JPWO2009081965A1 - 融解曲線解析方法および融解曲線解析装置 - Google Patents

融解曲線解析方法および融解曲線解析装置 Download PDF

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Abstract

２つの温度範囲の少なくとも一方にピークが存在するか否かを自動解析可能な融解曲線解析方法を提供する。各温度におけるシグナル微分値から絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索し、前記（Ａ）を示す温度（ｔ１）が所定の温度範囲ＴＨおよびＴＬのいずれか一方（Ｔ１）に含まれる場合、前記（Ａ）を第１ピークとして決定する。さらに、絶対値が減少から増加に変化した最初のシグナル微分値(Ｃ)および前記(Ａ)に次いで絶対値が最も大きくなる最初のシグナル微分値(Ｄ)を検索する。Ｘ＝(Ａ−Ｃ)／(Ｄ−Ｃ)が[Ｘ＞所定閾値]を満たし且つ前記(Ｄ)の温度(ｔ２)が前記温度範囲(Ｔ２)に含まれる場合、前記シグナル微分値(Ｄ)を第２ピークとして決定する。前記Ｘが[Ｘ≦所定閾値]となる場合、温度範囲(Ｔ１)におけるシグナル微分値の積分値(Ｙ１)および前記温度範囲(Ｔ２)におけるシグナル微分値の積分値(Ｙ２)からＹ＝Ｙ１／Ｙ２を求め、[１≦Ｙ≦所定の閾値]を満たす場合、前記(Ｄ)を第２ピークとして決定する。

Description

本発明は、融解曲線解析方法、融解曲線解析システム、融解曲線解析装置、前記解析方法をコンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラムならびにそれを格納した電子媒体に関する。
近年、遺伝子の多型や変異等を検出する方法として、標的核酸とプローブとから形成される二本鎖核酸の融解曲線を解析する方法（融解曲線解析方法）が広く採用されている。前記融解曲線解析方法によれば、前記融解曲線について、前記二本鎖の融解温度（Ｔｍ：ｍｅｌｔｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）におけるピークの有無を解析することで、遺伝子の多型の判断や変異の有無の検出が可能になる。
Ｔｍは、一般的に、以下のように定義されている。二本鎖ＤＮＡを含む溶液を加熱していくと、２６０ｎｍにおける吸光度が上昇する。これは、二本鎖ＤＮＡにおける両鎖間の水素結合が加熱によってほどけ、一本鎖ＤＮＡに解離（ＤＮＡの融解）することが原因である。そして、全ての二本鎖ＤＮＡが解離して一本鎖ＤＮＡになると、その吸光度は加熱開始時の吸光度（二本鎖ＤＮＡのみの吸光度）の約１．５倍程度を示し、これによって融解が完了したと判断できる。この現象に基づき、融解温度Ｔｍ（℃）とは、一般に、吸光度が、吸光度全上昇分の５０％に達した時の温度と定義される。
二本鎖ＤＮＡのこのような特性を利用すれば、例えば、以下のようにして標的部位における多型や変異の検出が可能である。すなわち、まず、変異型の標的部位を含む標的核酸配列に対して相補的な変異型検出用プローブを用いて、分析対象の一本鎖核酸と前記プローブとの二本鎖核酸を形成させる。続いて、形成された二本鎖核酸に加熱処理を施し、温度上昇に伴う二本鎖核酸の解離を示す吸光度等のシグナルを検出する。そして、得られたシグナル値の挙動から、標的部位における変異の有無を判断する方法である（非特許文献１、特許文献１参照）。Ｔｍ値は、二本鎖核酸の相同性が高い程高く、相同性が低い程低くなる。そこで、変異型の標的部位を含む標的核酸配列とそれに１００％相補的な変異型検出用プローブとの二本鎖核酸、および、前記標的部位が野生型である核酸配列と前記変異型検出用プローブとの二本鎖核酸のそれぞれについて、予め評価基準となるＴｍ値を求めておく。前述のように相同性が高い程Ｔｍ値は高くなるため、前者、すなわち標的部位が変異型である場合のＴｍ値（以下、「Ｔｍｍ値」ともいう）は、相対的に高く、後者、すなわち標的部位が野生型である場合のＴｍ値（以下、「Ｔｍｗ値」）は、相対的に低くなる。そして、分析対象の一本鎖核酸と前記変異型検出用プローブとから形成される二本鎖核酸の融解曲線を作成し、予め求めたＴｍｍ値およびＴｍｗ値のいずれにシグナルのピークが存在するかを確認する。その結果、Ｔｍｍ値付近にピークが存在する場合、前記変異型検出用プローブと１００％マッチしているため、分析対象の一本鎖核酸は、変異型の多型であると判断できる。他方、Ｔｍｗ値付近にピークが存在する場合、前記変異型変異用プローブと１塩基ミスマッチしているため、分析対象の一本鎖核酸は、野生型の多型であると判断できる。
クリニカル・ケミストリー、２０００年、第４６巻、第５号、ｐ６３１‐６３５ 特開２００５−５８１０７号公報
しかしながら、従来の方法では、以下のような点が問題視されている。すなわち、従来では、各温度と、前記各温度におけるサンプルの融解状態を表すシグナル値またはシグナル値の微分値（以下、「シグナル微分値」という）との関係を示す融解曲線のグラフが作成されるに留まっている。そして、多型が野生型および変異型のいずれであるかは、例えば、目視により融解曲線から判断するしかない。しかし、このような多型の判断には、専門的知識が必要とされるため、例えば、融解曲線解析によって容易に多型を判断することが困難である。また、目視判断の場合、判断基準に個人差が生じることも問題視されている。このため、一般的な分析や診断の現場に、融解曲線解析を利用した遺伝子分析・遺伝子診断の用途を広げることが難しい状況である。さらに、複数の検体を一括に分析することも、その専門性等から困難となっている。このような問題は、遺伝子解析には限られず、例えば、融解曲線の所定の領域にピークがあるか否かを判断することが必要な場合、同様に起こっている問題と考えられる。
そこで、本発明は、サンプルの融解曲線において、２つの温度範囲の少なくとも一方にピークが存在するか否かを容易に解析できる、自動化可能な融解曲線解析方法を提供することを目的とする。さらに、本発明は、そのような融解曲線解析方法を実行するための融解曲線解析システム、融解曲線解析装置、プログラムおよび電子媒体の提供を目的とする。
前記目的を達成するために、本発明の融解曲線解析方法は、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）の少なくとも一方に第１ピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析方法であって、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を準備する微分値準備工程、
前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索工程
、および、
前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定工程
を含むことを特徴とする。
本発明によれば、前述のように、絶対値が最も大きいシグナル微分値の検索と、そのシグナル微分値を示す温度が所定の温度範囲（ＴＨ）または（ＴＬ）内であるか否かを判断することによって、融解曲線について、所定の２つの温度範囲の少なくとも一方におけるピークの有無を解析できる。このため、例えば、従来のように、解析を行う個人の判定基準の違いや、専門的知識が必要とされるというような問題を回避することが可能である。したがって、融解曲線の解析が容易となり、また、自動化も可能となる。特に、従来の遺伝子解析装置等に本発明のシステムを組みこむことで、例えば、遺伝子型の判断はもちろんのこと、核酸の増幅から遺伝子型の判断までを全自動化して行うことも可能となる、したがって、本発明は、例えば、一般的な分析や診断の現場においても使用することができ、多数の検体についても容易な解析を可能とすることから、特に、遺伝子解析の分野において、極めて有用な技術といえる。
図１は、本発明のシステムを用いたスタンドアローン型の装置の一例の全体構成図である。 図２は、本発明のシステムを用いたネットワーク利用型の装置の一例の全体構成図である。 図３は、前記スタンドアローン型の装置の機器構成の一例を示すブロック図である。 図４は、前記ネットワーク型の装置の機器構成の一例を示すブロック図である。 図５は、本発明のシステムを実施するためのフローチャートの一例である。 図６は、本発明のシステムを実施するためのフローチャートの一例である。 図７は、本発明のシステムを実施するためのフローチャートの一例である。 図８は、本発明の実施形態における融解曲線を示すグラフである。 図９は、本発明の実施形態における融解曲線を示すグラフである。 図１０は、本発明の実施形態における融解曲線を示すグラフである。 図１１は、本発明の実施形態における融解曲線を示すグラフである。 図１２は、本発明の実施形態における融解曲線を示すグラフである。 図１３は、本発明の実施形態におけるシグナル微分値から得られたＸを示すグラフである。 図１４は、本発明の実施形態におけるシグナル積分値の比を示すグラフである。
本発明において、前記サンプルは、例えば、融解曲線の所定の温度範囲にピークが存在しているか否かを解析することが必要なものであれば、特に制限されない。前記サンプルの具体例としては、例えば、二本鎖核酸があげられる。前記二本鎖核酸としては、特に制限されないが、例えば、ＤＮＡとＤＮＡとの二本鎖、ＲＮＡとＲＮＡとの二本鎖、ＤＮＡとＲＮＡとの二本鎖等があげられる。また、前記二本鎖核酸における各一本鎖の核酸配列は、例えば、天然の核酸を含んでもよいし、ペプチド核酸等の非天然の核酸を含んでもよく、また両方を含んでもよい。
本発明において、サンプルの融解状態を示すシグナルは、例えば、前記サンプルの非融解によって発生し、前記サンプルの融解によって発生が抑制されるものでもよいし、反対に、前記サンプルの非融解によって発生が抑制され、前記サンプルの融解によって発生するものであってもよい。本発明において、シグナル微分値は、例えば、「ｄＦ／ｄＴ」で表してもよいし、「−ｄＦ／ｄＴ」で表してもよい。ｄＦは、シグナル値の変化量、ｄＴは、温度の変化量を示す。サンプルの融解によってシグナルの発生が抑制される場合、シグナル微分値を「ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは谷型となり、シグナル微分値を「−ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは山型となる。また、前記サンプルの融解によってシグナルが発生する場合、シグナル微分値を「ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは山型となり、シグナル微分値を「−ｄＦ／ｄＴ」で表した融解曲線において、ピークは谷型となる。なお、シグナルがサンプルの融解・非融解のいずれで発生しても、また、シグナル微分値をいずれの式で表した場合も、ピークの大きさは、例えば、シグナル微分値の絶対値の大きさで評価可能である。
本発明において、シグナル値の種類は、特に制限されず、例えば、吸光度（吸収強度）、蛍光強度等があげられる。前記本発明の融解曲線解析方法が、二本鎖核酸の融解曲線の解析を目的とする場合、前記シグナル値としては、例えば、前述のような、二本鎖核酸の融解により増加する、２６０ｎｍにおける吸光度があげられる。また、前記シグナル値は、蛍光物質を使用した場合、例えば、前記蛍光物質に応じた励起光により放射される蛍光の強度であってもよい。前記蛍光物質は、前述のように、二本鎖の形成（非融解）により蛍光を発するものでも、二本鎖の融解により蛍光を発するものでもよい。蛍光物質の具体例として、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎのようなインターカレーターがあげられる。これらは、一般的に、二本鎖の形成（非融解）により蛍光を発し、二本鎖の融解によって蛍光の発生が抑制される。また、前記蛍光物質は、例えば、二本鎖核酸を構成する少なくとも一方の一本鎖核酸に結合していてもよい。前記蛍光物質が結合した一本鎖核酸としては、例えば、グアニン消光プローブとして知られているＱＰｒｏｂｅ（登録商標）のようないわゆる蛍光消光プローブがあげられる。前記蛍光消光プローブは、一般的に、二本鎖の形成により蛍光が消光し、二本鎖の融解によって蛍光が発生する。なお、本発明は、シグナル値の処理に特徴があり、シグナルの種類等には何ら制限されない。
＜融解曲線解析方法＞
本発明の融解曲線解析方法は、前述のように、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）の少なくとも一方にピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析方法であって、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を準備する微分値準備工程、
前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索工程、
および、
前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定工程、を含むことを特徴とする。
本発明において、第１ピークとは、温度範囲（ＴＨ）および（ＴＬ）のいずれかに存在する、最も大きい絶対値であるシグナル微分値を示すピークを意味する。
また、本発明の融解曲線解析方法は、例えば、以下のような工程を含むことによって、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析することもできる。この場合、本発明は、前記温度範囲（ＴＨ）および温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方に前記第１ピークが存在すると決定した場合、さらに、前記決定した第１ピークが存在しない他方の温度範囲に、第２ピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析方法ともいえる。本発明において、第２ピークとは、前記温度範囲（ＴＨ）および（ＴＬ）のうち、前記第１ピークが存在する温度範囲（Ｔ１）とは別の温度範囲に存在する、前記第１ピークについで大きい絶対値であるシグナル微分値を示すピークを意味する。
