KR102408564B1 - 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널 - Google Patents

타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널 Download PDF

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Abstract

본 발명은 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 현저히 개선하는데 기여할 수 있다. 본 발명은 타겟 핵산 서열의 검출에 영향을 미칠 수 있는 시그널 영역을 제거하거나 조정함으로써, 보다 정확하고, 효과적이고, 재현가능한 방식으로 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.

Description

타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널{ANALYTICAL SIGNAL FOR DETERMINATION OF THE PRESENCE OF A TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCE}
본 발명은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는 방법에 관한 것이다.
타겟 핵산 서열의 검출을 위해, 실시간 방식으로 타겟 증폭을 모니터링하면서 타겟 핵산 서열을 검출하는 실시간 검출 방법이 널리 사용되고 있다. 실시간 검출 방법은 일반적으로 타겟 핵산 서열과 특이적으로 혼성화되는 표지된 프로브 또는 프라이머를 사용한다. 표지된 프로브와 타겟 핵산 서열 간의 혼성화를 이용하는 방법의 예로는 헤어핀 구조를 갖는 이중 표지된 프로브를 이용한 Molecular beacon 방법(Tyagi et al., Nature Biotechnology v.14 MARCH 1996), HyBeacon 방법(French DJ et al., Mol. Cell Probes, 15(6):363-374(2001)), 공여체 및 수용체로 각각 표지된 2개의 프로브를 이용한 혼성화 프로브 방법(Bernad et al, 147-148 Clin Chem 2000; 46) 및 단일 표지된 올리고뉴클레오타이드를 이용한 Lux 방법(미국 특허 제7,537,886호)이 있다. 이중 표지된 프로브와 DNA 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성에 의한 상기 프로브의 절단을 이용한 TaqMan 방법(미국 특허 제5,210,015호 및 제5,538,848호)이 본 기술분야에서 널리 이용되고 있다.
표지된 프라이머를 이용한 방법의 예로는 Sunrise 프라이머 방법(Nazarenko et al, 2516-2521 Nucleic Acids Research, 1997, v.25 no.12, 및 미국 특허 제6,117,635호), Scorpion 프라이머 방법(Whitcombe et al, 804-807, Nature Biotechnology v.17 AUGUST 1999 및 미국 특허 제6,326,145) 및 TSG 프라이머 방법(WO 2011/078441)이 있다.
대안적인 방법으로서, 타겟 핵산 서열의 존재시 형성되는 이합체를 이용한 실시간 검출 방법이 제안되어 왔다: Invader 분석(미국 특허 제5,691,142호, 제6,358,691호 및 제6,194,149호), PTOCE(PTO cleavage AND extension) 방법(WO 제2012/096523호), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 제2013/115442호), PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(WO 2014/104818).
상기 기술된 종래의 실시간 검출 기술은 타겟 증폭과 관련되거나 관련되지 않은 시그널 증폭 공정에서 선택된 하나의 검출 온도에서 형광 표지로부터 발생된 시그널을 검출한다. 종래의 실시간 검출 기술에 따라 단일 반응 튜브 내에서 단일 유형의 표지를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 때, 타겟 핵산 서열에 대해 발생한 시그널들은 서로 구별되지 않는다. 따라서, 종래의 실시간 검출 기술은 일반적으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 상이한 유형의 표지를 사용한다. Tm 차이를 사용한 멜팅 분석은 단일 유형의 표지를 사용하는 경우에도 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다. 그러나, 멜팅 분석은 실시간 기술보다 실시 시간이 더 길고 타겟 서열의 증가시 상이한 Tm 값을 갖는 프로브의 설계가 더 어려워진다.
따라서, 멜팅 분석에 의존하지 않는, 단일 반응 용기 내에서 단일 유형의 표지 및 단일 유형의 검출기를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 새로운 방법 또는 접근법이 개발된다면, 현저히 향상된 편의성, 비용 효과 및 효율성으로 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있을 것이다. 또한, 상기 새로운 방법과 다른 검출 방법(예컨대, 멜팅 분석)의 조합은 현저하게 향상된 효율성으로 단일 반응 용기에서 단일 유형의 표지를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출할 것이다.
이를 위해, 본 발명자들은 단일 반응 용기에서 단일 유형의 검출기를 사용하여 복수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 개시하였다(WO 제2015/147412호). 상기 방법에 따르면, 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 존재는 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 간의 차이에 의해 결정될 수 있다. 특히, 상대적 저온 검출 온도 및 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 강도가 서로 상이하다는 발견에 기초하여, 본 발명자들은 상이한 검출 온도에서의 시그널의 변화의 관계를 나타내는 기준값을 도입하여 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 간의 차이를 수득하였다.
전형적으로, 기준값은 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열만을 함유하는 대조군 샘플을 사용하여 반복 실험을 통해 특정 범위의 값을 획득한 다음 상기 획득된 값 중에서 적합한 값을 선택함으로써 미리 결정된다. 그러나, 부적절한 기준값의 선택은 일부 반응에서 잘못된 결과로 이어질 수 있음이 관찰되었다.
따라서, 이러한 잘못된 결과가 없도록, 보다 정확한 방식으로 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는 새로운 방법을 개발할 필요가 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 다양한 특허 및 문헌이 참조되고 그 인용이 괄호 안에 제공되어 있다. 본 발명 및 본 발명이 속하는 기술 분야를 보다 명확하게 설명하기 위하여 이러한 특허 및 문헌의 내용은 그 전체가 참조로 본원에 포함되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하기 위한 장치를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다.
I. 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널의 제공
본 발명의 일 양태에서, 하기를 포함하는, 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는 방법이 제공된다:
(a) 단일 반응 용기에서 샘플을 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제1 시그널 발생 수단 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제2 시그널 발생 수단과 함께 인큐베이션하고, 시그널을 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 단일 유형의 검출기에 의해 검출하는 단계로서; 상기 인큐베이션은 시그널 발생 과정에 의해 실시되고; 상기 검출은 시그널 발생 과정의 하나 이상의 사이클에서 실시되어 하나 이상의 사이클 각각에서 시그널 값을 얻고; 상기 2개의 시그널 발생 수단에 의해 발생되는 2개의 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며;
(b) 단계 (a)에서 얻은 시그널 값을 제2 기준값을 사용하여 가공하여 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하거나 또는 단계 (a)에서 얻은 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 가공하여 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이고, 상기 제2 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이며; 상기 제1 기준값은 제1 타겟 핵산 서열 및 제1 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되고, 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열 및 제2 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되며;
(c) 상기 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널에서 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하는 단계; 및
(d) 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공하는 단계.
본 발명은 하기와 같이 도 1 내지 4의 흐름도를 참조하여 보다 상세하게 설명될 것이다:
단계 (a): 인큐베이션 및 시그널 검출(S110; S210; S310; S410)
단계 (a)에서, 단일 반응 용기에서 샘플을 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제1 시그널 발생 수단 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제2 시그널 발생 수단과 함께 인큐베이션한다. 이후, 시그널을 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 단일 유형의 검출기에 의해 검출한다.
본원에 사용된 용어 "샘플"은 본 발명의 방법을 겪는 임의의 물질을 의미한다. 특히, 용어 "샘플"은 관심 핵산(제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열 중 하나 또는 모두)을 함유하거나 함유할 것으로 추정되는 임의의 물질 또는 관심 타겟 핵산 서열을 함유하거나 함유할 것으로 추정되는 핵산 자체인 임의의 물질을 의미한다. 더욱 특히, 본원에 사용된 용어 "샘플"은 생물학적 샘플(예컨대, 생물학적 공급원으로부터의 세포, 조직, 및 유체) 및 비생물학적 샘플(예컨대, 음식, 물 및 토양)을 포함한다. 생물학적 샘플은, 비제한적으로, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 객담, 스왑(swab), 흡인물, 기관지 폐포 세척액, 우유, 소변, 대변, 안구액, 타액, 정액, 뇌 추출물, 척수액(SCF), 충수, 비장 및 편도 조직 추출물, 양수 및 복수를 포함한다. 또한, 샘플은 생물학적 공급원으로부터 단리된 자연발생 핵산 분자 및 합성 핵산 분자를 포함할 수 있다. 본원에서 샘플은 핵산 추출 과정에 놓여지거나 놓여지지 않는 것을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "타겟 핵산", "타겟 핵산 서열" 또는 "타겟 서열"은 분석, 검출 또는 정량을 위한 관심 핵산 서열을 의미한다. 타겟 핵산 서열은 이중 가닥뿐만 아니라 단일 가닥의 서열을 포함한다. 타겟 핵산 서열은 샘플 내에 초기에 존재하는 서열뿐만 아니라 반응에서 새롭게 생성된 서열을 포함한다.
타겟 핵산 서열은 임의의 DNA(gDNA 및 cDNA), RNA 분자 및 이들의 혼성체(키메라 핵산)를 포함할 수 있다. 상기 서열은 이중 가닥 또는 단일 가닥 형태일 수 있다. 출발 물질로서 핵산이 이중 가닥인 경우, 상기 두 가닥을 단일 가닥 또는 부분적 단일 가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥을 분리하기 위한 알려진 방법은, 비제한적으로, 가열, 알칼리, 포름아미드, 우레아, 글리콕살 처리, 효소적 방법(예컨대, 헬리카아제 작용), 및 결합 단백질을 포함한다. 예를 들어, 가닥 분리는 80℃ 내지 105℃ 범위의 온도에서 가열함으로써 달성될 수 있다. 이러한 처리를 달성하기 위한 일반적인 방법은 문헌[Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)]에 의해 제공된다.
타겟 핵산 서열은 임의의 자연발생 원핵세포, 진핵세포(예를 들어, 원생동물 및 기생동물, 균류, 효모, 고등 식물, 하등 및 포유동물 및 인간을 포함하는 고등 동물), 바이러스(예를 들어, 헤르페스 바이러스, HIV, 인플루엔자 바이러스, 엡스타인-바 바이러스, 간염 바이러스, 폴리오 바이러스 등), 또는 비로이드 핵산을 포함한다. 또한, 상기 핵산 분자는 재조합에 의해 생산되거나 생산될 수 있는 또는 화학적으로 생산되거나 생산될 수 있는 임의의 핵산 분자일 수 있다. 따라서, 상기 핵산 서열은 자연에서 발견되거나 발견되지 않을 수 있다.
타겟 핵산 서열은 지정된 시점에 알려진 서열 또는 지정된 시점 이후로 이용가능한 서열로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 대신에 현재 또는 미래의 어느 시점에 이용가능하거나 알려질 수 있는 서열을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 타겟 핵산 서열은 본 발명의 방법을 실시하는 시점에 알려지거나 알려지지 않을 수 있다. 미지의 타겟 핵산 서열의 경우, 그의 서열은 본 발명의 방법을 실시하기 전에 종래의 시퀀싱 방법 중 하나에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 타겟 핵산 서열은 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 포함한다. 용어 "제1 타겟 핵산 서열" 및 "제2 타겟 핵산 서열"은 2개의 상이한 타겟 핵산 서열을 구별하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열은 관심있는 2개의 상이한 유전자, 2개의 상이한 유전자 영역 또는 2개의 상이한 DNA 서열일 수 있다. 특히, 제1 타겟 핵산 서열은 하나의 유기체로부터 유래될 수 있는 반면, 제2 타겟 핵산 서열은 또 다른 유기체로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 뉴클레오타이드 변이를 포함하거나, 또는 2개의 타겟 핵산 서열 중 하나는 한 가지 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함하고, 다른 하나는 다른 유형의 뉴클레오타이드 변이를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 서열이 유사한 연속의 DNA 세그먼트 중 특정 위치의 DNA 서열에서의 임의의 단일 또는 복수의 뉴클레오타이드 치환, 결실 또는 삽입을 의미한다. 이러한 연속적 DNA 세그먼트들은 하나의 유전자 또는 하나의 염색체의 임의의 다른 부위를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이는 돌연변이(mutant) 또는 다형성 대립유전자 변이(polymorphic allele variations)일 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 검출되는 뉴클레오타이드 변이는 단일 뉴클레오타이드 다형성(single nucleotide polymorphism; SNP), 돌연변이(mutation), 결실, 삽입, 치환 및 전좌를 포함한다. 뉴클레오타이드 변이의 예는, 인간 게놈 내의 다양한 변이(예컨대, 메틸렌사수소 엽산 환원효소(methylenetetrahydrofolate reductase; MTHFR) 유전자의 변이), 병원체의 약제 내성과 관련된 변이 및 종양 형성-유발 변이를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 핵산 서열의 특정 위치에서의 임의의 변이를 포함한다. 즉, 용어 "뉴클레오타이드 변이"는 핵산 서열의 특정 위치에서의 야생형 및 그의 임의의 돌연변이형을 포함한다.
본 발명에 따르면, 샘플(또는 샘플 내의 타겟 핵산 서열)은 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 얻기 위해 2개의 시그널 발생 수단과 함께 인큐베이션된다.
본원에 사용된 용어 "인큐베이션하는," "인큐베이션하다," 또는 "인큐베이션"은 상호작용 또는 반응을 위해 성분들을 합치는 것을 의미한다. 특히, 상기 용어는 본원의 성분들이 시그널 발생 과정을 거치게 하는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "시그널"은 측정가능한 산출물을 의미한다.
시그널 변화는 분석물질(타겟 핵산 서열)의 존재 또는 부존재를 정량적으로 또는 정성적으로 나타내는 지표의 역할을 할 수 있다.
유용한 지표의 예는 형광 강도, 발광 강도, 화학발광 강도, 생물발광 강도, 인광 강도, 전하 전달, 전압, 전류, 전력, 에너지, 온도, 점도, 광산란, 방사선 강도, 반사력, 투과도, 흡광도를 포함한다. 가장 널리 사용되는 지표는 형광 강도이다.
시그널은 시그널 검출로부터의 다양한 시그널 특징, 예컨대, 시그널 강도[예컨대, RFU(relative fluorescence unit) 값 또는 증폭을 실시하는 경우, 특정 사이클에서, 선택된 사이클에서 또는 마지막 지점에서의 RFU 값], 시그널 변화 모양(또는 패턴) 또는 Ct 값, 또는 상기 특징을 수학적으로 가공함으로써 수득된 값을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 기준값 또는 샘플 분석과 함께 사용되는 용어 "시그널" 은 검출 온도에서 수득된 시그널 자체뿐만 아니라 상기 시그널을 수학적으로 가공하여 제공된 변형된 시그널을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 실시간 PCR에 의해 증폭 곡선을 얻는 경우, 증폭 곡선으로부터 다양한 시그널 값(또는 특징)이 선택되고 타겟 존재를 결정하는데 사용될 수 있다(강도, Ct 값 또는 증폭 곡선 데이터).
본원에 사용된 용어 "제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널" 및 "제2 타겟 핵산 서열"은 각각 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열을 나타내는 시그널을 의미한다. 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 유의한 수준은 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재를 나타낸다. 반면, 시그널의 유의하지 않은 수준(예컨대, 백그라운드 시그널)은 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 부존재를 나타낸다.
시그널(특히, 시그널 강도)은 그의 검출 온도뿐만 아니라 사용된 시그널 발생 수단에 따라 달라질 수 있다.
본원에서 인큐베이션은 시그널 발생 수단을 사용한 시그널 발생 과정에 의해 실시된다.
본원에 사용된 용어 "시그널 발생 과정"은 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시킬 수 있는 임의의 과정을 의미한다.
본원에서 사용된 용어 "시그널 발생 수단"은 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널의 발생에 사용되는 임의의 물질을 의미하며, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드, 표지 및 효소를 포함한다. 택일적으로, 본원에 사용된 용어 "시그널 발생 수단"은 시그널 발생을 위한 물질을 사용하는 임의의 방법을 의미하기 위해 사용될 수 있다.
특히, 본원에서 사용된 용어 "제1 시그널 발생 수단" 및 "제2 시그널 발생 수단"은 각각 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시키기 위한 수단을 의미한다. 제1 시그널 발생 수단 및 제2 시그널 발생 수단은 시그널 발생에 사용되는 공통 성분(예컨대, 단일 유형의 표지 및 단일 유형의 효소) 또는 상이한 성분(예컨대, 상이한 유형의 올리고뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다. 특히, 제1 시그널 발생 수단 및 제2 시그널 발생 수단은 단일 유형의 표지(동일한 표지)를 갖는 것을 특징으로 한다. 따라서, 제1 시그널 발생 수단의 표지로부터 유래된 시그널은 제2 시그널 발생 수단의 표지로부터 유래된 시그널과 종래의 방법에 의해 구별되지 않는다.
다양한 시그널 발생 수단이 당업자에게 알려져 있다. 시그널 발생 수단은 표지 자체 및 표지를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 모두 포함한다. 표지는 형광 표지, 발광 표지, 화학발광 표지, 전기화학적 표지 및 금속 표지를 포함한다. 표지 자체, 예를 들어, 인터컬레이팅 염료가 시그널 발생 수단으로서 사용될 수 있다. 택일적으로, 단일 표지 또는 공여 분자 및 수용 분자를 포함하는 상호작용적 이중 표지가 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드에 결합된 형태로 시그널 발생 수단으로서 사용될 수 있다.
시그널 발생 수단은 핵산분해 효소(예컨대, 5'-뉴클레아제 및 3'-뉴클레아제)와 같이 시그널을 발생시키기 위한 추가의 성분을 포함할 수 있다.
시그널 발생 과정은 시그널 변화를 수반한다. 시그널 변화는 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부존재를 정량적으로 또는 정성적으로 나타내는 지표로서의 역할을 할 수 있다.
"시그널 발생 과정"의 세부사항은 본 발명자들에 의해 출원된 WO 제2015/147412호에 개시되어 있으며, 이의 교시는 그 전체가 참고로 본원에 포함되어 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널 발생 과정은 시그널 증폭 과정이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 시그널 발생 과정은 타겟 핵산 서열의 증폭이 수반되거나 증폭이 수반되지 않는 과정이다.
특히, 시그널 발생 과정은 타겟 핵산 분자의 증폭이 수반되는 과정이다. 더욱 특히, 시그널 발생 과정은 타겟 핵산 분자의 증폭이 수반되고 타겟 핵산 분자의 증폭시 시그널을 증가시키거나 감소시킬 수 있는(특히, 시그널을 증가시킬 수 있는) 과정이다.
본원에 사용된 용어 "시그널 발생"은 시그널의 출현 또는 소멸 및 시그널의 증가 또는 감소를 포함한다. 특히, 용어 "시그널 발생"은 시그널의 증가를 의미한다.
