JP2007282512A - セルフアニーリング形成を阻害する方法およびその用途 - Google Patents

セルフアニーリング形成を阻害する方法およびその用途 Download PDF

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Abstract

【課題】セルフアニーリング形成を阻害する方法を提供する。
【解決手段】前記セルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、前記セルフアニーリングを形成する相補配列のいずれか一方にハイブリダイズする阻害用ポリヌクレオチドを含むセルフアニーリング形成阻害剤を、セルフアニーリングを形成する二本鎖ＤＮＡを含有する試料に添し、加熱により前記二本鎖ＤＮＡを解離させる。ついで、前記解離した一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる。本発明のセルフアニーリング形成阻害方法は、例えば、ＨＢＶのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングの形成を阻害できる。
【選択図】図１

Description

本発明は、セルフアニーリング形成を阻害する方法であって、特に、Ｂ型肝炎ウイルスｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成を阻害する方法およびそれに用いる阻害剤並びにその用途に関する。
Ｂ型肝炎ウイルス（以下、「ＨＢＶ」ともいう）の感染症には、急性肝炎、劇症肝炎等の様々な病態があり、その病態の診断は、通常、ＨＢＶの増殖や活動性の指標となるＨＢｅ抗原およびその抗体等の測定により行われている。
しかしながら、ＨＢｅ抗原が陰性化し、且つ、ＨＢｅ抗体が陽性化したにも関わらず、ウイルスが高い活動状態にある症例や、再度ＨＢｅ抗原が出現する症例等が報告されており、前述の抗原−抗体検査方法では、必ずしも肝炎の病態を把握できないことがあった。
ＨＢｅ抗体陽性期のＢ型肝炎ウイルスには、ｐｒｅＣ領域における第１８９６番目および第１８９９番目の塩基Ｇに点突然変異（ＳＮＰ）が生じる場合があることが明らかになっている。このうち１８９６番目の塩基ＧがＡに変異すると、これを含むコドンがストップコドンに変化するため、ＨＢｅ抗原を産生しなくなる。この知見から、これらの点変異が、ＨＢｅ抗原が陰性化する原因と推測され、点突然変異の検出がＢ型肝炎の病態把握や予後の推定に有用であると考えられている。
このようなｐｒｅＣ領域の点突然変異の検出は、通常、ＰＣＲ−ＥＬＭＡ法やＰＣＲ−ＲＦＬＰ法により行われているが、これらの方法は、操作が煩雑であり、また、再現性にも問題がある。そこで、予め増幅したＤＮＡを鋳型とし、標識化したプライマーによりＤＮＡ合成を行った後、その合成したＤＮＡをイムノクロマトグラフ等の分析方法により検出する方法が提案されている（例えば、特許文献１参照）。
しかし、この方法によっても、以下のような問題が生じている。すなわち、ＨＢＶの二本鎖ＤＮＡを解離すると、解離した一本鎖ＤＮＡのｐｒｅＣ領域において強固なセルフアニーリングが形成されるため、ｐｒｅＣ領域（特に、前述の点突然変異を含む領域）にプライマーがハイブリダイズしにくいという問題である。このため、前述のように、予めＤＮＡを増幅させるとしても、セルフアニーリングの形成が原因で、十分な増幅効率でＰＣＲを行うことが困難である。また、点突然変異の検出には、操作や検出の容易性から、点突然変異を生じる領域とプローブとのハイブリダイゼーションを利用する方法や、点突然変異に特異的なプライマーを用いるＡＳＰ−ＰＣＲ等が一般的であるが、前述のようにセルフアニーリングが生じるとプローブやプライマーが結合できず、これらの方法が利用し難いという問題がある。
このような問題は、ＨＢＶに限らず、その他のセルフアニーリング形成領域における配列を検出する場合等においても生じる。
特開２００５−８７１３４号公報
そこで、本発明は、セルフアニーリング形成を阻害する方法の提供、特に、ＨＢＶ ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成を阻害する方法およびそれに用いる阻害剤並びにその用途の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の阻害方法は、一本鎖ＤＮＡにおけるセルフアニーリング形成を阻害する方法であって、前記セルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、前記セルフアニーリングを形成する相補配列のいずれか一方にハイブリダイズする阻害用ポリヌクレオチドを含むセルフアニーリング形成阻害剤を、セルフアニーリングを形成する二本鎖ＤＮＡを含有する試料に添加する工程、加熱により前記二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、前記解離した一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする。
本発明のＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成阻害方法は、ＨＢＶ二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成を阻害する下記（ａ）または（ｂ）の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤を添加する工程、加熱により前記二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、前記解離した一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号２から４のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または数個の塩基が修飾され、または置換、付加若しくは欠失された塩基配列からなり、且つ、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明のＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成を阻害する阻害剤は、下記（ａ）または（ｂ）の阻害用ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号２から４のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または数個の塩基が修飾され、または置換、付加若しくは欠失された塩基配列からなり、且つ、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド。
本発明のハイブリダイズ方法は、ＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域における目的部位にプローブをハイブリダイズさせる方法であって、前記目的部位が、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基を含む部分配列であり、ＨＢＶ二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤とプローブとを添加する工程、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、前記解離した一本鎖ＤＮＡに、前記阻害用ポリヌクレオチドおよび前記プローブをそれぞれハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする。
本発明の増幅方法は、ＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域における目的部位を、プライマーを用いて増幅させる方法であって、前記目的部位が、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基を含む部分配列であり、ＨＢＶ二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤とプライマーとを添加する工程、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、前記解離した一本鎖ＤＮＡに、前記阻害用ポリヌクレオチドおよび前記プライマーをそれぞれハイブリダイズさせる工程、および、前記プライマーを用いて前記目的部位の配列を増幅させる工程を含むことを特徴とする。
本発明の検出方法は、Ｔｍ解析によりＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域における点突然変異を検出する方法であって、プローブとして、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用し、本発明のハイブリダイズ方法により、ＨＢＶ二本鎖ＤＮＡを解離し、解離した一本鎖ＤＮＡに前記標識化プローブおよび前記阻害用ポリヌクレオチドをそれぞれハイブリダイズさせる工程、前記一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する工程、シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程、および、前記Ｔｍ値から、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基における点突然変異の有無を決定する工程を含むことを特徴とする。
