CN112004941B - 用于检测样品中的多个靶核酸序列的方法及装置 - Google Patents

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Abstract

本发明获取周期/信号变化值的数据集，由此，可在一个检测通道中有效检测多个靶核酸序列。

Description

用于检测样品中的多个靶核酸序列的方法及装置
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年4月20日提交且申请号为第2018-0046375号的韩国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及使用信号变化值的样品中的多个靶核酸序列的检测。
背景技术
实时聚合酶链式反应(实时PCR)为用于实时检测样品中的靶核酸的基于聚合酶链式反应的技术(Logan J et al.,(2009).Real-Time PCR：Current Technology andApplications.Caister Academic Press)。为了检测靶核酸分子，实时聚合酶链式反应使用与靶分子的量成比来产生能够检测的荧光信号的信号产生组合物。可通过使用当嵌入至双链脱氧核糖核酸(DNA)之间时产生信号的嵌入剂或具有荧光报道分子及猝灭分子的寡核苷酸来实现荧光信号的产生。具有与靶分子的量成比的强度的荧光信号在各个扩增周期中被检测到并对扩增周期进行绘制，从而获取扩增曲线(amplification curve)或扩增轮廓曲线(amplification profile curve)。
为了检测靶核酸序列，广泛使用通过实时方式监测靶扩增并检测靶核酸序列的实时检测方法。实时检测方法通常使用与靶核酸序列特异性杂交的标记的探针或引物。作为应对方案，提出了使用依赖于靶核酸序列的存在而形成的二聚物的实时检测方法。
上述所记载的以往的实时检测技术在与靶扩增一同或没有靶扩增的信号扩增过程中选择的检测温度中，检测从荧光标记物产生的信号。在根据以往的实时检测技术在单一反应管使用单一类型的标记物检测多个靶核酸序列的情况下，对于上述多个靶核酸序列产生的多个信号不会相互区分。因此，在以往的实时检测技术中，通常为了检测多个靶核酸序列，使用不同类型的标记物。即使使用单一类型的标记物，使用Tm值差值的解链分析可检测多个靶核酸序列。但是，解链分析的作业时间比实时技术长，当靶序列增加时，难以设计具有互不相同的Tm值的探针。并且，与实时检测方法不同，解链分析不提供Ct值，因此，定量适用受限。
为了在单一反应容器中使用更具有相同信号特性的标记物及单一类型的检测仪来检测多个靶核酸序列，研发了不依赖解链分析的新的方法或方法。
在国际申请公开第2015/147412号公开了利用不同的检测温度检测样品中的多个靶核酸序列的方法。上述方法的特征在于，在所要检测的靶核酸序列的数和相同数的检测温度测定信号。上述方法具有在每一个靶核酸序列使用较低检测温度的优点，但是，为了满足检测温度条件，需选择相距较远的检测温度。
在美国专利申请公开第2005/0053950号公开了使用靶核酸序列的扩增子及嵌入染料来检测多个靶核酸序列的方法。为了检测，上述方法采用多个扩增子之间的Tm值差值。但是，难以调节与不同的多个靶核酸序列有关的多个扩增子的Tm值。并且，上述多个扩增子具有相对长的核苷酸长度，通过多个检测温度中的小的温度变化诱导充足的信号变化时受限。
在美国专利第8039215号公开了在各个周期执行解链分析并在各个周期对靶的解链峰值进行绘制来生成与靶有关的扩增曲线的方法。各个周期中的解链分析消耗很多的时间。
在本说明书全文中，参照并引用多个论文及专利文献。全部所引用的论文及专利文献的公开内容通过引用结合在本说明书中，由此，更加明确说明本发明所属技术领域的水平及本发明的内容。
发明内容
技术问题
本发明人努力研究研发在单一反应容器中使用具有相同信号特性的标记物来检测多个靶核酸序列的新方法。结果，本发明人确认了如下的事项：在两个温度下，通过从包含标记的寡核苷酸的二聚物获取的多个信号值计算的信号变化值来确定多个靶核酸序列的存在或不存在。
因此，本发明的目的在于，提供通过使用信号变化值来检测多个靶核酸序列的方法。
本发明的再一目的在于，提供包含指令的计算机可读存储介质，上述指令执行使处理器使用信号变化值来确定多个靶核酸序列的存在的方法。
本发明的另一目的在于，提供使用信号变化值来检测多个靶核酸序列的装置。
本发明的还有一目的在于，提供使用信号变化值来检测靶核酸序列的方法。
本发明的又一目的在于，提供包含指令的计算机可读存储介质，上述指令执行使处理器使用信号变化值来确定靶核酸序列的存在的方法。
本发明的又一目的在于，提供使用信号变化值来检测靶核酸序列的装置。
可通过发明要求保护范围、附图以及下述详细说明明确本发明的其他目的及优点。
发明的效果
本发明的特征及优点如下。
(a)本发明在分配给多个靶核酸序列各自中的检测温度范围获取与相应的靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集，来可在一个检测通道有效检测多个靶核酸序列。
(b)相比于从靶核酸序列的扩增子的信号产生，本发明利用从包含标记的寡核苷酸的二聚物的信号产生。这些二聚物的长度比扩增子短，因此，在相对小的温度变化，也对杂交或解离更敏感。并且，在使用包含标记的寡核苷酸的二聚物的过程中，通过5℃以内间隔的基准温度，也可提供示出靶核酸序列的存在的信号变化值。
(c)本发明使用包含标记的寡核苷酸的多个二聚物。这些多个二聚物需精心设计为具有不同的Tm值。
在一实例中，在以依赖介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成多个二聚物的过程中，不受靶核酸序列的影响，可自由调节多个二聚物的Tm值。因此，通过介导寡核苷酸-干预裂解形成多个二聚物可使本发明的利用性最大化。
(d)能够与靶核酸序列杂交的以往的标记的寡核苷酸，尤其，标记的探针当存在具有5’核酸酶活性的核酸聚合酶时，在反应过程中被切割，与双链靶核酸序列中的一个链竞争，由此，可导致信号变化值的减少。在一实例中，依赖本发明的介导寡核苷酸-干预裂解的二聚物形成可防止这种信号变化值的减少。
(e)本发明对于各个靶核酸序列使用两个基准温度。上述两个基准温度之间的间隔可设置为相对窄，例如5℃以内，因此，本发明的方法去除了上述两个基准温度中的信号变化值包含与其他靶核酸序列有关的信号变化值的可能性。
(f)本发明可使用一个检测通道来在单一反应容器检测多个靶核酸序列。
(g)本发明中使用的与各个靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集可提供噪声信号减少、孔间或设备之间的信号偏差的减少或基线校正。
(h)由于Tm值的移动，以与靶核酸序列有关的二聚物的预测Tm值为基础的多个基准温度的确定可能不适合实际反应。本发明可从与各个靶核酸序列有关的多个检测温度选择反映实际反应的多个基准温度。
附图说明
图1为例示本发明的确定多个靶核酸序列的存在或不存在的过程的一实例的流程图。
图2例示与三个靶核酸序列有关的三个检测温度范围的一实例。
图3例示通过与三个靶核酸序列各自有关的两个基准检测温度中的信号值计算的信号变化值的一实例。
图4例示从多个检测温度选择两个基准温度的一实例。