시그널 발생 과정은 당업자에게 알려진 많은 방법에 따라 실시될 수 있다. 상기 방법은 TaqManTM 프로브 방법(미국 특허 제5,210,015호), Molecular Beacon 방법(Tyagi et al., Nature Biotechnology, 14 (3):303(1996)), Scorpion 방법(Whitcombe et al., Nature Biotechnology 17:804-807(1999)), Sunrise 또는 Amplifluor 방법(Nazarenko et al., Nucleic Acids Research, 25(12):2516-2521(1997), 및 미국 특허 제6,117,635호), Lux 방법(미국 특허 제7,537,886호), CPT(Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148(1990)), LNA 방법(미국 특허 제6,977,295호), Plexor 방법(Sherrill CB, et al., Journal of the American Chemical Society, 126:4550-4556(2004)), HybeaconsTM(D. J. French, et al., Molecular and Cellular Probes (2001) 13, 363-374 및 미국 특허 제7,348,141호), 이중 표지된, 자가-퀀칭된 프로브(미국 특허 제5,876,930호), 혼성화 프로브(Bernard PS, et al., Clin Chem 2000, 46, 147-148), PTOCE(PTO cleavage and extension) 방법(WO 제2012/096523호), PCE-SH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization) 방법(WO 제2013/115442호) 및 PCE-NH(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization) 방법(WO 제2014/104818호) 및 CER 방법(WO 제2011/037306호)을 포함한다.
시그널 발생 과정이 TaqManTM 프로브 방법에 따라 실시되는 경우, 시그널 발생 수단은 프라이머 쌍, 상호작용적 이중 표지를 갖는 프로브 및 5' -> 3' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 포함한다. 시그널 발생 과정이 PTOCE 방법에 따라 실시되는 경우, 시그널 발생 수단은 프라이머 쌍, PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide), CTO(Capturing and Templating Oligonucleotide) 및 5' -> 3' 뉴클레아제 활성을 갖는 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. PTO 또는 CTO는 적합한 표지로 표지될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 시그널 발생 과정은 타겟 증폭과 함께 시그널 증폭을 포함하는 과정으로 실시된다.
일 구현예에 따르면, 시그널 발생 과정으로서 증폭 반응은 타겟 핵산 서열의 증폭과 동시에 시그널이 증폭되는 방식으로 실시된다(예컨대, 실시간 PCR). 택일적으로, 증폭 반응은 타겟 핵산 분자의 증폭을 수반하지 않고 시그널이 증폭되는 방식으로 실시된다[예컨대, CPT 방법(Duck P, et al., Biotechniques, 9:142-148 (1990)), 인베이더 분석(미국 특허 제6,358,691호 및 제6,194,149호)].
타겟 핵산 분자를 증폭하는 다양한 방법이 알려져 있으며, 이는 비제한적으로 PCR(polymerase chain reaction), LCR(ligase chain reaction, Wiedmann M, et al., "Ligase chain reaction (LCR)-overview and applications." PCR methods and Applications 1994 Feb; 3(4):S51-64 참고), GLCR(gap filling LCR, see WO 제90/01069호, EP 제439182호 및 WO 제93/00447호), Q-beta(Q-beta replicase amplification, Cahill P, et al., Clin Chem., 37(9):1482-5(1991), 미국 특허 제5556751호 참고), SDA(strand displacement amplification, G T Walker et al., Nucleic Acids Res. 20(7):16911696(1992), EP 제497272호 참고), NASBA(nucleic acid sequence-based amplification, Compton, J. Nature 350(6313):912(1991) 참고), TMA(Transcription-Mediated Amplification, Hofmann WP et al., J Clin Virol. 32(4):289-93(2005); 미국 특허 제5888779호 참고) 또는 RCA(Rolling Circle Amplification, Hutchison C.A. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA. 102:1733217336(2005) 참고)를 포함한다.
샘플의 인큐베이션 후, 2개의 시그널 발생 수단(즉, 제1 시그널 발생 수단 및 제2-시그널 발생 수단)으로부터의 시그널은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된다.
본 발명은 검출 온도에 비추어 임의의 유형의 시그널 발생 수단을 사용하여 실시될 수 있다. 2개의 시그널 발생 수단 중 하나는 타겟 핵산 서열의 존재 하에 2개의 검출 온도 모두에서 시그널을 제공하도록 설계되고 다른 하나는 상응하는 타겟 핵산 서열의 존재 하에 상대적 저온 검출 온도에서만 시그널을 제공하도록 설계될 수 있다. 택일적으로, 2개의 시그널 발생 수단 모두는 상응하는 타겟 핵산 서열의 존재 하에 2개의 검출 온도 모두에서 시그널을 제공하도록 설계될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 검출 온도는 시그널 발생 수단에 의해 시그널을 발생시키는 온도 범위를 고려하여 미리 결정된다. 검출 온도는 상대적 고온 검출 온도(예컨대, 72oC) 및 상대적 저온 검출 온도(예컨대, 60oC)를 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상대적 고온 검출 온도는 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 온도이고, 상대적 저온 검출 온도는 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이다.
또 다른 구현예에서, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도는 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 상대적 고온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 모두를 발생시킬 수 있는 온도이다.
본 발명의 한 가지 특징은 상이한 검출 온도에서 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 나타내는 시그널을 검출함으로써 2개의 타겟 핵산 서열의 존재를 구별하여 결정하는 것이다.
일 구현예에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대한 검출 온도는 시그널 발생 수단에 의해 시그널을 발생시키는 온도 범위를 고려하여 미리 결정된다.
본 발명은 시그널 발생 수단에 의존적인 방식으로 시그널을 발생시키는 특정 온도 범위가 존재한다는 사실에 기초한다.
예를 들어, 시그널 발생 수단이 2개의 핵산 분자 사이의 혼성화(또는 결합)시에 시그널을 발생시키고 이들 사이의 비혼성화(또는 해리)시에 시그널을 발생시키지 않는 경우, 2개의 핵산 분자 사이에 혼성화를 가능하게 하는 온도에서 시그널이 발생하지만, 2개의 핵산 분자 간에 혼성화하지 못하는 온도에서는 시그널이 발생하지 않는다. 이와 같이, 시그널을 발생(즉, 시그널 검출)시키는 특정 온도 범위와 시그널을 발생시키지 않는 다른 온도 범위가 존재한다. 상기 온도 범위는 시그널 발생 수단에 사용된 2개의 핵산 분자의 혼성체의 Tm 값에 의해 영향을 받는다.
2개의 온도 범위를 고려하여, 검출 온도는 타겟 핵산 서열 각각에 대해 결정될 수 있다. 상대적 고온 검출 온도는 전자의 온도 범위로부터 선택될 수 있고, 상기 상대적 고온 검출 온도는 제1 타겟 핵산 서열에 할당된다. 상대적 저온 검출 온도는 후자의 온도 범위로부터 선택될 수 있고, 상기 상대적 저온 검출 온도는 제2 타겟 핵산에 할당된다.　
본 발명의 중요한 기술적 특징은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 모두를 분석함으로써, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 또는 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것이다.
시그널의 검출은 검출기, 특히 단일 유형의 검출기에서 실시된다.
본원에 사용된 용어 "단일 유형의 검출기"는 단일 유형의 시그널을 위한 검출 수단을 의미한다. 몇 개의 상이한 유형의 시그널을 위한 몇 개의 채널(예컨대, 광다이오드)을 포함하는 검출기에서, 각각의 채널(예컨대, 광다이오드)은 "단일 유형의 검출기"에 해당한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 2개의 시그널 발생 수단은 동일한 표지를 포함하고, 상기 표지로부터의 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다.
상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 2개의 시그널 발생 수단으로부터의 시그널의 검출은 시그널 발생 과정의 하나 이상의 사이클에서 실시되어 상기 하나 이상의 사이클 각각에서 시그널 값을 수득한다.
본원에 사용된 용어 "사이클"은 상태 변화를 수반하는 복수의 측정에서 상태의 변화의 단위를 의미한다. 예를 들어, 상태의 변화는 온도, 반응 시간, 반응 횟수, 농도, pH 및/또는 타겟 핵산 분자 서열의 복제 횟수의 변화를 포함한다. 따라서, 사이클은 시간 또는 과정 사이클, 단위 운영 사이클 및 복제 사이클을 포함할 수 있다. 예를 들어, 등온 증폭은 등온 조건 하에 반응 시간의 과정에서 샘플의 복수의 측정을 가능하게 하며, 반응 시간은 상태 변화에 해당할 수 있고 반응 시간의 단위는 사이클에 해당할 수 있다.
특히, 일련의 반응을 반복하거나 일정 시간 간격으로 반응을 반복할 때, 용어 "사이클"은 상기 반복의 단위를 의미한다.
예를 들어, 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서, 사이클은 타겟 분자의 변성, 타겟 분자와 프라이머 사이의 어닐링(혼성화) 및 프라이머 연장을 포함하는 반응 단위를 의미한다. 반응의 반복의 증가는 상태 변화에 해당할 수 있고 반복의 단위는 사이클에 해당할 수 있다.
검출이 실시되는 사이클의 수는, 비제한적으로 1-5, 1-10, 1-20, 1-25, 1-30, 1-35, 1-40, 1-45, 1-50, 1-55 및 1-60을 포함한다. 검출이 복수의 사이클에서 실시되는 경우, 사이클은 순차적인 사이클이거나 비순차적인 사이클일 수 있다.
시그널의 검출은 시그널 발생 과정의 각 사이클에서 시그널 값을 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "시그널 값"은 시그널 발생 과정의 각 사이클에서 실제 측정된 시그널 값(예컨대, 증폭 반응에 의해 가공된 형광 강도의 실제 값) 또는 이의 변형된 값을 의미한다. 상기 변형된 값은 측정된 시그널 값(예컨대, 강도)의 수학적으로 가공된 값을 포함할 수 있다. 측정된 시그널 값의 수학적으로 가공된 값의 예는 측정된 시그널 값의 로그 값 및 도함수를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "시그널"은 용어 "시그널 값"을 포함하는 것으로 의도되므로 이 용어들은 상호교환적으로 사용될 것이다.
2개의 시그널 발생 수단에 의해 발생한 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는다. 용어 "단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않는 시그널"은 시그널이 동일하거나 실질적으로 동일한 시그널 특성(예컨대, 광학적 특성, 발광 파장 및 전기적 시그널)으로 인해 단일 유형의 검출기에 의해 서로 구별되지 않는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "단일 유형의 시그널"은 동일하거나 실질적으로 동일한 시그널 특성(예컨대, 광학적 특성, 발광 파장 및 전기적 시그널)을 제공하는 시그널을 의미한다. 예를 들어, FAM 및 CAL Fluor 610은 서로 상이한 유형의 시그널을 제공한다.
시그널은 시그널 발생 과정에 의해 발생하여 데이터 세트를 제공한다. 본원에 사용된 용어 "데이터 세트"는 데이터 지점의 세트를 의미한다. 본원에서 사용된 용어 "데이터 지점"은 사이클과 상기 사이클에서의 신호값을 포함하는 좌표값을 의미한다. 시그널 발생 과정에서 수득된 데이터 지점은 직교 좌표 시스템에서 좌표값으로 플롯팅되어, 곡선(예컨대, 증폭 곡선)을 제공할 수 있다. 상기 곡선은 피팅되거나 정규화된(예컨대, 베이스라인 차감된) 곡선일 수 있다. 특히, 검출된 시그널은 사이클에 대해 플롯팅된다.
특정 구현예에서, 시그널, 및 이의 데이터 세트, 데이터 지점 및 곡선은 베이스라인 차감된다.
단계 (b): 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출을 위한 시그널 값의 가공(S120; S220; S320; S420)
이후, 단계 (a)에서 얻은 시그널 값을 제2 기준값을 사용하여 가공하여 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하거나 또는 제1 기준값을 사용하여 가공하여 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출한다.
본원에 사용된 용어 "기준값"은 2개의 시그널이 상이한 검출 온도(즉, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도)에서 발생할 때, 특히 수치적으로, 시그널의 변화, 시그널 변화 또는 시그널 차이의 관계 또는 정도를 기술한다. 달리 말하면, "기준값"은 상이한 검출 온도에서의 시그널 변화의 패턴(규칙)을 반영하는 임의의 값을 포함한다. 또한, 용어 "기준값"은 특정 타겟 핵산 서열에 대해 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 사이의 변화의 정도를 나타내는 값을 가리킨다. 기준값은 하나의 온도에서 검출된 시그널을 또 다른 온도에서의 시그널로 변환, 전환, 조절 또는 변형시키기 위해 사용된 값을 가리킬 수 있다. 기준값은 타겟 핵산 서열의 유형, 시그널 발생 수단의 유형 및 인큐베이션 및 검출의 조건에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 상이하거나 동일한 타겟 핵산 서열에 대해 다양한 기준값이 결정될 수 있다.
기준값은 다양한 양태로 표현될 수 있다. 예를 들어, 기준값은 수치값, 시그널의 존재/부존재 또는 시그널 특징을 갖는 플롯으로 표현될 수 있다.
용어 "기준값"은 "제1 기준값" 또는 "제2 기준값"으로서 본원에 추가로 기재된다. 상기 용어에서, 용어 "제1" 및 "제2"는 각각 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 기준값을 구별하기 위해 사용된다.
특히, 본원에 사용된 바와 같이 용어 "제1 기준값" 및 "제2 기준값"은 각각 제1 타겟 핵산 서열에 대해 미리 결정된 기준값 및 제2 타겟 핵산 서열에 대해 미리 결정된 기준값으로서 각각 단계 (b)에서 제2 타겟 핵산 서열의 시그널 추출 및 제1 타겟 핵산의 시그널 추출에 사용된 기준값을 의미한다.
더욱 특히, 제1 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 2개의 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이고, 제2 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 2개의 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이다.
일 구현예에서, 기준값은 선택된 사이클에서의 시그널 값을 고려하여 결정될 수 있다. 즉, 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 중에서 선택된 사이클에서의 시그널 값을 고려하여 결정될 수 있다. 이 경우, 상기 선택된 사이클은 증폭 곡선의 베이스라인 영역 이후의 사이클 중 하나, 특히 정체기 영역의 사이클 중 하나, 더욱 특히 마지막 사이클일 수 있다.
택일적인 구현예에서, 기준값은 상이한 선택된 사이클에서의 복수의 시그널 값을 고려하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 기준값은 상이한 선택된 사이클에서의 복수의 시그널 값의 평균을 고려하여 결정될 수 있다.
기준값은 하기에 상세히 설명될 것이다.
기준값은 상응하는 타겟 핵산 서열을 시그널 발생 수단과 함께 인큐베이션하고, 시그널을 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출한 다음, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 변화의 관계를 얻음으로써 미리 결정될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 타겟 핵산 서열에 상응하는 표준 물질을 사용하여 미리 결정된다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 대조군 반응으로부터 미리 결정된다. 예를 들어, 제1 기준값은 제1 타겟 핵산 서열 및 제1 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 미리 결정되고, 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열 및 제2 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 미리 결정된다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 상응하는 타겟 핵산 서열을 함유하는 대조군 샘플을 사용하여 미리 결정될 수 있다. 예를 들면, 제1 기준값은 제1 타겟 핵산 서열을 함유하는 대조군 샘플을 사용하여 미리 결정될 수 있고, 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열을 함유하는 대조군 샘플을 사용하여 미리 결정될 수 있다.
기준값은 다양한 조건(예컨대, 타겟 핵산 서열의 농도 및 프라이머의 유형) 하에 대조군 반응(또는 대조군 샘플)에 대한 반복 반응을 통해 특정 범위의 값을 획득하고 상기 획득된 값 중에서 적합한 값을 선택함으로써 미리 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 기준값은 추출되지 않을 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 제거되도록 선택될 수 있다. 다른 구현예에서, 기준값은 추출될 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 제거되지 않거나 가능한 한 적게 제거되도록 선택될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 기준값은 추출되지 않을 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 제거되고 추출될 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 제거되지 않거나 가능한 한 적게 제거되도록 선택될 수 있다.
예를 들어, 제2 기준값을 사용하여 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하고자 하는 경우, 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 제거되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 제거되지 않도록 선택될 수 있다.
더욱 구체적으로, 타겟 핵산 서열이 "클라미디아 트라코마티스(CT)" 및 "나이세리아 고노로애(NG)"를 포함하고, "NG"에 대한 시그널을 추출하고자 하는 경우, CT에 대한 기준값은 CT에 대한 시그널은 완전히 제거되고 NG에 대한 시그널은 제거되지 않거나 가능한 한 적게 제거되도록 선택될 수 있다.
기준값은 반복 실험에 의해 경험적으로 수득될 수 있다.
기준값은 반복 실험을 통해 경험적으로 수득된 특정 범위 중에서 선택될 수 있다. 이와 관련하여, 상기 범위 내에서 비교적 높은 값을 기준값으로 선택하는 것이 유리한데, 비교적 높은 기준값은 비교적 낮은 기준값과 비교하여 추출하지 않고자 하는 시그널을 제거할 가능성이 더 높기 때문이다. 예를 들어, 1.1 내지 1.50의 범위가 얻어지는 경우, 약 1.50의 값이 기준값으로서 더 적합할 수 있다. 택일적으로, 상기 범위를 초과하는 값이 기준값으로서 선택될 수 있다. 예를 들어, 상기 범위의 상한보다 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 큰 값이 기준값으로서 선택될 수 있다. 그러나, 너무 높은 기준값은 오히려 추출하고자 하는 시그널을 제거할 수 있으므로 바람직하지 않다는 것에 유의한다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 상응하는 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 간의 차이에 의해 계산될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 상응하는 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널을 수학적으로 가공함으로써 계산될 수 있다.
특정 구현예에서, 수학적 가공은 시그널 또는 시그널로부터 유래된 다른 값을 사용한 계산(예컨대, 덧셈, 곱셈, 뺄셈 및 나눗셈)을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값을 수득하기 위한 시그널의 수학적 가공은 상대적 저온 검출 온도에서 상응하는 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 상응하는 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율의 계산이다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값을 수득하기 위한 시그널의 수학적 가공은 상대적 고온 검출 온도에서 상응하는 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 저온 검출 온도에서 상응하는 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율의 계산이다.