本発明のセルフアニーリング形成阻害方法よれば、前記阻害用ポリヌクレオチドが、セルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度でセルフアニーリング形成領域にハイブリダイズするため、前記セルフアニーリングの形成を阻害できる。このため、前記セルフアニーリング形成領域に検出目的の部位が存在する場合、そのような目的部位へのプライマーやプローブのハイブリダイズが困難であるという問題も解消される。このようにプライマーやプローブのハイブリダイズが容易になることから、例えば、ＰＣＲでの増幅効率の向上や、プローブの結合量が増加することによる分析精度や分析感度の向上も可能となる。
具体的には、本発明のセルフアニーリング形成阻害方法は、例えば、ＨＢＶのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングの形成を阻害できる。このため、従来の方法では、セルフアニーリングによって、ＨＢＶ感染症に特異的な点突然変異が生じるｐｒｅＣ領域へのプライマーやプローブのハイブリダイズが困難であったが、そのような問題も解消される。したがって、本発明は、例えば、ＨＢＶ感染症の診断等に極めて有効といえる。
本発明の阻害方法は、前述のとおり、一本鎖ＤＮＡにおけるセルフアニーリング形成を阻害する方法であって、前記セルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、前記セルフアニーリングを形成する相補配列のいずれか一方にハイブリダイズする阻害用ポリヌクレオチドを含むセルフアニーリング形成阻害剤を、セルフアニーリングを形成する二本鎖ＤＮＡを含有する試料に添加する工程、加熱により前記二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、前記解離した一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程を含むことを特徴とする。
本発明の阻害方法は、解離した一本鎖ＤＮＡがセルフアニーリングを形成する領域を含むものであればどのようなものにでも使用できる。前記セルフアニーリングを形成する領域としては、例えば、ＨＢＶのｐｒｅＣ領域、ｔＲＮＡのクローバーリーフ構造、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ゲノム上のパッケージングシグナル領域、枯草菌のＨｕｔオペロンのステムループ構造等があげられる。
以下に、ＨＢＶのｐｒｅＣ領域を例にあげて、本発明のセルフアニーリング形成阻害方法およびそれに用いる阻害剤並びにその用途について詳細に説明する。
本発明の阻害剤は、前述のように、ＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成を阻害する阻害剤であって、下記（ａ）または（ｂ）の阻害用ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする。
（ａ）配列番号２から４のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
（ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または数個の塩基が修飾され、または置換、付加若しくは欠失された塩基配列からなり、且つ、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド。
「セルフアニーリング」とは、同一ＤＮＡ分子中に相補配列がある場合、この配列が対合して二本鎖ＤＮＡを形成することを意味し、これによって、同一分子内にヘアピン構造やヘアピンループ構造等が形成される。
本発明の阻害剤を用いれば、後述のように、ＨＢＶの二本鎖ＤＮＡを熱変性により一本鎖ＤＮＡに解離した後、徐々に冷却しても、ｐｒｅＣ領域においてＨＢＶのセルフアニーリングが生じる前に、ＨＢＶの一本鎖ＤＮＡに前記阻害用ポリヌクレオチドがハイブリダイズする。このため、従来のようなＨＢＶ 一本鎖ＤＮＡのセルフアニーリング形成を阻害することができる。
前記（ｂ）の阻害用ポリヌクレオチドは、一本鎖に解離されたＨＢＶのＤＮＡがセルフアニーリングするよりも高い温度において、ＨＢＶの一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするものであればよい。前記（ｂ）の阻害用ポリヌクレオチドにおいて、置換、付加（または挿入）若しくは欠失される塩基の数は、特に制限されず、例えば、１個〜６個、好ましくは１個〜３個、より好ましくは１個である。また、修飾される塩基の数も、特に制限されず、例えば、１個〜２０個、好ましくは１個〜１０個、より好ましくは１個〜３個、さらにより好ましくは１個である。また、本発明における阻害用ポリヌクレオチドは、さらに、末端（例えば、３’末端）がさらにリン酸化されてもよい。
また、前記（ａ）および（ｂ）の阻害用ポリヌクレオチド配列の他に、例えば、以下のポリヌクレオチドがあげられる。
（ｃ）前記（ａ）の塩基配列と相補的な配列からなるポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件でハイブリダイズする塩基配列からなり、且つ、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングよりも高い温度で、ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド。
（ｄ）前記（ａ）の塩基配列との相同性が９０％以上の塩基配列からなり、且つ、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングよりも高い温度で、ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド。
前記ストリンジェントな条件とは、例えば、当該技術分野における標準の条件があげられるが、例えば、温度条件は、前記（ａ）の塩基配列のＴｍ値の±５℃が好ましく、より好ましくは±２℃、さらに好ましくは±１℃である。条件の具体例としては、５×ＳＳＣ溶液、１０×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、１００μｇ／ｍＬサケ精子ＤＮＡおよび１％ＳＤＳ中、６５℃でのハイブリダイゼーション、０．２×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳ中、６５℃、１０分の洗浄（２回）があげられる。また、相同性は、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７．５％以上である。
前述のように、本発明における阻害用ポリヌクレオチドは、前記（ａ）のポリヌクレオチドに限られず、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングよりも高い温度で、ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチドであればよい。すなわち、本発明の阻害用ポリヌクレオチドは、例えば、そのＴｍ値（Ｔｍ1）が、前記セルフアニーリングしたＨＢＶ一本鎖ＤＮＡのＴｍ値（Ｔｍ2）よりも高いものであればよい。Ｔｍ1とＴｍ2の差（Ｔｍ1−Ｔｍ2）は、特に制限されないが、好ましくは０〜５５℃である。具体例として、配列番号２〜４の塩基配列からなる阻害用ポリヌクレオチドのＴｍ値は、それぞれ、５７．７℃、５７．４℃、６２．１℃であり、前記セルフアニーリングしたＨＢＶ一本鎖ＤＮＡのＴｍ値（Ｔｍ2）は、４０．９〜５６．４℃である。なお、前記Ｔｍ値は、すべてＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエアにより算出したが、本発明においてＴｍ値は、例えば、隣接法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）によっても決定することができる。
阻害用ポリヌクレオチドのＴｍ値（Ｔｍ1）は、例えば、ポリヌクレオチドの長さによって調節できる。すなわち、ポリヌクレオチドの長さが相対的に長い程、Ｔｍ値が上昇するため、より高温でのハイブリダイズが可能となる。したがって、例えば、前記（ａ）に示す配列番号２〜４のポリヌクレオチドよりもさらに長いポリヌクレオチドを設計すれば、Ｔｍ1とＴｍ2の差（Ｔｍ1−Ｔｍ2）をより大きくすることができ、プローブとＨＢＶとのハイブリダイズの温度も、より高い温度に設定できる。なお、このようにポリヌクレオチドの長さを伸長する際には、さらに伸長する領域の塩基配列が、配列番号１の塩基配列と相補的になるように設計することが望ましい。
また、阻害用ポリヌクレオチドの塩基配列に含まれるＧＣ含量によっても、阻害用ポリヌクレオチドとＨＢＶ一本鎖ＤＮＡとのハイブリッド体のＴｍ値（Ｔｍ1）を調節できる。すなわち、阻害用ポリヌクレオチドに含まれるＧＣ含量が相対的に多い程、Ｔｍ値が上昇する。