图5例示从多个检测温度选择两个基准温度的另一实例。
图6例示变数分离法。
图7示出绘制与单一靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集来获取的扩增曲线。
图8-12示出绘制与多个靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集来获取的扩增曲线。
具体实施方式
在包含提供具有相同信号特性(例如，相同的波长范围)的信号的标记物的且具有不同Tm值的多个二聚物存在于单一反应容器的情况下，在特定检测温度下检测的信号值可包含从上述多个二聚物产生的多个信号的组合。
在与靶核酸序列有关的各个二聚物的情况下，存在信号值的强度根据温度不同的温度范围，这依赖各个二聚物的Tm值。从靶核酸序列的信号强度根据温度改变，但是，来自其他靶核酸序列的未改变信号强度的温度范围内的温度中的信号值可包含来自其他靶核酸序列的信号。其他靶核酸序列所贡献的信号强度在上述温度范围几乎恒定。在上述温度范围内的两个温度中的信号值的信号变化值的计算过程中可去除通过其他靶核酸序列提供的信号值，并可仅获取通过靶核酸序列提供的信号-变化值。换言之，上述温度范围内的两个温度之间的信号变化值可通过与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化提供，这表示相应的靶核酸序列的存在。
本发明人确认了如下事项：包含标记的寡核苷酸的二聚物，尤其，在使用依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物的过程中，可通过多个二聚物的Tm值的精准调节及对于温度变化的二聚物-解离或杂交敏感度的增加，以及，相对窄的间隔的多个温度之间，例如2℃至5℃(尤其，约2℃至4℃)间隔的多个温度中的信号变化值来检测靶核酸序列。并且，还确认了如下事项：使用窄间隔的多个温度可减少假阳性的风险，并且，可检测更多数量的核酸序列。进而，本发明人为了解决二聚物的预测Tm值与实际反应中的Tm值不同的问题，采用了对于各个反应所要用于信号变化值的计算的多个基准温度的方法。这种方法可提供更准确且可靠的结果以及对于反应之间变化的耐受性更强的结果。
I.使用两个温度中的信号变化值来检测样品中的多个靶核酸序列
根据本发明的一实施方式，本发明提供用于检测样品中的多个靶核酸序列的方法，包括：在单一反应容器中使上述样品与用于检测上述多个靶核酸序列的信号产生组合物相接触的步骤，上述信号产生组合物形成与上述多个靶核酸序列有关的多个二聚物，上述多个二聚物分别提供表示各自相应的靶核酸序列的存在的信号，上述多个二聚物具有互不相同的Tm值；为了(i)上述多个二聚物的形成及(ii)所形成的上述多个二聚物的杂交(hybridization)或解离(dissociation)而实施至少两周期的反应的步骤；在上述反应的所有或一部分周期中，在分配给上述多个靶核酸序列的多个检测温度范围各自中的至少两个检测温度下获取多个信号值的步骤，上述多个检测温度范围分别包括与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物量变化的温度范围；获取从上述多个检测温度范围各自中的上述至少两个检测温度选择的两个基准温度之间的多个信号值的信号变化值，来获取与上述多个靶核酸序列各自有关的周期/信号变化值的数据集的步骤；以及通过与上述多个靶核酸序列各自有关的上述周期/信号变化值的数据集确定样品中的多个靶核酸序列的存在或不存在的步骤。
图1为本发明的方法的流程图。参照图1，本发明的详细说明如下。
步骤110：将样品与信号产生组合物相接触的步骤
在单一反应容器中将所要分析的样品与用于检测多个靶核酸序列的信号产生组合物相接触。
在本申请中使用的术语“信号产生组合物”指产生用于表示靶核酸序列的存在或不存在的信号的组合物。择一性地，在本申请中使用的术语“信号产生组合物”指用于产生可通过生物学、生化或化学个过程以依赖于靶核酸序列的存在的方式检测的信号的一种物质。尤其，在本申请中使用的术语“信号产生组合物”指用于产生能够以依赖于二聚物的形成的方式检测的信号的一种物质。
在本发明的一实例中，信号产生组合物包含用于形成与相应的靶核酸序列有关的二聚物的物质。
可通过相应的信号产生组合物检测各个靶核酸序列。第一信号产生组合物可表示用于检测第一靶核酸序列的物质，第二信号产生组合物可表示用于检测第二靶核酸序列的物质。
通过相应的信号产生组合物形成的与相应的靶核酸序列有关的二聚物提供表示相应的靶核酸序列的存在或不存在的信号。
除非另行表示，则在本申请中使用的术语“表示存在的信号”可与“表示存在或不存在的信号”相互交换来使用。
在本申请中使用的术语“通过信号产生组合物产生的信号”可指从通过信号产生组合物形成的二聚物产生的信号。
与靶核酸序列有关的信号产生组合物可包含一个以上的寡核苷酸。上述一个以上的寡核苷酸可包含一个以上的标记的寡核苷酸。与靶核酸序列有关的信号产生组合物可包含参与二聚物的形成的一个以上的标记的寡核苷酸。
在一实例中，二聚物中的一个以上的链为标记的寡核苷酸。根据一实例，二聚物在至少一个链上包含至少一个标记物。
在本申请中使用的术语“检测寡核苷酸”为参与所要检测的信号的产生的寡核苷酸。根据一实例，检测寡核苷酸包含参与实际信号产生的寡核苷酸。根据一实例，检测寡核苷酸包含至少一个标记物。根据一实例，参与二聚物形成及信号产生的标记的寡核苷酸为检测寡核苷酸。
根据本发明的一实例，本发明的信号产生组合物以依赖于二聚物的形成的方式产生信号。
已周知以依赖于二聚物的形成的方式产生信号的多种方法，本发明的信号产生组合物可包含用于实施上述方法所需的物质。
在本申请中使用的关于信号产生组合物的表达“以依赖于二聚物的形成的方式产生信号”指所要检测的信号以依赖于两个核酸分子的结合或解离的方式提供。上述表达包括信号通过以依赖于靶核酸序列的存在的方式形成的二聚物(例如，具有标记物的检测寡核苷酸及核酸序列)提供。并且，上述表达包括信号通过抑制二聚物(例如，具有标记物的检测寡核苷酸及核酸序列)的杂交来提供，上述抑制通过其他二聚物的形成来诱发。
在本申请中使用的术语“二聚物的形成”不仅包括在反应过程中通过生成构成二聚物的一个以上的链的二聚物的形成，还包括通过杂交在杂交条件下存在于反应之前的两个链的的二聚物的形成。
本发明的最突出的特征中的一个在于，利用包含标记的寡核苷酸的二聚物代替作为靶核酸序列的扩增产物的扩增子。
本发明使用包含标记的寡核苷酸的二聚物的Tm值，而不是靶核酸序列的扩增子的Tm值。
相对难以将扩增子的Tm值调节为所要的Tm值。并且，多个扩增子的Tm值属于相对高的温度范围的可能性高，因此，能够用于检测多个靶核酸序列的温度范围受限。进而，用于标记靶核酸序列的扩增子而使用的嵌入染料混入非特异性产物，由此诱发错误的信号。根据一实例，本发明不使用嵌入染料。
通过本发明方法的多个信号产生组合物形成的多个二聚物可以为(i)通过靶核酸序列与标记的寡核苷酸之间的杂交形成的二聚物，(ii)通过包含与靶核酸序列互补的杂交序列的寡核苷酸和与上述杂交序列的至少一部分互补的标记的寡核苷酸之间的杂交形成的二聚物或(iii)以依赖于与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸-干预裂解(mediationoligonucleotide-involving cleavage)的方式形成的二聚物。