本発明の融解曲線解析方法は、さらに、
前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索工程、
および、
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定工程を含むことが好ましい。
また、前記第２ピーク候補検索工程は、例えば、前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後（絶対値が減少から増加に変化した最初）のシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、絶対値がさらに増加して前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きくなる最初のシグナル微分値（Ｄ）を検索してもよい。
前記第２ピーク候補検索工程および第１の第２ピーク判定工程は、前述の第１ピーク判定工程において、前記第１ピークを決定した場合に行うことが好ましい。また、前記第１の第２ピーク判定工程においては、例えば、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピーク候補として決定できる。
本発明の融解曲線解析方法は、例えば、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、さらに、
前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて式「Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）」の演算を行う演算工程、
および、
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定工程を含むことが好ましい。
本発明の融解曲線解析方法は、例えば、前記Ｘが「Ｘ≧閾値」を満たす場合、さらに、
前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算工程、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて式「Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２」の演算を行う演算工程、
および、
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定工程を含むことが好ましい。
このように、温度範囲（ＴＨ）および温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析方法としては、具体例として、以下のような方法があげられる。すなわち、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析方法であり、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を準備する微分値準備工程、
前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索工程、
前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定工程、
第１ピークが存在する場合、前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索工程、
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定し、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定工程、
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、
前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて下記式の演算を行う演算工程、
Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定工程、
前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合、前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算工程、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算工程
Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
、および、
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定工程を含む方法があげられる。
以下に、本発明の融解曲線解析方法について、サンプルが二本鎖核酸である例をあげて説明する。具体的に、前記二本鎖核酸は、標的部位を含む標的核酸と前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸（以下、「検出用核酸」という）とから形成される二本鎖核酸である。この二本鎖核酸の融解曲線を、本発明の方法で解析することにより、前記標的部位における多型の解析が可能である。なお、本発明は、これに制限されない。
微分値準備工程
まず、各温度における二本鎖核酸の融解状態を示すシグナル値の微分値（シグナル微分値）を準備する。
前記シグナル微分値は、例えば、予め演算した値を用いてもよいし、本工程において、シグナル値から演算してもよい。また、前記シグナル微分値は、例えば、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）を含む広域の範囲について準備する。
前記温度範囲（ＴＨ）および（ＴＬ）は、それぞれ、後述するようにＴｍを含むことが好ましく、前記温度範囲（ＴＨ）は、相対的に高い温度のＴｍＨ値を含むことが好ましく、前記温度範囲（ＴＬ）は、相対的に低い温度のＴｍＬ値を含むことが好ましい。
前記温度範囲（ＴＨ）および温度範囲（ＴＬ）のそれぞれの温度幅は、特に制限されない。前記温度範囲（ＴＨ）と前記温度範囲（ＴＬ）との間、つまり、前記温度範囲（ＴＨ）の下限と前記温度範囲（ＴＬ）の上限とは、例えば、離れていることが好ましい。具体例としては、前記温度範囲（ＴＨ）の下限と前記温度範囲（ＴＬ）の上限との差が、３℃以上であることが好ましく、より好ましくは５℃以上である。前記差の上限は特に制限されず、前記温度範囲（ＴＨ）の下限と前記温度範囲（ＴＬ）の上限は、例えば、前記差の設定値や、Ｔｍ値（ＴｍＨ、ＴｍＬ）等に応じて適宜決定できる。具体的に、ＴｍＨ値（例えば、５６℃）とＴｍＬ値（例えば、４９℃）とに基づいて、温度範囲（ＴＨ）および（ＴＬ）を設定する一例をあげるが、本発明はこれには制限されない。ＴｍＨ値（５６℃）を含むＴＨの下限と、ＴｍＬ値（４９℃）を含むＴＬの上限との差が、例えば、３℃となるように、ＴＨの下限およびＴＬの上限を決定する場合、ＴｍＨ値（５６℃）とＴＨの下限との温度幅、および、ＴｍＬ値（４９℃）とＴＬの上限との温度幅が、同程度となるように、ＴＨの下限（５４℃）とＴＬの上限（５１℃）とを設定することが好ましい。そして、前記ＴＨの上限は、ＴｍＨ値（５６℃）とＴＨの上限との温度幅が、ＴｍＨ値（５６℃）とＴＨの下限（５４℃）との温度幅（２℃）と同程度となるように設定する（ＴＨの上限５８℃）。また、前記ＴＬの下限は、ＴｍＬ値（４９℃）とＴＬの下限との温度幅が、ＴｍＬ値（４９℃）とＴＬの上限（５１℃）との温度幅と同程度となるように設定する（ＴＬの下限４７℃）。
前記温度範囲（ＴＨ）および温度範囲（ＴＬ）を含む広域の温度範囲としては、例えば、下限が、ＴｍＬ値よりも１〜２０℃低い温度であることが好ましく、より好ましくは、ＴｍＬ値よりも１〜１０℃低い温度であり、上限が、ＴｍＨ値よりも１〜２０℃高い温度であることが好ましく、より好ましくは、ＴｍＨ値よりも１〜１０℃高い温度である。具体例として、前記温度範囲は、［ＴｍＬ値−５］℃〜［ＴｍＨ値＋５］℃であることが好ましく、より好ましく［ＴｍＬ値−２］℃〜［ＴｍＨ値＋２］℃である。
シグナル微分値の温度間隔は、特に制限されないが、例えば、０．１〜５℃の間隔であり、好ましくは０．２〜３℃の間隔、より好ましくは０．８〜１．２℃の間隔である。また、前記温度間隔は、例えば、異なっていてもよいが（ランダムでもよいが）、等間隔であることが好ましい。
前記温度範囲（ＴＨ）は、相対的に高い温度のＴｍＨ値を含むことが好ましく、前記温度範囲（ＴＬ）は、相対的に低い温度のＴｍＬ値を含むことが好ましい。これらのＴｍ値は、解析目的の二本鎖核酸の種類に応じて適宜決定できる。前記Ｔｍ値は、例えば、従来公知のＭＥＬＴＣＡＬＣソフトウエア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｌｔｃａｌｃ．ｃｏｍ／）や最近接塩基対法（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ Ｍｅｔｈｏｄ）等によって決定できる。また、二本鎖核酸の標品を用いて、実際にＴｍ値を測定することによっても決定できる（以下、同様）。具体例を以下に示すが、本発明は、これには制限されない。前記検出用核酸として、例えば、変異型の標的部位にハイブリダイズ可能な検出用核酸（以下、「変異型検出用核酸」という）を使用する場合には、変異型の標的部位を有する標的核酸と前記変異型検出用核酸との二本鎖核酸のＴｍ値と、野生型の標的部位を有する標的核酸と前記変異型検出核酸との二本鎖核酸のＴｍ値とを予め決定する。相同性が高い程、Ｔｍ値が高くなることから、前者のＴｍ値がＴｍＨ値となり、後者のＴｍ値がＴｍＬ値となる。反対に、前記検出用核酸として、野生型の標的部位にハイブリダイズ可能な検出用核酸（以下、「野生型検出用核酸」という）を使用する場合には、野生型の標的部位を有する標的核酸と前記野生型検出用核酸との二本鎖核酸のＴｍ値と、変異型の標的部位を有する標的核酸と前記野生型検出核酸との二本鎖核酸のＴｍ値とを予め決定する。相同性が高い程、Ｔｍ値が高くなることから、前者のＴｍ値がＴｍＨ値となり、後者のＴｍ値がＴｍＬ値となる。
なお、本発明の融解曲線解析方法においては、例えば、前記微分値準備工程に先立って、増幅不良の検知工程を有してもよい。二本鎖核酸の融解曲線解析は、一般に、目的の鋳型核酸を核酸増幅方法により増幅させ、得られた増幅産物を用いて行われるが、例えば、増幅目的の配列が存在しなかったり、増幅試薬の劣化等によって、鋳型核酸が増幅されない場合もある。したがって、本発明においては、微分値準備工程に先立って、増幅不良を検知することで、未増幅のサンプルについての解析を中止し、増幅したサンプルのみの解析を行うこともできる。
第１ピーク候補検索工程
つぎに、前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する。
第１ピーク判定工程
続いて、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれるか否かを確認する。そして、前記温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定する。他方、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する。
第２ピーク候補検索工程
前記工程で第１ピークが存在すると判定した場合、続いて、シグナル微分値（Ｃ）およびシグナル微分値（Ｄ）の検索を行う。具体的には、前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する。この際、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または絶対値が減少から増加に変化した最初のシグナル微分値（Ｃ）、および、絶対値がさらに増加して前記シグナル微分値（Ａ）に次いで最も大きくなる最初のシグナル微分値（Ｄ）を検索してもよい（以下、同様）。
第１の第２ピーク判定工程
前記工程で前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在すると判定した場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定する。他方、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する。
Ｘの演算工程
続いて、前記工程で前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在すると判定した場合、前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて下記式の演算を行う。
Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）
第２の第２ピーク判定工程
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定する。他方、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する。前記閾値は、例えば、シグナルの種類、シグナルの検出波長、シグナル（蛍光）を発する蛍光物質の種類、検出目的の遺伝子や多型の種類、検出用核酸の配列、二本鎖核酸を形成する際の反応溶液組成等に応じて適宜設定できる。本発明は、閾値の具体的な値やその設定方法が特徴ではなく、それらによって制限されるものではない。なお、閾値の設定方法については、その一例を後述する。