상기 비율은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 하나의 사이클에서의 시그널 값 대 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 상기 사이클에서의 시그널 값의 비율일 수 있다. 택일적으로, 상기 비율은 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널의 선택 사이클에서의 시그널 값 대 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널의 선택 사이클에서의 시그널 값의 비율일 수 있다. 비율 계산을 위해 선택된 사이클은 증폭 곡선의 베이스라인 영역 이후의 사이클 중 하나일 수 있다. 특히, 비율 계산을 위한 사이클은 정체기 영역 내의 사이클 중 하나일 수 있다. 보다 특히, 비율 계산을 위한 사이클은 마지막 사이클일 수 있다.
일 구현예에서, 기준값은 몇 개의 사이클, 예컨대, 연속적인 2개의 사이클, 3개의 사이클, 4개의 사이클, 5개의 사이클 등에서의 비율의 평균에 의해 계산될 수 있다. 또한, 기준값은 몇 개의 사이클에서의 비율을 고려하여 적합하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 기준값은 선택 사이클에서의 시그널 값의 비율 또는 몇 개의 사이클에서의 시그널 값의 비율보다 약간 높은 것으로서 선택될 수 있다.
특정 구현예에서, 기준값은 수학식 II에 따라 계산될 수 있다:
<식 II>
타겟에 대한 기준값 = [타겟만을 함유하는 샘플에 대한 상대적 저온에서의 시그널] ÷ [타겟만을 함유하는 샘플에 대한 상대적 고온에서의 시그널]
기준값을 얻기 위한 수학적 가공은 다양한 방식으로 실시될 수 있다. 수학적 가공은 기계를 사용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 시그널은 검출기 또는 실시간 PCR 장치에서 프로세서에 의해 수학적 가공을 거칠 수 있다. 택일적으로, 시그널은 특히 미리 결정된 알고리즘에 따라 수작업으로 수학적 가공을 거칠 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 기준값을 위한 시그널 발생 수단은 단계 (a)의 시그널 발생 수단과 동일할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 단계 (a)에서 얻은 시그널로부터 제2 기준값에 의해 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 제거함으로써 또는 단계 (a)에서 얻은 시그널로부터 제1 기준값에 의해 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 제거함으로써 실시된다.
더욱 특히, 제2 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 단계 (a)에서 얻은 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 제거하는 것이고, 제1 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 단계 (a)에서 얻은 시그널로부터 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 제거하는 것이다.
더욱 특히, 제2(또는 제1) 시그널 발생 수단에 의해 발생된 시그널의 제거는 상대적 저온에서 검출된 시그널로부터 제2(또는 제1) 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 제거하는 것이거나, 상대적 고온에서 검출된 시그널로부터 제2(또는 제1) 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 제거하는 것이다.
본 발명자들은 상이한 검출 온도를 사용하여 샘플 내 다수의 타겟 핵산 서열을 검출하는 2개의 기술을 개발하였다. 전자의 기술에서, 제1 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도 모두에서 시그널을 발생시키고 제2 시그널 발생 수단은 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시킨다(WO 제2015/147412호 참고). 후자의 기술에서, 제1 시그널 발생 수단 및 제2 시그널 발생 수단 모두는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도 모두에서 시그널을 발생시킨다(WO 제2016/093619호 참고). 전자 및 후자 기술은 각각 MuDT1 및 MuDT2 기술로 불린다.
본 발명이 MuDT1 기술(WO 제2015/147412호 참고)에 적용되는 경우, 본 발명은 다음과 같이 실시될 수 있다:
일 구현예에 따르면, 제1 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고 제2 시그널 발생 수단은 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키며, 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 수학적으로 가공하여 단계 (a)에서 얻은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것을 포함한다.
더욱 특히, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출은 하기 수학식 I-1에 의해 실시될 수 있다:
<식 I-1>
제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [단계 (a)에서 얻은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널] - [(단계 (a)에서 얻은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널) x (제1 기준값)];
상기 식에서, 제1 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율이다.
본원에 기재된 수학식에서, 기호 "-"는 뺄셈, 특히 시그널 차감을 나타낸다. 예를 들어, 시그널 차감은 하나의 시그널 내의 하나의 사이클에서의 시그널 값으로부터 또 다른 시그널 내의 상응하는 사이클에서의 시그널 값을 차감함으로써 각 사이클에서 실시될 수 있다.
본원에 기재된 수학식에서, 기호 "x"는 곱셈을 나타낸다.
본원에 기재된 수학식에서, 기호 "÷"는 나눗셈을 나타낸다.
수학식 I-1에 의한 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출에 따르면, 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널은 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 조합을 반영하는 반면, 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널은 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널만을 반영한다. 따라서, 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 변하지 않는다는 가정하에, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 차감함으로써 얻을 수 있다. 그러나, 시그널이 검출 온도에 따라 달라진다는 것을 고려할 때, 시그널 차감 전에, 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널을 상대적 저온 검출 온도에서 예상되는 시그널로 조정(변환)하는 것이 필요하다. 이 목적을 위해, 제1 기준값이 사용된다.
택일적인 구현예에 따르면, 제1 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고, 제2 시그널 발생 수단은 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키며, 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 수학적으로 가공하여 단계 (a)에서 얻은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것을 포함한다.
보다 특히, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출은 하기 수학식 I-2에 의해 실시된다:
<식 I-2>
제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [단계 (a)에서 얻은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널] - [(단계 (a)에서 얻은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널) ÷ (제1 기준값)];
상기 식에서, 제1 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율이다.
MuDT1 기술에서, 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널은 제1 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널로서 간주될 수 있는데, 상대적 고온 검출 온도에서는 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널만이 검출되기 때문이다.
수학식 I-1 및 I-2에서, 제1 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 비율로 표시된다. 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 대 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널의 비율로 표시된 제1 기준값을 사용하여 변형으로 달성될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 당업자는 이러한 변형이 본 발명의 취지 및 범위에 속한다는 것을 이해할 것이다.
본 발명이 MuDT2 기술(WO 제2016/093619호 참고)에 적용되는 경우, 본 발명은 다음과 같이 실시될 수 있다:
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시킨다.
일 구현예에 따르면, 제2 기준값이 제1 기준값보다 큰 경우, (i) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 기준값에 의해 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하거나; (ii) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 단계 (a)에서 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 기준값에 의해 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하거나; (iii) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 기준값에 의해 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것을 포함하거나; 또는 (iv) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 단계 (a)에서 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 기준값에 의해 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것을 포함한다.
더욱 특히, 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 기준값에 의한 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출은 수학식 I-1에 의해 실시되거나; 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 기준값에 의한 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출은 하기 수학식 I-2에 의해 실시되거나; 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 기준값에 의한 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출은 하기 수학식 I-3에 의해 실시되거나; 또는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 기준값에 의한 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출은 하기 수학식 I-4에 의해 실시된다:
<식 I-1>
제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [단계 (a)에서 얻은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널] - [(단계 (a)에서 얻은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널) x (제1 기준값)];
<식 I-2>
제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [단계 (a)에서 얻은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널] - [(단계 (a)에서 얻은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널) ÷ (제1 기준값)];
상기 식에서, 제1 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율이다;
<식 I-3>
제1 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [단계 (a)에서 얻은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널] - [(단계 (a)에서 얻은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널) x (제2 기준값)];
<식 I-4>
제1 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [단계 (a)에서 얻은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널] - [(단계 (a)에서 얻은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널) ÷ (제2 기준값)];
상기 식에서, 제2 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율이다.
수학식 I-3을 참고할 때, 상대적 저온 검출 온도 및 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 각각은 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 조합을 반영한다. 제2 기준값이 제1 기준값보다 크다고 가정하면, 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널과 제2 기준값의 곱셈은 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널(상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 포함됨)을 상대적 저온 검출 온도에서 검출될 것으로 예상되는 시그널로 변환시킨다. 또한, 상기 곱셈은 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널(상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널에 포함됨)을 상대적 저온 검출 온도에서 검출될 것으로 예상되는 시그널보다 더 큰 시그널로 변환시킨다. 따라서, 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널로부터 상기 변환된 시그널의 시그널 차감은 제1 타겟 핵산 서열의 시그널 추출을 가능하게 하는데, 이러한 차감이 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 제거할 것이기 때문이다.
식 I-1, I-2, I-3 및 I-4에서, 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널의 비율로 표시된다. 시그널 추출이 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널 대 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널의 비율로 표시된 기준값을 사용하여 변형으로 달성될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다. 당업자는 이러한 변형이 본 발명의 취지 및 범위에 속한다는 것을 이해할 것이다.
수학식 I-1 및 I-2는 MuDT1 기술 및 MuDT2 기술 모두에서 공통적으로 사용되는 반면; 수학식 I-3 및 I-4는 MuDT2 기술에서만 사용된다는 점에 유의한다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 수학식을 적용하기 전에, 2개의 기술 중 어느 것이 실시되었는지 확인하는 것이 필수적이다.
타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는데 추출된 시그널을 사용하는 것은 부적합한 기준값이 사용될 때 위양성 또는 위음성 결과를 초래할 수 있다. 이 문제를 극복하기 위해, 본 발명의 방법은 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용하기 위한 분석 시그널로서 특정 영역만을 제공한다.
단계 (c): 최대 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클의 선택(S130; S230; S330; S430)
단계 (c)에서는, 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널로부터 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택한다.
흥미롭게도, 본 발명자들은 최대 시그널 값을 갖는 사이클(본원에서 "최대 사이클"로도 지칭됨) 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클(본원에서 "최소 사이클"로도 지칭됨)이 추출된 시그널을 분석하는데, 특히 잘못 추출된 시그널을 분석하는데 중요한 지표임을 발견하였다.
이러한 발견에 기초하여, 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클은 타겟 관련 시그널 영역과 타겟 비관련 시그널 영역을 구별하기 위한 기준점으로서 작용한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "타겟 관련 시그널 영역"은 관심있는 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부존재를 결정하는데 유의한 것으로 간주되는, 추출된 시그널의 영역을 지칭하는데, 상기 영역이 타겟 핵산 서열과 관련된 정확한 시그널을 포함하기 때문이다. 따라서, "타겟 관련 시그널 영역에서의 시그널"은 타겟 핵산 서열의 존재/부존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "타겟 비관련 시그널 영역"은 관심있는 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부존재를 결정하는데 무시할 만한 것으로 간주되는, 추출된 시그널의 영역을 지칭하는데, 상기 영역이 타겟 핵산 서열과 관련되지 않은 부정확한 시그널을 포함하기 때문이다. 따라서, "타겟 비관련 시그널 영역에서의 시그널"은 타겟 핵산 서열의 존재/부존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 사용되지 않는다.
추출된 시그널을 분석할 때 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클의 역할을 더 포괄적으로 이해하기 위해, 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정 및 수학식 I-1을 사용하는 MuDT1 기술에 따라 수행된 추출 과정을 포함하는 본 발명의 예시적인 구현예가 논의된다.
예시적인 구현예에서, 제1 타겟 핵산 서열의 적합한 기준값이 사용되는 경우, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널은 (i) 증가하는 패턴 또는 (ii) 실질적으로 0을 나타낼 수 있지만, 제1 타겟 핵산 서열의 부적합한 기준값이 적용되는 경우, 생성된 추출된 시그널의 전부 또는 일부가 감소하는 패턴을 나타낼 수 있다.
상기 패턴을 고려하여, 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 추출된 시그널, 특히 잘못 추출된 시그널을 해석하는데 중요한 역할을 할 수 있다.
전형적으로, 최소 시그널 값을 갖는 사이클은 시그널이 감소하는 패턴(즉, 하향 패턴)에서 증가하는 패턴(즉, 상향 패턴)으로 변화하는 변곡점일 수 있다.
상기 추론에 기초하여, 감소된 패턴을 나타내는 최소 시그널 값을 갖는 사이클 이전의 영역은 잘못된 추출을 반영하는 것으로 간주될 수 있고, 증가된 패턴을 나타내는 최소 시그널 값을 갖는 사이클 이후의 영역은 적절한 추출을 반영하는 것으로 간주될 수 있다.
특히, 최소 시그널 값을 갖는 사이클 이전에 나타나는 감소하는 패턴은 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널에 실질적으로 기여하는 수준(적절한 추출을 위한 예상된 수준)까지 적합하게 추출되지 않았음을 나타낼 수 있다.
또한, 최소 시그널 값을 갖는 사이클에서의 시그널 값은 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 가장 낮은 수준까지 추출되었음을 나타낼 수 있다. 반면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클 이후에 나타나는 증가하는 패턴은 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 적절하게 추출되었음을 나타낼 수 있거나(시그널 값이 RFU 0 초과인 경우) 또는 잘못 추출된 시그널이 개선되고 있거나 회복되고 있음을 나타낼 수 있다(시그널 값이 RFU 0 미만인 경우).
따라서, 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되는 경우, 증가하는 패턴을 나타내는 영역은 관심 있는 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부존재를 결정하는데 유의한 것으로 간주되며, 이는 타겟 관련 시그널 영역에 해당한다.
이러한 추론은, 예를 들어 수학식 I-2를 사용한 MuDT1 기술에 의해 추출된 시그널을 분석할 때 최대 시그널 값을 갖는 사이클의 역할에 적용될 수 있다. 예시적인 구현예에서, 제1 타겟 핵산 서열에 대한 적합한 기준값이 사용되는 경우, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널은 (i) 감소하는 패턴 또는 (ii) 실질적으로 0을 나타낼 수 있지만, 제1 타겟 핵산 서열에 대한 부적합한 기준값이 사용되는 경우, 생성된 추출된 시그널의 전부 또는 일부는 증가하는 패턴을 나타낼 수 있다.
따라서, 최대 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되는 경우, 감소하는 패턴을 나타내는 영역은 관심있는 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부존재를 결정하는데 유의한 것으로 간주되며, 이는 타겟 관련 시그널 영역에 해당한다.
본 발명의 모든 구현예에서, 타겟 관련 시그널 영역은 이론적으로 예측되지 않는 시그널 패턴을 함유하고 있을지라도 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용될 수 있다. 타겟 관련 영역은 증폭 곡선의 지수기에 해당하는 것으로 간주될 수 있다.
타겟 관련 시그널 영역은 단일 사이클 또는 복수의 사이클로 구성될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 마지막 사이클인 경우, 타겟 관련 시그널 영역은 하나의 사이클만으로 구성되고; 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 마지막 사이클 이외의 임의의 사이클인 경우, 타겟 관련 시그널 영역은 복수의 사이클로 구성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클은 "선택된 사이클" 또는 "선택 사이클"로 지칭될 수 있다.
상기 기재된 선택된 사이클은 최대 시그널 값을 갖는(가장 큰 시그널 값을 갖는) 사이클 또는 최소 시그널 값을 갖는(가장 작은 시그널 값을 갖는) 사이클일 수 있으며, 이는 단계 (b)에서 사용된 시그널 발생 과정 및 추출 과정에 따라 달라진다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 관심있는 타겟 핵산 서열에 대한 적합하게 추출된 시그널이 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재 하에 증가하는 시그널 패턴을 나타내는 경우, 상기 기재된 선택된 사이클은 최소 시그널 값을 갖는(가장 작은 시그널 값을 갖는) 사이클일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 관심있는 타겟 핵산 서열에 대한 적합하게 추출된 시그널이 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재 하에 감소하는 시그널 패턴을 나타내는 경우, 상기 기재된 선택된 사이클은 최대 시그널 값을 갖는(가장 큰 시그널 값을 갖는) 사이클일 수 있다.
본 발명이 MuDT1 기술(WO 제2015/147412호 참고)에 적용되는 경우, 선택된 사이클은 다음과 같을 수 있다:
(i) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최소 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있고;
(ii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최대 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있다.
대안적으로, 본 발명이 MuDT2 기술(WO 제2016/093619호 참고)에 적용되고 제2 기준값이 제1 기준값보다 큰 경우, 선택된 사이클은 다음과 같을 수 있다:
(i) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최소 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있고;
(ii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최대 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있고;
(iii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-3에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최대 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있고;
(iv) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-4에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최소 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있고;
(v) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최대 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있고;
(vi) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최소 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있고;
(vii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-3에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최소 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있고;
(viii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-4에 의해 실시되는 경우, 선택된 사이클은 최대 시그널 값을 갖는 사이클일 수 있다.
선택된 사이클의 결정은 도 6A 및 6B, 및 도 7A 및 7B를 참조하여 예시될 수 있다.
도 6A에 나타낸 바와 같이, 10 pg의 CT 타겟을 함유하는 샘플로부터 1.50의 단일 기준값을 사용하여 NG 타겟에 대한 추출된 시그널을 얻는다. 이후, NG에 대한 추출된 시그널을 분석한 다음, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 50번째 사이클에 해당함)을 선택한다(도 6B; 상부 좌측 참고).
도 7A에 나타낸 바와 같이, 100 fg의 NG 타겟 및 10 pg의 CT 타겟을 함유하는 샘플로부터 1.50의 단일 기준값을 사용하여 NG 타겟에 대한 추출된 시그널을 얻는다. 이후, NG에 대한 추출된 시그널을 분석한 다음, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 35번째 사이클에 해당함)을 선택한다(도 7B; 상부 좌측 참고).
본 발명의 일 구현예에서, 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클의 선택은 단계 (b)에서 추출된 시그널이 잘못된 경우에만 실시될 수 있다.
이하, 상기 구현예가 하기 섹션 "기준의 사용"에서 상세히 설명될 것이다:
"기준의 사용"
일 구현예에 따르면, 단계 (b)에서 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 단계 (b)에서 정확하게 추출되는 경우, 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되지 않을 수 있고, 단계 (b)에서 타겟 핵산 서열에 대한 시그널이 잘못 추출되는 경우, 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 선택될 수 있다.
상기 구현예가 도 3(300)에 예시되어 있다.
상기 구현예는 단계 (b)와 단계 (c) 사이에 하기 단계를 추가로 포함한다:
(bc-1) 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하는지 여부를 확인하는 단계로서; 상기 정확성 기준은 추출된 시그널이 역치를 교차하지 않는 것이며;
(bc-2) 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하지 않으면 단계 (c)를 진행하거나, 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하면 단계 (c)를 진행하지 않고 추출된 시그널을 분석 시그널로 제공하는 단계.
단계 (bc-1) 및 (bc-2)는 하기에 상세히 설명될 것이다.
단계 (bc-1): 잘못 추출된 시그널의 확인(S325)
단계 (bc-1)에서, 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하는지 여부를 확인하며, 상기 정확성 기준은 추출된 시그널이 역치를 교차하지 않는 것이다.