尤其，二聚物形成于与靶核酸序列及上述靶核酸序列特异性杂交的标记的寡核苷酸之间。
靶核酸序列与标记的寡核苷酸之间的二聚物的形成可通过包括Scorpion方法(Whitcombe et al,Nature Biotechnology17：804-807(1999))、Sunrise(或Amplifluor)方法(Nazarenko et al,Nucleic Acids Research,25(12)：2516-2521(1997)及美国专利第6117635号)、Lux方法(美国专利第7537886号)、Plexo r方法(Sherrill C B,et al.,Journal of the American Chemical Society,126：4550-45569(2004))、分子信标(Molecular Beacon)方法(Tyagi et al,Nature Biotechnology v.14MARCH 1996)、HyBeacon方法(French DJ et al.,Mol.Cell Probes,15(6)：363-374(2001))、相邻杂交探针(adjacent hybridization probe)方法(Bernard,P.S.et al.,Anal.Biochem.,273：221(1999))及LNA方法(美国专利第6977295号)的多种方法生成。
尤其，二聚物通过包含与靶核酸序列互补的杂交序列的寡核苷酸和与上述杂交序列的至少一部分互补的标记的寡核苷酸之间的杂交形成。
二聚物可在不存在靶核酸序列的状态下形成二聚物。但是，靶核酸序列的存在可阻断二聚物的杂交或诱发二聚物的一个以上的寡核苷酸的切割来防止形成二聚物。因此，二聚物可提供表示靶核酸序列的存在或不存在的信号。
包含与靶核酸序列互补的杂交序列的寡核苷酸可包含标记物，并且，可起到作为检测寡核苷酸的作用。
包含与靶核酸序列互补的杂交序列的寡核苷酸和与上述杂交序列的至少一部分互补的标记的寡核苷酸之间的二聚物可通过包括在文献[Li et al.,Nucleic AcidsResearch,Vol.30,No.2,e5(2002)]公开的方法的多种方法生成。
尤其，二聚物能够以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成。
在本申请中使用的术语“介导寡核苷酸”为不包含靶核酸序列的介导二聚物的生产的寡核苷酸。
在一实例中，介导寡核苷酸包含(i)包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的靶向部位以及(ii)包含与靶核酸序列非互补的核苷酸序列的标记部位。
根据一实例，介导寡核苷酸包含(i)包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-靶向部位以及(ii)包含与靶核酸序列非互补的核苷酸序列的5’-标记部位。
介导寡核苷酸可参与以多种方式提供片段。
在本发明的一实例中，介导寡核苷酸与靶核酸序列杂交，诱导片段的释放来介导二聚物的生产。
在一实例中，介导寡核苷酸与靶核酸序列杂交，介导寡核苷酸-干预裂解释放片段。
在一实例中，介导寡核苷酸-干预裂解释放介导寡核苷酸的片段。尤其，介导寡核苷酸的片段包含介导寡核苷酸的标记部位的至少一部分。
在一实例中，介导寡核苷酸-干预裂解释放包含介导寡核苷酸的扩增子的片段。尤其，包含介导寡核苷酸的扩增子的片段包含与介导寡核苷酸的标记部位的至少一部分互补的序列。
在一实例中，将介导寡核苷酸用作引物来扩增靶核酸序列并通过在扩增子切割与介导寡核苷酸互补的序列的一部分来释放片段来生成包含介导寡核苷酸的扩增子。
在一实例中，包含介导寡核苷酸作为引物的引物对用于扩增靶核酸序列。
在本发明中，介导寡核苷酸本身的杂交不产生信号，通过介导寡核苷酸-干预裂解形成的片段参与用于形成二聚物的连续反应。
在一实例中，以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物为以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物，上述延伸链借助通过介导寡核苷酸-干预裂解释放的片段的延伸来形成。
在一实例中，介导寡核苷酸-干预裂解释放片段，上述片段与捕获寡核苷酸特异性杂交来在捕获寡核苷酸上延伸并形成延伸链。
在一实例中，捕获寡核苷酸从3’朝向5’方向包含(i)包含与通过介导寡核苷酸-干预裂解释放的片段互补的核苷酸序列的捕获部位以及(ii)包含用于延伸反应的模板序列的模板部位。
在一实例中，以不依赖于靶核酸序列的方式确定用于捕获寡核苷酸中的延伸反应的模板序列。
在一实例中，用于捕获寡核苷酸中的延伸反应的模板序列与介导寡核苷酸不互补。
在一实例中，以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物为通过从介导寡核苷酸-干预裂解释放的片段与对应(counterpart)寡核苷酸的杂交形成的二聚物。在此情况下，对应寡核苷酸上没有延伸反应。
在一实例中，对应寡核苷酸不具有用于片段的延伸反应的序列。该方法无法调节通过延伸反应形成的二聚物的Tm值。根据一实例，介导寡核苷酸-干预裂解释放片段，上述片段与对应寡核苷酸特异性杂交。
介导寡核苷酸可与对应寡核苷酸杂交来形成二聚物。但是，介导寡核苷酸的切割提供不同的二聚物，即，片段和对应寡核苷酸之间的二聚物。标记系统可使作为后者的二聚物通过二聚物的杂交和/或解离产生表示靶核酸序列存在或不存在的信号，但是，对于作为前者的二聚物并不这样。
在一实例中，以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物为通过包括下述步骤的以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物：步骤(i)，使介导寡核苷酸与靶核酸序列杂交；步骤(ii)，通过核酸酶切割介导寡核苷酸或包含介导寡核苷酸的扩增子来生成片段；步骤(iii)，使上述片段与包含所要与上述片段杂交的5’-捕获部位的捕获寡核苷酸杂交；以及步骤(iv)，实施在3’-模板部位上与捕获部位杂交的片段的延伸反应来形成延伸链。
在一实例中，通过下述步骤切割包含介导寡核苷酸的扩增子：步骤(i)，使靶核酸序列与包含介导寡核苷酸作为引物的引物对杂交；步骤(ii)，生成包含介导寡核苷酸的扩增子；以及步骤(iii)，切割包含与介导寡核苷酸互补的序列的链的一部分。
尤其，切割的部位包含与介导寡核苷酸的标记部位的至少一部分互补的序列，上述标记部位包含与靶核酸序列非互补的核苷酸序列。
在一实例中，以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物为通过下述步骤形成的二聚物：步骤(i)，使介导寡核苷酸与靶核酸序列杂交；步骤(ii)，通过核酸酶切割介导寡核苷酸来生成片段；以及步骤(iii)，使上述片段和具有与上述片段互补的序列的对应寡核苷酸杂交。
在一实例中，5’核酸酶或3’核酸酶用于切割介导寡核苷酸。根据一实例，具有5’核酸酶活性的核酸聚合酶或5’核酸酶用于切割介导寡核苷酸。
根据一实例，限制酶用于切割包含介导寡核苷酸的扩增子。
以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物包含多种类型的二聚物。延伸链本身可通过形成二聚物来产生信号。并且，延伸链的形成可控制其他二聚物的形成。