積分演算工程
一方、前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合、前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る。
Ｙの演算工程
前記工程により得られた温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う。
Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
第３の第２ピーク判定工程
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定する。他方、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する。前記閾値は、例えば、シグナルの種類、シグナルの検出波長、シグナル（蛍光）を発する蛍光物質の種類、検出目的の遺伝子や多型の種類、検出用核酸の配列、二本鎖核酸を形成する際の反応溶液組成等に応じて適宜設定できる。本発明は、閾値の具体的な値やその設定方法が特徴ではなく、それらによって制限されるものではない。なお、閾値の設定方法については、その一例を後述する。このようにして、融解曲線解析の所定の温度範囲ＴＨおよびＴＬのそれぞれにおいてピークが存在するか否かを客観的に判断することができる。
前記標的核酸が一対の対立遺伝子の場合、前記標的部位の多型が、ホモ接合性およびヘテロ接合性のいずれであるかを判定することが求められる。本発明においては、まず、前記第１の第２ピーク判定工程、前記第２の第２ピーク判定工程および前記第３の第２ピーク判定工程において、第２ピークなしと決定した場合、第１ピークのみが存在することから、前記標的部位の多型をホモ接合性であると決定できる。他方、前記各工程のいずれかにおいて、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定した場合は、第１および第２の２つのピークが存在することから、前記標的部位の多型をヘテロ接合性であると決定できる。
また、前記多型がホモ接合性の場合、前記標的部位における多型について、野生型であるか変異型であるかを判定することが求められる。そこで、本発明は、さらに、多型について野生型であるか変異型であるかを判定する多型判定工程を含んでもよい。この工程においては、前記野生型検出用核酸を用いた場合、前記第１ピークであるシグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が前記温度範囲（ＴＨ）に含まれる際には、野生型と判定し、前記温度範囲（ＴＬ）に含まれる際には、変異型と判定できる。他方、前記変異型検出用核酸を使用した場合、前記第１ピークであるシグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が前記相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）に含まれる際には、変異型と判定し、前記相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）に含まれる際には、野生型と判定できる。以上のようにして、標的部位の多型がホモ接合性であるかヘテロ接合性であるか、さらに、野生型であるか変異型であるかについても判定することができる。
本発明の融解曲線解析方法は、例えば、得られた判定結果の情報を出力する出力工程をさらに有することが好ましい。前記判定結果としては、例えば、第１ピークおよび第２ピークの有無、多型がホモ接合性およびヘテロ接合性のいずれであるか、多型が野生型および変異型のいずれであるか等という項目があげられる。出力の際には、例えば、判定結果のみが出力されてもよいし、融解曲線のグラフとあわせてこれらの判定結果が出力されてもよい。
本発明においては、例えば、さらに、前記微分値準備工程において準備した前記各温度におけるシグナル微分値について、連続するシグナル微分値間の多項演算を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得る多項演算工程を含んでもよい。これによって、例えば、融解曲線においてピークを際立たせることができる。この多項演算工程において得られた前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を、前述した各工程において、前記各温度におけるシグナル微分値として使用すればよい。
多項演算の方法は、特に制限されず、一般的な方法が採用できる。多項演算は、例えば、連続する奇数個のシグナル微分値の和により行ってもよいし、連続する偶数個のシグナル微分値の和により行ってもよい。奇数個の場合、例えば、下記式に示すように、融解曲線における任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）の多項演算値（ＱＭ）は、任意の点（Ｍ：Ｍ個目の点）のシグナル微分値（ＰＭ）と、前記任意の点（Ｍ）を中心として、連続する前のｑ個のシグナル微分値と、連続する後ろのｑ個のシグナル微分値との和から算出できる。Ｍは、２以上の正整数であり、ｑは、１以上の正整数である。
多項演算値（ＱＭ）＝ＰＭ−ｑ＋ＰＭ−ｑ＋１＋・・・＋ＰＭ＋・・・+ＰＭ＋ｑ−１＋ＰＭ＋ｑ
また、偶数個の場合、例えば、下記式に示すように、融解曲線における任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）の多項演算値（ＱＭ）は、任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）と、前記任意の点（Ｍ）を中心として、連続する前のｒ個のシグナル微分値と、連続する後ろの（ｒ＋１）個のシグナル微分値との和から算出できる。Ｍは、２以上の正整数であり、ｒは、０以上の正整数である。
多項演算値（ＱＭ）＝ＰＭ−ｒ＋・・・＋ＰＭ＋・・・＋ＰＭ＋（ｒ＋１）
または、例えば、下記式に示すように、任意の点（Ｍ）におけるシグナル微分値（ＰＭ）の多項演算値（ＱＭ）は、任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）と、前記任意の点（Ｍ）を中心として、連続する前の（ｒ＋１）個のシグナル微分値と、連続する後ろのｒ個のシグナル微分値との和から算出することもできる。ｒは、０以上の正整数である。
多項演算値（ＱＭ）＝ＰＭ−（ｒ＋１）＋・・・＋ＰＭ＋・・・＋ＰＭ＋ｒ
多項演算において、任意の点の多項演算値の算出に使用するシグナル微分値の個数は、特に制限されず、例えば、連続する２点以上のシグナル微分値について行うことが好ましく、より好ましくは２〜９点であり、さらに好ましくは３点である。３点のシグナル微分値について行う場合は、例えば、前記微分値準備工程において準備したｎ点（ｎは３以上の正整数）の各温度におけるシグナル微分値のうち、２点目から（ｎ−１）点目の各温度におけるシグナル微分値について、それぞれ、下記式に基づいて多項演算処理を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得ることができる。下記式において、ＰＭは、融解曲線における任意の点（Ｍ）のシグナル微分値、ＰＭ−１は、前記任意の点（Ｍ）の直前の点（Ｍ−１）におけるシグナル微分値、ＰＭ＋１は、前記任意の点（Ｍ）の直後の点（Ｍ＋１）におけるシグナル微分値である。Ｍは、２番目以降の点であり、具体的には、２番目の点から（ｎ−１）番目の点である。
多項演算値＝（ＰＭ−１＋ＰＭ＋ＰＭ＋１）
このように多項演算を行った場合の融解曲線の例を図１２に示す。同図は、温度とシグナル微分値（−ｄＦ／ｄＴ）との関係を示す融解曲線のグラフであり、同図において、◆が、シグナル微分値のプロットであり、■が、シグナル微分値を多項演算した値のプロットである。このように、多項演算を行うことによって、ピークを際立たせることが可能である。なお、同図において、シグナル微分値の値ならびに温度値等は例示であって、本発明を制限するものではない（他の図においても同様）。また、前記多項演算工程においては、例えば、連続するシグナル微分値について、移動平均化を行ってもよい。
また、微分値準備工程における前記シグナル微分値は、予め演算されたものを使用してもよいが、例えば、微分値準備工程において、各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値を微分することによって、前記各温度におけるシグナル微分値を得てもよい。また、前記シグナル値は、例えば、予め検出により得られたデータを使用してもよいが、例えば、微分値準備工程に先立って、シグナル値の検出を行うことにより準備してもよい。具体的には、前記微分値準備工程に先立って、さらに、サンプル（例えば、二本鎖核酸）の温度を変化させる温度変化工程、および、温度変化時における前記サンプルの融解状態を示すシグナル値を連続的または断続的に検出する検出工程を有してもよい。前記温度変化工程は、例えば、前記サンプルを加熱する加熱工程であってもよいし、加熱されたサンプルを冷却する冷却工程でもよいが、前記加熱工程が好ましい。
さらに具体的に、図８〜図１１に示す融解曲線を例にあげて、本発明の融解曲線解析方法を説明する。図８〜図１１は、それぞれ、温度とシグナル微分値（−ｄＦ／ｄＴ）との関係を示す融解曲線のグラフである。各図において、Ｘ軸が温度（℃）であり、Ｙ軸が、シグナル微分値（−ｄＦ／ｄＴ）である。また、相対的に低いＴｍＬ値を４９℃、それを含む温度範囲ＴｍＬを４７〜５１℃、相対的に高いＴｍＨ値を５６℃、それを含む温度範囲ＴｍＨを５４〜５８℃に設定している。なお、これらは例示であって、本発明を制限するものではない。
図８に示すように、温度と各温度におけるシグナル微分値との関係を示す融解曲線を準備し、絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する。これが第１ピーク候補となる。ここで、前記シグナル微分値（Ａ）が検出されなかった場合、第１ピークおよび第２ピークなしと判断される。
次に、図９に示すように、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度５６℃は、温度範囲（ＴＨ）に含まれることから、シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定する。続いて、図１０に示すように、シグナル微分値（Ａ）を示す温度５６℃を始点として、矢印で示すように、温度範囲（ＴＨ）から他方の温度範囲（ＴＬ）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前のシグナル微分値（Ｃ）を検索する。図１０においては、５２℃におけるシグナル微分値がシグナル微分値（Ｃ）となる。引き続き、シグナル微分値（Ｃ）を示す温度（５２℃）から、矢印に示すように温度範囲（ＴＬ）の方向に向かって、絶対値がさらに増加して、前記シグナル微分値（Ａ）に次いで最も大きくなる最初のシグナル微分値（Ｄ）を検索する。図１０においては、４９℃におけるシグナル微分値が、第２ピーク候補のシグナル微分値（Ｄ）となる。なお、ここで、シグナル微分値（Ｃ）および（Ｄ）が検出されなかった場合は、第２ピークなしと決定される。
続いて、シグナル微分値（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）を用いて式「Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）」の演算を行う。得られたＸが［Ｘ＜所定閾値］を満たす場合、シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（４９℃）は、温度範囲（ＴＬ）に含まれるため、第２ピークとして決定する。
他方、得られたＸが［Ｘ＜所定閾値］ではなく［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合、温度範囲（ＴＨ）におけるシグナル微分値、および、温度範囲（ＴＬ）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、温度範囲（ＴＨ）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および温度範囲（ＴＬ）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る。図１１における斜線部分が、温度範囲ＴＨおよびＴＬにおける微分値の積分範囲である。そして、温度範囲（ＴＨ）の積分値（Ｙ１）と温度範囲（ＴＬ）の積分値（Ｙ２）を用いて式「Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２」の演算を行う。前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定する。なお、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する。
本発明において、前述のように、前記Ｘの閾値およびＹの閾値は何ら制限されず、例えば、標的核酸(遺伝子)の種類や多型の種類等に応じて適宜決定できる。以下に、閾値の設定方法について例示するが、本発明は、これに制限されない。
Ｘの閾値は、例えば、以下のようにして決定できる。予め、所定の遺伝子の標的部位における多型(ホモ接合性またはヘテロ接合性）が既知である核酸検体を複数準備する。そして、各核酸検体と検出用核酸との二本鎖に関する融解曲線から、前述と同様にして、シグナル微分値（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）を決定し、Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）の演算を行う。そして、各核酸検体におけるＸをプロットしたグラフを作成する。このグラフの一例を図１３に示す。同図に示すように、第１ピークのみが検出されるホモ接合性（■）と、第１および第２の２つのピークが検出されるヘテロ接合性（◆）では、Ｘの値が明らかに異なる。そこで、このグラフから、ホモ接合性とヘテロ接合性との臨界値を決定し、これをＸの閾値に設定することができる。
