
바이러스		 프라이머 산물크기 염기서열 비교대상
/상동성
SwPLV SwPLV 1-F
&
SPLV 1R		 185bp GGAGTCAGTTCAAATCAATGGTATGAGGGCGTGAAGAGTGCTTACGAAGTGGATGACCAGCAGATGTCAATCCTAATGAATGGACTTGTTGTATGGTGTATAGAGAATGGGACTTCTCCAAATATCAATGGTGATTGGGTGATGATGGACGGAGACACGCAAGTATCATACCCAATAAAGCCACT HQ844144
/ 98%
SPGV SPGV 3-F
&
SPGV 3-R
 286bp CAATGCCAAATGGAAGAATAGTAGTCAATCTTGACCACTTGACAATCTATGACCCTGAACAAACAAGTCTTTCAAATACTCGAGCAACACAGGAACAATTTAATGCTTGGTACGAGGGTGTCAGGGAAGATTATGGAGTGAATGATGAGCAAATGGGGATATTGCTCAATGGGTTAATGGTTTGGTGTATCGAGAATGGAACATCCCCGAATATTAATGGAATGTGGGTCATGATGGATGGTGATGAACAAGTTACATATCCAATAAAACCTCTATTGGATCATGC JQ073704
/ 99%
SPFMV SPFMV 1-F
&
SPFMV 1-R		 356bp TACACACTGCTAAAACTAGGTATTCAGGAGAGCGAGTTTGATGAATGCTGTGTCTTCTTCGCGAATGGAGATGATCTATTACTGGCAATGAGGCCAGACACAGCTCATTTACTGGATAAGTTTAGTGAGTGCTTTTCAGAGTTAGGACTCAATTATGATTTTTCATCGCGAACCAGTAATAAAGAAGAGCTATGGTTTATGTCACACTGCGGAGTGAAACGTGATGGAATATTCATACCGAAGCTGGAGCCTGAGAGAATTGTTTCCATTCTTGAATGGGATCGCTCACACGAACCTATCCATCGATTGGAAGCAATATGTGCTGCGATGGTAGAATCATGGGGTTATGATGAACT D86371
/ 98%
SPLCV IYVV 1-F
&
IYVV 1-R
 503bp TCTGCCGTCGATCTGGAACTCACCCCAGGTGATGGTATCCCCGTCCTTGTCAACGTAGGACTTGACATCGGACGAGGATTTAGCTCCCTGGATGTTGGGGTGAAAGTGATTCGATCTGTTCGGTGAGACCAGATCGAAGAATCTGCTATTTGTGCAGACGAATTTGCCTTCGAACTGCACCAGCACATGGAGGTGAGGTTCCCCATCCTCGTGCAGTTCTCTTGCTACGTGTATGTATTTTTTGTTGGTGGGTGTTTGGATATTTAGGAGTTGGGCTAGGCAGTCCTCTTTTGAGAGAGAACAGCGTGGATAAGTAATAAAATAATTTTTGGCCTGAATTTTAAAACGTTTTGGAGGAGCCATTTGGAGACACGCATAAGTTCAAATGAATTGGAGACTGGAGACAATATATAGTATGTCTCCAAATGGCATTCTGGTAATTTAGAAGATCCTTTTAGCTTTAATTCAAATTCCGACAACTCTGGGTCCACCAAAGGCGGGCA FJ969837
/ 99%
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 고구마 잎말림병 바이러스(Sweet potato leaf curl virus, SPLCV), 고구마 모틀 바이러스(Sweet potato feathery mottle virus, SPFMV), 고구마 G 바이러스(Sweet potato G virus, SPGV) 및 고구마 잠재 바이러스(Sweet potato latent virus, SwPLV)의 4종 바이러스를 각각 또는 동시에 진단할 수 있는 서열번호 1 내지 8로 표시되는 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법과 진단용 키트에 관한 것으로서, 국내 고구마에 발생하는 4종 바이러스(SPLCV, SPFMV, SPGV, SwPLV)를 한번의 RT-PCR 반응으로 바이러스 각각에 대한 진단뿐만 아니라 4종 바이러스에 대한 모든 조합의 복합감염의 경우에도 특이적으로 진단이 가능하다. 이 동시진단법의 사용으로 비용과 시간을 줄이는 경제성이 있으며, 고구마 바이러스 무병주 생산 개발에 효과적이어서 산업상 이용가능성이 크다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Primer set for detecting viruses in sweet potato and method for detecting simultaneously said viruses using the same <130> NP12-0003 <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 1-F, Forward primer for SPLCV <400> 1 tctgccgtcg atctggaact c 21 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 1-R, Reverse primer for SPLCV <400> 2 gtgcccgcct ttggtggac 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV1-F, Forward primer for SPFMV <400> 3 tacacactgc taaaactagg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 1-R, Reverseprimer for SPFMV <400> 4 agttcatcat aaccccatga 20 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 3-F, Forward primer for SPGV <400> 5 caatgccaaa tggaagaata g 21 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 3-R, Reverse primer for SPGV <400> 6 gcatgatcca atagaggttt ta 22 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 1-F, Forward primer for SwPLV <400> 7 ggagtcagtt caatcaatgg ta 22 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 1-R, Reverse primer for SwPLV <400> 8 agtggcttta ttgggtatga t 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 2-F, Forward primer for SPFMV <400> 9 ggaccaagcc ccatacaat 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 2-R, Reverse primer for SPFMV <400> 10 ggaatggttg cgggttgc 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 3-F, Forward primer for SPFMV <400> 11 gagctaagca acccgcaacc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 3-R, Reverse primer for SPFMV <400> 12 tcatatgttg acaagagttg 20 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 4-F, Forward primer for SPFMV <400> 13 tgaatggatt aatggtttgg tg 22 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 4-R, Reverse primer for SPFMV <400> 14 gcatatcgcg caagactca 19 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 5-F, Forward