以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物可以为(i)延伸链与捕获寡核苷酸之间的二聚物、(ii)捕获寡核苷酸和捕获寡核苷酸-杂交寡核苷酸之间的二聚物、(iii)从延伸链-捕获寡核苷酸及捕获到上述延伸链-捕获寡核苷酸的延伸链的双延伸链之间的二聚物、(iv)双延伸链和上述双延伸链-杂交寡核苷酸之间的二聚物、或者(v)双延伸链-捕获寡核苷酸和所要与上述延伸链-捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸之间的二聚物。
在一实例中，介导寡核苷酸-干预裂解释放片段，上述释放与捕获寡核苷酸特异性杂交，上述片段通过延伸形成延伸链，在延伸链和捕获寡核苷酸之间形成延伸二聚物，这提供表示靶核酸序列的存在的信号。
在一实例中，在使用包含与上述片段的延伸链互补的杂交核苷酸序列的延伸链-杂交寡核苷酸的情况下，延伸链-杂交寡核苷酸与延伸链的杂交形成提供表示靶核酸序列的存在的信号的其他类型的二聚物。
在一实例中，在使用包含与捕获寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的捕获寡核苷酸-杂交寡核苷酸的情况下，捕获寡核苷酸-杂交寡核苷酸和捕获寡核苷酸之间的二聚物的形成提供被延伸链与捕获寡核苷酸之间的二聚物的形成抑制来表示靶核酸序列的存在的信号。
在一实例中，片段的延伸链与延伸链-捕获寡核苷酸特异性杂交，延伸链被延伸来形成双延伸链，导致双延伸链和上述延伸链-捕获寡核苷酸之间的二聚物形成，这提供表示靶核酸序列的存在的信号。
在一实例中，在使用包含与双延伸链互补的杂交核苷酸序列的双延伸链-杂交寡核苷酸的情况下，上述双延伸链-杂交寡核苷酸与上述双延伸链的杂交形成提供表示靶核酸序列的存在的信号的其他类型的二聚物。
在一实例中，在使用包含与延伸链-捕获寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的寡核苷酸的情况下，上述寡核苷酸和上述延伸链-捕获寡核苷酸之间的杂交的形成被双延伸链和延伸链-捕获寡核苷酸之间的二聚物的形成一致，由此，提供表示靶核酸序列的存在的信号。
在一实例中，包含与片段、延伸链、捕获寡核苷酸、延伸链-杂交寡核苷酸、捕获寡核苷酸-杂交寡核苷酸、双延伸链、延伸链-捕获寡核苷酸、双延伸链-杂交寡核苷酸、延伸链-捕获寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的寡核苷酸或它们的组合可作用为检测寡核苷酸。
尤其，伴随切割介导寡核苷酸的以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物可通过包括检测和标记寡核苷酸裂解和延伸(PTOCE，PTO cleavage and extension)方法(WO2012/096523)、检测和标记寡核苷酸切割和延伸依赖性信号寡核苷酸杂交(P CE-SH，PTO Cleavage and Extension-Dependent Signaling oligonucleotide Hybridization)方法(WO2013/115442)、检测和标记寡核苷酸切割和延伸依赖性非杂交(PCE-NH，PT OCleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization)方法(PCT/KR2013/012312)以及检测和标记寡核苷酸解理和延伸相关延伸(PTOCE-E，PTO Cleavage and Extension-dependent Extension)方法(WO2019/066461)的多种方法生成。
尤其，可通过包括在WO公开第2017/188669号中公开的方法的多种方法生成伴随切割包含介导寡核苷酸的扩增子的以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物。
关于在上述参考文献公开的术语，多个寡核苷酸的相应的例如下：介导寡核苷酸与检测和标记寡核苷酸(PTO，Probing and Tagging oligonucleotide)相应，捕获寡核苷酸与捕获和模板寡核苷酸(CTO，Capturing and Templating oligonucleotide)相应，延伸链-杂交寡核苷酸与信号寡核苷酸(SO，Signaling oligonucleotide)相应，捕获寡核苷酸-杂交寡核苷酸与杂交寡核苷酸(HO，Hybr idization oligonucleotide)相应，双延伸链与第二延伸链相应，延伸链-捕获寡核苷酸与第二捕获和模板寡核苷酸相应。信号寡核苷酸、杂交寡核苷酸、捕获和模板寡核苷酸、延伸链或它们的组合可作用为检测寡核苷酸。
通过以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物的信号包括通过以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物一致其他二聚物的形成来提供的信号(例如，检测和标记寡核苷酸切割和延伸依赖性非杂交)。
例如，在通过以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物的信号通过检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法生成的情况下，信号产生组合物包括包含与上游寡核苷酸及靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的检测和标记寡核苷酸、捕获和模板寡核苷酸、适合的标记物及具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。检测和标记寡核苷酸包含(i)包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列的3’-靶向部位；以及(ii)包含与上述靶核酸序列非互补的核苷酸序列的5’-标记部位。捕获和模板寡核苷酸沿着3’→5’方向包括(i)包含与上述检测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列的捕获部位以及(ii)包含与上述检测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非互补的核苷酸序列的模板部位。