Ｙの閾値も、前記Ｘと同様にして決定できる。予め、所定の遺伝子の標的部位における多型(ホモ接合性またはヘテロ接合性）が既知である核酸検体を複数準備する。そして、各核酸検体と検出用核酸との二本鎖に関する融解曲線から、温度範囲Ｔ１における積分値（Ｙ１）と温度範囲Ｔ２における積分値（Ｙ２）を求め、Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２の演算を行う。そして、各核酸検体におけるＹをプロットしたグラフを作成する。このグラフの一例を図１４に示す。同図に示すように、第１ピークのみが検出されるホモ接合性（■）と、第１および第２の２つのピークが検出されるヘテロ接合性（◆）では、Ｘの値が明らかに異なる。そこで、このグラフから、ホモ接合性とヘテロ接合性との臨界値を決定し、これをＸの閾値に設定することができる。
本発明の融解曲線解析方法は、例えば、後述する本発明の融解曲線解析システム、本発明の融解曲線解析装置、本発明のコンピュータプログラムの実行等によって実現できる。
＜第２ピーク判定方法＞
本発明の第２ピーク判定方法は、例えば、前述の本発明の融解曲線解析方法における、積分演算工程、Ｙの演算工程および第３の第２ピーク判定工程に該当する。この方法によれば、第１ピークの存在が決定された融解曲線について、容易に、第２ピークの存在の有無を判定することが可能である。
本発明の第２ピーク判定方法は、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）にピーク（第１ピーク）が存在する場合、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち他方の温度範囲（Ｔ２）にピーク（第２ピーク）が存在するか否かを判定する第２ピーク判定方法であって、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を準備する微分値準備工程、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）における前記シグナル微分値、および、前記他方の温度範囲（Ｔ２）における前記シグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算工程、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて式「Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２」の演算を行う演算工程、
および、
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、第２ピークありと決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第２ピーク判定工程を含むことを特徴とする。なお、前記第２ピーク判定工程は、前述の第３の第２ピーク判定工程に該当する。
本発明の第２ピーク判定方法は、例えば、前記積分演算工程に先立って、さらに、前述のような、前記第２ピーク候補検索工程、前記第１の第２ピーク判定工程、前記Ｘの演算工程、前記第２の第２ピーク判定工程を有してもよい。すなわち、本発明の第２ピーク判定方法は、例えば、前記Ｙの演算工程に先立って、さらに、前記第１ピークを示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から前記他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索工程を有してもよい。
そして、例えば、さらに、第１の第２ピーク判定工程を有し、本工程において、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定し、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定してもよい。本工程において、前記ピークの候補を決定した場合は、例えば、引き続き、前記Ｙの演算工程および第３の第２ピーク判定工程を実施してもよいし、さらに、前記Ｘの演算工程および第２の第２ピーク判定工程を実施してもよい。
すなわち、本発明の第２ピーク判定方法は、例えば、さらに、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合には、前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて式「Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）」の演算を行う演算工程、
および、
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定工程を有してもよい。そして、前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合に、前記Ｙを演算する演算工程を行うことが好ましい。
本発明の第２ピーク判定方法は、例えば、後述する本発明の融解曲線解析システム、本発明の第２ピーク判定システム、本発明の融解曲線解析装置、本発明の第２ピーク判定システム、本発明のコンピュータプログラムの実行等によって実現できる。
＜融解曲線解析システム＞
本発明の融解曲線解析システムは、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）の少なくとも一方にピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムであって、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
前記微分値入力部により入力された前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索部、
および、
前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定部、を含むことを特徴とする。
また、本発明の融解曲線解析システムは、例えば、以下のような各部を含むことによって、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析することもできる。この場合、本発明は、前記温度範囲（ＴＨ）および温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方に前記第１ピークが存在すると決定した場合、さらに、前記決定した前記第１ピークが存在しない他方の温度範囲に第２ピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムともいえる。
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、
前記微分値入力部により入力された前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索部、
および、
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定部を含むことが好ましい。
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記第１の第２ピーク判定部において、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定することができる。
また、前記第２ピーク候補検索部は、例えば、前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後（絶対値が減少から増加に変化した最初）のシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、絶対値がさらに増加して前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きくなる最初のシグナル微分値（Ｄ）を検索する検索部であってもよい。
本発明の融解曲線解析システムは、例えば、さらに、前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて式「Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）」の演算を行う演算部、
および、
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定部を含むことが好ましい。
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、これらの各部によって、前記第２ピークの候補について、第２ピークか否かを判断することができる。
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて式「Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２」の演算を行う演算部、
および、
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定部を含むことが好ましい。
前記演算部で求めた前記Ｘが［Ｘ≦所定閾値］を満たす場合、これらの各部により、第２ピークか否かを判断することができる。
このように、温度範囲（ＴＨ）および温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムとしては、具体例として、以下のような方法があげられる。すなわち、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムであって、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
前記微分値入力部により入力された前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索部、
前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定部、
第１ピークが存在する場合、前記微分値入力部により入力された前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索部、
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定し、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定部、
前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて下記式の演算を行う演算部、
Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定部、
前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合、前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算部
Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
、および、
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定部、を含むことを特徴とする。
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値を微分して、前記各温度におけるシグナル微分値を得る微分演算部を含むことが好ましい。
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、前記微分値入力部により入力された前記各温度におけるシグナル微分値について、連続するシグナル微分の多項演算を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得る多項演算部を含んでもよい。他の各部は、前記多項演算部により得られた前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を、前記各温度におけるシグナル微分値として使用することが好ましい。
本発明の融解曲線解析システムにおいて、前記多項演算部は、特に制限されず、一般的な手段が採用できる。多項演算は、例えば、連続する奇数個のシグナル微分値の和により行ってもよいし、連続する偶数個のシグナル微分値の和により行ってもよい。奇数個の場合、例えば、下記式に示すように、融解曲線における任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）の多項演算値（ＱＭ）は、任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）と、前記任意の点（Ｍ：Ｍ番目の点）を中心として、連続する前のｑ個のシグナル微分値と、連続する後ろのｑ個のシグナル微分値との和から算出できる。Ｍは、２以上の正整数であり、ｑは、１以上の正整数である。
多項演算値（ＱＭ）＝ＰＭ−ｑ＋ＰＭ−ｑ＋１＋・・・＋ＰＭ＋・・・+ＰＭ＋ｑ−１＋ＰＭ＋ｑ