本発明における前記阻害用ポリヌクレオチドは、配列番号１の塩基配列における第１８５５番目と第１８５８番目の塩基を含む部分配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドであることが好ましい。配列番号１は、ＨＢＶ ＤＮＡの全配列を示すものであり、第１８１４番目から第１９００番目の塩基配列がｐｒｅＣ領域に該当する。配列番号１における第１８５５番目および第１８５８番目の塩基は、それぞれ、ＨＢＶ 一本鎖ＤＮＡがｐｒｅＣ領域においてセルフアニーリングした際に、ＨＢＶに特異的な点変異を生じる第１８９９番目および第１８９６番目の塩基に対応する塩基である。つまり、本発明における阻害用ポリヌクレオチドが、第１８５５番目および第１８５８番目の塩基を含む部分配列にハイブリダイズすることにより、点変異を生じる第１８９６番目および第１８９９番目の塩基がセルフアニーリングすることを防止できる。このため、後述するように第１８９６番目および第１８９９番目の塩基における点変異を検出するために、例えば、プローブを結合させたり、プライマーを結合させて目的部位の増幅を行うことが可能となる。なお、本発明において、ＨＢＶ ＤＮＡの塩基配列は、配列番号１に示す塩基配列だけでなく、例えば、第１８９９番目および第１８９６番目の塩基Ｇの少なくとも一方がＡに変異している配列も含む。
具体例として、前記阻害用ポリヌクレオチドは、例えば、配列番号１の塩基配列における第１８３９番目から第１８７１番目の塩基配列にハイブリダイズするポリヌクレオチド、または、前記第１８３９番目から第１８７１番目の塩基配列の部分配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドがあげられる。すなわち、例えば、配列番号１の塩基配列における第１８３９番目から第１８７１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列、または、前記ポリヌクレオチドの部分配列と相補的な塩基配列からなる阻害用ポリヌクレオチドである。このような阻害用ポリヌクレオチドとしては、例えば、前記（ａ）に示す、前記配列番号２〜４の塩基配列からなる各ポリヌクレオチドがあげられ、それぞれ、配列番号１の塩基配列における、第１８３９番目から第１８７１番目、第１８３９番目から第１８６６番目、第１８４７番目から第１８７１番目の塩基配列からなる領域にハイブリダイズする。
つぎに、本発明のＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成阻害方法は、前述のとおり、ＨＢＶ二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤を添加する工程、加熱により前記二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、前記解離した一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程を含む。
本発明において、試料中の二本鎖ＤＮＡは、配列番号１に示す全配列からなる二本鎖ＤＮＡ（野生型）には限られない。この他に、例えば、ｐｒｅＣ領域を含む部分配列、ｐｒｅＣ領域からなる部分配列、ｐｒｅＣ領域の一部（特に、第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方）を含む部分配列、後述するようなＰＣＲ法によってＨＢＶ ＤＮＡから増幅させた部分配列であってもよい。また、配列番号１において、第１８９６番目および第１８９９番目の塩基Ｇの少なくとも一方がＡに変異しているもの（変異型）や、その部分配列も含まれる。なお、以下の方法（ハイブリダイズ方法等）におけるＨＢＶ 二本鎖ＤＮＡも同様である。
本発明において、前記試料は、前記ＨＢＶ二本鎖ＤＮＡを含むものであれば特に制限されず、例えば、血液、血漿、血清等の生体試料や、そこから調製された核酸やゲノムＤＮＡを含む試料があげられる。なお、生体試料の採取方法、採取部位、核酸やゲノムＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡの調製方法等は、特に制限されず、従来公知の方法が採用できる。
前記阻害用ポリヌクレオチドは、直接、二本鎖ＤＮＡを含む液体試料に添加してもよいし、溶媒中で前記阻害用ポリヌクレオチドと前記液体試料とを混合してもよい。前記溶媒としては、特に制限されず、例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ等の緩衝液、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＭｇＳＯ4、グリセロール等の従来公知の溶媒が挙げられる。前記試料に添加する本発明の阻害剤の量は、特に制限されず、試料中の二本鎖ＤＮＡの量等に応じて適宜決定できるが、例えば、二本鎖ＤＮＡ１モルに対して、阻害用ポリヌクレオチドを１モル以上添加することが好ましい。
前記解離工程における加熱温度は、前記二本鎖ＤＮＡが解離できる温度であれば特に制限されないが、例えば、８５〜９５℃である。加熱時間も特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
解離した一本鎖ＤＮＡと阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズは、例えば、前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。
本発明においては、ＨＢＶの一本鎖ＤＮＡがｐｒｅＣ領域においてセルフアニーリングを生じる前に、ＨＢＶの一本鎖ＤＮＡに前記阻害用ポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる必要がある。このため、前記ハイブリダイズ工程における加熱温度は、前記セルフアニーリングが生じる温度よりも高い温度に設定することが必要であるが、これは、本発明の阻害剤を使用することによって可能となる。その理由は、前述のように、本発明における阻害用ポリヌクレオチドのＴｍ値が、前記セルフアニーリングしたＨＢＶ一本鎖ＤＮＡのＴｍ値よりも高いからである。
前記加熱温度は、前述のように、前記セルフアニーリングが生じる温度よりも高い温度（もしくは、セルフアニーリングしたＨＢＶ一本鎖ＤＮＡのＴｍ値よりも高い温度）であればよく、例えば、４０〜９５℃の範囲であり、好ましくは４０〜８０℃の範囲である。前記加熱温度での加熱時間は、特に制限されないが、通常、１秒〜１０分であり、好ましくは１秒〜５分である。
つぎに、本発明のハイブリダイズ方法は、前述のように、前記目的部位が、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基を含む部分配列であり、ＨＢＶ 二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤とプローブとを添加する工程、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、前記解離した一本鎖ＤＮＡに、前記阻害用ポリヌクレオチドおよび前記プローブをそれぞれハイブリダイズさせる工程を含む。
前記目的部位は、例えば、第１８９６番目の塩基を含む部分配列、第１８９９番目の塩基を含む部分配列、第１８９６番目および第１８９９番目の双方の塩基を含む部分配列が好ましい。このような目的部位の具体例としては、特に制限されないが、配列番号１の塩基配列における第１８８７番目から第１９０８番目からなる塩基配列があげられる。なお、前記目的部位は、前記配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基ＧがＡに変異した配列も含む。なお、以下の方法（例えば、遺伝子増幅方法等）における目的部位も同様である。
前記プローブは、目的部位に応じて適宜設計できるが、例えば、第１８９６番目および第１８９９番目の塩基における点突然変異の検出がＨＢＶ感染症の検査に極めて重要であることから、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基を含む部分配列に相補的なポリヌクレオチドや、前記配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基ＧがＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド等があげられる。前記プローブの長さは、特に制限されないが、例えば、５〜１００ｍｅｒであり、好ましくは１０〜４５ｍｅｒであり、より好ましくは１５〜３０ｍｅｒである。前記プローブの具体例は、後述するが、それらには限定されず、その部分配列でもよいし、さらに末端を伸長させた配列であってもよい。伸長させる場合には、配列番号１の塩基配列と相補的になるように設計することが好ましい。
前記プローブは、標識化プローブが好ましく、具体例としては、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブや、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブ等があげられ、中でも、蛍光色素（蛍光団）で標識された標識化プローブであり、単独で蛍光を示し且つハイブリッド形成により蛍光が消光する消光プローブが好ましい。また、この蛍光強度の変化を示す標識化プローブにおいて、５’末端または３’末端の塩基がＣであり、前記末端塩基Ｃが標識化されていることが好ましい。前記蛍光色素としては、例えば、フルオレセイン、リン光体、ローダミン、ポリメチン色素誘導体等があげられ、市販の蛍光色素としては、例えば、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名、モレキュラー・プローブ社製）、ＦｌｕｏｒｅＰｒｉｍｅ（商品名、アマシャムファルマシア社製）、Ｆｌｕｏｒｅｄｉｔｅ（商品名、ミリポア社製）、ＦＡＭ（ＡＢＩ社製）、Ｃｙ３およびＣｙ５（アマシャムファルマシア社製）等が挙げられる。このようなプローブを使用すれば、シグナルの変動により、ハイブリダイズと解離とを容易に確認することができる。