通过检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法的信号产生的具体例包括下述步骤：步骤(a)，使靶核酸序列与上游寡核苷酸及检测和标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于切割检测和标记寡核苷酸的条件下，使步骤(a)的产物与具有5’核酸酶活性的酶接触的步骤；上述上游寡核苷酸或其延伸链通过具有5’核酸酶活性的酶诱导检测和标记寡核苷酸的切割，上述切割释放包含检测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述检测和标记寡核苷酸释放的片段与捕获和模板寡核苷酸杂交，从上述检测和标记寡核苷酸释放的片段与捕获和模板寡核苷酸的捕获部位杂交；步骤(d)，通过使用步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶来实施延伸反应，与捕获和模板寡核苷酸的捕获部位杂交的片段被延伸并形成延伸的二聚物，上述延伸二聚物具有可通过(i)片段的序列和/或长度、(ii)捕获和模板寡核苷酸的序列和/或长度或(iii)片段的序列和/或长度及捕获和模板寡核苷酸的序列和/或长度调节的Tm值，上述延伸二聚物通过(i)与上述片段和/或上述捕获和模板寡核苷酸相连接的至少一个标记物、(ii)在延伸反应过程中混入延伸二聚物的标记物、(iii)在延伸反应过程中混入延伸二聚物的标记物及及与上述片段和/或上述捕获和模板寡核苷酸相连接的标记物或(iv)嵌入标记物提供靶信号；以及步骤(e)，在延伸二聚物维持双链形态的事先确定的温度下测定靶信号来检测延伸二聚物，延伸二聚物的存在表示靶核酸序列的存在。在此情况下，上述方法还包括在反复周期之间包括改性来反复执行步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分的步骤。
在句子“反复周期之间的改性”中，术语“改性”意味着将双链核酸分子分离为单链核酸分子。
在检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法的步骤(a)中，可代替上游寡核苷酸来使用用于扩增靶核酸序列的引物组。在此情况下，上述方法还可包括在反复周期之间包括改性来反复执行步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分的步骤。
检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法可分类为如下的过程：与捕获和模板寡核苷酸杂交的检测和标记寡核苷酸片段延伸并形成延伸链，之后，检测上述延伸链的过程。检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法的特征在于，通过使用延伸链和捕获和模板寡核苷酸之间的二聚物来形成检测延伸链的形成。
还具有另一种检测延伸链的形成的方法。例如，可通过与延伸链特异性杂交的寡核苷酸来检测延伸链的形成(例如，检测和标记寡核苷酸切割和延伸依赖性信号寡核苷酸杂交方法)。在此方法中，信号可从(i)连接于与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标记物、(ii)连接于与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标记物及连接于检测和标记寡核苷酸片段的标记物、(iii)连接于与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标记物及在延伸反应过程中混入于延伸链的标记物或(iv)连接于与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标记物及嵌入染料提供。择一性地，信号可从(i)连接于延伸链的标记物或(ii)嵌入染料提供。
择一性地，延伸链形成的检测通过用于检测捕获和模板寡核苷酸和能够与上述捕获和模板寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸之间的杂交的抑制的其他方法实施(例如，检测和标记寡核苷酸切割和延伸依赖性非杂交方法)。这种抑制视作表示靶核酸序列的存在。信号可从(i)连接于可与捕获和模板寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸的标记物、(ii)连接于捕获和模板寡核苷酸的标记物、(iii)连接于可与捕获和模板寡核苷酸杂交的寡核苷酸的标记物及连接于捕获和模板寡核苷酸的标记物或(iv)嵌入标记物提供。
在一实例中，与捕获和模板寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸具有与检测和标记寡核苷酸片段的重叠序列。
在一实例中，检测寡核苷酸包含可与延伸链特异性杂交的寡核苷酸(例如，检测和标记寡核苷酸切割和延伸依赖性信号寡核苷酸杂交方法)以及可与捕获和模板寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸(例如，检测和标记寡核苷酸切割和延伸依赖性非杂交方法)。在一实例中，检测寡核苷酸包含在反应过程中生产的延伸链或捕获和模板寡核苷酸。
以检测和标记寡核苷酸裂解和延伸为基础的方法通常伴随依赖于靶核酸序列的存在的延伸链的形成。上述术语“以检测和标记寡核苷酸裂解和延伸为基础的方法”为了涵盖包括通过检测和标记寡核苷酸的切割及延伸的延伸链的形成的用于提供信号的多种方法而用于本申请。
通过以检测和标记寡核苷酸裂解和延伸为基础的方法的信号产生的例包括：步骤(a)，使靶核酸序列与上游寡核苷酸及检测和标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于切割上述检测和标记寡核苷酸的条件下，在具有5’核酸酶活性的酶接触上述步骤(a)的产物，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导通过具有上述5’核酸酶活性的酶的上述检测和标记寡核苷酸的切割，上述切割释放包含上述检测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，将从上述检测和标记寡核苷酸释放的上述片段与捕获和模板寡核苷酸杂交，从上述检测和标记寡核苷酸释放的上述片段与上述捕获和模板寡核苷酸的捕获部位杂交；步骤(d)，利用步骤(c)的产物及模板-依赖性核酸聚合酶实施延伸反应，与上述捕获和模板寡核苷酸的上述捕获部位杂交的上述片段通过延伸来形成延伸链；以及步骤(e)，检测以依赖于上述延伸链的存在的方式产生的信号来检测上述延伸链的形成的步骤。在上述步骤(a)中，可代替上述上游寡核苷酸来使用用于扩增靶核酸序列的引物组。在此情况下，上述方法还包括在反复周期之间包括改性来反复执行上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分的步骤。
在一实例中，通过二聚物形成产生的信号包括通过上述二聚物的杂交(例如，二聚物自身的杂交或延伸链-杂交寡核苷酸的杂交)诱导的信号或通过抑制二聚物形成引起的捕获寡核苷酸-杂交寡核苷酸的杂交而诱导的信号。
在一实例中，检测寡核苷酸可由至少一个寡核苷酸构成。在一实例中，在检测寡核苷酸由多个寡核苷酸构成的情况下，检测寡核苷酸能够以多种方式具有标记物。例如，多个寡核苷酸中的一个寡核苷酸可具有至少一个标记物，或者所有寡核苷酸可具有至少一个标记物，或者寡核苷酸的一部分可具有至少一个标记物且另一部分不具有标记物。
通过片段与对应寡核苷酸的杂交形成的二聚物可通过包括美国公开第2018/0073056号的多种方法生成。
在一实例中，二聚物包含标记物的寡核苷酸，上述标记的寡核苷酸包含具有相同信号特性的标记。在本申请中使用的术语“具有相同信号特性的标记物”意味着标记物相同或具有实质上相同的信号特性(例如，光学特性、释放波长及电信号)。例如，FAM及CALFluor 610提供不同的信号特性(例如，不同的释放波长范围)，FAM/Alexa Fluor 488、HEX/Alexa fluor 532及Texas Red/Alexa594分别具有实质上相同的释放波长，可因此，可视作具有相同的信号特性。