구체적으로, 단계 (b)에서 추출된 시그널을 분석하여 정확히 또는 적합하게 추출되었는지 여부를 확인한다.
용어 "정확하게 추출된 시그널"은 특히 MuDT1 또는 MuDT2 기술에서 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타내는 추출된 시그널을 지칭하며; 용어 "잘못 추출된 시그널"은 특히 MuDT1 또는 MuDT2 기술에서 이론적으로 예측되지 않는 시그널 패턴을 나타내는 추출된 시그널을 지칭한다.
타겟 핵산 서열이 샘플 내에 존재할 때 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하거나 감소하는 통상적인 시그널 발생 과정의 경우, 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널은 증가하거나 감소하는 패턴을 생성할 가능성이 높은 반면, 타겟 핵산 서열이 샘플 내에 부존재하는 경우, 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널은 실질적으로 0 값(예컨대, RFU 0)에 접근하는 패턴을 생성할 가능성이 높을 것이다.
따라서, 본 발명의 일 구현예에 따르면, 관심있는 타겟 핵산 서열에 대한 적합하게 추출된 시그널이 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재 하에 증가하는 시그널 패턴을 나타내고 샘플 내 타겟 핵산 서열의 부존재 하에 실질적으로 0 값(예컨대, RFU 0)에 접근하는 패턴을 나타내는 경우, 이러한 두 가지 패턴은 이론적으로 예측되는 패턴으로 간주되지만, 이러한 시그널 패턴을 벗어나는 다른 패턴은 이론적으로 예측되지 않는 패턴으로 간주된다. 예를 들어, 0 미만의 시그널 값을 갖는 시그널 패턴은 이론적으로 예측되지 않는 패턴으로 간주될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 관심있는 타겟 핵산 서열에 대한 적합하게 추출된 시그널이 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재 하에 감소하는 시그널 패턴을 나타내고 샘플 내 타겟 핵산 서열의 부존재 하에 실질적으로 0 값(예컨대, RFU 0)에 접근하는 패턴을 나타내는 경우, 이러한 두 가지 패턴은 이론적으로 예측되는 패턴으로 간주되지만, 이러한 시그널 패턴을 벗어나는 다른 패턴은 이론적으로 예측되지 않는 패턴으로 간주된다. 예를 들어, 0 초과의 시그널 값을 갖는 시그널 패턴은 이론적으로 예측되지 않은 패턴으로 간주될 수 있다.
본원에서 정확하게 추출된 시그널 및 잘못 추출된 시그널은 포괄적으로 해석되어야 하는데, 즉 추출된 시그널을 전체로서 고려하여 해석되어야 한다는 점에 유의해야 한다. 예를 들어, 이론적으로 예측되지 않는 패턴을 나타내는 적어도 하나의 부분을 갖는 시그널은 잘못 추출된 시그널로서 간주되어야 한다.
시그널이 정확하게 또는 적합하게 추출되었는지 여부는 정확성 기준을 사용하여 확인된다.
시그널 추출과 관련하여 본원에 사용된 용어 "정확성 기준"은 정확하게 추출된 시그널과 잘못 추출된 시그널을 구별하는 기준을 의미한다. 예를 들어, 정확성 기준은 추출된 시그널이 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타내는지 여부를 확인하는 기준을 의미할 수 있다. 정확성 기준은 시그널 추출을 위한 기준값의 적합성(정확성)을 결정하기 위한 기준을 의미할 수 있다.
정확성 기준은 정확하게 추출된 시그널과 잘못 추출된 시그널을 구별할 수 있는 한, 당업자에 의해 적합하게 미리 결정될 수 있다. 정확성 기준은 비제한적으로 임의의 값일 수 있다. 정확성 기준은 경험적으로 미리 결정될 수 있다.
일 구현예에서, 정확성 기준은 시그널 추출에서 이론적으로 예측되는 시그널의 패턴을 고려하여 미리 결정될 수 있다.
상기 나타낸 바와 같이, 시그널 추출의 정확성은 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하는지 여부에 기초한다.
즉, 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족한다는 확인은 시그널 추출을 위한 기준값의 적합성을 나타내는 반면, 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하지 않는다는 확인은 시그널 추출을 위한 기준값의 부적합성을 나타낸다.
단계 (b)에서 사용된 기준값이 적합하다고 고려하면, 추출된 시그널은 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타낼 가능성이 높다. 예를 들어, 기준값이 적합하고 정상 시그널이 양의 값(예컨대, 증가하는 또는 성장하는 패턴) 또는 실질적으로 0 값(예컨대, RFU 0)에 접근하는 패턴(예컨대, 백그라운드 패턴)을 나타낸다고 가정하면, 음의 값(예컨대, 감소하는 패턴)을 나타내는 시그널은 잘못된 것으로 결정될 수 있다. 이러한 결정의 정확성을 높이기 위한 정확성 기준이 0 미만의 임의의 값으로서 역치를 채택함으로써 적용되고, 추출된 시그널이 역치에 교차하는 시그널 값을 갖는 경우, 추출된 시그널은 잘못된 것으로 결정될 수 있다. 반면, 양의 값(예컨대, 증가하는 또는 성장하는 패턴)을 나타내는 시그널이 이론적으로 잘못되고 역치가 0 초과의 임의의 값으로서 채택되는 경우, 역치에 교차하는 시그널 값을 갖는 추출된 시그널은 잘못된 것으로 결정될 수 있다.
정확성 기준은 미리 결정된 역치에 의해 예시될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 정확성 기준은 추출된 시그널이 역치에 교차하지 않는 것, 즉 추출된 시그널이 역치(또는 역치 선)에 교차하는 시그널 값을 갖지 않는 것이다.
제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하는 경우, 추출된 시그널은 단계 (c)를 진행하지 않고 각각의 타겟 핵산 서열의 존재/부존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공된다.
예를 들어, 추출된 시그널이 역치에 교차하는 시그널 값을 갖지 않는 경우, 본 발명의 방법의 절차는 종료된다. 이 경우, 기준값을 사용하여 추출된 시그널은 정확하게 추출된 시그널로서 간주되고 분석 시그널로서 제공된다.
역치에 교차하는 시그널 값을 갖지 않는 추출된 시그널에 의해 표시되는 정확성 기준은 2가지 경우를 포함한다: 역치를 초과하는 시그널 값을 갖는 추출된 시그널 및 역치 미만의 시그널 값을 갖는 추출된 시그널.
용어 "역치를 초과하는 시그널 값을 갖는 추출된 시그널"은 추출된 시그널 내의 모든 사이클에서의 시그널 값이 역치를 초과하는 것을 의미한다. 마찬가지로, 용어 "역치 미만의 시그널 값을 갖는 추출된 시그널"은 추출된 시그널 내의 모든 사이클에서의 시그널 값이 역치 미만에 속한다는 것을 의미한다.
예를 들어, 정확성 기준이 추출된 시그널이 미리 결정된 역치를 초과하는 시그널 값을 갖는 것이고, 추출된 시그널이 미리 결정된 역치를 초과하는 시그널 값을 갖는 것으로 결정되는 경우, 다음 단계를 실시하지 않고 추출된 시그널(1번째 사이클부터 마지막 사이클까지)이 타겟 핵산 서열의 존재/부존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공된다. 정확성 기준이 추출된 시그널이 미리 결정된 역치 미만의 시그널 값을 갖는 것이고, 추출된 시그널이 미리 결정된 역치 미만의 시그널 값을 갖는 것으로 결정되는 경우, 다음 단계를 실시하지 않고 추출된 시그널(1번째 사이클부터 마지막 사이클까지)이 타겟 핵산 서열의 존재/부존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공된다.
상기 역치는 본 발명에 따른 시그널 추출시에 이론적으로 예측되는 시그널 패턴에 기초하여 미리 결정될 수 있다.
일 예로서, 이론적으로 예측된 정상 시그널 패턴이 양의 값(예컨대, 증가하거나 성장하는 패턴) 또는 실질적으로 0 값(예컨대, RFU 0)에 접근하는 패턴(예컨대, 백그라운드 패턴)인 경우, 역치는 임의의 적합한 음의 값일 수 있고, 정확성 기준은 추출된 시그널이 역치를 초과하는 시그널 값을 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 역치는, 예컨대, RFU -10, -20, -30, -40, -50, -60, -70, -80, -90, -100, -200, -300 또는 그 미만일 수 있다. 이 경우, 역치 이하의 시그널 값을 갖는 추출된 시그널, 즉, 역치에 교차하는 시그널 값을 갖는 추출된 시그널은 비정상적으로 추출된 시그널로서 간주될 수 있다.
또 다른 예로서, 이론적으로 예측된 정상 시그널 패턴이 음의 값(예컨대, 감소하는 패턴) 또는 실질적으로 0 값(예컨대, RFU 0)에 접근하는 패턴(예컨대, 백그라운드 패턴)인 경우, 역치는 임의의 적합한 양의 값일 수 있고, 정확성 기준은 추출된 시그널이 역치 미만의 시그널 값을 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 역치는, 예컨대, RFU 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 또는 그 초과일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 이 경우, 역치 이상의 시그널 값을 갖는 추출된 시그널, 즉 역치에 교차하는 시그널 값을 갖는 추출된 시그널은 비정상적으로 추출된 시그널로서 간주될 수 있다.
역치는 단계 (b)에서 사용된 시그널 발생 과정 및 추출 과정에 따라 달라질 수 있다.
구체적으로, 본 발명이 MuDT1 기술(WO 제2015/147412호 참고)에 적용되는 경우, 역치는 다음과 같이 결정될 수 있다:
(i) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 역치는 음의 값일 수 있고;
(ii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 역치는 양의 값일 수 있다.
대안적으로, 본 발명이 MuDT2 기술(WO 제2016/093619호 참고)에 적용되고 제2 기준값이 제1 기준값보다 큰 경우, 역치는 다음과 같이 결정될 수 있다:
(i) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 역치는 음의 값일 수 있고;
(ii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 역치는 양의 값일 수 있고;
(iii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-3에 의해 실시되는 경우, 역치는 양의 값일 수 있고;
(iv) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-4에 의해 실시되는 경우, 역치는 음의 값일 수 있고;
(v) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 역치는 양의 값일 수 있고;
(vi) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 역치는 음의 값일 수 있고;
(vii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-3에 의해 실시되는 경우, 역치는 음의 값일 수 있고;
(viii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-4에 의해 실시되는 경우, 역치는 양의 값일 수 있다.
역치는 정상적으로 추출된 시그널을, 예컨대 시그널 노이즈 또는 변동으로 인해, 잘못 추출된 시그널로 잘못 해석하는 것을 피하도록 적절하게 선택되어야 한다.
당업자는 본 단계에 사용된 역치가 이하 기재된 타겟 핵산 핵산 서열의 존재의 결정에 사용되는 역치와 구별된다는 것을 이해해야 한다.
단계 (bc-2): 절차의 진행 또는 종료의 결정
제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하지 않는 경우, 다음 단계 (c)가 진행되고; 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널이 정확성 기준을 만족하는 경우, 방법은 단계 (c)를 진행하지 않고 추출된 시그널을 분석 시그널로서 제공한다.
본 단계에서, 정확성 기준을 만족하는 추출된 시그널은 정확하게 추출된 것으로 간주되기 때문에 분석 시그널로서 직접 제공된다. 반면, 정확성 기준을 만족하지 않는 추출된 시그널은 잘못 추출된 것으로 간주되기 때문에 이하 단계에 적용된다.
한편, 추출된 시그널을 분석하여 최대 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택한 후, 하기 단계를 실시한다.
단계 (d): 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)의 제공 (S140; S240; S340; S440)
단계 (d)에서, 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)이 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공된다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "분석 시그널"은 관심있는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 제공되는 시그널을 의미한다. 상기 용어는 또한 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위해 최종적으로 사용되는 시그널을 의미한다.
상기 설명한 바와 같이, 본 발명자들은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)(타겟 비관련 영역)이 관심있는 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부존재를 결정하는데 무시할 만하며, 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)(타겟 관련 영역)이 관심있는 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부존재를 결정하는데 유의하다는 것을 발견하였다.
상기 발견에 기초하여, 본 단계에서 타겟 관련 영역만이 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 제공된다.
선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)(타겟 관련 영역)은 하기와 같이 변형하여 또는 변형 없이 분석 시그널로서 제공될 수 있다.
(i) 변형되지 않은 분석 시그널의 제공
선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)은 변형 없이 분석 시그널로서 제공될 수 있다(도 6B 및 7B; 중간 좌측 참고). 즉, 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들) 자체는 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 사용될 수 있다.
단계 (d)에서 변형 없이 분석 시그널로서 제공되는 시그널 값(들)은 당업계에 널리 공지된 많은 방법에 의해 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하는데 사용된다.
일 구현예에서, 미리 결정된 역치가 타겟 핵산의 존재를 결정하기 위해 변형 없이 제공된 분석 시그널에 적용될 수 있다.
단계 (d)에서의 역치는 단계 (bc-1)에서 잘못 추출된 시그널을 확인하기 위한 역치와 상이하다는 것이 당업자에게 이해되어야 한다.
예를 들어, 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 역치는 양성 시그널을 검출하기 위해 RFU 100으로 설정될 수 있는 반면, 잘못 추출된 시그널을 확인하기 위한 역치는 음성 시그널을 검출하기 위해 RFU -100으로 설정될 수 있다.
타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위해, 변형되지 않은 분석 시그널에 적용되는 역치는 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값의 크기를 고려하여 결정될 수 있다.
구체적으로, 최대 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되는 경우, 최대 시그널 값이 클수록 역치는 크고; 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되는 경우, 최소 시그널 값이 작을수록 역치는 작다.
최대 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되는 경우, 최대 시그널 값의 크기를 확인한 다음, 상기 확인된 크기에 상응하는 역치를 결정하며; 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되는 경우, 최소 시그널 값의 크기를 확인한 다음, 상기 확인된 크기에 상응하는 역치를 결정한다.
(ii) 변형된 분석 시그널의 제공
선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)은 분석 시그널로서 제공하기 전에 변형된 다음, 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에 적용된다(도 6B 및 7B; 하부 좌측 참조). 이를 위해, 본 방법은 분석 시그널로서 제공하기 전에 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 변형하는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "변형"은 수학적 연산(덧셈, 뺄셈, 곱셈, 나눗셈, 미분, 적분 등)을 사용하여 시그널 값(들)이 또 다른 시그널 값(들)으로 전환되는 과정을 의미한다.
변형은 타겟 핵산 서열의 존재를 결정할 때 사용자의 편의성을 개선하기 위해 수행되는 과정을 의미한다.
변형은 모든 추출된 시그널에 대해 달성될 수 있거나, 특정 기준이 만족되는 경우에만 달성될 수 있다. 변형은 선택된 사이클에서의 시그널 값이 특정 범위(예컨대, 대략 RFU 0) 내에 있지 않을 때에만 실시될 수 있다. 예를 들어, 최대 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되는 경우, 선택된 사이클이 특정 값(예컨대, RFU 0)보다 큰 시그널 값을 갖는 경우에만 변형이 실시될 수 있다. 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되는 경우, 선택된 사이클이 특정 값(예컨대, RFU 0)보다 작은 시그널 값을 갖는 경우에만 변형이 실시될 수 있다.
시그널의 변형은, 상기 변형이 타겟 핵산 서열의 존재 또는 부존재의 결정에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 당업계에 널리 공지된 많은 방법을 사용하여 실시될 수 있다.
일 예로서, 변형은 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향으로 또는 하향으로 이동시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "이동시키다" 또는 "이동시키는"은 시그널 값(들)이 Y 축을 따라 동일한 크기로 수직 이동하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 변형은 선택된 사이클이 특정 값보다 크고 0 이하인 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 이동시키거나, 선택된 사이클이 특정 값보다 작고 0 이상인 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 하향 이동시키는 것을 포함한다.
상기 특정 값은 0과 가까운 0이 아닌 값일 수 있다. 택일적으로, 단계 (bc-1) 및 (bc-2)가 추가로 포함되는 경우, 상기 특정 값은 단계 (bc-1)에 사용된 역치일 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 또는 하향 이동시키는 것을 포함한다.
구체적으로, 본 발명이 MuDT1 기술(WO 제2015/147412호 참고)에 적용되는 경우, 변형, 특히 이동은 다음과 같이 실시될 수 있다:
(i) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 이동시키는 것을 포함하고;
(ii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 하향 이동시키는 것을 포함한다.
대안적으로, 본 발명이 MuDT2 기술(WO 제2016/093619호 참고)에 적용되고 제2 기준값이 제1 기준값보다 큰 경우, 역치는 다음과 같이 결정될 수 있다:
(i) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 이동시키는 것을 포함하고;
(ii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 하향 이동시키는 것을 포함하고;
(iii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-3에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 하향 이동시키는 것을 포함하고;
(iv) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 증가하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-4에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 이동시키는 것을 포함하고;
(v) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-1에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 하향 이동시키는 것을 포함하고;
(vi) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-2에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 이동시키는 것을 포함하고;
(vii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-3에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 이동시키는 것을 포함하고;
(viii) 타겟 핵산 서열의 증폭과 함께 시그널 강도가 감소하는 시그널 발생 과정이 실시되고 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출이 수학식 I-4에 의해 실시되는 경우, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 하향 이동시키는 것을 포함한다.
또 다른 예로서, 변형은 베이스라이닝(baselining)(베이스라인 차감)에 의해 수행될 수 있다(US 8,219,324; US 2003/0148332; US 2006/0269947; KR 10-2012-0097215).
분석 시그널로서 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)은 베이스라인 영역을 함유하지 않는다. 따라서, 베이스라인 차감은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)이 베이스라인 영역(백그라운드 수준)이라고 가정하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 선택된 사이클이 35번째 사이클인 경우, 베이스라인 차감은 첫 번째 사이클부터 34번째 사이클까지의 영역이 베이스라인 영역이라고 가정하여 실시된다.
상기 기재된 이동 및 베이스라인 차감은 동일한 결과를 낳을 수 있다.
본 발명에 따르면, 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)이 시그널 조정 후 분석 시그널로서 추가로 제공될 수 있다(도 2, S250 및 도 4, S450 참고).
본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에 영향을 미치지 않을 정도까지 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)을 조정하고 상기 조정된 시그널 값(들)을 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)과 조합하여 분석 시그널로서 제공하는 것을 추가로 포함한다.
즉, 타겟 비관련 영역, 즉 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 영역이 조정된 다음 분석 시그널로서 추가로 제공될 수 있다.