前記試料への前記プローブの添加は、本発明の阻害方法における阻害剤（阻害用ポリヌクレオチド）の添加と同様にして行うことができる。前記プローブの添加順序は、特に制限されず、前記阻害用ポリヌクレオチドと同時に試料に添加してもよいし、前記阻害用ポリヌクレオチド添加の前後いずれに添加してもよい。前記試料に添加する前記阻害用ポリヌクレオチドおよび前記プローブの量は特に制限されず、試料中の二本鎖ＤＮＡの量等に応じて適宜決定できる。
前記解離工程は、前記本発明のセルフアニーリング形成阻害方法と同様に行うことができ、加熱温度および加熱時間も前述の通りである。
前記ハイブリダイズ工程は、特に制限されず、例えば、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。本発明においては、前述のように本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤によって、ＨＢＶ一本鎖ＤＮＡのセルフアニーリングよりも先に、ＨＢＶ一本鎖ＤＮＡへ前記阻害用ポリヌクレオチドがハイブリダイズする。このため、解離したＨＢＶ一本鎖ＤＮＡはセルフアニーリングすることなく、前記目的部位に前記プローブがハイブリダイズすることができる。前記加熱温度の降下方法は、特に制限されないが、例えば、プローブがハイブリダイズする温度（例えば、プローブのＴｍ値以下）にまで、徐々に温度を降下させてもよいし、加熱温度を、「セルフアニーリングのＴｍ値（Ｔｍ2）＜加熱温度＜阻害用ポリヌクレオチドのＴｍ値（Ｔｍ1）」の条件となるように降下させ、一定時間維持した後、さらに、プローブがハイブリダイズする温度にまで降下させてもよい。本発明のハイブリダイズ方法によれば、前記阻害用ポリヌクレオチドが、ＨＢＶ一本鎖ＤＮＡのセルフアニーリング形成温度よりも高い温度で、ＨＢＶ 一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするため、前記セルフアニーリングの形成温度よりも低い温度になっても、前記プローブが目的部位にハイブリダイズすることができる。
前者の場合、例えば０．１〜２０℃／秒の速度で、９４〜２０℃にまで温度を降下させ、前記温度で１秒〜１０分間、プローブのハイブリダイズ処理を行うことが好ましく、より好ましくは１〜５℃／秒の速度で、８０〜４０℃にまで温度を降下させ、前記温度で１秒〜６０秒間、プローブのハイブリダイズ処理を行う。後者の場合、例えば、まず９４〜５０℃の範囲に温度を降下させて１秒〜１０分間維持した後、さらに７０〜４０℃に降下して１秒〜１０分間、プローブのハイブリダイズ処理を行うことが好ましく、より好ましくは８０〜５０℃の範囲に温度を降下させて１秒〜６０秒間維持した後、さらに６０〜４０℃に降下して１秒〜６０秒間、プローブのハイブリダイズ処理を行う。なお、この温度設定等は、使用する阻害用ポリヌクレオチドの種類やプローブの種類によって適宜決定できる。
本発明のハイブリダイズ方法は、例えば、サザンブロット、ＤＮＡアレイ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＤＮＡチップ、Ｉｎｖａｄｅｒ（商標、Ｔｈｉｒｄ Ｗａｖｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）法等の従来公知のハイブリダイゼーションを利用した遺伝子検出技術に利用できる。
なお、本発明のハイブリダイズ方法は、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤を使用して、ＨＢＶのセルフアニーリング形成を阻害することが特徴であり、具体的なプローブの配列や、プローブの組合せ等は何ら制限されず、当業者であれば適宜決定できる（以下、同様）。
つぎに、本発明の遺伝子増幅方法は、前述のとおり、ＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域における目的部位を、プライマーを用いて増幅させる方法であって、前記目的部位が、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基を含む部分配列であり、ＨＢＶ二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤とプライマーとを添加する工程、加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、前記解離した一本鎖ＤＮＡに、前記阻害用ポリヌクレオチドおよび前記プライマーをそれぞれハイブリダイズさせる工程、および、前記プライマーを用いて前記目的部位の配列を増幅させる工程を含むことを特徴とする。
前記プライマーは、前記目的部位を増幅可能であれば特に制限されず、前記目的部位の塩基配列に応じて設計できる。プライマーの長さは、特に制限されず、一般的な長さ（例えば、１０〜３０ｍｅｒ）に設定できる。目的部位がｐｒｅＣ領域を含む場合、例えば、配列番号５の塩基配列からなるポリヌクレオチド（センスプライマー）、配列番号６の塩基配列からなるポリヌクレオチド（アンチセンスプライマー）等が使用できる。また、前記目的部位は、例えば、前記本発明のハイブリダイズ方法と同様である。
前記試料へのプライマーの添加は、本発明の阻害方法における阻害剤（阻害用ポリヌクレオチド）の添加と同様にして行うことができる。前記プライマーの添加順序は、特に制限されず、前記阻害用ポリヌクレオチドと同時に試料に添加してもよいし、前記阻害用ポリヌクレオチド添加の前後いずれに添加してもよい。前記試料に添加する前記阻害用ポリヌクレオチドおよび前記プライマーの量は特に制限されず、試料中の二本鎖ＤＮＡの量等に応じて適宜決定でき、例えば、二本鎖ＤＮＡと阻害用ポリヌクレオチドとプライマーとのモル比は、適宜決定できる。
前記解離工程は、前記本発明のセルフアニーリング形成阻害方法と同様に行うことができ、加熱温度および加熱時間も前述の通りである。
前記ハイブリダイズ工程は、特に制限されず、例えば、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって行うことができる。本発明においては、前述のように本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤によって、ＨＢＶ一本鎖ＤＮＡのセルフアニーリングよりも先に、ＨＢＶ一本鎖ＤＮＡへ前記阻害用ポリヌクレオチドがハイブリダイズする。このため、解離したＨＢＶ一本鎖ＤＮＡはセルフアニーリングすることなく、前記目的部位に前記プライマーがハイブリダイズすることができる。前記加熱温度の降下方法は、特に制限されないが、例えば、プライマーがハイブリダイズする温度（例えば、プライマーのＴｍ値以下）にまで、徐々に温度を降下させてもよいし、加熱温度を、「セルフアニーリングのＴｍ値（Ｔｍ2）＜加熱温度＜阻害用ポリヌクレオチドのＴｍ値（Ｔｍ1）」の条件となるように降下させ、一定時間維持した後、さらに、プライマーがハイブリダイズする温度にまで降下させてもよい。本発明によれば、前記阻害用ポリヌクレオチドが、ＨＢＶ一本鎖ＤＮＡのセルフアニーリング形成温度よりも高い温度で、ＨＢＶ 一本鎖ＤＮＡにハイブリダイズするため、前記セルフアニーリングの形成温度よりも低い温度になっても、前記プライマーが目的部位にハイブリダイズすることができる。
前者の場合、例えば、０．１〜２０℃／秒の速度で、９４〜２０℃にまで温度を降下させ、前記温度で１秒〜１０分間、プライマーのハイブリダイズ処理を行うことが好ましく、より好ましくは、１〜５℃／秒の速度で、８０〜４０℃にまで温度を降下させ、前記温度で１秒〜６０秒間、プライマーのハイブリダイズ処理を行う。後者の場合、例えば、まず９４〜５０℃の範囲に温度を降下させて１秒〜１０分間維持した後、さらに７０〜４０℃に降下して１秒〜１０分間、プライマーのハイブリダイズ処理を行うことが好ましく、より好ましくは８０〜５０℃の範囲に温度を降下させて１秒〜６０秒間維持した後、さらに６０〜４０℃に降下して１秒〜６０秒間、プライマーのハイブリダイズ処理を行う。なお、この温度設定等は、使用する阻害用ポリヌクレオチドの種類やプライマーの種類によって適宜決定できる。