primer for SPFMV <400> 15 cgatatgcat ttgatttcta cg 22 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPFMV 5-R, Reverse primer for SPFMV <400> 16 ttaaaggcat actaaagata a 21 <210> 17 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 1-F, Forward primer for SPGV <400> 17 tggcgcatca aggaaaag 18 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 1-R, Reverse primer for SPGV <400> 18 acctggtggt aatggtcc 18 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 2-F, Forward primer for SPGV <400> 19 gaaattccgc agccagagtc ac 22 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 2-R, Reverse primer for SPGV <400> 20 tccaaccgta ccagcattca ca 22 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 4-F, Forward primer for SPGV <400> 21 gcgcaatagg atcaaggcat ac 22 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 4-R, Reverse primer for SPGV <400> 22 acactgaagg cgaaactgaa at 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 5-F, Forward primer for SPGV <400> 23 caaatgaaag cagcagcact 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPGV 5-R, Reverse primer for SPGV <400> 24 atcacgaacc aaaaaggctt 20 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 2-F, Forward primer for SwPLV <400> 25 gggtgatgat ggacggagac a 21 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 2-R, Reverse primer for SwPLV <400> 26 ccgatgatgt gtatttgtga gc 22 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 3-F, Forward primer for SwPLV <400> 27 acacatcatc ggctgttcgg t 21 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV 3-R, Reverse primer for SwPLV <400> 28 gtgtgtggta taagacaaaa a 21 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV-u1, Forward primer for SwPLV <400> 29 tggaaaagtg gaaacgaaga agaa 24 <210> 30 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SwPLV-d1, Reverse primer for SwPLV <400> 30 gaaatgttgg tgctgcgaaa tc 22 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 2-F, Forward primer for SPLCV <400> 31 tgtgagggcc caaagacc 18 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 2-R, Reverse primer for SPLCV <400> 32 tcgataagga cggggatacc 20 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 3-F, Forward primer for SPLCV <400> 33 tcccctgtgc gtgaatcc 18 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 3-R, Reverse primer for SPLCV <400> 34 aacagtatgg gccaggtctt t 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 5-F, Forward primer for SPLCV <400> 35 atgggtatag atgggaaggt 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 5-R, Reverse primer for SPLCV <400> 36 tgcgaatcat agaaataagc 20 <210> 37 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 6-F, Forward primer for SPLCV <400> 37 ggaccctttg cagaacccac tac 23 <210> 38 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SPLCV 6-R, Reverse primer for SPLCV <400> 38 tctgtcacga atcaaccaat ac 22 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 4-F, Forward primer for SPLCV <400> 39 ttaaggcgtt gcaaaatacc agt 23 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IYVV 4-R, Reverse primer for SPLCV <400> 40 tagataaacc agagcaagga gca 23

Claims (5)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. (a) 시료의 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a)단계의 RNA를 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 PCR 조성물을 이용하여 RT-PCR을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 (b)단계의 RT-PCR 산물을 크기별로 분리하여 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 고구마잎말림바이러스(SPLCV), 고구마모틀바이러스(SPFMV), 고구마G바이러스(SPGV) 및 고구마잠재바이러스(SwPLV) 로 이루어지는 4종의 바이러스 감염 동시 진단 방법.
  4. 서열번호 1 및 2의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 3 및 4의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍, 서열번호 5 및 6의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍 및 서열번호 7 및 8의 염기서열로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 고구마잎말림바이러스(SPLCV), 고구마모틀바이러스(SPFMV), 고구마G바이러스(SPGV) 및 고구마잠재바이러스(SwPLV)로 이루어지는 4종의 바이러스 감염 동시 진단용 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 포함하는 키트.
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