본 발명자들은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)이 타겟 비관련 영역이므로, 보다 정확한 결과를 얻기 위해 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에서 상기 시그널 값(들)이 무시되어야 한다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)이 정확하게 추출되는 경우 백그라운드 영역에 해당한다는 것을 발견하였다.
따라서, 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)을 분석 시그널로서 추가로 제공하기 위해, 시그널 값(들)이 시그널 조정 과정에 적용되어야 한다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "조정하다" 또는 "조정"은 시그널 값(들)이 단일 값 또는 특정 범위 내의 값으로 전환되는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에서, 조정은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)을 백그라운드 수준(또는 백그라운드 시그널)으로 조정하는 것을 포함한다. 상기 조정은 시그널 값(들)이 임의의 타겟 핵산 서열의 부존재 하에 생성되는 시그널로 전환되는 과정 또는 시그널 값(들)이 임의의 타겟 핵산 서열의 부존재를 나타내는 시그널로 전환되는 과정을 의미한다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 백그라운드 수준으로의 조정은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)이 선택된 사이클에서의 시그널 값과 실질적으로 동일하도록 조정하는 것을 포함한다.
문구 "선택된 사이클에서의 시그널 값과 실질적으로 동일한"은 선택된 사이클에서의 시그널 값을 고려하여 미리 결정된 특정 범위 내의 값 또는 선택된 사이클에서의 시그널 값과 동일한 값을 의미한다.
일 예에서, 백그라운드 수준으로의 조정은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)을 선택된 사이클에서의 시그널 값을 고려하여 미리 결정된 특정 범위 내의 값이 되도록 조정하는 것을 포함한다.
또 다른 예에서, 백그라운드 수준으로의 조정은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)을 선택된 사이클에서의 시그널 값과 동일하도록 조정하는 것을 포함한다.
조정되는 시그널 값(들)은 선택된 사이클에서의 시그널 값을 포함할 수 있음에 유의한다. 선택된 사이클이 35번째 사이클인 경우, 1번째 사이클부터 35번째 사이클까지의 시그널 값이 조정될 수 있다. 택일적으로, 1번째 사이클부터 34번째 사이클까지의 시그널 값이 조정될 수 있다.
본 발명에 따르면, 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 조정되지 않은 시그널 값(들)을 포함하는 전체 시그널 값이 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공된다.
타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위해, 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들)은 추가 변형 없이 직접 제공될 수 있거나(도 6B 및 7B; 중간 우측 참고), 또는 추가 변형되어 제공될 수 있다(도 6B 및 7B; 하부 우측 참고).
일 구현예에서, 상기 방법은 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)의 변형과 무관하게 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들)을 변형시키는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 분석 시그널로서 제공하기 전에 변형시키는 것을 추가로 포함한다.
상기 변형은 상기 기재된 바와 같은 이동 또는 베이스라이닝을 포함한다.
일 예로서, 변형은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 또는 하향 이동시키는 것을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 변형은 선택된 사이클이 특정 값보다 크고 0 이하인 시그널 값을 갖도록 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 상향 이동시키는 것을 포함하거나, 선택된 사이클이 특정 값보다 작고 0 이상인 시그널 값을 갖도록 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 하향 이동시키는 것을 포함하며; 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 변형된 시그널 값은 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에 영향을 미치지 않는다(도 6B & 7B, 하부 우측 참고).
상기 특정 값은 0에 가까운 0이 아닌 값일 수 있다. 택일적으로, 상기 특정 값은 단계 (bc-1)에 사용된 역치일 수 있다.
본 발명의 구현예에서, 변형은 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 시그널을 상향 또는 하향 이동시키는 것을 포함한다.
또 다른 예로서, 변형은 베이스라이닝(베이스라인 차감)을 포함한다.
상기 기재된 바와 같은 조정 및 변형은 정확성 기준의 사용과 조합될 수 있다.
본 발명이 MuDT1 기술(WO 제2015/147412호)에 적용되는 경우, 본 발명은 다음과 같이 구현될 수 있다:
일 구현예에 따르면, 제1 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고 제2 시그널 발생 수단은 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키며, 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 수학적으로 가공하여 단계 (a)에서 얻은 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출은 수학식 I-1에 의해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 추출된 시그널을 분석하여 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택한다. 이후, 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 분석 시그널로서 제공하기 전에 추가로 변형시키는 것을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)을 조정한 다음, 상기 조정된 시그널 값(들)을 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)과 조합하여 분석 시그널로서 제공하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 조정되지 않은 시그널 값(들)을 분석 시그널로서 제공하기 전에 변형시키는 것을 추가로 포함한다.
택일적으로, 제1 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고 제2 시그널 발생 수단은 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키며, 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 수학적으로 가공하여 단계 (a)에서 얻은 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출은 수학식 I-2에 의해 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 추출된 시그널을 분석하여 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택한다. 이후, 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공한다.
일 구현예에서, 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)이 분석 시그널로서 제공되기 전에 변형된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)을 조정한 다음, 상기 조정된 시그널 값(들)을 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)과 조합하여 분석 시그널로서 제공하는 것을 추가로 포함한다.
일 구현예에서, 상기 방법은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 조정되지 않은 시그널 값(들)을 분석 시그널로서 제공하기 전에 변형시키는 것을 추가로 포함한다.
본 발명이 MuDT2 기술(WO 제2016/093619호)에 적용되는 경우, 본 발명은 다음과 같이 구현될 수 있다:
일 구현예에 따르면, 2개의 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시킨다.
보다 구체적으로, 제2 기준값은 제1 기준값보다 크고, (i) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 제1 기준값을 사용하여 단계 (a)에서 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하거나; (ii) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 제1 기준값을 사용하여 단계 (a)에서 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하거나; (iii) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 제2 기준값을 사용하여 단계 (a)에서 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하거나; (iv) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 제2 기준값을 사용하여 단계 (a)에서 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함한다.
보다 구체적으로, 이론적으로 예측된 시그널 패턴이 양의 패턴(예컨대, 증가하는 패턴)인 경우, 추출된 시그널을 분석하여 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택한다. 이후, 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널을 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공한다. 택일적으로, 이론적으로 예측된 시그널 패턴이 음의 패턴(예컨대, 감소하는 패턴)인 경우, 추출된 시그널을 분석하여 최대 시그널 값을 갖는 사이클을 선택한다. 이후, 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널을 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공한다.
본 발명의 방법은 2개의 타겟 핵산 서열 중 최소 하나의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널을 제공하는데 사용될 수 있다. 표현 "2개의 타겟 핵산 서열 중 최소 하나"는 2개의 타겟 핵산 서열 중 어느 하나 또는 둘 모두를 의미한다.
유사하게, 본 발명의 방법은 3개 이상의 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널을 제공하는데 사용될 수 있다.
MuDT1 기술 및 MuDT2 기술에 따르면, 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 전술한 방법과 유사한 방식으로 기준값을 사용하여 3개 이상의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널로부터 추출될 수 있다. 이 경우, 본 발명의 방법은 또한 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는데 적용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)이 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공된다.
샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널로부터 하나의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하기 위한 구현예에서, 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열은 샘플 내 3개 이상의 타겟 핵산 서열 중에서 선택된 것이다.
본 발명의 방법은 3개 이상의 타겟 핵산 서열을 위한 3개 이상의 시그널을 발생시킬 수 있는 반응에서 하나의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것과 관련될 수 있다.
또한, 3개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출은 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출과 유사한 방식으로 실시될 수 있다.
즉, 샘플 내 3개 이상의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널로부터 하나의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출은 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널로부터 하나의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출의 일 양태를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 3개 이상의 타겟 핵산 서열 중 하나 또는 2개의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널을 제공하는데 사용될 수 있다.
일 예로서, 샘플 내의 3개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널로부터 하나의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 방법이 상세히 기재되어 있다.
MuDT1 기술에 따르면, 3개의 시그널 발생 수단(예컨대, 제1 시그널 발생 수단, 제2 시그널 발생 수단 및 제3 시그널 발생 수단) 및 3개의 검출 온도(예컨대, 상대적 고온 검출 온도, 상대적 중간 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도)가 사용된다.
제1 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도, 상대적 중간 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고; 제2 시그널 발생 수단은 상대적 중간 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키며; 제3 시그널 발생 수단은 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시킨다.
단일 반응 용기에서 샘플을 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제1 시그널 발생 수단, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제2 시그널 발생 수단, 및 제3 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제3 시그널 발생 수단과 함께 인큐베이션하고, 시그널을 상대적 고온 검출 온도, 상대적 중간 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 단일 유형의 검출기에 의해 검출한다. 이후, 상대적 고온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 중간 검출 온도에서 검출된 시그널을 제1 기준값을 사용하여 수학적으로 가공하여 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하고; 제1 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 중간 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이다. 제1 기준값의 적합성을 확인한다.
이후, 상기 추출 단계의 결과로부터 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열 중 하나가 부존재하는 것으로 결정되면, 마치 샘플 내 2개의 타겟 핵산 서열이 존재하는 것처럼 본 발명의 방법에 따라 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 중간 검출 온도에서 검출된 시그널로부터의 시그널 추출을 실시할 수 있다.
한편, 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열 모두가 존재하는 것으로 결정되면, 본 발명의 방법은 하기와 같이 변형되어 적용될 수 있다: 상대적 저온 검출 온도에서 검출된 시그널 및 상대적 중간 검출 온도에서 검출된 시그널을 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열의 혼합물에 대한 기준값을 사용하여 수학적으로 가공하여 제3 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하고; 제1 타겟 핵산 서열 및 제2 타겟 핵산 서열의 혼합물에 대한 기준값은 상대적 중간 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단 및 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이다.
이후, 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 및 제3 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 각각은 본 발명의 방법의 단계 (c)를 거친다.
이와 같이, 3개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출은 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출과 유사한 방식으로 실시될 수 있다.
따라서, 당업자는 본 발명의 방법이 약간의 변형으로 3개 이상의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
일 구현예에 따르면, 인큐베이션은 복수의 인큐베이션을 포함하고, 인큐베이션에 대한 분석 시그널이 개별적으로 제공된다.
본원에 사용된 용어 "복수의 인큐베이션"은 상이한 반응 용기, 튜브 또는 웰에서 실시된 인큐베이션을 의미한다. 본 발명의 장점은 복수의 인큐베이션에서 더 강조된다. 복수의 인큐베이션이 미지의 양의 "NG" 타겟 서열 및 "CT" 타겟 서열의 특정 조합을 포함하는 것으로 가정하면, 각각의 타겟 핵산 서열에 대한 단일 기준값을 사용하여 복수의 인큐베이션을 분석하는 것이 일반적일 것이다. 본 발명자들은 이러한 단일 기준값의 사용이 잘못된 검출 결과를 야기할 가능성이 있다는 것을 발견하였다. 일 구현예에 따르면, "NG" 타겟 서열에 대한 기준값 또는 "CT" 타겟 서열에 대한 기준값을 모든 인큐베이션에 적용한 다음, 필요한 경우 분석 시그널이 개별 인큐베이션으로부터 개별적으로 제공된다.
II. 시그널 추출을 위한 기록매체, 컴퓨터 프로그램 및 장치
하기에 기재된 본 발명의 기록매체, 장치 및 컴퓨터는 컴퓨터에서 본 발명의 방법을 실행하기 위한 것이므로, 이들 사이의 공통된 내용은 본 명세서의 복잡성을 초래하는 과도한 중복을 피하기 위해 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기를 포함하는, 샘플 내 타겟 핵산 서열에 대한 분석 시그널을 제공하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체가 제공된다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 샘플로부터 시그널 값을 수신하는 단계로서; 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열은 제1 시그널 발생 수단에 의해 검출되고 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열은 제2 시그널 발생 수단에 의해 검출되며; 상기 검출은 시그널 발생 과정의 하나 이상의 사이클에서 실시되어 상기 하나 이상의 사이클 각각에서 시그널 값을 얻고; 상기 2개의 시그널 발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며;
(b) 단계 (a)에서 얻은 시그널 값을 제2 기준값을 사용하여 가공하여 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하거나 또는 단계 (a)에서 수득된 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 가공하여 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이고, 상기 제2 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이며; 상기 제1 기준값은 제1 타겟 핵산 서열 및 제1 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되고, 상기 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열 및 제2 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되며;
(c) 상기 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널에서 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하는 단계; 및
(d) 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공하는 단계.
일 구현예에 따르면, 제1 기준값(또는 제2 기준값)은 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된다. 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 본 방법을 실행하는데 있어서 제1 기준값(또는 제2 기준값)을 입력하는 지시를 포함한다. 일 구현예에 따르면, 컴퓨터 해독가능한 기록매체는 제1 기준값(또는 제2 기준값)을 수득하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 하기를 포함하는, 샘플 내 타겟 핵산 서열에 대한 분석 시그널을 제공하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장되기 위한 컴퓨터 프로그램이 제공된다:
(a) 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 샘플로부터 시그널 값을 수신하는 단계로서; 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열은 제1 시그널 발생 수단에 의해 검출되고 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열은 제2 시그널 발생 수단에 의해 검출되며; 상기 검출은 시그널 발생 과정의 하나 이상의 사이클에서 실시되어 상기 하나 이상의 사이클 각각에서 시그널 값을 얻고; 상기 2개의 시그널 발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며;
(b) 단계 (a)에서 얻은 시그널 값을 제2 기준값을 사용하여 가공하여 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하거나 또는 단계 (a)에서 수득된 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 가공하여 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이고, 상기 제2 기준값은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이며; 상기 제1 기준값은 제1 타겟 핵산 서열 및 제1 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되고, 상기 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열 및 제2 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되며;
(c) 상기 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널에서 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하는 단계; 및
(d) 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공하는 단계.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값(또는 제2 기준값)을 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 본 방법을 실행하는데 있어서 제1 기준값(또는 제2 기준값)을 입력하는 지시를 포함한다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 컴퓨터 프로그램은 제1 기준값(또는 제2 기준값)을 얻기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 추가로 포함한다.
프로세서에 의해 실행되는 경우, 상기 프로그램 지시가 작동하여 프로세서가 상기 기재된 본 방법을 실행하게 한다. 본 방법을 실행하기 위한 상기 프로그램 지시는 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 샘플을 이용하여 시그널 발생 과정으로부터 시그널 값을 수신하는 지시; 시그널을 추출하기 위해 수신된 시그널 값을 가공하는 지시; 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하는 지시; 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 분석 시그널로서 제공하는 지시를 포함할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 본 방법을 실행하기 위한 프로그램 지시는 제1 기준값(또는 제2 기준값)을 수득하기 위한 지시를 추가로 포함할 수 있다.
상기 기재된 본 발명의 방법은 프로세서, 예컨대 독립형 컴퓨터, 네트워크에 연결된 컴퓨터 또는 실시간 PCR 기기와 같은 데이터 수집 장치 내의 프로세서에서 실행된다.
컴퓨터 해독가능한 기록매체의 유형은 CD-R, CD-ROM, DVD, 플래쉬 메모리, 플로피 디스크, 하드 드라이브, 휴대용 HDD, USB, 마그네틱 테이프, MINIDISC, 비휘발성 메모리 카드, EEPROM, 광학 디스크, 광학 기록매체, RAM, ROM, 시스템 메모리 및 웹 서버와 같은 다양한 기록매체를 포함한다.
시그널 발생 과정으로부터의 시그널 값은 몇 가지 기기를 통해 수신될 수 있다. 예를 들어, 시그널 값은 PCR 데이터 획득 장치에 있는 프로세서에 의해 획득될 수 있다. 상기 시그널 값은 시그널 값이 수집되고 있는 동안 실시간으로 프로세서에 제공될 수 있거나, 또는 그것은 메모리 유닛 또는 버퍼에 저장될 수 있고 실험이 완료된 후 프로세서에 제공될 수 있다. 유사하게, 시그널 값은 상기 획득 장치와의 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인트라넷 및 인터넷) 또는 직접 연결(예컨대, USB 또는 다른 직접 유선 연결 또는 무선 연결)에 의해 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 별도의 시스템에 제공될 수 있거나, 또는 CD, DVD, 플로피 디스크, 휴대용 HDD 등과 같은 휴대용 매체 상에 독립형 컴퓨터 시스템으로 제공될 수 있다. 유사하게, 상기 데이터 세트는 노트북 또는 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 클라이언트에 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인트라넷, 인터넷 및 무선 통신 네트워크)을 통해 서버 시스템에 제공될 수 있다.
시그널 값이 수신되고 획득된 후, 시그널 값의 가공이 실시되어 제2 기준값에 의해 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하거나 또는 제1 기준값에 의해 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출한다. 프로세서는 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하고 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 분석 시그널로서 제공한다.
본 발명을 실행하는 프로세서를 구현하는 지시들은 로직 시스템에 포함될 수 있다. 상기 지시는 비록 휴대용 HDD, USB, 플로피 디스크, CD 및 DVD와 같은 어떠한 소프트웨어 기록매체 상으로 제공될 수 있지만, 다운로드 가능하고 메모리 모듈(예컨대, 하드 드라이브 또는 로컬 또는 부착 RAM이나 ROM과 같은 다른 메모리)에 저장될 수 있다. 본 발명을 실행하기 위한 컴퓨터 코드는, C, C++, Java, Visual Basic, VBScript, JavaScript, Perl 및 XML과 같은 다양한 코딩 언어로 실행될 수 있다. 또한, 다양한 언어 및 프로토콜은 본 발명에 따른 데이터와 명령의 외부 및 내부 저장과 전송에 이용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태에서, (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 연결된 상기 기재된 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 샘플 내 타겟 핵산 서열에 대한 분석 시그널을 제공하기 위한 장치가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 장치는 샘플 및 시그널 발생 수단을 수용하는 반응 용기, 상기 반응 용기의 온도를 조절하는 온도 조절 수단 및/또는 사이클에서 시그널을 검출하는 검출기를 추가로 포함한다.