从包含具有相同信号特性的标记物的多个二聚物的多个信号可通过相同的检测仪或相同的检测通道检测。但是，根据现有技术，无法区分哪些二聚物提供信号。
在本申请中使用的术语“检测仪或检测通道具有相同的信号特性”意味着检测仪相同或可检测实质上相同的信号特性。
多个二聚物具有互不相同的Tm值。在本申请中使用的术语“Tm”意味着双链核酸分子的群体(population)的一半被解离为单链分子的解链温度。通过杂交的核苷酸的长度及G/C含量确定Tm值。可通过如Wallace rule(R.B.Wallace等，Nucleic Acids Research,6：3543-3547(1979))及nearest-neighbor方法(SantaLucia J.Jr.等，Biochemistry,35：3555-3562(1996)；Sugimoto N.等，Nucleic Acids Res.,24：4501-4505(1996))的现有方法计算Tm值。
可通过使用标准靶核酸序列及相应的信号产生组合物来实验性获取所形成的二聚物的Tm值。可在样品分析过程中测定在样品中形成的二聚物的实际Tm值。
可用于本发明的标记物包括在本技术领域中周知的多种标记物。例如，可用于本发明的标记物包括单标记物、相互作用的双标记物、嵌入染料及嵌入标记物(incorporating label)。例如，可用于本发明的标记物包括荧光标记物、发光标记物、化学发光标记物、电化学标记物及金属标记物。
上述单标记物包括如荧光标记物。在一实例中，上述单标记物根据其在双链或单链上的存在提供不同信号(例如，不同的信号强度)。在一实例中，上述单标记物为荧光标记物。在本发明中使用的单荧光标记物的优选类型及结合部位公开在美国专利第7537886号及第7348141号中，其教示事项通过引用结合在本说明书中。例如，上述单荧光标记物包括JOE、FAM、TAMRA、ROX及以荧光素为基础的标记物。上述单标记物可通过多种方法与寡核苷酸相连接。例如，上述标记物通过包含碳原子的间隔物(例如，3-碳间隔物、6-碳间隔物或12-碳间隔物)与探针相连接。
作为上述相互作用的标记系统的代表性例，荧光共振能量转移(FRET，fluorescence resonance energy transfer)标记系统包含荧光报道分子(供体分子)及猝灭分子(受体分子)。在荧光共振能量转移中，能量供体为荧光性，但是，能量受体可以为荧光性或非-荧光性。在相互作用的标记系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，如发色团(chromophore)，能量受体为荧光性。在相互作用的标记系统的另一形态中，能量供体为发光性(luminescent)，如生物发光性、化学发光性或电化学发光性，受体为荧光性。相互作用的标记系统包含以“接触-介导猝灭(on contact-mediated quenching)”为基础的双标记物(Salvatore等，Nucleic Acids Research,2002(30)no.21e122 and Johansson等，J.AM.CHEM.SOC 2002(124)pp 6950-6956)。上述相互作用的标记系统还包括通过至少两个分子(例如，染料)之间的相互作用诱导信号变化的任何标记系统。
可用于本发明的报道分子及猝灭分子可包含盖领域周知的任何分子。其例如下：Cy2TM(506)、YO-PROTM-1(509)、YOYOTM-1(509)、钙黄绿素(Calcein)(517)、FITC(518)、FluorXTM(519)、AlexaTM(520)、罗丹明110(Rhodamine110)(520)、俄勒冈绿500(OregonGreenTM 500)(522)、俄勒冈绿488(Oregon GreenTM 488)(524)、RiboGreenTM(525)、罗丹明绿(Rhodamine GreenTM)(527)、罗丹明123(Rhodamine 123)(529)、镁绿(MagnesiumGreenTM)(531)、钙绿(Calcium GreenTM)(533)、TO-PROTM-1(533)、TOTO1(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPY TMR(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3TM(570)、AlexaTM 546(570)、TRITC(572)、镁橙(Magnesium OrangeTM)(575)、藻红蛋白(Phycoerythrin)R&B(575)、罗丹明鬼笔环肽(Rhodamine Phalloidin)(575)、钙橙(Calcium OrangeTM)(576)、派洛宁Y(Pyronin Y)(580)、罗丹明B(Rhodamine B)(580)、TAMRA(582)、罗丹明红(Rhodamine RedTM)(590)、Cy3.5TM(596)、ROX(608)、钙红(CalciumCrimsonTM)(615)、AlexaTM 594(615)、德克萨斯红(Texas Red)(615)、尼罗红(Nile Red)(628)、YO-PROTM-3(631)、YOYOTM-3(631)、R-藻蓝蛋白(R-phycocyanin)(642)、、C-藻蓝蛋白(C-Phycocyanin)(648)、TO-PROTM-3(660)、TOTO3(660)、DiD DilC(5)(665)、Cy5TM(670)、噻二碳菁(Thiadicarbocyanine)(671)、Cy5.5(694)、HEX(556)、TET(536)、Biosearch Blue(447)、氟化钙金540(CAL Fluor Gold540)(544)、氟化钙橙560(CAL Fluor Orange 560)(559)、氟化钙红590(CAL Fluor Red 590)(591)、氟化钙红610(CAL Fluor Red 610)(610)、氟化钙红635(CAL Fluor Red 635)(637)、FAM(520)、萤光素(Fluorescein)(520)、萤光素-C3(Fluorescein-C3)(520)、Pulsar 650(566)、Quasar 570(667)、Quasar 670(705)以及Quasar 705(610)。括号的数字为以纳米单位表示的最大释放波长。优选地，报道分子及猝灭分子包含JOE、FAM、TAMRA、ROX以及以荧光素为基础的标记物。