また、偶数個の場合、例えば、下記式に示すように、融解曲線における任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）の多項演算値（ＱＭ）は、任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）と、前記任意の点（Ｍ）を中心として、連続する前のｒ個のシグナル微分値と、連続する後ろの（ｒ＋１）個のシグナル微分値との和から算出できる。Ｍは、２以上の正整数であり、ｒは、０以上の正整数である。
多項演算値（ＱＭ）＝ＰＭ−ｒ＋・・・＋ＰＭ＋・・・＋ＰＭ＋（ｒ＋１）
または、例えば、下記式に示すように、任意の点（Ｍ）におけるシグナル微分値（ＰＭ）の多項演算値（ＱＭ）は、任意の点（Ｍ）のシグナル微分値（ＰＭ）と、前記任意の点（Ｍ）を中心として、連続する前の（ｒ＋１）個のシグナル微分値と、連続する後ろのｒ個のシグナル微分値との和から算出することもできる。ｒは、０以上の正整数である。
多項演算値（ＱＭ）＝ＰＭ−（ｒ＋１）＋・・・＋ＰＭ＋・・・＋ＰＭ＋ｒ
多項演算において、任意の点の多項演算値の算出に使用するシグナル微分値の個数は、特に制限されず、例えば、連続する２点以上のシグナル微分値について行うことが好ましく、より好ましくは２〜９点であり、さらに好ましくは３点である。３点のシグナル微分値について行う場合は、例えば、前記微分値準備工程において準備したｎ点（ｎは３以上の正整数）の各温度におけるシグナル微分値のうち、２点目から（ｎ−１）点目の各温度におけるシグナル微分値について、それぞれ、下記式に基づいて多項演算処理を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得ることができる。下記式において、ＰＭは、融解曲線における任意の点（Ｍ）のシグナル微分値、ＰＭ−１は、前記任意の点（Ｍ）の直前の点（Ｍ−１）におけるシグナル微分値、ＰＭ＋１は、前記任意の点（Ｍ）の直後の点（Ｍ＋１）におけるシグナル微分値である。Ｍは、２番目以降の点であり、具体的には、２番目の点から（ｎ−１）番目の点である。
多項演算値＝（ＰＭ−１＋ＰＭ＋ＰＭ＋１）
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、サンプルの温度を変化させる温度変化部、および、温度変化時における前記サンプルの融解状態を示すシグナル値を連続的または断続的に検出する検出部を有することが好ましい。前記温度変化部としては、例えば、サンプルを加熱する加熱部でもよいし、加熱されたサンプルを冷却する冷却部であってもよい。前記温度変化部としては、例えば、温度調節が可能な温度調節器、ヒーター、サーマルサイクラー等があげられ、前記検出部としては、例えば、分光光度計や蛍光光度計等があげられる。また、両者を備えた手段としては、例えば、リアルタイムＰＣＲに使用する測定器等があげられる。
本発明の融解曲線解析システムにおいて、前記シグナルが蛍光であり、前記検出部は、蛍光を検出することが好ましい。
本発明の融解曲線解析システムは、二本鎖核酸の融解曲線の解析システムであることが好ましく、前記二本鎖核酸は、標的部位を含む標的核酸と前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから形成される二本鎖核酸であることが好ましい。そして、前記標的部位を含む標的核酸と前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから形成される二本鎖核酸の融解曲線の解析により、前記標的部位における多型を解析することが好ましい。
本発明において、前記標的核酸が一対の対立遺伝子の場合、前記第１の第２ピーク判定部、前記第２の第２ピーク判定部および前記第３の第２ピーク判定部は、第２ピークなしと決定する場合、さらに前記標的部位の多型についてホモ接合性であると決定し、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定する場合、さらに前記標的部位の多型についてヘテロ接合性であると決定することが好ましい。
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、前記標的核酸の標的部位における多型について野生型であるか変異型であるかを判定する多型判定部を含み、前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸が、野生型の前記標的部位にハイブリダイズ可能な場合、前記第１ピークであるシグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）に含まれる際には野生型と判定し、前記相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）に含まれる際には変異型と判定し、
前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸が、変異型の前記標的部位にハイブリダイズ可能な場合、前記第１ピークであるシグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）に含まれる際には変異型と判定し、前記相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）に含まれる際には野生型と判定することが好ましい。
本発明の融解曲線解析システムは、例えば、第１ピークおよび第２ピークの有無、ホモ接合性かヘテロ接合性であるか、野生型か変異型であるか等の判定結果の情報を出力する出力部を有することが好ましい。出力の際には、例えば、判定結果のみが出力されてもよいし、融解曲線のグラフとあわせてこれらの判定結果が出力されてもよい。
＜ネットワーク融解曲線解析システムおよびそれに用いる端末＞
本発明の融解曲線解析システムは、以下に示す端末とサーバーとを有するネットワークシステムであってもよい。なお、特に示さない限りは、前述の融解曲線解析システムと同様である。すなわち、本発明のネットワーク融解曲線解析システムは、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）の少なくとも一方にピークが存在するか否かを解析するネットワーク融解曲線解析システムであって、
端末と、サーバーとを有し、
前記端末および前記サーバーは、システム外の通信網を介して接続可能であり、
前記端末は、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバーに送信する端末側送信部、および、
前記サーバーから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信部を有し、
前記サーバーは、
前記サーバー内の情報を前記通信網を介して前記端末に送信するサーバー側送信部、
前記端末から送信された情報を前記通信網を介して受信するサーバー側受信部、
前記サーバー側受信部により受信した前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索部、および、
前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定部を含み、
少なくとも前記各温度における前記シグナル微分値が、前記端末側送信部から前記サーバー側受信部に送信され、且つ、前記第１ピークの判定結果の情報が、前記サーバー側送信部から前記端末側受信部に送信されることを特徴とする。
また、本発明の融解曲線解析システムは、例えば、以下のような各部を含むことによって、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析することもできる。この場合、本発明は、前記温度範囲（ＴＨ）および温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方に前記第１ピークが存在すると決定した場合、さらに、前記決定した前記第１ピークが存在しない他方の温度範囲に第２ピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムともいえる。また、この場合、前記第１ピークの判定結果に加えて、第２ピークの判定結果の情報が、前記サーバー側送信部から前記端末側受信部に送信されることが好ましい。
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、前記サーバー側受信部により受信した前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索部、
および、
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定部を含むことが好ましい。前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記第１の第２ピーク判定部において、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定することができる。
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて式「Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）」の演算を行う演算部、
および、
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定部を含むことが好ましい。前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、これらの部によって、前記第２ピークの候補について、第２ピークか否かを判断することができる。
本発明の融解曲線解析システムは、さらに、前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて式「Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２」の演算を行う演算部、
および。
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定部を含むことが好ましい。前記演算部で求めた前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合、これらの各部により、第２ピークか否かを判断することができる。
このように、温度範囲（ＴＨ）および温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムとしては、具体例として、以下のような方法があげられる。すなわち、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析するネットワーク融解曲線解析システムであって、
端末と、サーバーとを有し、
前記端末および前記サーバーは、システム外の通信網を介して接続可能であり、
前記端末は、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバーに送信する端末側送信部、および、
前記サーバーから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信部を有し、
前記サーバーは、
前記サーバー内の情報を前記通信網を介して前記端末に送信するサーバー側送信部、
前記端末から送信された情報を前記通信網を介して受信するサーバー側受信部、
前記サーバー側受信部により受信した前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索部、
前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定部、
第１ピークが存在する場合、前記サーバー側受信部により受信した前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索部、
前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定し、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定部、
前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて式「Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）」の演算を行う演算部、
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定部、
前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合、前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算部
Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
、および、
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定部を含み、
少なくとも前記各温度における前記シグナル微分値が、前記端末側送信部から前記サーバー側受信部に送信され、且つ、前記第１ピークおよび第２ピークの判定結果の情報が、前記サーバー側送信部から前記端末側受信部に送信されることを特徴とする。
前記端末は、さらに、前記各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値を微分して、前記各温度におけるシグナル微分値を得る微分演算部を含むことが好ましい。また、前記端末から前記サーバーに微分前の前記シグナル値を送信する場合には、前記サーバーは、前記微分演算部を含むことが好ましい。