일 구현예에 따르면, 컴퓨터 프로세서는 시그널 발생 과정의 하나 이상의 사이클에서 시그널 값을 수신할 뿐만 아니라 수득된 시그널 값을 기준값에 의해 가공하여 시그널을 추출하고 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택한다. 프로세서는 단일 프로세서가 몇 가지 행위를 하도록 준비될 수 있다. 택일적으로, 프로세서 유닛은 몇 개의 프로세서가 몇 가지 행위를 각각 하도록 준비될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 프로세서는 타겟 핵산 서열의 검출을 위한 종래의 장치(예컨대, 실시간 PCR 장치) 내로 소프트웨어를 설치함으로써 구현될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 장치는 실시간 PCR 시스템 내로 구현될 수 있다. 상기 시스템은 실시간 PCR 증폭을 실시하기 위한 실시간 PCR 장치, 및 시그널을 추출하고 보정 결과물을 디스플레이하기 위해 케이블을 통해 실시간 PCR 장치에 연결된 로직 시스템으로서 컴퓨터 시스템을 포함한다. 상기 컴퓨터 시스템은 사용자의 요구에 따라 그래프, 표 및 워드와 같은 다양한 형태로 추출 결과물을 디스플레이할 수 있다. 상기 컴퓨터 시스템은 본 발명의 방법을 실시하기 위한 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 포함된 지시를 포함할 수 있다. 실시간 PCR 장치 및 컴퓨터 시스템은 하나의 시스템 내로 통합될 수 있다.
시그널 값은 다양한 방식으로 증폭 곡선으로 수신될 수 있다. 예를 들어, 시그널 값은 실시간 PCR 장치의 데이터 수집기 내에 프로세서에 의해 수신되고 수집될 수 있다. 시그널 값의 수집시, 이들은 실시간 방식으로 프로세서에 제공되거나, 메모리 단위 또는 버퍼에 저장된 다음, 실험 후에 프로세서에 제공될 수 있다.
유사하게, 시그널 값은 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인트라넷 및 인터넷) 또는 직접 연결(예컨대, USB 및 유선 또는 무선 직접 연결)을 통해, 또는 CD, DVD, 플로피 디스크 및 휴대용 HDD와 같은 휴대용 매체를 통해, 실시간 PCR 장치로부터 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 컴퓨터 시스템에 제공될 수 있다. 택일적으로, 시그널 값은 노트북 또는 데스크탑 컴퓨터 시스템과 같은 클라이언트에 연결된 네트워크 연결(예컨대, LAN, VPN, 인트라넷, 인터넷 및 무선 통신 네트워크)을 통해 서버 시스템에 제공될 수 있다.
시그널 값이 수신되거나 얻어진 후, 시그널-값 프로세서는 기준값에 의해 시그널을 추출한다. 본 발명의 시그널 추출은 컴퓨터 시스템에 설치된 애플리케이션(즉, 프로그램)에 의해 실시될 수 있다. 택일적으로, 이는 애플리케이션 스토어 서버 또는 애플리케이션 제공자 서버를 통해 컴퓨터 시스템에 직접 설치된 애플리케이션에 의해 이뤄질 수 있고, 애플리케이션은 컴퓨터 시스템의 운영 체제에서 작동가능하다. 운영 체제는 윈도우, 매킨토시 및 스마트폰 및 태블릿 PC와 같은 모바일 단말기에 설치된 iOS 및 안드로이드와 같은 모바일 운영 체제를 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 시그널 추출 방법은 상기 컴퓨터 시스템 내로 공급자에 설치되거나 사용자에 의해 직접 설치된 애플리케이션(즉, 프로그램)에 의해 구현되고, 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 기록될 수 있다.
본 발명의 방법을 구현하는 컴퓨터 프로그램은 시그널 추출을 위한 모든 기능을 구현할 수 있다. 컴퓨터 프로그램은 본 발명의 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체에 저장된 프로그램 지시를 포함하는 프로그램일 수 있다.
컴퓨터 프로그램은 C, C++, JAVA, Visual basic, VBScript, JavaScript, Perl, XML 및 기계 언어와 같은 적합한 컴퓨터 언어를 사용하여 코딩될 수 있다. 상기 프로그램은 상기 기재된 수학적 기능을 위한 기능 코드 및 컴퓨터 시스템의 프로세서에 의해 순서대로 프로세서를 구현하기 위한 제어 코드를 포함할 수 있다.
상기 코드는 프로세서에 의해 상기 기재된 기능을 구현하는데 필요한 부가적인 정보 또는 매체가 컴퓨터 시스템의 내부 또는 외부 메모리의 위치(어드레스)에서 참조되는 메모리 참조 코드를 더 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템이 프로세서의 기능을 구현하기 위해 원격의 또 다른 컴퓨터 또는 서버와의 통신을 필요로 하는 경우, 상기 코드는 프로세서가 통신 모듈(예컨대, 유선 및/또는 무선 통신 모듈)을 사용하여 원격의 또 다른 컴퓨터 또는 서버와 어떻게 통신하는지 또는 어떤 정보 또는 매체가 전송되는지를 코딩하는 통신 관련 코드를 더 포함할 수 있다.
본 발명을 구현하기 위한 기능적 프로그램 및 코드(코드 세그먼트)는 기록매체를 판독하고 프로그램을 실행하는 컴퓨터의 시스템 환경을 고려하여 당업계의 프로그래머에 의해 쉽게 추론되거나 변형될 수 있다.
컴퓨터 시스템에 네트워크 연결된 기록매체는 분산될 수 있고, 컴퓨터 해독가능한 코드는 분산 방식으로 저장되고 실행될 수 있다. 이 경우, 복수의 분산된 컴퓨터 중 적어도 하나의 컴퓨터는 기능들의 일부를 구현할 수 있고, 기능의 일부를 구현하고 구현 결과를 적어도 하나의 컴퓨터에 전송할 수 있는 적어도 하나의 컴퓨터에 전송할 수 있다.
본 발명을 실행하기 위해 애플리케이션(즉, 프로그램)이 기록된 기록매체는 애플리케이션 스토어 또는 애플리케이션 제공자 서버에 포함된 기록매체(예컨대, 하드 디스크), 애플리케이션 제공자 서버 자체, 상기 프로그램 및 그의 기록매체를 갖는 또 다른 컴퓨터를 포함한다.
기록매체를 판독할 수 있는 컴퓨터 시스템은 데스크탑 또는 노트북 컴퓨터와 같은 일반 PC, 스마트폰, 태블릿 PC, PDA(개인 디지털 보조장치) 및 모바일 통신 단말기와 같은 모바일 단말기뿐만 아니라 모든 컴퓨팅 실행가능 장치를 포함할 수 있다.
III. 타겟 핵산의 검출
타겟 핵산 서열에 대한 분석 시그널은 이의 검출에 사용될 수 있다. 타겟 핵산 서열의 검출은 샘플 내의 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 포함한다. 타겟 검출은 당업계에 알려진 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 타겟 검출은 추출된 시그널의 플롯에 역치를 적용하고, 플롯 및 역치 사이에 교차점이 있는지 확인함으로써 달성될 수 있다. 만약 교차점이 있는 경우, 타겟 핵산 서열의 존재가 결정되고; 만약 교차점이 없는 경우, 타겟 핵산 서열의 부존재가 결정된다.
본 발명의 특징 및 장점은 하기와 같이 요약될 것이다:
(a) 본 발명은 타겟 핵산의 검출에 잘못된 영향을 미칠 수 있는 시그널 영역을 제거하거나 조정함으로써, 보다 정확하고, 효과적이고, 재현가능한 방식으로 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있다.
(b) 본 발명은 상이한 검출 온도 및 기준값을 사용하여 타겟 핵산 서열을 검출하는 방법을 현저히 개선하는데 기여할 수 있다.
(c) 특히, 축퇴성 프라이머 세트를 사용한 RNA 타겟 검출 또는 저농도의 상대적 저온 검출 온도를 갖는 타겟 핵산 서열의 경우, 본 발명의 유용성은 더 두드러지게 된다.
(d) 본 발명에 따르면, 타겟 핵산 서열을 검출하기 위한 더 정확한 시그널 추출은 본 발명의 방법을 실시하기 위한 컴퓨터 프로그램을 개발함으로써 실용적이다.
도 1 내지 4는 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하기 위한 본 발명의 구현예 100, 200, 300 및 400을 나타내는 흐름도이다.
도 5는 100 fg의 나이세리아 고노로애(NG)의 게놈 DNA, 10 pg의 클라미디아 트라코마티스(CT)의 게놈 DNA, 100 fg의 NG 및 10 pg의 CT의 혼합물, 및 NTC(비타겟 대조군)를 함유하는 샘플에 대해, PTOCE 실시간 PCR 방법을 사용한 MuDT1 기술(WO 제2015/147412호 참고)에 따라 60℃ 및 72℃의 상이한 검출 온도에서 검출된 시그널을 나타낸다.
도 6A는 10 pg의 CT 타겟을 함유하는 샘플에서 식 I-1을 사용한 NG 타겟에 대한 시그널 추출의 예를 나타낸다.
도 6B는 도 6A의 추출된 시그널로부터 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 다양한 분석 시그널을 수득하는 본 발명의 4개의 구현예(중간 좌측; 중간 우측; 하부 좌측; 하부 우측)를 나타낸다.
도 7A는 100 fg의 NG 및 10 pg의 CT 타겟을 함유하는 샘플에서 식 I-1을 사용한 NG 타겟에 대한 시그널 추출의 예를 나타낸다.
도 7B는 도 7A의 추출된 시그널로부터 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 다양한 분석 시그널을 수득하는 본 발명의 4개의 구현예(중간 좌측; 중간 우측; 하부 좌측; 하부 우측)를 나타낸다.
도 8A 내지 8D는 도 5에서의 시그널로부터 다양한 기준값(1.15, 1.50, 2.00 또는 2.50) 및 식 I-1을 사용하여 수득된 NG 타겟에 대한 추출된 시그널(좌측 컬럼), 및 본 발명의 구현예 200에 따라 추출된 시그널로부터 수득된 NG 타겟에 대한 분석 시그널(우측 컬럼)을 나타낸다. 각 추출된 시그널에서의 최소 사이클(최소 시그널 값을 갖는 사이클)이 화살표로 표시되어 있다.
도 9는 10 pg의 나이세리아 고노로애(NG)의 게놈 DNA, 1 pg의 클라미디아 트라코마티스(CT)의 게놈 DNA, 10 pg의 NG 및 1 pg의 CT의 혼합물, 및 NTC(비타겟 대조군)를 함유하는 샘플에 대해, TaqMan 실시간 PCR 방법을 사용한 MuDT2 기술(WO 제2016/093619호 참고)에 따라 60℃ 및 72℃의 상이한 검출 온도에서 검출된 시그널을 나타낸다.
도 10A 내지 10D는 도 9에서의 시그널로부터 다양한 기준값(6.50, 6.00, 5.50 또는 5.00) 및 식 I-4를 사용하여 수득된 NG 타겟에 대한 추출된 시그널(좌측 컬럼), 및 본 발명의 구현예 200에 따라 추출된 시그널로부터 수득된 NG 타겟에 대한 분석 시그널(우측 컬럼)을 나타낸다. 각 추출된 시그널 내의 최소 사이클이 화살표로 표시되어 있다.
도 11A 내지 11D는 도 9에서의 시그널로부터 다양한 기준값(1.80, 2.50, 3.00 또는 3.50) 및 식 I-1을 사용하여 수득된 CT 타겟에 대한 추출된 시그널(좌측 컬럼), 및 본 발명의 구현예 200에 따라 추출된 시그널로부터 수득된 CT 타겟에 대한 분석 시그널(우측 컬럼)을 나타낸다. 각 추출된 시그널에서의 최소 사이클이 화살표로 표시되어 있다.
도 12는 도 9에서의 시그널로부터 다양한 기준값(1.80, 2.50, 3.00 또는 3.50) 및 식 I-2를 사용하여 수득된 CT 타겟에 대한 추출된 시그널(좌측 컬럼), 및 본 발명의 구현예 200에 따라 추출된 시그널로부터 수득된 CT 타겟에 대한 분석 시그널(우측 컬럼)을 나타낸다. 각 추출된 시그널에서의 최대 사이클(최대 시그널 값을 갖는 사이클)이 화살표로 표시되어 있다.
본 발명은 실시예에 의해 더 상세히 설명될 것이다. 이들 실시예는 본 발명을 더 구체적으로 예시하기 위한 것이고 첨부된 청구범위에 제시된 본 발명의 범위는 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: MuDT1 기술에 기초한 시그널 검출 및 추출
MuDT1 기술(WO 2015/147412호 참고)의 일 구현예에 따르면, 제1 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고, 제2 시그널 발생 수단은 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키며, 시그널 값의 가공은 제1 기준값을 사용하여 실시되어 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출한다.
<1-1> 주형 및 올리고뉴클레오타이드의 준비
상이한 검출 온도에서 실시간 방식으로 시그널을 검출하기 위한 실시간 PCR 접근법으로서 PTOCE 방법(WO 제2012/096523호)을 사용하였다.
5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 연장, PTO(Probing and Tagging Oligonucleotide)의 절단, 및 PTO 단편의 연장을 위해 사용하였다. 나이세리아 고노로애(NG)의 게놈 DNA 및 클라미디아 트라코마티스(CT)의 게놈 DNA를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다.
시그널 발생 수단으로서 PTOCE 방법을 사용하여 NG 및 CT를 검출하기 위한 PTO는 (i) 타겟 핵산 서열에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 5'-태깅 부위 및 (ii) 타겟 핵산 서열에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 3'-타겟팅 부위를 포함한다. CTO(Capturing and Templating Oligonucleotides)는, 3'에서 5' 방향으로, (i) PTO의 5'-태깅 부위 또는 상기 5'-태깅 부위의 부분에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 캡처링 부위 및 (ii) PTO의 5'-태깅 부위 및 3'-타겟팅 부위에 비상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 템플레이팅 부위를 포함한다. CTO는 5'-말단에 퀀처 분자(BHQ-2) 및 템플레이팅 부위에 형광 리포터 분자(CAL Fluor Red 610)로 표지되었다. PTO 및 CTO는 연장을 방지하기 위해 3'-말단에 카본 스페이서로 블록킹되어 있다.
PTOCE 실시간 방법은 2개의 상이한 타겟 핵산 서열을 검출하기 위해 단일 유형의 형광 표지(CAL Fluor Red 610)를 사용하기 때문에, 2개의 타겟 핵산 서열에 대한 시그널은 단일 검출기에 의해 단일 반응 용기에서 서로 구별될 수 없다.
PTOCE 실시간 방법에서, 타겟 서열이 존재하는 경우, 상기 타겟 핵산 서열과 혼성화된 PTO는 절단되고, PTO 단편이 생성된다. 상기 PTO 단편은 CTO의 캡처링 부위에 어닐링되고, CTO의 템플레이팅 부위 상에서 연장되어, CTO와 연장된 이합체(Duplexed CTO)를 형성한다. 상기 연장 이합체의 형성은 시그널을 제공하고, 연장 이합체-형성 온도에서 시그널을 측정함으로써 증폭 곡선을 얻을 수 있다.
본 실시예에서, 각 연장 이합체의 서열 및 길이는 CT에 대한 연장 이합체가 72℃에서 형성될 수 있고 NG에 대한 연장 이합체가 72℃가 아닌 60℃에서 형성될 수 있도록 설계하였다.
따라서, 72℃의 검출 온도에서는, CT에 대한 시그널만이 검출되는 반면, 60℃의 검출 온도에서는, NG에 대한 시그널뿐만 아니라 CT에 대한 시그널이 검출된다.
본 실시예에서 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, PTO, 및 CTO의 서열이 표 1에 기재되어 있다.
명칭 유형 서열 (5' → 3') 서열번호
NG_F 프라이머 TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG 서열번호:1
NG_R 프라이머 CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC 서열번호:2
NG_PTO PTO GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[C3 spacer] 서열번호:3
NG_CTO CTO [BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(Cal Fluor Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3 spacer] 서열번호:4
CT_F 프라이머 GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATAAC 서열번호:5
CT_R 프라이머 CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGGAGA 서열번호:6
CT_PTO PTO GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTGGCTGCG[C3 spacer] 서열번호:7
CT_CTO CTO [BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(Cal Fluor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3 spacer] 서열번호:8
I : 데옥시이노신PTO : 프로빙 및 태깅 올리고뉴클레오타이드
CTO : 캡처링 및 템플레이팅 올리고뉴클레오타이드
BHQ : 퀀처(블랙홀 퀀처)
밑줄친 문자 : PTO의 5’-태깅 부위
<1-2> 실시간 PCR 및 상이한 온도에서 시그널 검출
PTOCE 방법에 따른 실시간 PCR을 타겟 핵산(100 fg의 NG 게놈 DNA, 10 pg의 CT 게놈 DNA, 100 fg의 NG 게놈 DNA 및 10 pg의 CT 게놈 DNA의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호:1), 5 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호:2), 3 pmole의 PTO(서열번호:3) 및 1 pmole의 CTO(서열번호:4), CT 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호:5), 5 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호:6), 3 pmole의 PTO(서열번호:7) 및 1 pmole의 CTO(서열번호:8), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스(최종 농도, 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA polymerase)(Enzynomics, Korea)를 함유하는 20 μl의 최종 부피에서 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96 실시간 열순환기, Bio-Rad)에 50℃에서 5분 동안 두고, 95℃에서 15분 동안 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초의 50 사이클을 실시하였다. 시그널의 검출을 각 사이클에서 60℃ 및 72℃에서 실시하였다. 상기 결과가 도 5에 나타나 있다.
도 5에 나타낸 바와 같이, NG 타겟(100 fg)만을 함유하는 샘플은 60℃에서 시그널을 나타내었지만 72℃에서는 시그널을 나타내지 않았고(첫 번째 열 참고); CT 타겟(10 pg)만을 함유하는 샘플은 60℃ 및 72℃ 모두에서 시그널을 나타내었으며(두 번째 열 참고); NG 및 CT 타겟(100 fg NG + 10 pg CT) 모두를 함유하는 샘플은 60℃ 및 72℃ 모두에서 시그널을 나타내었고(세 번째 열 참고); 타겟을 함유하지 않는 샘플(NTC)은 60℃ 및 72℃에서 시그널을 나타내지 않았다(네 번째 열 참고).
<1-3> 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출
도 5에 나타낸 바와 같이, CT 타겟에 대한 시그널은 72℃에서 검출된 시그널로부터 직접 얻을 수 있는데, NG 타겟에 대한 시그널이 72℃에서 검출되지 않기 때문이다. 반면, NG 타겟에 대한 시그널은 72℃에서는 검출되지 않고 60℃에서는 CT 타겟에 대한 시그널과 함께 검출되므로, NG 타겟에 대한 시그널을 추출하기 위해 60℃에서의 시그널로부터 CT 타겟에 대한 시그널을 제거해야 한다. 타겟 핵산, 특히 CT에 대한 시그널 강도는 검출 온도에 따라 달라지며, 즉 60℃에서의 시그널의 강도는 72℃에서의 시그널의 강도보다 더 클 수 있다는 것에 유의한다. 따라서, 72℃에서 검출된 CT 타겟에 대한 시그널은 60℃에서 예상되는 시그널로 적절하게 변환되어야 한다. 이 목적을 위해, 기준값이 본 방법에서 사용되었다.