本発明における増幅工程は、従来公知のＰＣＲ方法により行うことができ、中でも、目的部位の増幅と多型解析等を同時に行うことができるため、定量的遺伝子増幅方法が好ましい。前記定量的遺伝子増幅方法としては、例えば、リアルタイムＰＣＲ法、ＴａｑＭａｎ法（商標、Applied Biosystems社）、ＲＦＬＰ−ＰＣＲ法（Restriction Fragment Length Polymorphisms-PCR）、ＬＡＴＥ−ＰＣＲ法（Linear-After-The-Exponential-PCR; Sanchez et al. (2004) PNAS, 101(7); 1933-1938）、アレル特異的プライマーＰＣＲ法（Allele Specific Primer PCR：ASP PCR）、シングルヌクレオチドプライマー伸長反応等があげられる。前記リアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、標的遺伝子をＰＣＲで増幅し、リアルタイムモニタリング用試薬を用いて増幅産物の生成過程をリアルタイムでモニタリングし、解析する方法があげられる。前記リアルタイムモニタリング試薬としては、例えば、ＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（登録商標；Molecular Probes社）、ＴａｑＭａｎプローブ（登録商標：Applied Biosystems社）、サイクリングプローブ、モレキュラービーコンプローブ等が挙げられる。特に、前記ＡＳＰ−ＰＣＲは、ＳＮＰ特異的なプライマーを用いたＰＣＲ法であるため、本発明は、セルフアニーリングが生じるｐｒｅＣ領域にプライマーを結合させるＡＳＰ−ＰＣＲに極めて有用といえる。
つぎに、本発明の点突然変異検出方法は、前述のように、Ｔｍ解析によりＨＢＶ ＤＮＡのｐｒｅＣ領域における点突然変異を検出する方法であって、プローブとして、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用し、本発明のハイブリダイズ方法により、ＨＢＶ二本鎖ＤＮＡを解離し、解離した一本鎖ＤＮＡに前記標識化プローブおよび前記阻害用ポリヌクレオチドをそれぞれハイブリダイズさせる工程、前記一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する工程、シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程、および、前記Ｔｍ値から、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基における点突然変異の有無を決定する工程を含むことを特徴とする。なお、特に示さない限り、ハイブリダイズ工程は、前述と同様である。
前記プローブとしては、例えば、標識化された下記（１）および（２）の少なくとも一方のポリヌクレオチドからなるプローブがあげられる。
（１）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の塩基の少なくとも一方を含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド。
（２）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基ＧがＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド。
前記点突然変異の有無は、例えば、前記ハイブリダイズ工程において、二種類以上のプローブを使用してそれぞれハイブリダイズを行い、各プローブを使用した際の各Ｔｍ値を決定し、Ｔｍ値の高低およびＴｍ値の差から決定することが好ましい。
二種類以上のプローブを使用する場合、下記（１）と（２）のプローブを組み合わせて使用することが好ましい。前記（１）のプローブと（２）のプローブの組合せとしては、例えば、下記ｘ１およびｘ２の組合せ、ｙ１およびｙ２の組合せ、ｚ１およびｚ２の組合せ等があげられる。また、ｘ２およびｚ２の組合せ、ｙ２およびｚ２の組合せ等でもよい。
（ｘ１）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目の塩基Ｇを含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド
（ｘ２）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目の塩基がＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド
（ｙ１）配列番号１の塩基配列における第１８９９番目の塩基Ｇを含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド
（ｙ２）配列番号１の塩基配列における第１８９９番目の塩基がＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド
（ｚ１）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の塩基Ｇを含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド。
（ｚ２）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の塩基ＧがＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド
前記ｘ１、ｙ１およびｚ１の具体例としては、以下のものがあげられ、下記配列においてｔはｕでもよい。
配列番号９： 5'- atgtccatgCccCaaagccacc
前記ｘ２の具体例としては、
配列番号１０： 5'- atgtccatgCccTaaagccacc
前記ｙ２の具体例としては、
配列番号１１： 5'- atgtccatgTccCaaagccacc
前記ｚ２の具体例としては、
配列番号７： 5'- atgtccatgTccTaaagccacc
具体例として、一方のプローブが配列番号１の部分配列と完全に相補的なポリヌクレオチドであり、他方のプローブが配列番号１における第１８９６番目の塩基ＧがＡに変異した部分配列と完全に相補的なポリヌクレオチドとした場合について説明する。この場合、測定対象の二本鎖ＤＮＡに点突然変異が存在しなければ（野生型）、解離した一本鎖ＤＮＡと前者のプローブとは、完全一致（Perfect Match）でハイブリッドを形成し、解離した一本鎖ＤＮＡと後者のプローブとは、一塩基が異なる状態（Miss Match）でハイブリッドを形成する。他方、前記二本鎖ＤＮＡが第１８９６番目の塩基に点突然変異が生じている場合（Ｇ→Ａ：変異型）、前記一本鎖ＤＮＡと前者のプローブとはミスマッチを生じ、前記一本鎖ＤＮＡと後者のプローブとは、完全一致となる。そして、完全一致のハイブリッド体とミスマッチのハイブリッド体では、完全一致の方がＴｍ値が高く、完全一致とミスマッチとでは、一塩基の違いでＴｍ値が約２〜８℃異なることが知られている。したがって、前者のプローブを使用した際のＴｍ値が高ければ、完全一致であるため、一本鎖ＤＮＡには点突然変異は無く野生型と判断できる。また、後者のプローブを使用した際のＴｍ値が高ければ、一本鎖ＤＮＡには第１８９６番目に点突然変異が存在し、変異型と判断できる。このように、前記二種類のプローブを使用すれば、それぞれのＴｍ値を測定し、いずれのＴｍ値が高い値であるか、また、両方のＴｍ値の差を求めることによって、点突然変異の有無を決定できる。このように、二種類以上のプローブを用いることで、より高い精度で点突然変異の有無を決定できる。なお、完全一致と一塩基のミスマッチでは、Ｔｍ値が約２〜８℃異なり、二塩基のミスマッチでは、さらに異なると考えられる。
また、予め、点突然変異を有する二本鎖ＤＮＡ（変異型）と有さない二本鎖ＤＮＡ（野生型）ならびに各種プローブを用いて、それぞれのＴｍ値を測定しておき、これを評価基準とすることもできる。
下記表に、プローブの組合せによって検出できる点突然変異を例示するが、これには限定されない。なお、下記表において「Ｇ→Ａ」とは、分析対象遺伝子のＨＢＶ ＤＮＡにおいて、第１８９６番目および第１８９９番目の塩基ＧがＡに変異していることを示す。
Figure 2007282512
本発明の検出方法によれば、従来の方法では困難であったＴｍ解析によるミスマッチの検出が可能である。その理由は以下のとおりである。ミスマッチの場合、前述のように完全一致に比較してＴｍ値が低くなるが、Ｔｍ値が低くなるということは、完全一致と比較して、プローブと一本鎖ＤＮＡとの結合力が弱いということである。このため、プローブと一本鎖ＤＮＡとの結合が、一本鎖ＤＮＡ内での完全一致のセルフアニーリングに負けてしまう。したがって、従来方法では、プローブが一本鎖ＤＮＡと完全一致である場合のＴｍ値は測定できたとしても、ミスマッチのＴｍ値は、セルフアニーリング形成によって測定できなかったのである。しかし、本発明によれば、セルフアニーリングの問題が解消されているため、前述のような一塩基の違いをＴｍ値の測定によって検出することが可能となった。このため、従来の方法よりも極めて容易且つ確実に点突然変異の有無を決定することができる。
なお、本発明の検出方法は、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤を使用して、ＨＢＶのセルフアニーリング形成を阻害することが特徴であり、具体的なプローブの配列や、プローブの組合せ等は何ら制限されず、当業者であれば適宜決定できる。
前記シグナル変動の測定方法は、特に制限されず、標識の種類によって適宜決定でき、例えば、蛍光標識の場合には蛍光強度、発色標識の場合には吸光度、放射線標識の場合には、放射線量を測定すればよい。
つぎに、本発明の点突然変異検出方法の具体例として、グアニン消光プローブを用いた例をあげて説明するが、以下の方法には制限されない。
まず、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを用いてセルフアニーリングを阻害し、ＨＢＶ ＤＮＡを鋳型としてｐｒｅＣ領域を含む部分配列をＰＣＲ法により増幅させる。なお、使用する阻害用ポリヌクレオチドやプライマー、条件等は、前述の通りである。