前記端末または前記サーバーは、さらに、前記各温度におけるシグナル微分値について、それぞれ多項演算を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得る多項演算部を含むことが好ましい。そして、他の各部においては、前記多項演算部により得られた前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を、前記各温度におけるシグナル微分値として使用することが好ましい。また、前記端末または前記サーバーは、さらに、前記各温度におけるシグナル微分値について、それぞれ移動平均処理を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の移動平均値を得る移動平均演算部を含んでもよい。そして、他の各部においては、前記移動平均演算部により得られた前記各温度におけるシグナル微分値の移動平均値を、例えば、前記各温度におけるシグナル微分値として使用することもできる。
本発明のネットワーク融解曲線解析システムは、二本鎖核酸の融解曲線の解析システムであることが好ましく、前記二本鎖核酸は、標的部位を含む標的核酸と前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから形成される二本鎖核酸であることが好ましい。そして、前記標的部位を含む標的核酸と前記標的部位にハイブリダイズ可能な核酸とから形成される二本鎖核酸の融解曲線の解析により、前記標的部位における多型を解析することが好ましい。
本発明において、前記標的核酸が一対の対立遺伝子の場合、前記第１の第２ピーク判定部、前記第２の第２ピーク判定部および前記第３の第２ピーク判定部は、第２ピークなしと決定する場合、さらに前記標的部位の多型についてホモ接合性であると決定し、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定する場合、さらに前記標的部位の多型についてヘテロ接合性であると決定することが好ましい。
前記サーバーは、さらに、前記標的核酸の標的部位における多型について野生型であるか変異型であるかを判定する多型判定部を含むことが好ましい。判定方法は、前述の通りある。この場合、前記サーバーから前記端末に、多型の判定結果の情報が送信されることが好ましい。また、前記端末が、多型判定部を有し、前記サーバーから前記端末に送信された前記第１ピークおよび第２ピークの判定結果の情報に基づいて、多型の判定が行われてもよい。
本発明の端末は、本発明のネットワーク融解曲線解析システムに用いる端末であって、
前記端末は、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバーに送信する端末側送信部、および、
前記サーバーから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信部を有し、
少なくとも前記各温度における前記シグナル微分値が、前記端末側送信部から前記サーバー側受信部に送信され、且つ、前記第１ピークの判定結果の情報が、前記サーバー側送信部から前記端末側受信部に送信されることを特徴とする。また、前記サーバー側送信部から、前記第１ピークの判定結果に加えて、第２ピークの判定結果の情報が、前記端末受信部に送信されることが好ましい。
＜第２ピーク判定システム＞
本発明の第２ピーク判定システムは、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）にピーク（第１ピーク）が存在する場合、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち他方の温度範囲（Ｔ２）にピーク（第２ピーク）が存在するか否かを解析する第２ピーク判定システムであって、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）における前記シグナル微分値、および、前記他方の温度範囲（Ｔ２）における前記シグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて式「Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２」の演算を行う演算部、および、
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、第２ピークありと決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第２ピーク判定部を含むことを特徴とする。
本発明の第２ピーク判定システムは、さらに、前記微分値入力部により入力された前記各温度におけるシグナル微分値から、前記第１ピークを示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から前記他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索部を有することが好ましい。そして、例えば、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合には、前記演算部および前記第２ピーク判定部を実行させ、前記第２ピーク判定部により、前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル部分値（Ｄ）を第２ピークとして決定することが好ましい。また、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合には、例えば、前記２ピーク判定部により、第２ピークなしと決定することができる。前記第２ピーク候補検索部は、例えば、本発明の融解曲線解析システムにおける第２ピーク候補検索部に該当する。
また、本発明の第２ピーク判定システムは、さらに、前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて式「Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）」の演算を行う演算部、および、
前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する判定部を有してもよい。そして、前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合に、前記Ｙを演算する演算部を実行させることが好ましい。
本発明の第２ピーク判定システムは、例えば、本発明の融解曲線解析システムにおいて、第２の第２ピーク判定部として用いることが好ましい。
＜第２ピーク判定ネットワークシステムおよびそれに用いる端末＞
本発明の第２ピーク判定システムは、以下に示す端末とサーバーとを有するネットワークシステムであってもよい。なお、特に示さない限りは、前述の第２ピーク判定システムと同様である。すなわち、本発明のネットワーク第２ピーク判定システムは、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）にピーク（第１ピーク）が存在する場合、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち他方の温度範囲（Ｔ２）にピーク（第２ピーク）が存在するか否かを解析するネットワーク第２ピーク判定システムであって、
端末と、サーバーとを有し、
前記端末および前記サーバーは、システム外の通信網を介して接続可能であり、
前記端末は、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバーに送信する端末側送信部、および、
前記サーバーから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信部を有し、
前記サーバーは、
前記サーバー内の情報を前記通信網を介して前記端末に送信するサーバー側送信部、
前記端末から送信された情報を前記通信網を介して受信するサーバー側受信部、
前記サーバー側受信部により受信した、前記一方の温度範囲（Ｔ１）における前記シグナル微分値、および、前記他方の温度範囲（Ｔ２）における前記シグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算部
Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
、および、
前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、第２ピークありと決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第２ピーク判定部を含み、
少なくとも前記各温度における前記シグナル微分値が、前記端末側送信部から前記サーバー側受信部に送信され、且つ、前記第２ピークの判定結果の情報が、前記サーバー側送信部から前記端末側受信部に送信されることを特徴とする。
前記サーバーは、さらに、前記微分値入力部により入力された前記各温度におけるシグナル微分値から、前記第１ピークを示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から前記他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索部を有することが好ましい。そして、例えば、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合には、前記演算部および前記第２ピーク判定部が実行され、前記第２ピーク判定部により、前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル部分値（Ｄ）を第２ピークとして決定することが好ましい。また、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合には、例えば、第２ピークなしと決定することができる。
本発明の端末は、本発明の第２ピーク判定システムに用いる端末であって、
前記端末は、
各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
前記端末内の情報を前記通信網を介して前記サーバーに送信する端末側送信部、および、
前記サーバーから送信された情報を前記通信網を介して受信する端末側受信部を有し、
少なくとも前記各温度における前記シグナル微分値が、前記端末側送信部から前記サーバー側受信部に送信され、且つ、前記第２ピークの判定結果の情報が、前記サーバー側送信部から前記端末側受信部に送信されることを特徴とする。
＜融解曲線解析装置＞
本発明の融解曲線解析装置は、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）の少なくとも一方にピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析装置であって、本発明の融解曲線解析システムを含むことを特徴とする。
＜第２ピーク判定装置＞
本発明の第２ピーク判定装置は、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）にピーク（第１ピーク）が存在する場合、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち他方の温度範囲（Ｔ２）にピーク（第２ピーク）が存在するか否かを解析する第２ピーク判定装置であって、本発明の第２ピーク判定システムを含むことを特徴とする。また、本発明の第２ピーク判定装置は、本発明の融解曲線解析装置に用いることが好ましい。
＜プログラム＞
本発明のプログラムは、本発明の融解曲線解析方法をコンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラムである。また、本発明のプログラムは、本発明の第２ピーク判定方法をコンピュータ上で実行可能なコンピュータプログラムである。
＜電子媒体＞
本発明の電子媒体は、本発明のコンピュータプログラムを格納した電子媒体である。
つぎに、本発明の実施例について説明する。
第１のシステム構成例
図１に、本発明のシステムの構成の一例であるスタンドアローン型の全体構成図を示す。図１に示すシステムは、本発明の融解曲線解析システム１１から構成され、融解曲線解析システム１１は、データ入出力部１２とピーク判定計算部１３から構成される。図３に、スタンドアローン型の融解曲線解析装置のハードウェア構成の一例を示す。図示のように、融解曲線解析システム１１は、データ入出力部１２、ピーク判定計算部１３および記憶装置３７から構成されている。前記データ入出力部１２は、プログラムを実行するＣＰＵ３１、入出力Ｉ／Ｆ（インターフェース）３２、データの入力を行う入力装置３３、データの出力を行う出力装置３４を有するコンピュータ機器で構成される。入力装置３３としては、例えば、キーボードやマウス等があげられ、出力装置３４としては、例えば、プリンターや、ＬＥＤまたは液晶ディスプレイ等があげられる。ピーク判定計算部１３は、プログラムが格納されたプログラム格納部３６およびプログラムを実行するＣＰＵ３５を有するコンピュータ機器で構成される。記憶装置３７には、例えば、各温度におけるシグナル値およびシグナル微分値、Ｔｍ値（ＴｍＨ値、ＴｍＬ値）やＴｍ値を含む所定の温度範囲（ＴＨ、ＴＬ）、検出用プローブの種類（野生型検出用であるか変異型検出用であるか）やその配列等のデータが、呼び出し可能な状態で記憶される。記憶装置３７としては、例えば、ＲＯＭ、ＨＤＤ、ＨＤ等があげられ、ＣＰＵの制御下、読みこみ／書きこみを制御し、データを記憶する。なお、データ出力部１２、ピーク判定計算部１３、記憶装置３７は、あくまでも機能上のものであり、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。