구체적으로, NG 타겟에 대한 시그널은 식 I-1에 따라 CT 타겟에 대한 72℃ 및 60℃에서의 시그널의 변화의 관계를 나타내는 기준값을 사용하여 추출될 수 있다:
<식 I-1>
제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [상대적 저온 검출 온도에서의 시그널] - [(상대적 고온 검출 온도에서의 시그널) x (제1 기준값)];
상기 식에서, 제2 타겟 핵산 서열은 NG 타겟이고, 상대적 저온 검출 온도는 60℃이고, 상대적 고온 검출 온도는 72℃이며, 제1 기준값은 CT 타겟에 대한 기준값이다.
NG 타겟에 대한 추출된 시그널은 플롯팅될 수 있다.
CT 타겟에 대한 기준값은 식 II-1에 따라 계산될 수 있다:
<식 II-1>
CT 타겟에 대한 기준값 = [CT 타겟만을 함유하는 대조군 샘플에 대한 60℃에서의 시그널] ÷ [CT 타겟만을 함유하는 대조군 샘플에 대한 72℃에서의 시그널]
CT 타겟에 대한 기준값은 반응 조건에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 반복 실험으로부터 CT에 대한 일부 상이한 기준값이 얻어질 수 있다. 즉, CT에 대한 기준값은 CT 타겟만을 함유하는 대조군 샘플로부터 특정 범위의 값으로 얻어질 수 있다.
CT 타겟에 대한 기준값은 CT 타겟만을 함유하는 대조군 샘플로부터 특정 범위로 얻어지고, 60℃에서의 시그널로부터 CT 타겟에 대한 시그널을 제거하기 위해 상기 기준값 중에서 하나의 적합한 기준값이 적합하게 선택된다는 것이 당업자에게 일반적일 것이다. 본 발명자들은 CT 타겟에 대한 단일 기준값을 모든 반응에 적용하는 것이 단일 기준값이 개별 반응에 부적합할 때 잘못된 시그널을 유발할 수 있음을 발견하였다.
예를 들어, 도 6A는 10 pg의 CT 타겟을 함유하는 샘플에서 NG 타겟에 대한 시그널 추출의 일 구현예를 나타낸다. 제2 타겟 핵산 서열(NG)에 대한 시그널을 수학식 I-1에 따라 (i) 제1 타겟 핵산 서열(CT)에 대한 기준값 1.50 및 (ii) 상대적 저온 검출 온도(60℃) 및 상대적 고온 검출 온도(72℃)에서 검출된 시그널을 사용하여 추출하였다. 상기 샘플은 CT 타겟만을 함유하기 때문에, CT 타겟 시그널을 제거하여 추출된 NG 타겟에 대한 시그널은 CT 타겟에 대한 적절한 단일 기준값이 적용된 경우 모든 사이클에서 이론적으로 약 RFU 0이어야 한다. 이러한 예상과 달리, CT 타겟에 대한 기준값(1.50)의 적용은 CT 타겟으로부터 유래된 시그널보다 큰 시그널의 제거로 인해 RFU 0보다 유의하게 낮은 잘못된 시그널을 발생하였다.
또 다른 예로서, 도 7A는 100 fg의 NG 및 10 pg의 CT 타겟을 함유하는 샘플에서 NG 타겟에 대한 시그널 추출의 일 구현예를 나타낸다. 제2 타겟 핵산 서열(NG)에 대한 시그널을 수학식 I-1에 따라 (i) 제1 타겟 핵산 서열(CT)에 대한 기준값 1.50 및 (ii) 상대적 저온 검출 온도(60℃) 및 상대적 고온 검출 온도(72℃)에서 검출된 시그널을 사용하여 추출하였다. 도 7A에서, 생성된 추출된 시그널의 일부는 이론적으로 예측되지 않는 패턴(RFU 0 미만)을 나타낸다.
이러한 결과는 타겟 핵산 서열에 대한 시그널 추출을 위해 모든 반응에 단일 기준값이 적용되는 경우, 특정 반응에 대한 기준값의 부적합성으로 인해 잘못된 시그널이 발생할 수 있음을 입증한다.
실시예 2: MuDT1 기술에 기초한 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널의 제공
추출된 시그널이 잘못된 시그널을 포함하고 있음에도 불구하고, 본 발명의 방법이 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공할 수 있는지 확인하였다.
도 6B는 도 6A의 추출된 시그널로부터 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 다양한 분석 시그널을 수득하는 본 발명의 4개의 구현예(중간 좌측; 중간 우측; 하부 좌측; 하부 우측)를 나타낸다. 본 발명의 제1 구현예에 따르면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 50번째 사이클에 해당함)이 선택되고(상부 좌측); 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)(선택된 사이클 및 마지막 사이클이 모두 50번째 사이클임)이 NG의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 제공된다(중간 좌측). 본 발명의 제2 구현예에 따르면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 50번째 사이클에 해당함)이 선택되고(상부 좌측); 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클(50번째 사이클)까지의 시그널 값(들)이 추가로 변형(예컨대, 이동)된 다음, NG의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 제공된다(하부 좌측). 본 발명의 제3 구현예에 따르면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 50번째 사이클에 해당함)이 선택되고(상부 좌측); 첫 번째 사이클부터 상기 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의(1번째 사이클부터 49번째 사이클까지의) 시그널 값(들)이 상기 선택된 사이클에서의 시그널 값과 동일하도록 조정되고; 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의(1번째 사이클부터 49번째 사이클까지의) 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클(50번째 사이클)까지의 시그널 값(들)이 NG의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 함께 제공된다(중간 우측). 본 발명의 제4 구현예에 따르면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 50번째 사이클에 해당함)이 선택되고(상부 좌측); 첫 번째 사이클부터 상기 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의(1번째 사이클부터 49번째 사이클까지의) 시그널 값(들)이 선택된 사이클에서의 시그널 값과 동일하도록 조정되고; 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의(1번째 사이클부터 49번째 사이클까지의) 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클(50번째 사이클)까지의 시그널 값(들)이 추가로 변형(예컨대, 이동)된 다음 NG의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 제공된다(하부 우측).
도 7B는 도 7A의 추출된 시그널로부터 타겟 핵산 서열의 존재를 결정하기 위한 다양한 분석 시그널을 수득하는 본 발명의 4개의 구현예(중간 좌측; 중간 우측; 하부 좌측; 하부 우측)를 나타낸다. 본 발명의 제1 구현예에 따르면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 35번째 사이클에 해당함)이 선택되고(상부 좌측); 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의(35번째 사이클부터 50번째 사이클까지의) 시그널 값(들)이 NG의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 제공된다(중간 좌측). 본 발명의 제2 구현예에 따르면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 35번째 사이클에 해당함)이 선택되고(상부 좌측); 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의(35번째 사이클부터 50번째 사이클까지의) 시그널 값(들)이 추가로 변형(예컨대, 이동)된 다음, NG의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 제공된다(하부 좌측). 본 발명의 제3 구현예에 따르면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 35번째 사이클에 해당함)이 선택되고(상부 좌측); 첫 번째 사이클부터 상기 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의(1번째 사이클부터 34번째 사이클까지의) 시그널 값(들)이 선택된 사이클에서의 시그널 값과 동일하도록 조정되고; 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의(1번째 사이클부터 34번째 사이클까지의) 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의(35번째 사이클부터 50번째 사이클까지의) 시그널 값(들)이 NG의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 함께 제공된다(중간 우측). 본 발명의 제4 구현예에 따르면, 최소 시그널 값을 갖는 사이클("최소 사이클"로 표시됨; 35번째 사이클에 해당함)이 선택되고(상부 좌측); 첫 번째 사이클부터 상기 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의(1번째 사이클부터 34번째 사이클까지의) 시그널 값(들)이 선택된 사이클에서의 시그널 값과 동일하도록 조정되고; 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의(1번째 사이클부터 34번째 사이클까지의) 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의(35번째 사이클부터 50번째 사이클까지의) 시그널 값(들)이 추가로 변형(예컨대, 이동)된 다음 NG의 존재를 결정하기 위한 분석 시그널로서 제공된다(하부 우측).
상기 도 6B 및 7B에서, 관심있는 타겟 핵산 서열에 대한 적합하게 추출된 시그널이 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재 하에 증가하는 시그널 패턴을 나타낼 것으로 예상되기 때문에 최소 시그널 값을 갖는 사이클이 선택되었다는 것에 유의한다. 하지만, 단계 (b)에서 사용된 시그널 발생 과정 및 추출 과정에 따라, 최대 시그널 값을 갖는 사이클이 대신 선택될 수 있음이 당업자에게 이해될 것이다.
본 발명의 방법의 적용가능성을 입증하기 위해, 도 8A 내지 8D의 좌측 컬럼에 나타낸 NG 타겟에 대한 추출된 시그널(다양한 기준값, 예컨대 1.15, 1.50, 2.00 및 2.50을 사용하여)을 사용하였다.
<2-1> 최소 시그널 값을 갖는 사이클의 선택
실시예 1의 추출된 시그널(도 8A 내지 8D, 좌측 컬럼 참고)을 분석하여 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하였다. 이후, 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)을 타겟 비관련 시그널 영역으로 간주하고, 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값(들)을 타겟 관련 시그널 영역으로 간주하였다.
<2-2> 타겟 비관련 시그널 영역의 조정
각각의 추출된 시그널에 대해, 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)(타겟 비관련 시그널 영역)을 NG 타겟의 존재의 결정에 영향을 미치지 않도록 조정하였다. 구체적으로, 상기 시그널 값(들)을 선택된 사이클(최소 값을 갖는 사이클)에서의 시그널 값과 동일하도록 조정하였다.
<2-3> 전체 시그널 값의 이동
첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 조정되지 않은 시그널 값(들)을 포함하는 전체 시그널 값을 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 상향 이동시켰다. 수득된 시그널을 NG 타겟의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공하였다.
상기 단계에 의해 수득된 NG 타겟에 대한 분석 시그널을 도 8A 내지 8D의 우측 컬럼에 나타내었다.
도 8B에 나타낸 바와 같이, 10 pg의 CT만을 함유하는 샘플의 경우, 잘못 추출된 시그널(좌측 컬럼)이 본 발명의 방법에 의해 정확하게 추출된 시그널(우측 컬럼)로 보정된 것으로 나타났다.
또한, 도 8C에 나타낸 바와 같이, 100 fg의 NG 및 10 pg의 CT를 함유하는 샘플의 경우, 잘못 추출된 시그널(좌측 컬럼)이 본 발명의 방법에 의해 정확하게 추출된 시그널(우측 컬럼)로 보정된 것으로 나타났다.
<2-4> 타겟 핵산 서열의 존재의 결정
단계 3에서 제공된 분석 시그널을 사용하여, 타겟 핵산 서열의 존재 및 양을 결정하였다. 이 목적을 위해 RFU 100의 역치를 사용하였다.
결과가 하기 표 2에 요약되어 있다.
NG CT RV 추출된 신호 분석 신호
존재 Ct 값 존재 Ct 값
100 fg - 1.15 양성 36.43 양성 36.21
100 fg - 1.50 양성 36.55 양성 36.26
100 fg - 2.00 양성 36.72 양성 36.32
100 fg - 2.50 양성 36.89 양성 36.39
- 10 pg 1.15 음성 N.D 음성 N.D
- 10 pg 1.50 음성 N.D 음성 N.D
- 10 pg 2.00 음성 N.D 음성 N.D
- 10 pg 2.50 음성 N.D 음성 N.D
100 fg 10 pg 1.15 양성 36.56 양성 35.72
100 fg 10 pg 1.50 양성 39.85 양성 36.98
100 fg 10 pg 2.00 양성 46.35 양성 37.47
100 fg 10 pg 2.50 음성 N.D 양성 37.79
- - 1.15 음성 N.D 음성 N.D
- - 1.50 음성 N.D 음성 N.D
- - 2.00 음성 N.D 음성 N.D
- - 2.50 음성 N.D 음성 N.D
표 2에 나타낸 바와 같이, 10 pg의 CT만을 함유하는 샘플 및 100 fg의 NG 및 10 pg의 CT를 함유하는 샘플에 대해 위음성 결과 및 일부 Ct 값이 보정된 것으로 나타났다.
실시예 3: MuDT2 기술에 기초한 시그널 검출 및 추출
MuDT2 기술(WO 제2016/093619호 참고)의 일 구현예에 따르면, 2개의 시그널 발생 수단은 상대적 고온 검출 온도 및 상대적 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시킨다. 시그널 값의 가공을 실시하여 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 또는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 기준값에 의해 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출한다. 마찬가지로, 시그널 값의 가공을 실시하여 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널 또는 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 기준값에 의해 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출한다.
<3-1> 주형 및 올리고뉴클레오타이드의 제조
TaqMan 방법을 상이한 검출 온도에서 실시간 방식으로 시그널을 검출하기 위한 실시간 PCR 접근법으로서 사용하였다.
5' 뉴클레아제 활성을 갖는 Taq DNA 중합효소를 업스트림 프라이머 및 다운스트림 프라이머의 연장 및 TaqMan 프로브의 절단에 사용하였다. 나이세리아 고노로애(NG)의 게놈 DNA 및 클라미디아 트라코마티스(CT)의 게놈 DNA를 타겟 핵산 서열로서 사용하였다.
타겟 핵산이 TaqMan 실시간 PCR에 존재하는 경우, TaqMan 프로브는 절단되어 표지된 단편을 방출한다. 상기 표지된 단편의 방출은 시그널을 제공하고 상기 표지된 단편으로부터 시그널을 측정함으로써 증폭 곡선을 얻을 수 있다.
NG를 위한 TaqMan 프로브는 5'-말단에 형광 리포터 분자(Quasar 670) 및 3'-말단에 퀀처 분자로 표지되었고(서열번호: 9), CT를 위한 TaqMan 프로브는 5'-말단에 형광 리포터 분자(Quasar 670) 및 내부 사이트에 퀀처 분자(BHQ-2)로 표지되었다(서열번호: 12).
본 실시예에서, NG에 대한 시그널 및 CT에 대한 시그널 모두는 60℃ 및 72℃에서 검출된다. 2개의 타겟에 사용되는 TaqMan 프로브는 2개의 검출 온도 사이에서 상이한 시그널 변화의 관계(즉, 상이한 기준값)를 제공한다. 특히, TaqMan 프로브는 본 실시예에서 CT에 대한 60℃ 및 72℃에서의 시그널 차이가 NG에 대한 것보다 크도록 설계되었다.
본 실시예에 사용된 업스트림 프라이머, 다운스트림 프라이머, 및 TaqMan 프로브의 서열이 표 3에 기재되어 있다.
명칭 유형 서열 (5' → 3') 서열번호
NG_F 프라이머 TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG 서열번호:1
NG_R 프라이머 CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC 서열번호:2
NG_P TaqMan프로브 [Quasar 670]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2] 서열번호:9
CT2_F 프라이머 TCCGAATGGATAAAGCGTGACIIIIIATGAACTCAC 서열번호:10
CT2_R 프라이머 AACAATGAATCCTGAGCAAAGGIIIIICGTTAGAGTC 서열번호:11
CT2_P TaqMan프로브 [Quasar 670]CATTGTAAAGA[T(BHQ-2)]ATGGTCTGCTTCGACCG[C3 spacer] 서열번호:12
I : 데옥시이노신
BHQ : 퀀처(블랙홀 퀀처)
<3-2> 실시간 PCR 및 상이한 온도에서 시그널 검출
TaqMan 방법에 따른 실시간 PCR을 타겟 핵산(10 pg의 NG 게놈 DNA, 1 pg의 CT 게놈 DNA, 10 pg의 NG 게놈 DNA 및 1 pg의 CT 게놈 DNA의 혼합물), NG 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호:1), 10 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호:2) 및 1.5 pmole의 TaqMan 프로브(서열번호:9), CT 타겟 증폭을 위한 5 pmole의 업스트림 프라이머(서열번호:10), 10 pmole의 다운스트림 프라이머(서열번호:11) 및 3 pmole의 TaqMan 프로브(서열번호:12), 및 5 μl의 4X 마스터 믹스(최종 농도, 200 μM dNTPs, 2 mM MgCl2, 2 U의 Taq DNA 중합효소)(Enzynomics, Korea)를 함유하는 20 μl의 최종 부피에서 실시하였다. 상기 반응 혼합물을 함유하는 튜브를 실시간 열순환기(CFX96 실시간 순환기, Bio-Rad)에 50℃에서 5분간 두고, 95℃에서 15분간 변성시키고 95℃에서 30초, 60℃에서 60초, 72℃에서 30초의 50 사이클을 실시하였다. 시그널의 검출을 각 사이클에서 60℃ 및 72℃에서 실시하였다. 상기 결과가 도 9에 나타나 있다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 시그널은 NG, CT, 또는 NG + CT 타겟의 존재 하에 60℃ 및 72℃ 모두에서 검출되었고 타겟의 부존재 하에(NTC) 검출되지 않았다.
<3-3> 타겟 핵산 서열에 대한 시그널의 추출
도 9에 나타낸 바와 같이, 각 타겟에 대한 시그널은 60℃ 또는 72℃에서 검출된 시그널로부터 직접 얻을 수 없다. 따라서, 각 타겟에 대한 시그널을 추출하기 위해 각 검출 온도에서의 시그널로부터 다른 타겟에 대한 시그널을 제거해야 한다.
각 타겟에 대한 시그널은 각 타겟에 대해 72℃ 및 60℃에서의 시그널의 변화의 관계를 나타내는 기준값을 사용하여 추출할 수 있다. 본 실시예에서, 시그널을 수학식 I-1 및 수학식 I-4에 따라 추출하였다:
<식 I-1>
제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [상대적 저온 검출 온도에서의 시그널] - [(상대적 고온 검출 온도에서의 시그널) x (제1 기준값)];
상기 식에서, 제2 타겟 핵산 서열은 CT 타겟이고; 제1 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율이다.
<식 I-4>
제1 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [상대적 고온 검출 온도에서의 시그널] - [(상대적 저온 검출 온도에서의 시그널) ÷ (제2 기준값)];
상기 식에서, 제1 타겟 핵산 서열은 NG 타겟이고; 제2 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율이다.