つぎに、得られたＰＣＲ産物に、阻害用ポリヌクレオチドとグアニン消光プローブを添加して、ＰＣＲ産物（二本鎖ＤＮＡ）の解離と、前記阻害用ポリヌクレオチドおよびプローブのハイブリダイズを行う。グアニン消光プローブとは、プローブの末端シトシン塩基を蛍光色素で標識化したプローブであり、これが目的部位に結合することで蛍光色素とグアニン塩基が相互作用し、その結果、蛍光が消光するものである。なお、前記阻害用ポリヌクレオチドは新たに添加してもよいし、ＰＣＲ増幅の際に添加したものをそのまま利用してもよい。また、プローブは、ＰＣＲ増幅の際に予め添加しておいてもよい。
そして、得られた前記一本鎖ＤＮＡとプローブとのハイブリッド体を加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の変動を測定する。グアニン消光プローブを使用した場合、一本鎖ＤＮＡとのハイブリダイズした状態では、蛍光が消光し、解離した状態では、蛍光を発する。したがって、例えば、消光しているハイブリッド体を徐々に加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の増加を測定する。
蛍光強度の変動を測定する際の温度範囲は、特に制限されないが、例えば、開始温度が室温〜８５℃であり、好ましくは２５〜７０℃であり、終了温度は、例えば、４０〜１０５℃である。また、温度の上昇速度は、特に制限されないが、例えば、０．１〜２０℃／秒であり、好ましくは０．５〜５℃／秒である。
つぎに、前記蛍光強度の変動を解析してＴｍ値として決定する。具体的には、得られた蛍光強度から各温度における値（−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ）を算出し、最も低い値を示す温度をＴｍ値として決定できる。また、単位時間当たりの蛍光強度増加量（蛍光強度増加量／ｔ）が最も高い点をＴｍ値として決定することもできる。なお、プローブとして、消光プローブではなく、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示すプローブを使用した場合には、反対に、蛍光強度の減少量を測定すればよい。
前述のように、Ｔｍ値は、ミスマッチがある場合、完全一致と比較して低い値となる。このため、野生型遺伝子に対応したプローブまたは変異型遺伝子に対応したプローブを用いることによって、分析対象遺伝子を、Ｔｍ値の結果から、野生型遺伝子であるか変異型遺伝子であるかを決定できる。また、各温度における値（例えば、−ｄ蛍光強度増加量／ｄｔ、蛍光強度増加量／ｔ等）をプロットした際に、ピークが２点得られた場合には、分析対象遺伝子がヘテロタイプであることを示す。
そして、このＴｍ値から、例えば、前述のように使用したプローブの組合せ等に基づき、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基における点突然変異の有無を決定すればよい。
本発明は、前述のような点突然変異検出方法によりＨＢＶ感染症の診断や治療が可能であることから、さらに、本発明の点突然変異検出方法を利用したＨＢＶ感染症の診断方法ならびに治療方法を含む。
また、本発明のハイブリダイズ用キットは、本発明のポリヌクレオチドを含む阻害剤を含むことを特徴とする。このキットを用いれば、前述のように、ＨＢＶのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングを防止して、例えば、プローブやプライマーをＨＢＶ ＤＮＡに結合させることができる。本発明のキットは、前記阻害剤を含んでいればよく、他の構成は何ら制限されないが、例えば、プローブ、プライマー、試薬、内部標準試料および取扱説明書等を含んでいてもよい。前記プローブおよびプライマーは、前述のものがあげられ、前記試薬としては、例えば、ポリメラーゼ等の酵素、ヌクレオチド、標識化合物、バッファー等があげられる。
つぎに、本発明の実施例について、比較例と併せて説明する。ただし、本発明は下記の実施例および比較例により制限されない。
まず、商品名ＱＩＡａｍｐ(R) ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、ＨＢＶ Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社製：Ｎｕｍｂｅｒ１０２２２１３６）からＨＢＶ ＤＮＡを精製した。
つぎに、精製したＨＢＶ ＤＮＡ５μＬを下記表２の試薬２０μＬに添加し、ＰＣＲ反応によりｐｒｅＣ領域を含む領域（配列番号８：配列番号１における第１６７３番目から第１９５４番目に相当）を増幅した。ＰＣＲ反応は、商品名Ｍａｓｔｅｒ Ｃｙｃｌｅｒ（ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社製）を用い、５０℃２分間および９５℃２分間で処理した後、９５℃１０秒、５４℃１０秒および７２℃３０秒を１サイクルとし、５０サイクル繰り返した。なお、下記表３には、使用した阻害用ポリヌクレオチドの配列を示し、前記阻害用ポリヌクレチドの３’末端はリン酸化した。下記表４には、プライマーと消光プローブの配列を示す。前記消光プローブは、３’末端の塩基Ｃに蛍光色素ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（商標名）を付加したプローブであり、セルフアニーリングの形成領域にあたる配列番号１の塩基配列における第１８８７番目から第１９０８番目を目的部位として、これにハイブリダイズするように設計した。
Figure 2007282512
Figure 2007282512
Figure 2007282512
ついで、９５℃１０秒間および４５℃１秒間で処理し、ＰＣＲ産物の解離、および、解離した一本鎖ＤＮＡとプローブおよび阻害用ポリヌクレオチドとのハイブリダイズを行った。そして、一本鎖ＤＮＡとプローブとのハイブリッド体を加熱し、温度上昇に伴う蛍光強度の変化を測定した。前記測定は、商品名Ｓｍａｒｔ Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｃｅｐｈｅｉｄ製）を用いて、温度の上昇速度１℃／秒とし、４０℃〜９５℃の範囲を行った。そして、得られた蛍光強度から各温度における単位時間あたりの蛍光強度の変化量（−ｄ蛍光強度／ｄｔ）を算出し、蛍光強度の変動を示すグラフ（融解曲線）を作成した。各阻害用ポリヌクレオチドを使用した際のグラフを図１〜３に示す。図１が、Ｂ−ＰＣ−Ｒ２の結果（Ｔｍ値６３℃）であり、図２が、Ｂ−ＰＣ−Ｒ４の結果（Ｔｍ値６３℃）であり、図３が、Ｂ−ＰＣ−Ｒ５の結果（Ｔｍ値６３℃）である。
（比較例１）
阻害用ポリヌクレオチドに代えてｄＨ2Ｏとした以外は、実施例１と同様に測定を行った。得られた蛍光強度の変動のグラフ（融解曲線）を図４に示す。
図１〜３に示す実施例１は、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない図４の比較例１と比較して、阻害用ポリヌクレオチドの添加により曲線のピークが顕著となっている。すなわち、前記阻害用ポリヌクレオチドの添加によりセルフアニーリング形成が阻害され、その結果、セルフアニーリング形成領域に位置する目的部位にハイブリダイズするプローブの量を増加できたといえる。また、阻害用ポリヌクレオチドの長さが長い程、変化量のピークが顕著になったことから、より長い阻害用ポリヌクレオチドの使用により、より一層セルフアニーリング形成を阻害できるといえる。このように、本発明の阻害用ポリヌクレオチドを用いれば、Ｔｍ解析における精度・感度を向上できるため、ＨＢＶ感染症の診断に極めて有用といえる。
ＨＢＶ ＰｌａｓｍａとしてＮｕｍｂｅｒ９９９０２８２（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社製）、阻害用ポリヌクレオチドとして前記Ｂ−ＰＣ−Ｒ２のみを使用した以外は、前記実施例１と同様にしてＨＢＶ ＤＮＡの精製、ＰＣＲおよびＴｍ解析を行った。得られた蛍光強度の変動のグラフ（融解曲線）を図５（Ｔｍ値６７℃）に示す。
（比較例２）
ポリヌクレオチドに代えてｄＨ2Ｏとした以外は、実施例２と同様に測定を行った。得られ蛍光強度の変動のグラフ（融解曲線）を図６に示す。
図５に示す実施例２は、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない図６の比較例２と比較して、阻害用ポリヌクレオチドの添加により曲線のピークが顕著となっている。すなわち、前記阻害用ポリヌクレオチドの添加によりセルフアニーリング形成を阻害でき、その結果、セルフアニーリング形成領域に位置する目的部位にハイブリダイズするプローブの量を増加できたといえる。
実施例１および２のいずれの試料においても、阻害用ポリヌクレオチドを添加することにより、ＨＢＶのセルフアニーリング形成が阻害されるため、セルフアニーリング形成領域に位置する目的部位へのプローブのハイブリダイズが容易になり、プローブのハイブリダイズ量を増加できた。このように、本発明の阻害剤を用いれば、Ｔｍ解析における精度・感度を向上できるため、ＨＢＶ感染症の診断に極めて有用といえる。
まず、商品名ＱＩＡａｍｐ(R) ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、２００μＬのＨＢＶ Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社製：Ｎｕｍｂｅｒ９９９０２８２（実施例２と同様））からＨＢＶ ＤＮＡを精製した。なお、溶出は２０μＬのｄＨ2Ｏで行った。