在以下的多种文献公开了适当的荧光分子及适当的报道分子-猝灭对：Pesce等，editors,Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker,New York,1971)；White等，Fluorescence Analysis：A Practical Approach(Marcel Dekker,New York,1970)；Berlman,Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules,2nd Edition(Academic Press,New York,1971)；Griffiths,Color AND Constitution of OrganicMolecules(Academic Press,New York,1976)；Bishop,editor,Indicators(PergamonPress,Oxford,1972)；Haugland,Handbook of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(Molecular Probes,Eugene,1992)；Pringsheim,Fluorescence andPhosphorescence(Interscience Publishers,New York,1949)；Haugland,R.P.,Handbookof Fluorescent Probes and Research Chemicals,6th Edition(Molecular Probes,Eugene,Oreg.,1996)；美国专利第3996345号及第4351760号。
在本发明中值得注意的是，可利用能够猝灭宽范围波长或特定波长的荧光的非-荧光猝灭分子(例如，黑猝灭或暗猝灭)。
在包含报道分子及猝灭分子的信号传递系统中，上述报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭包含荧光共振能量转移的剩余伙伴(受体)。例如，将荧光素染料(fluorescein dye)用作报道分子，将罗丹明染料(rhodamine dye)用作猝灭。
上述相互作用的双标记物可与二聚物中的一个链相连接。在包含上述相互作用的双标记物的链以单链状态存在的情况下，上述链形成发夹或无规则卷曲结构，由此，诱导相互作用的双标记物之间的猝灭。在上述链形成二聚物的情况下，上述猝灭减少。择一性地，在上述相互作用的双标记物与邻近位于链上的核苷酸相连接的情况下，引起相互作用的双标记物之间的猝灭。在上述链形成二聚物并被切割的情况下，上述猝灭减少。
各个相互作用的双标记物可分别与二聚物的两个链相连接。上述二聚物的形成诱导猝灭，上述二聚物的改性诱导非猝灭。择一性地，在两个链中的一个被切割的情况下，可诱导非猝灭。
插入标记物可用于在延伸引物的过程中插入标记物来产生信号的过程(例如，Plexor方法，Sherrill C B,等，Journal of the American Chemical Society,126：4550-45569(2004))。并且，上述插入标记物还可用于通过以依赖于与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚物产生信号的过程。
通常，上述插入标记物可与核苷酸结合。并且，还可利用具有非-天然碱基的核苷酸。
在本说明书中使用的术语“非-天然碱基(non-natural base)”意味着如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)的天然碱基碱基的衍生物，它们可形成氢键碱基对。在本说明书中使用的术语“非-天然碱基”为母体化合物(mothercompound)，包含具有与天然碱基不同的碱基对模式的碱基，例如，记载于在美国专利第5432272号、第5965364号、第6001983号及第6037120号中。如天然碱基，多个非-天然碱基之间的碱基对包含两个或三个氢键。并且，多个非-天然碱基之间的碱基对还以特异性方式形成。非-天然碱基的特定例在碱基对组合中包含如下的多个碱基：iso-C/iso-G、iso-dC/iso-dG、K/X、H/J及M/N(参照美国专利第7422850号)。
在通过检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法产生信号的情况下，在上述延伸反应过程中插入的核苷酸可具有第一非-天然碱基，上述捕获和模板寡核苷酸可具有核苷酸，上述核苷酸具有对于第一非-天然碱基具有特异性结合亲和性的第二非-天然碱基。
在本说明书中使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”意味着所要检测或定量的核酸序列。上述靶核酸序列不仅包含双链，还包含单链。上述靶核酸序列不仅包含在反应过程中新生成的序列，还包含最初存在于核酸样品中的序列。
上述靶核酸序列包含所有脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))、核糖核酸(RNA)分子及它们的杂交物(嵌合体核酸)。上述序列可以为双-链或单-链形态。优选地，在作为起始物质的核酸为双-链的情况下，将上述两个链制备为单-链或部分单-链形态。用于分离链的周知的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶法(例，解旋酶作用)及结合蛋白，但并不限定于此。例如，链分离可在80℃～105℃范围的温度下进行加热来实现。在文献[Joseph Sambrook,等，Molecular Cloning,ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)]中提供用于实现这些处理的常规方法。
在将信使核糖核酸(mRNA)用作起始物质的情况下，在实施退火步骤之前必须实施逆转录步骤，在文献[Joseph Sambrook,等，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；及Noonan,K.F.等，Nucleic Acids Res.16：10366(1988)]公开详细内容。为了实施逆转录反应，可利用与信使核糖核酸的多聚腺苷酸尾(poly A tail)杂交的寡核苷酸dT引物、随机引物或靶-特异性引物。
靶核酸序列包含所有天然(naturally occurring)原核细胞核酸、真核细胞(例如，原生动物和寄生动物、菌类、酵母、高凳植物、低等动物及包括哺乳动物和人类的高凳动物)核酸、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、流感病毒、EB病毒、肝炎病毒、脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。并且，上述核酸分子可以为通过重组生产或所要生产的任何核酸分子或者化学合成或所要合成的任何核酸分子。因此，上述核酸序列可以为在自然界中发现或未发现的。上述靶核酸序列可包含周知或未知的序列。
在本说明书中，术语“样品”指包含或推定为包含关注核酸的任意物质或其本身为核酸的任意位置。更具体地，在本申请中使用的术语“样品”包括生物学样品(例如，来自生物学供给源的细胞、组织或流体)及非生物学样品(例如，食品、水及土壤)。生物学样品包括病毒、细菌、组织、细胞、血液、血清、血浆、淋巴、牛奶、尿液、粪便、眼液、唾液、精液、脑提取物、脊髓液(SCF)、阑尾、脾脏及扁桃体提取物、羊水及腹水，但并不限定于此。为了有效的扩增反应，样品可经过如溶解及加热的预处理，或者可经过该领域公知的核酸提取过程(参照Sambrook,J.et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,3rd ed.Cold SpringHarbor(2001))。核酸提取过程可根据样品类型不同。并且，在所提取的核酸的核糖核酸的情况下，还执行逆转录，来利用其来合成互补脱氧核糖核酸(参照上文)。