また、本発明のシステムは、さらに、サンプルの温度を変化させる温度変化処理部、温度変化処理時におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値を連続的または断続的に検出する検出部を有してもよい。そして、前記検出部において検出されたシグナル値を前記データ入出力部により入力してもよい。前記温度変化処理部は、例えば、サンプルを加熱処理する加熱処理部でもよいし、加熱したサンプルを冷却する冷却処理部であってもよい。前記加熱処理部は、例えば、加熱装置等があげられる。前記検出部は、例えば、光学光度計や蛍光光度計があげられる。前記温度変化処理部および前記検出部は、それぞれ、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。また、前記温度変化処理部および前記検出部は、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。この他に、生体試料から核酸を抽出するための核酸抽出部や、核酸増幅反応を行う増幅処理部等を備えてもよい。このような構成とすることで、例えば、核酸の増幅から融解曲線解析による多型の判定までを一つのシステムで自動的に行うことができる遺伝子型判定システムを提供できる。
第２のシステム構成例
図２に、サーバーで処理するネットワーク型のシステムの全体構成図を示す。図２に示すように、本実施形態のシステムは、本発明の融解曲線解析システム２１、および、ピーク判定計算部２３から構成されるサーバーシステム２４で構成される。融解曲線解析システム２１は、データ入出力部２２から構成される。融解曲線解析システム２１とサーバーシステム２４は、例えば、ＴＣＰ（Transmission Control Protocol）／ＩＰ（Internet Protocol）に基づくインターネットとして機能する公衆網や専用線等の通信回線１００を介して接続されている。図４に、前記ネットワーク型システムの装置の構成の一例を示す。融解曲線解析システム２１は、データ入出力部２２および通信Ｉ／Ｆ（インターフェース）４７から構成され、通信Ｉ/Ｆ４７を介して通信回線１００に接続されている。サーバーシステム２４は、ピーク判定計算部２３および通信Ｉ／Ｆ４８から構成され、通信Ｉ／Ｆ４８を介して通信回線１００に接続されている。データ出力部２２は、プログラムを実行するＣＰＵ４１、入出力Ｉ／Ｆ４２、データの入力を行う入力装置４３およびデータの出力を行う出力装置４４から構成される。前記データ入出力部２２および通信Ｉ／Ｆ４７は、あくまでも機能上のものであり、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。ピーク判定計算部２３は、プログラムを実行するＣＰＵ４５およびプログラムが格納されたプログラム格納部４６で構成される。ピーク判定計算部２３および通信Ｉ／Ｆ４８は、あくまでも機能上のものであり、例えば、１台のコンピュータ機器で一体に構成してもよいし、複数台のコンピュータ機器で個別に構成してもよい。
システムの基本的な処理の例
本発明の融解曲線解析システムの基本的な処理の例を、図５のフローチャートに示す。以下、同図にしたがって、処理の流れを説明する。なお、本発明のシステムにおける各処理ステップは、例えば、ＣＰＵ、主メモリ、バス、あるいは、二次記憶装置、印刷装置やディスプレイ、その他の外部周辺装置等のハードウェア構成部や、その外部周辺機器用の入出力ポート（Ｉ／Ｏポート）、それらハードウェアを制御するためのドライバプログラムやその他のアプリケーションプログラムなどを適宜利用することで実行できる。
［１］
各温度におけるシグナル微分値を入力する。
［２］
最も高いシグナル微分値（Ａ）を検索する。
［３］
シグナル微分値（Ａ）の温度が、温度範囲ＴＨおよびＴＬのいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれるかを判断する。
［３−１：Ｎｏ］
前記［３］がＮｏの場合、ピークなしと決定する。
［４：Ｙｅｓ］
前記［３］がＹｅｓの場合、シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定する。
［５］
シグナル微分値（Ｃ）およびシグナル微分値（Ｄ）が存在するかを検索する。
［５−１：Ｎｏ］
前記［５］がＮｏの場合、第２ピークなしと決定する。
［６］
前記［５］がＹｅｓの場合、シグナル微分値（Ａ）、（Ｃ）および（Ｄ）から演算したＸが、［Ｘ＞閾値］を満たすか判断する。
［７：Ｙｅｓ］
前記［６］がＹｅｓの場合、シグナル微分値（Ｄ）の温度が、温度範囲ＴＨおよびＴＬのうち、前記温度範囲（Ｔ１）ではない他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれるかを判断する。
［７−１：Ｎｏ］
前記［７］がＮｏの場合、第２ピークなしと決定する。
［８：Ｙｅｓ］
前記［７］がＹｅｓの場合、シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定する。
［６−１：Ｎｏ］
前記［６］がＮｏの場合、温度範囲（Ｔ１）と温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値をそれぞれ積算し、温度範囲（Ｔ１）の積算値Ｙ１と温度範囲（Ｔ２）の積算値Ｙ２をそれぞれ求める。
［９］
前記温度範囲（Ｔ１）の積算値Ｙ１と温度範囲（Ｔ２）の積算値Ｙ２からＹを演算し、前記Ｙが、［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たすか否かを判断する。
［９−１：Ｎｏ］
前記［９］がＮｏの場合、第２ピークなしと決定する。
［１０：Ｙｅｓ］
前記［９］がＹｅｓの場合、シグナル積分値（Ｄ）を第２ピークとして決定する。
さらに、第１ピークおよび第２ピークの有無の判断から、多型がヘテロ接合性かホモ接合性であるかを判断する処理の例を、図６のフローチャートに示す。特に示さない限り、前記図５と同様である。
［３−１’］
前記［３−１］でピークなしと判断した場合、標的核酸なしと判定する。
［５−１’］
前記［５−１］で第２ピークなしと判断した場合、ホモ接合性と判定する。
［７−１’］
前記［７−１］で第２ピークなしと判断した場合、ホモ接合性と判定する。
［８’］
前記［８］でシグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定した場合、ヘテロ接合性と判定する。
［９−１’］
前記［９-１］で第２ピークなしと判断した場合、ホモ接合性と判定する。
［１０’］
前記［１０］でシグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定した場合、ヘテロ接合性と判定する。
さらに、第２ピークなしとの判断からホモ接合性との判定に到った際、多型が野生型であるか変異型であるかを判断する処理の例を、図７（ａ）、（ｂ）のフローチャートに示す。特に示さない限り、前記図５および図６と同様である。なお、図７（ａ）、（ｂ）は、図６における「Ａ」に続くフローチャートである。
検出用核酸の種類に応じて以下のように判断する。
［１１ｂ］
前記検出用核酸が、変異型検出用ポリヌクレオチド（変異型検出用核酸）である場合
［１２ｂ］
第１ピークを示す温度が温度範囲ＴＨに含まれるかを判断する。
［１２−１ｂ：Ｙｅｓ］
前記［１２ｂ］がＹｅｓの場合、変異型のホモ接合体と判定する。
［１２−２ｂ：Ｎｏ］
前記［１２ｂ］がＮｏの場合、野生型のホモ接合体と判定する。
［１１ｃ］
前記検出用核酸が、野生型検出用ポリヌクレオチド（野生型検出用核酸）である場合
［１２ｃ］
第１ピークを示す温度が温度範囲ＴＨに含まれるかを判断する。
［１２−１ｃ：Ｙｅｓ］
前記［１２ｃ］がＹｅｓの場合、野生型のホモ接合体と判定する。
［１２−２ｃ：Ｎｏ］
前記［１２ｃ］がＮｏの場合、変異型のホモ接合体と判定する。
［１１ｄ］
前記検出用核酸が、変異型検出用ポリヌクレオチド（変異型検出用核酸）である場合
［１２ｄ］
第１ピークを示す温度が温度範囲ＴＬに含まれるかを判断する。
［１２−１ｄ：Ｙｅｓ］
前記［１２ｄ］がＹｅｓの場合、野生型のホモ接合体と判定する。
［１２−２ｄ：Ｎｏ］
前記［１２ｄ］がＮｏの場合、変異型のホモ接合体と判定する。
［１１ｅ］
前記検出用核酸が、野生型検出用ポリヌクレオチド（野生型検出用核酸）である場合
［１２ｅ］
第１ピークを示す温度が温度範囲ＴＬに含まれるかを判断する。
［１２−１ｅ：Ｙｅｓ］
前記［１２ｅ］がＹｅｓの場合、変異型のホモ接合体と判定する。
［１２−２ｅ：Ｎｏ］
前記［１２ｅ］がＮｏの場合、野生型のホモ接合体と判定する。
第１ピークを示す温度が温度範囲ＴＨに含まれるかを判断する。
以上のように、本発明によれば、前述のような演算を利用することにより、融解曲線の所定の２つの温度範囲の少なくとも一方におけるピークの有無を解析することができる。このため、例えば、従来のように、解析を行う個人の判定基準の違いや、専門的知識が必要とされるというような問題がないことから、融解曲線の解析を容易に行うことができ、また、自動化も可能となる。したがって、本発明は、例えば、一般的な分析や診断の現場においても使用することができ、また、例えば、多量の検体についても解析が可能であることから、特に、遺伝子解析の分野において、極めて有用な技術といえる。

Claims (20)

  1. サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）の少なくとも一方にピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析方法であって、
    各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を準備する微分値準備工程、
    前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索工程、
    および、
    前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定工程
    を含む融解曲線解析方法。
  2. さらに、前記第１ピークが存在すると決定した場合、前記第１ピークが存在しない他方の温度範囲に第２ピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析方法であり、
    さらに、
    前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索工程、
    および、
    前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定工程、
    を含む、請求の範囲１記載の融解曲線解析方法。
  3. 前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、
    さらに、
    前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて下記式の演算を行う演算工程
    Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）
    、および、
    前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定工程
    を含む請求の範囲２記載の融解曲線解析方法。
  4. 前記Ｘが「Ｘ≧閾値」を満たす場合、
    さらに、
    前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算工程、
    前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算工程
    Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
    、および、
    前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定工程
    を含む請求の範囲３記載の融解曲線解析方法。
  5. 前記融解曲線解析方法が、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析方法であり、
    各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を準備する微分値準備工程、
    前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索工程、
    前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定工程、
    第１ピークが存在する場合、前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索工程、
    前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定し、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定工程、
    前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、
    前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて下記式の演算を行う演算工程、
    Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）
    前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定工程、
    前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合、前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算工程、
    前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算工程
    Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
    、および、
    前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定工程
    を含む、請求の範囲１記載の融解曲線解析方法。
  6. 前記微分値準備工程において、各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値を微分して、前記各温度におけるシグナル微分値を得る、請求の範囲１記載の融解曲線解析方法。
  7. さらに、前記微分値準備工程において準備した前記各温度におけるシグナル微分値について、連続するシグナル微分値間の多項演算を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得る多項演算工程を含み、
    前記多項演算工程において得られた前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を、他の工程において、前記各温度におけるシグナル微分値として使用する、請求の範囲１記載の融解曲線解析方法。
  8. 前記多項演算工程において、前記微分値準備工程において準備した各温度におけるシグナル微分値について、それぞれ、下記式に基づいて多項演算を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得る、請求の範囲７記載の融解曲線解析方法。
    多項演算値＝（ＰＭ−１＋ＰＭ＋ＰＭ＋１）
    前記式において、
    ＰＭは、任意の点（Ｍ）におけるシグナル微分値、ＰＭ−１は、前記任意の点（Ｍ）の直前の点（Ｍ−１）におけるシグナル微分値、ＰＭ＋１は、前記任意の点（Ｍ）の直後の点におけるシグナル微分値であり、Ｍは、２以上の正整数である。
  9. サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）にピーク（第１ピーク）が存在する場合、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち他方の温度範囲（Ｔ２）にピーク（第２ピーク）が存在するか否かを判定する第２ピーク判定方法であって、
    各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を準備する微分値準備工程、
    前記一方の温度範囲（Ｔ１）における前記シグナル微分値、および、前記他方の温度範囲（Ｔ２）における前記シグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算工程、
    前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算工程
    Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
    、および、
    前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、第２ピークありと決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第２ピーク判定工程
    を含む第２ピーク判定方法。
  10. サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）の少なくとも一方にピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムであって、
    各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
    前記微分値入力部により入力された前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索部、
    および、
    前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定部
    を含む融解曲線解析システム。
  11. さらに、前記第１ピークが存在すると決定した場合、前記第１ピークが存在しない他方の温度範囲に第２ピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムであり、
    さらに、
    前記微分値入力部により入力された前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索部、
    および、
    前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定部
    を含む、請求の範囲１０記載の融解曲線解析システム。
  12. さらに、
    前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて下記式の演算を行う演算部
    Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）
    、および、
    前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定部
    を含む、請求の範囲１１記載の融解曲線解析システム。
  13. さらに、
    前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
    前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算部
    Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
    、および、
    前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定部
    を含む、請求の範囲１２記載の融解曲線解析システム。
  14. 前記融解曲線解析システムが、サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のそれぞれにピークが存在するか否かを解析する融解曲線解析システムであり、
    各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
    前記微分値入力部により入力された前記各温度における前記シグナル微分値から、第１ピークの候補として、その絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ａ）を検索する第１ピーク候補検索部、
    前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ａ）を第１ピークとして決定し、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）が、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のいずれにも含まれない場合、ピークなしと決定する第１ピーク判定部、
    第１ピークが存在する場合、前記微分値入力部により入力された前記各温度におけるシグナル微分値から、前記シグナル微分値（Ａ）を示す温度（ｔ１）を始点として、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち前記温度（ｔ１）を含む一方の温度範囲（Ｔ１）から他方の温度範囲（Ｔ２）に向かって、絶対値が減少から増加に変化する直前または直後であり且つ前記絶対値が最も小さいシグナル微分値（Ｃ）、および、第２ピークの候補となる、前記絶対値が増加から減少に変化する直前または直後であり且つ前記シグナル微分値（Ａ）に次いで絶対値が最も大きいシグナル微分値（Ｄ）を検索する第２ピーク候補検索部、
    前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在する場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークの候補として決定し、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）が存在しない場合、第２ピークなしと決定する第１の第２ピーク判定部、
    前記シグナル微分値（Ａ）、前記シグナル微分値（Ｃ）および前記シグナル微分値（Ｄ）を用いて下記式の演算を行う演算部、
    Ｘ＝（Ａ−Ｃ）／（Ｄ−Ｃ）
    前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれる場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｘが［Ｘ＜所定閾値］を満たし且つ前記シグナル微分値（Ｄ）を示す温度（ｔ２）が前記他方の温度範囲（Ｔ２）に含まれない場合、第２ピークなしと決定する第２の第２ピーク判定部、
    前記Ｘが［Ｘ≧所定閾値］を満たす場合、前記温度（ｔ１）を含む前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値、および、前記温度（ｔ２）を含む前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
    前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算部
    Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
    、および、
    前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、前記シグナル微分値（Ｄ）を第２ピークとして決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第３の第２ピーク判定部
    を含む、請求の範囲１０記載の融解曲線解析システム。
  15. さらに、各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値を微分して、前記各温度におけるシグナル微分値を得る微分演算部を含む、請求の範囲１０記載の融解曲線解析システム。
  16. さらに、前記微分値入力部により入力された前記各温度におけるシグナル微分値について、連続するシグナル微分値間の多項演算を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得る多項演算部を含み、
    他の各部は、前記多項演算部により得られた前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を、前記各温度におけるシグナル微分値として使用する、請求の範囲１０記載の融解曲線解析システム。
  17. 前記多項演算部は、前記微分値入力部により入力された各温度におけるシグナル微分値について、それぞれ、下記式に基づいて多項演算を行い、前記各温度におけるシグナル微分値の多項演算値を得る、請求の範囲１６記載の融解曲線解析システム。
    多項演算値＝（ＰＭ−１＋ＰＭ＋ＰＭ＋１）
    前記式において、
    ＰＭは、任意の点（Ｍ）におけるシグナル微分値、ＰＭ−１は、前記任意の点（Ｍ）の直前の点（Ｍ−１）におけるシグナル微分値、ＰＭ＋１は、前記任意の点（Ｍ）の直後の点におけるシグナル微分値であり、Ｍは、２以上の正整数である。
  18. サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）にピーク（第１ピーク）が存在する場合、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち他方の温度範囲（Ｔ２）にピーク（第２ピーク）が存在するか否かを判定する第２ピーク判定システムであって、
    各温度におけるサンプルの融解状態を示すシグナル値の微分値を入力する微分値入力部、
    前記一方の温度範囲（Ｔ１）における前記シグナル微分値、および、前記他方の温度範囲（Ｔ２）における前記シグナル微分値を、それぞれ積分して、前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を得る積分演算部、
    前記一方の温度範囲（Ｔ１）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ１）および前記他方の温度範囲（Ｔ２）におけるシグナル微分値の積分値（Ｙ２）を用いて下記式の演算を行う演算部
    Ｙ＝Ｙ１／Ｙ２
    、および、
    前記Ｙが［１≦Ｙ≦所定の閾値］を満たす場合、第２ピークありと決定し、前記Ｙが［Ｙ＞所定の閾値］または［Ｙ＜１］を満たす場合、第２ピークなしと決定する第２ピーク判定部
    を含む第２ピーク判定システム。
  19. サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）の少なくとも一方に温度範囲（Ｔ１）にピーク（第１ピーク）が存在するか否かを解析する融解曲線解析装置であって、
    請求の範囲１０記載の融解曲線解析システムを含む融解曲線解析装置。
  20. サンプルの融解曲線において、相対的に高い所定の温度範囲（ＴＨ）および相対的に低い所定の温度範囲（ＴＬ）のいずれか一方の温度範囲（Ｔ１）にピーク（第１ピーク）が存在する場合、前記温度範囲（ＴＨ）および前記温度範囲（ＴＬ）のうち他方の温度範囲（Ｔ２）にピーク（第２ピーク）が存在するか否かを判定する第２ピーク判定装置であって、
    請求の範囲１８記載の第２ピーク判定システムを含む第２ピーク判定装置。
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