つぎに、精製したＨＢＶ ＤＮＡ１μＬを下記表５の試薬２３．５μＬに添加し、ｐｒｅＣ領域を含む領域（配列番号１における第１６７３番目から第１８９５番目に相当）をＰＣＲにより増幅させつつリアルタイムで蛍光強度を測定した。ＰＣＲ反応は、商品名ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用いて、５０℃２分間および９５℃２分間で処理した後、９５℃１０秒、５４℃１０秒および７２℃３０秒を１サイクルとし、５０サイクル繰り返した。下記表６には、プライマーを示す。下記アンチセンスプライマーは、セルフアニーリングの形成領域を含む部分配列（配列番号１における第１８９６番目から第１９１１番目に相当）にハイブリダイズするように設計した。阻害用ポリヌクレオチドは、実施例１におけるＢ−ＰＣ−Ｒ５を使用した。
Figure 2007282512
Figure 2007282512
（比較例３）
前記阻害用ポリヌクレオチドに代えてｄＨ2Ｏとした以外は、実施例３と同様に測定を行った。
実施例３および比較例３における蛍光強度の変動のグラフを図７に示す。同図において、マーカー（三角）を付したグラフが実施例３の結果であり、マーカーなしのグラフが比較例３の結果である。同図に示すように、実施例３のＣｔ値（蛍光強度が１００となるときのサイクル数）は、２６．３であったのに対し、比較例３ではＣｔ値が３１．５であった。すなわち、阻害用ポリヌクレオチドの添加によりセルフアニーリング形成を阻害でき、その結果、セルフアニーリング形成領域に位置する目的部位にハイブリダイズするプライマーの量を増加できたといえる。この結果から、本発明の阻害剤を用いれば、ＰＣＲの増幅効率を改善できることがわかる。
まず、商品名ＱＩＡａｍｐ(R) ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて、１００μＬのＨＢＶ Ｐｌａｓｍａ（ＰｒｏＭｅｄＤｘ社製：Ｎｕｍｂｅｒ１０１５００３６）からＨＢＶ ＤＮＡを精製した。なお、溶出は２０μＬのｄＨ2Ｏで行った。
つぎに、精製したＨＢＶ ＤＮＡ１μＬを下記表６の試薬２４μＬに添加し、ｐｒｅＣ領域を含む領域（配列番号８：配列番号１における第１６７３番目から第１９５４番目に相当）をＰＣＲにより増幅させつつリアルタイムで蛍光強度を測定した。ＰＣＲ反応は、商品名ｉ−Ｃｙｃｌｅｒ（登録商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製）を用い、５０℃２分間および９５℃２分間で処理した後、９５℃１０秒、５４℃１０秒および６８℃１分を１サイクルとし、５０サイクル繰り返した。下記表８にプローブの配列を示す。前記プローブは、５’末端の塩基にＴＡＭＲＡ（tetramethylrhodamine）を付加し、３’末端の塩基に蛍光色素ＤＡＢＣＹＬ（商標名）を付加したプローブであり、セルフアニーリングの形成領域にあたる配列番号１の塩基配列における第１８８７番目から第１９０６番目を目的部位として、これにハイブリダイズするように設計した。なお、プライマーは実施例１と同様のものを使用し、阻害用ポリヌクレオチドは実施例１におけるＢ−ＰＣ−Ｒ２およびＢ−ＰＣ−Ｒ５を使用した。
Figure 2007282512
Figure 2007282512
（比較例４）
前記阻害用ポリヌクレオチドに代えてｄＨ2Ｏとした以外は、実施例４と同様に測定を行った。
実施例４および比較例４における蛍光強度の変動のグラフを図８に示す。同図において、マーカー（四角）を付したグラフが実施例４のＢ−ＰＣ−Ｒ２の結果（Ｃｔ値３２．４）であり、マーカー（三角）を付したグラフが実施例４のＢ−ＰＣ−Ｒ５の結果（Ｃｔ値２９．２）であり、マーカーなしのグラフが比較例４の結果（Ｃｔ値３７．７）である。前記阻害用ポリヌクレオチドの添加した実施例４は、阻害用ポリヌクレオチドを添加していない比較例４と比較してＣｔ値が低かった。すなわち、前記阻害用ポリヌクレオチドの添加によりセルフアニーリング形成が阻害され、その結果、セルフアニーリング形成領域に位置する目的部位にハイブリダイズするプローブの量を増加できたといえる。また、阻害用ポリヌクレオチドの長さが長い程、Ｃｔ値が低くなったことから、より長い阻害用ポリヌクレオチドを使用することで、より一層セルフアニーリング形成を阻害できるといえる。このように本発明の阻害剤を用いれば、遺伝子の検出精度・感度を向上できるため、例えば、感染症等の遺伝子診断等に有用である。
以上のように、本発明のセルフアニーリング形成阻害剤によれば、前記阻害用ポリヌクレオチドが、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、ＨＢＶ ＤＮＡにハイブリダイズすることができる。このため、従来の方法では、セルフアニーリングによって、ＨＢＶ感染症に特異的な点突然変異が生じるｐｒｅＣ領域へのプライマーやプローブのハイブリダイズが従来困難であったが、そのような問題も解消される。このようにプライマーやプローブのハイブリダイズが容易になることから、例えば、ＰＣＲでの増幅効率の向上や、プローブの結合量が増加することによる分析精度や分析感度の向上も可能となる。したがって、本発明は、例えば、ＨＢＶ感染症の診断等に極めて有効といえる。
図１は、本発明の一実施例において得られた蛍光強度の変動を示すグラフである。 図２は、本発明の前記実施例において得られたその他の蛍光強度の変動を示すグラフである。 図３は、本発明の前記実施例において得られたさらにその他の蛍光強度の変動を示すグラフである。 図４は、比較例１において得られた蛍光強度の変動を示すグラフである。 図５は、本発明のその他の実施例において得られた蛍光強度の変動を示すグラフである。 図６は、比較例２において得られた蛍光強度の変動を示すグラフである。 図７は、本発明のさらにその他の実施例および比較例３において得られた蛍光強度の変動を示すグラフである。 図８は、本発明のさらにその他の実施例および比較例４において得られた蛍光強度の変動を示すグラフである。
配列番号２ ポリヌクレオチド：Ｂ−ＰＣ−Ｒ２
配列番号３ ポリヌクレオチド：Ｂ−ＰＣ−Ｒ４
配列番号４ ポリヌクレオチド：Ｂ−ＰＣ−Ｒ５
配列番号５ プライマー：Ｂ−１６５３−Ｆ１
配列番号６ プライマー：Ｂ−ＢＣ１−Ｒ２
配列番号７ プローブ：３ＦＬ−ＰＣ−Ｒ１
配列番号９ プローブ
配列番号１０ プローブ
配列番号１１ プローブ
配列番号１２ プライマー：Ｂ−ＡＳＰ−Ｒ２ｍ
配列番号１３ プローブ：ＴＤ−ＰＣ−Ｗｉｌｄ−Ｔａｑｍａｎ

Claims (22)

  1. 一本鎖ＤＮＡにおけるセルフアニーリング形成を阻害する方法であって、
    前記セルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、前記セルフアニーリングを形成する相補配列のいずれか一方にハイブリダイズする阻害用ポリヌクレオチドを含むセルフアニーリング形成阻害剤を、セルフアニーリングを形成する二本鎖ＤＮＡを含有する試料に添加する工程、
    加熱により前記二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、
    前記解離した一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程を含むセルフアニーリング形成阻害方法。
  2. Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成を阻害する方法であって、
    ｐｒｅＣ領域を含むＢ型肝炎ウイルス二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成を阻害する下記（ａ）または（ｂ）の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤を添加する工程、
    加熱により前記二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、
    前記解離した一本鎖ＤＮＡと前記阻害用ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる工程を含むセルフアニーリング形成阻害方法。
    （ａ）配列番号２から４のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
    （ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または数個の塩基が修飾され、または置換、付加若しくは欠失された塩基配列からなり、且つ、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド。
  3. 前記解離工程の後、前記解離工程における加熱温度を降下させることによって、前記ハイブリダイズ工程において、前記解離した一本鎖ＤＮＡと阻害用ポリヌクレオチドとをハイブリダイズさせる、請求項２記載の阻害方法。
  4. 前記ハイブリダイズ工程における加熱温度が、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度である、請求項２または３記載の阻害方法。
  5. 前記ハイブリダイズ工程における加熱温度が、４０〜９５℃の範囲である、請求項２〜４のいずれか一項に記載の阻害方法。