각 타겟에 대한 추출된 시그널은 플롯팅될 수 있다.
각 타겟에 대한 기준값은 수학식 II-1 및 II-2에 따라 계산될 수 있다:
<식 II-1>
CT 타겟에 대한 기준값 = [CT 타겟만을 함유하는 대조군 샘플에 대한 60℃에서의 시그널] ÷ [CT 타겟만을 함유하는 대조군 샘플에 대한 72℃에서의 시그널]
<식 II-2>
NG 타겟에 대한 기준값 = [NG 타겟만을 함유하는 대조군 샘플에 대한 60℃에서의 시그널] ÷ [NG 타겟만을 함유하는 대조군 샘플에 대한 72℃에서의 시그널]
도 10A 내지 10D에 나타낸 바와 같이, NG 타겟에 대한 시그널을 CT 타겟에 대한 기준값을 사용하여 72℃에서의 시그널로부터 추출하였다. CT에 대한 기준값은 "6.50, 6.00, 5.50 또는 5.00"으로 미리 결정되었다. 1 pg의 CT 타겟을 함유하는 샘플에서 CT 타겟에 대한 기준값(5.50 또는 5.00)의 적용은 CT 타겟으로부터 비롯된 시그널보다 큰 시그널의 제거로 인해 잘못된 시그널을 발생시켰다(도 10B 참고). 상기 잘못된 시그널은 상기 기준값이 적합하지 않다는 것을 나타낸다.
도 11A 내지 11D에 나타낸 바와 같이, CT 타겟에 대한 시그널을 NG 타겟에 대한 기준값을 사용하여 60℃℃의 시그널로부터 추출하였다. NG 타겟에 대한 기준값은 "1.80, 2.50, 3.00 또는 3.50"으로 미리 결정되었다. NG 타겟에 대한 기준값(2.50, 3.00 또는 3.50)의 적용은 NG 타겟으로부터 비롯된 시그널보다 큰 시그널의 제거로 인해 잘못된 시그널을 발생시켰다(도 11A 및 11C 참고). 상기 잘못된 시그널은 상기 기준값이 적합하지 않다는 것을 나타낸다.
이러한 결과는, 타겟 핵산 서열의 시그널 추출을 위해 모든 반응에 단일 기준값을 적용할 때, 특정 샘플에 대한 기준값의 부적합성으로 인해 잘못된 시그널이 발생한다는 것을 입증한다.
실시예 4: MuDT2 기술에 기초한 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널의 제공
실시예 2와 유사한 방식으로, 실시예 3의 추출된 시그널을 분석하여 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하였다. 적합하게 추출된 시그널은 증가하는 시그널 패턴을 나타낼 것으로 예상되므로, 본 실시예에서는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하였다. 이후, 첫 번째 사이클부터 상기 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)(타겟 비관련 영역)을 선택된 사이클(최소 값을 갖는 사이클)에서의 시그널 값과 동일하도록 조정하였다. 이후, 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 조정되지 않은 시그널 값(들)을 포함하는 전체 시그널 값을 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 상향 이동시켰다. 수득된 시그널을 NG 타겟 또는 CT 타겟의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공하였다.
상기 단계에 의해 수득된 NG 타겟에 대한 분석 시그널을 도 10A 내지 10D의 우측 컬럼에 나타내었다. 또한, 상기 단계에 의해 수득된 CT 타겟에 대한 분석 시그널을 도 11A 내지 11D의 우측 컬럼에 나타내었다.
도 10B에 나타낸 바와 같이, 1 pg의 CT만을 함유하는 샘플의 경우, 잘못 추출된 시그널(좌측 컬럼)이 본 발명의 방법에 의해 정확하게 추출된 시그널(우측 컬럼)로 보정된 것으로 나타났다.
또한, 도 11A에 나타낸 바와 같이, 10 fg의 NG만을 함유하는 샘플 및 10 pg의 NG 및 1 pg의 CT를 함유하는 샘플의 경우, 잘못 추출된 시그널(좌측 컬럼)이 본 발명의 방법에 의해 정확하게 추출된 시그널(우측 컬럼)로 보정된 것으로 나타났다.
또한, 상기 분석 시그널을 사용하여, 타겟 핵산 서열의 존재 및 양을 결정하였다. 이 목적을 위해 역치 200 및 150을 CT 및 NG 타겟에 대해 각각 사용하였다.
결과가 하기 표 4 및 5에 요약되어 있다.
NG CT RV 추출된 시그널 분석 시그널
존재 Ct 값 존재 Ct 값
10 pg - 6.50 양성 35.04 양성 34.94
10 pg - 6.00 양성 35.16 양성 35.05
10 pg - 5.50 양성 35.30 양성 35.19
10 pg - 5.00 양성 35.50 양성 35.41
- 1 pg 6.50 음성 N.D 음성 N.D
- 1 pg 6.00 음성 N.D 음성 N.D
- 1 pg 5.50 음성 N.D 음성 N.D
- 1 pg 5.00 음성 N.D 음성 N.D
10 pg 1 pg 6.50 양성 34.74 양성 34.65
10 pg 1 pg 6.00 양성 34.87 양성 34.77
10 pg 1 pg 5.50 양성 35.02 양성 34.93
10 pg 1 pg 5.00 양성 35.20 양성 35.12
- - 6.50 음성 N.D 음성 N.D
- - 6.00 음성 N.D 음성 N.D
- - 5.50 음성 N.D 음성 N.D
- - 5.00 음성 N.D 음성 N.D
NG CT RV 추출된 시그널 분석 시그널
존재 Ct 값 존재 Ct 값
10 pg - 1.80 음성 N.D 음성 N.D
10 pg - 2.50 음성 N.D 음성 N.D
10 pg - 3.00 음성 N.D 음성 N.D
10 pg - 3.50 음성 N.D 음성 N.D
- 1 pg 1.80 양성 42.29 양성 42.29
- 1 pg 2.50 양성 43.20 양성 43.06
- 1 pg 3.00 양성 43.77 양성 43.37
- 1 pg 3.50 양성 44.36 양성 43.65
10 pg 1 pg 1.80 양성 41.67 양성 41.69
10 pg 1 pg 2.50 양성 44.68 양성 43.07
10 pg 1 pg 3.00 양성 47.66 양성 43.46
10 pg 1 pg 3.50 음성 N.D 양성 43.75
- - 1.80 음성 N.D 음성 N.D
- - 2.50 음성 N.D 음성 N.D
- - 3.00 음성 N.D 음성 N.D
- - 3.50 음성 N.D 음성 N.D
표 4에 나타낸 바와 같이, 10 pg의 NG만을 함유하는 샘플 및 10 pg의 NG 및 1 pg의 CT를 함유하는 샘플에 대해 일부 Ct 값이 보정된 것으로 나타났다. 또한, 표 5에 나타낸 바와 같이, 1 pg의 CT만을 함유하는 샘플에 대해 일부 Ct 값이 보정되었고, 10 pg의 NG 및 1 pg의 CT를 함유하는 샘플에 대해 위음성 결과 및 일부 Ct 값이 또한 보정된 것으로 나타났다.
실시예 5: 상이한 방식으로 추출된 시그널에 본 발명의 방법의 적용가능성
본 발명의 방법이 실시예 3에서 식 I-1을 사용하여 추출된 것 대신에 식 I-2를 사용하여 추출된 제2 타겟 핵산 서열(즉, CT 타겟)에 대한 시그널에 적용될 수 있는지 여부를 조사하였다.
이 목적을 위해, 10 pg의 NG 및 1 pg의 CT의 혼합물을 함유하는 샘플에 대해 60℃ 및 72℃에서 검출된 두 시그널(도 9에서 3번째 열 참고)을 CT 타겟을 위한 시그널 검출에 적용하였다. CT 타겟의 시그널 추출을 위해, 하기 수학식 I-2를 사용하였다:
<식 I-2>
제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널 = [단계 (a)에서 수득된 상대적 고온 검출 온도에서의 시그널] - [(단계 (a)에서 수득된 상대적 저온 검출 온도에서의 시그널) ÷ (제1 기준값)];
상기 식에서, 제2 타겟 핵산 서열은 CT 타겟이고; 제1 기준값은 상대적 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널 대 상대적 고온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 비율이다.
제1 기준값 1.80, 2.50, 3.00 및 3.50을 사용하였다.
CT 타겟에 대한 추출된 시그널을 도 12의 좌측 컬럼에 나타내었다.
사용된 기준값이 적합하면, 식 I-2를 사용하여 추출된 시그널은 타겟의 존재 하에 감소하는 패턴을 나타내거나 타겟의 부존재 하에 실질적으로 0을 나타낼 것이다. 따라서, 이러한 예측된 시그널 패턴을 벗어나는 시그널, 예를 들어 RFU 0보다 유의하게 큰 시그널 값(들)을 갖는 시그널은 잘못 추출된 시그널에 해당한다.
도 12의 좌측 컬럼에 나타낸 바와 같이, NG 타겟에 대한 기준값(2.50, 3.00 또는 3.50)의 적용은 RFU 0보다 유의하게 큰 잘못된 시그널을 발생시켰다.
실시예 4와 유사한 방식으로, 추출된 시그널을 분석하여 최대 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하였다. 적합하게 추출된 시그널은 감소하는 시그널 패턴을 나타낼 것으로 예상되므로, 본 실시예에서는 최대 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하였다. 이후, 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값(들)(타겟 비관련 시그널 영역)을 선택된 사이클(최대 값을 갖는 사이클)에서의 시그널 값과 동일하도록 조정하였다. 이후, 첫 번째 사이클부터 상기 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값(들) 및 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 조정되지 않은 시그널 값(들)을 포함하는 전체 시그널 값을 선택된 사이클이 0의 시그널 값을 갖도록 하향 이동시켰다. 수득된 시그널을 CT 타겟의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공하였다.
상기 단계에 의해 수득된 CT 타겟에 대한 분석 시그널을 도 12의 우측 컬럼에 나타내었다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 비정상적으로 추출된 시그널(좌측 컬럼)은 본 발명의 방법에 의해 정확하게 추출된 시그널(우측 컬럼)로 보정된 것으로 나타났다.
이들 결과로부터 본 발명의 방법이 특정 시그널 영역을 분석 시그널로서 사용하여 보다 정확한 방식으로 타겟 핵산 서열을 검출할 수 있음을 추론할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예를 상세히 기술하였는바, 본 발명의 취지에 속하는 변형 및 수정이 당업자에게 명백할 것으로 이해될 것이며, 본 발명의 범위는 첨부된 청구항과 그의 균등물에 의해 정의될 것이다.
<110> SEEGENE, INC. <120> ANALYTICAL SIGNAL FOR DETERMINATION OF THE PRESENCE OF A TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCE <130> PP180015 <150> KR 10-2017-0039306 <151> 2017-03-28 <150> PCT/KR 2018/003590 <151> 2018-03-27 <160> 12 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 1 tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37 <210> 2 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_R <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 2 caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_PTO <400> 3 gtacgcgata cgggcccctc attggcgtgt ttcg 34 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_CTO <400> 4 tttttttttt tttttttttg tactgcccgt atcgcgtac 39 <210> 5 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT_F <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> n denotes deoxyinosine <400> 5 gagttttaaa atgggaaatt ctggtnnnnn tttgtataac 40 <210> 6 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT_R <220> <221> misc_feature <222> (26)..(30) <223> n denotes deoxyinosine <400> 6 ccaattgtaa tagaagcatt ggttgnnnnn ttattggaga 40 <210> 7 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT_PTO <400> 7 gattacgcga ccgcatcaga agctgtcatt ttggctgcg 39 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT_CTO <400> 8 gcgctggata ccctggacga tatgtgcggt cgcgtaatc 39 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NG_P <400> 9 tgcccctcat tggcgtgttt cg 22 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT2_F <220> <221> misc_feature <222> (22)..(26) <223> n denotes deoxyinosine <400> 10 tccgaatgga taaagcgtga cnnnnnatga actcac 36 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT2_R <220> <221> misc_feature <222> (23)..(27) <223> n denotes deoxyinosine <400> 11 aacaatgaat cctgagcaaa ggnnnnncgt tagagtc 37 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CT2_P <400> 12 cattgtaaag atatggtctg cttcgaccg 29

Claims (16)

  1. 하기를 포함하는, 샘플 내 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널을 제공하는 방법:
    (a) 단일 반응 용기에서 샘플을 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제1 시그널 발생 수단 및 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 발생시킬 수 있는 제2 시그널 발생 수단과 함께 인큐베이션하고, 시그널을 고온 검출 온도 및 저온 검출 온도에서 단일 유형의 검출기에 의해 검출하는 단계로서; 상기 인큐베이션은 시그널 발생 과정에 의해 실시되고; 상기 검출은 시그널 발생 과정의 하나 이상의 사이클에서 실시되어 하나 이상의 사이클 각각에서 시그널 값을 얻고; 상기 2개의 시그널 발생 수단에 의해 발생되는 2개의 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며;
    (b) 단계 (a)에서 얻은 시그널 값을 제2 기준값을 사용하여 가공하여 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하거나 또는 단계 (a)에서 얻은 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 가공하여 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 고온 검출 온도 및 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이고, 상기 제2 기준값은 고온 검출 온도 및 저온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이며; 상기 제1 기준값은 제1 타겟 핵산 서열 및 제1 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되고, 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열 및 제2 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되며;
    (c) 상기 추출된 시그널이 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타내는지 확인하는 단계;
    (d) 상기 추출된 시그널이 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타내지 않으면, 상기 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널에서 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하고, 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값을 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공하며,
    상기 추출된 시그널이 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타내면, 상기 추출된 시그널을 분석 시그널로 제공하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 제1 시그널 발생 수단 또는 제2 시그널 발생 수단이 시그널 발생 과정에서 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재 하에 증가하는 시그널 패턴을 나타내는 시그널 발생 수단인 경우, 상기 선택된 사이클은 최소 시그널 값을 갖는 사이클이거나; 또는 제1 시그널 발생 수단 또는 제2 시그널 발생 수단이 시그널 발생 과정에서 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재 하에 감소하는 시그널 패턴을 나타내는 시그널 발생 수단인 경우, 상기 선택된 사이클은 최대 시그널 값을 갖는 사이클인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값을 분석 시그널로서 제공하기 전에 변형시키는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 변형은 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값을 상향 또는 하향 이동시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 방법은 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정에 영향을 미치지 않을 정도까지 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값을 조정하고 상기 조정된 시그널 값을 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값과 조합하여 분석 시그널로서 제공하는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조정은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값을 백그라운드 수준으로 조정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 조정은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 시그널 값을 선택된 사이클에서의 시그널 값과 실질적으로 동일하도록 조정하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제5항에 있어서, 상기 방법은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값을 분석 시그널로서 제공하기 전에 변형시키는 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 변형은 첫 번째 사이클부터 선택된 사이클 바로 이전 사이클까지의 조정된 시그널 값 및 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값을 상향 또는 하향 이동시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 제1 시그널 발생 수단은 고온 검출 온도 및 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키고, 제2 시그널 발생 수단은 저온 검출 온도에서 시그널에서 발생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 수학적으로 가공하여 단계 (a)에서의 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 수학적으로 가공하여 단계 (a)에서의 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 2개의 시그널 발생 수단은 고온 검출 온도 및 저온 검출 온도에서 시그널을 발생시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 제2 기준값은 제1 기준값보다 크고, (i) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 제1 기준값을 사용하여 단계 (a)에서 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하거나; (ii) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 제1 기준값을 사용하여 단계 (a)에서 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하거나; (iii) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 제2 기준값을 사용하여 단계 (a)에서 저온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하거나; (iv) 단계 (b)에서 시그널 값의 가공은 제2 기준값을 사용하여 단계 (a)에서 고온 검출 온도에서의 시그널로부터 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 수학적으로 추출하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 하기를 포함하는, 샘플 내 타겟 핵산 서열에 대한 분석 시그널을 제공하기 위한 방법을 실행하기 위한 프로세서를 구현하는 지시를 포함하는 컴퓨터 해독가능한 기록매체:
    (a) 고온 검출 온도 및 저온 검출 온도에서 샘플로부터 시그널 값을 수신하는 단계로서; 샘플 내 제1 타겟 핵산 서열은 제1 시그널 발생 수단에 의해 검출되고 샘플 내 제2 타겟 핵산 서열은 제2 시그널 발생 수단에 의해 검출되며; 상기 검출은 시그널 발생 과정의 하나 이상의 사이클에서 실시되어 상기 하나 이상의 사이클 각각에서 시그널 값을 얻고; 상기 2개의 시그널 발생 수단에 의해 발생되는 시그널은 단일 유형의 검출기에 의해 구별되지 않으며;
    (b) 단계 (a)에서 얻은 시그널 값을 제2 기준값을 사용하여 가공하여 제1 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하거나 또는 단계 (a)에서 수득된 시그널 값을 제1 기준값을 사용하여 가공하여 제2 타겟 핵산 서열에 대한 시그널을 추출하는 단계로서; 상기 제1 기준값은 고온 검출 온도 및 저온 검출 온도에서 제1 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이고, 상기 제2 기준값은 고온 검출 온도 및 저온 검출 온도에서 제2 시그널 발생 수단에 의해 제공된 시그널의 변화의 관계를 나타내는 값이며; 상기 제1 기준값은 제1 타겟 핵산 서열 및 제1 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되고, 상기 제2 기준값은 제2 타겟 핵산 서열 및 제2 시그널 발생 수단을 사용하는 대조군 반응으로부터 결정되며;
    (c) 상기 추출된 시그널이 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타내는지 확인하는 단계;
    (d) 상기 추출된 시그널이 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타내지 않으면, 상기 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열에 대한 추출된 시그널에서 최대 시그널 값 또는 최소 시그널 값을 갖는 사이클을 선택하고, 상기 선택된 사이클부터 마지막 사이클까지의 시그널 값을 제1 타겟 핵산 서열 또는 제2 타겟 핵산 서열의 존재의 결정을 위한 분석 시그널로서 제공하며,
    상기 추출된 시그널이 이론적으로 예측된 시그널 패턴을 나타내면, 상기 추출된 시그널을 분석 시그널로 제공하는 단계.
  16. (a) 컴퓨터 프로세서 및 (b) 상기 컴퓨터 프로세서에 연결된 제15항의 컴퓨터 해독가능한 기록매체를 포함하는, 샘플 내 타겟 핵산 서열에 대한 분석 시그널을 제공하기 위한 장치.
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