  6. Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡのｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリング形成を阻害する阻害剤であって、
    下記（ａ）または（ｂ）の阻害用ポリヌクレオチドを含むことを特徴とする阻害剤。
    （ａ）配列番号２から４のいずれかの塩基配列からなるポリヌクレオチド。
    （ｂ）前記（ａ）の塩基配列において、１または数個の塩基が修飾され、または置換、付加若しくは欠失された塩基配列からなり、且つ、前記ｐｒｅＣ領域におけるセルフアニーリングを生じる温度よりも高い温度で、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡにハイブリダイズするポリヌクレオチド。
  7. 前記阻害用ポリヌクレオチドが、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡを示す配列番号１の塩基配列における第１８５５番目と第１８５８番目の塩基を含む部分配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドである、請求項６記載の阻害剤。
  8. 前記阻害用ポリヌクレオチドが、配列番号１の塩基配列における第１８３９番目から第１８７１番目の塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列、または、前記ポリヌクレオチドの部分配列と相補的な塩基配列からなる、請求項６または７記載の阻害剤。
  9. Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡのｐｒｅＣ領域における目的部位にプローブをハイブリダイズさせる方法であって、
    前記目的部位が、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基を含む部分配列であり、
    Ｂ型肝炎ウイルス二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、請求項６〜８のいずれか一項に記載の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤とプローブとを添加する工程、
    加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、および、
    前記解離した一本鎖ＤＮＡに、前記阻害用ポリヌクレオチドおよび前記プローブをそれぞれハイブリダイズさせる工程を含む、ハイブリダイズ方法。
  10. 前記目的部位が、前記配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基ＧがＡに変異している部分配列である、請求項９記載のハイブリダイズ方法。
  11. 前記プローブが、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基を含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド、または、前記配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基ＧがＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチドである、請求項９または１０記載のハイブリダイズ方法。
  12. 前記プローブが、配列番号７の塩基配列からなるポリヌクレオチドである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のハイブリダイズ方法。
  13. 前記プローブが、標識化プローブである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のハイブリダイズ方法。
  14. 前記プローブが、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブである、請求項１３記載のハイブリダイズ方法。
  15. 前記プローブが、蛍光色素で標識された標識化プローブであり、単独で蛍光を示し、且つ、ハイブリッド形成により蛍光が消光するプローブである、請求項１４記載のハイブリダイズ方法。
  16. 前記プローブにおいて、５’末端または３’末端の塩基がＣであり、前記末端塩基Ｃが標識化されている、請求項１５記載のハイブリダイズ方法。
  17. Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡのｐｒｅＣ領域における目的部位を、プライマーを用いて増幅させる方法であって、
    前記目的部位が、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基を含む部分配列であり、
    Ｂ型肝炎ウイルス二本鎖ＤＮＡを含有する試料に、請求項６〜８のいずれか一項に記載の阻害用ポリヌクレオチドを含む阻害剤とプライマーとを添加する工程、
    加熱により前記試料中の二本鎖ＤＮＡを解離させる工程、
    前記解離した一本鎖ＤＮＡに、前記阻害用ポリヌクレオチドおよび前記プライマーをそれぞれハイブリダイズさせる工程、および、
    前記プライマーを用いて前記目的部位の配列を増幅させる工程を含む増幅方法。
  18. 前記目的部位が、前記配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基ＧがＡに変異している部分配列である、請求項１７記載の増幅方法。
  19. Ｔｍ解析によりＢ型肝炎ウイルスＤＮＡのｐｒｅＣ領域における点突然変異を検出する方法であって、
    プローブとして、単独でシグナルを示し且つハイブリッド形成によりシグナルを示さない標識化プローブ、または、単独でシグナルを示さず且つハイブリッド形成によりシグナルを示す標識化プローブを使用し、
    請求項９〜１６のいずれか一項に記載のハイブリダイズ方法により、Ｂ型肝炎ウイルス二本鎖ＤＮＡを解離し、解離した一本鎖ＤＮＡに前記標識化プローブおよび前記阻害用ポリヌクレオチドをそれぞれハイブリダイズさせる工程、
    前記一本鎖ＤＮＡと前記プローブとのハイブリッド形成体を加熱し、温度上昇に伴うシグナルの変動を測定する工程、
    シグナルの変動を解析してＴｍ値を決定する工程、および、
    前記Ｔｍ値から、配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基における点突然変異の有無を決定する工程を含む検出方法。
  20. 前記プローブが、標識化された下記（１）および（２）の少なくとも一方のポリヌクレオチドからなるプローブである、請求項１９記載の検出方法。
    （１）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の塩基の少なくとも一方を含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド。
    （２）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の少なくとも一方の塩基ＧがＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド。
  21. 前記ハイブリダイズ工程において、二種類以上のプローブを用いてそれぞれハイブリダイズを行い、各プローブを使用した際のそれぞれのＴｍ値を決定し、Ｔｍ値の高低およびＴｍ値の差から点突然変異の有無を決定する、請求項１９または２０記載の検出方法。
  22. 前記プローブの組合せが、下記（ｘ１）および（ｘ２）の組合せ、（ｙ１）および（ｙ２）の組合せ、（ｚ１）および（ｚ２）の組合せ、（ｘ２）および（ｚ２）の組合せ、ならびに、（ｙ２）および（ｚ２）の組合せからなる群から選択された少なくとも一つの組合せである、請求項２０または２１記載の検出方法。
    （ｘ１）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目の塩基Ｇを含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド
    （ｘ２）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目の塩基ＧがＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド
    （ｙ１）配列番号１の塩基配列における第１８９９番目の塩基Ｇを含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド
    （ｙ２）配列番号１の塩基配列における第１８９９番目の塩基ＧがＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド
    （ｚ１）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の塩基Ｇを含む部分配列に相補的なポリヌクレオチド。
    （ｚ２）配列番号１の塩基配列における第１８９６番目および第１８９９番目の塩基ＧがＡに変異している部分配列に相補的なポリヌクレオチド

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