信号产生组合物可包含用于切割寡核苷酸和/或聚合核酸的酶，如5’-核酸酶、3’-核酸酶、FEN核酸酶、限制酶、具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶及具有3’-核酸酶活性的核酸聚合酶。
用于不同靶的信号产生组合物可包含如核酸聚合酶的共同成分。
所用通过包含相同信号特性的标记物的延伸二聚物检测的靶核酸序列的数量在单一反应容器中包含超出1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个及10个的靶核酸序列。
内部对照组可被计数为通过本方法检测的多个靶核酸序列。
除非另行表示，则在本申请中使用的术语“在单一反应容器中检测样品中的多个靶核酸序列”中的“多个靶核酸序列”可指通过具有相同信号特性的标记物检测的多个靶核酸序列。在相同的反应容器中可存在其他靶核酸序列，这可被具有不同信号特性的不同标记物检测。
在单一反应容器中，多个靶核酸序列可通过使用具有不同信号特性的至少2种标记物来检测。具有不同标记特性的各个标记物可分别用于检测一个以上的靶核酸序列。在一实例中，包含相同信号特性的标记物的二聚物可具有互不相同的Tm值。来自具有不同信号特性的标记物的信号被不同的检测仪，如不同的检测通道检测。
例如，与一部分靶核酸序列有关的一部分二聚物标记为FAM，与其他靶核酸序列有关的其他二聚物标记为Cal red 610。为了检测两个不同的释放光，使用2种检测仪(即，两个检测通道)。在单一反应容器中可使用至少2种、3种、4种、5种、6种或7种标记物。
所要检测的靶核酸序列的数量在单一反应容器中包含超出1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、18个、20个、25个及30个的靶核酸序列。
步骤120：至少两周期内的反应
为了(i)多个二聚物的形成及(ii)所形成的多个二聚物的杂交或解离而实施至少两周期的反应。为了提供以依赖于靶核酸序列的存在或不存在的方式相应的二聚物，信号产生组合物可参与反应。
在一实例中，反应在允许多个二聚物的形成及从上述多个二聚物产生信号的条件下执行。这种条件包括温度、盐浓度及溶液的pH值。
在本发明的一实例中，在反应过程中，与靶核酸序列有关的二聚物的数增加，来自二聚物的类型的信号强度被扩增。
二聚物中的标记物位置可提供相对于不同温度的信号模式。例如，在二聚物的一个链与相互作用的双标记物(荧光报道分子及猝灭分子)相连接的情况下，随着温度的增加，来自上述组中的二聚物的信号强度减少。择一性地，在荧光报道分子及猝灭分子中的一个与一个链相连接且另一标记物与二聚物的另一链相连接的情况下，随着温度的增加，来自上述组中的二聚物的信号强度增加。
本方法的反应可指“信号产生过程”。在本申请中使用的术语“信号产生过程”指能够以依赖于样品中的靶核酸序列的存在或不存在的方式产生信号的任意过程。
信号产生过程伴随着信号变化。在本申请中使用的术语“信号”意味着能够测定的输出。
通过测定信号来评价信号产生反应。信号值或信号变化起到定性或定量地指示靶分析物的特性，具体地，定性或定量地指示靶分析物的存在或不存在的指标作用。上述信号变化不仅包括信号增加，还可包括信号减少。
上述指标的例包括荧光强度、发光强度、化学发光强度、生物发光强度、磷光强度、电荷转移、电压、电流、电力、能量、温度、粘度、光散射、辐射能强度、反射率、透光率及吸光度，但并不限定于此。使用最频繁的指标为荧光强度(fluorescence intensity)。
在本申请中使用的术语“信号产生”包括信号的产生或小时以及信号的增加或减少。尤其，术语“信号产生”意味着信号的增加。
在一实例中，信号产生过程为信号的扩增过程。
在本申请中使用的术语“扩增反应”意味着增加或减少信号的反应。
在一实例中，扩增反应意味着使用信号产生组合物来增加以依赖于靶核酸序列的存在的方式产生的信号(或扩增)。在一实例中，扩增反应意味着与相应的靶核酸序列有关的二聚物的数的增加引起的信号的增加(或扩增)。扩增反应可伴随或不伴随靶核酸序列的扩增。更具体地，本发明的扩增反应意味着与靶核酸序列的扩增一同实施的信号的扩增反应。
通过扩增反应获取的数据集包括扩增周期或周期数。
在本申请中使用的术语“周期”伴随条件的变化的多个测定过程中的条件的变化单位。例如，条件的变化意味着温度、反应时间、反应次数、浓度、pH值和/或测定对象(例如，靶核酸分子)的复制次数的增加或减少)。因此，周期可指时间(time)或过程(process)周期、单位操作(unit operation)周期及再生产(reproductive)周期。
如另一例，在实施核酸的等温扩增(isothermal amplification)的情况下，在等温条件下，在等温条件下，以规定间隔的时间数次测定一个样品的信号。在此反应中，反应时间相当于条件变化，反应时间单位相当于一个周期。
具体地，在反复一系列反应或以规定时间间隔反复执行反应的情况下，术语“周期”意味着反复的一个单位。
例如，在聚合酶链式反应(PCR)中，一个周期指包括靶核酸分子的改性(denaturation)、靶核酸分子和引物之间的退火及引物延伸的反应单位。反应反复的增加可相当于条件的变化，反复的单位可相当于周期。
从信号产生过程获取的数据集包含多个数据点，上述多个数据点包含周期数及信号值。
在一实例中，用于扩增表示靶核酸分子的存在的信号的扩增反应以扩增靶核酸分子的同时扩增信号的方式实施(例如，实时聚合酶链式反应方法)。择一性地，扩增反应以不扩增靶核酸分子且扩增信号的方式实施。
在本发明中，可在扩增靶的同时扩增产生信号的二聚物的数。择一性地，可在不扩增靶的同时扩增产生信号的二聚物的数。
在一实例中，信号产生组合物包含用于扩增多个靶核酸序列的至少一个引物对，二聚物反应伴随多个靶核酸序列的扩增。
靶核酸序列可通过多种方法扩增。例如，已周知如下的用于扩增靶分析物的诸多方法：包括聚合酶链式反应(PCR，polymerase chain反应)、连接酶链反应(LCR，ligasechain反应，美国专利第4683195号及第4683202号；参照PCR Protocols：A Guide toMethods and Applications(Innis et al.,eds,1990))、链替代扩增反应(SDA，stranddisplacement amplification)(Walker,et al.Nucleic Acids Res.20(7)：1691-6(1992)；Walker PCR Methods Appl 3(1)：1-6(1993))、转录介导扩增(transcription-mediated amplification)(Phyffer,et al.,J.Clin.Microbiol.34：834-841(1996)；Vuorinen,et al.,J.Clin.Microbiol.33：1856-1859(1995))、核酸序列的扩增(NASBA，nucleic acid sequence-based amplification)(Compton,Nature 350(6313)：91-2(1991))、滚环扩增(rolling circle amplification,RCA)(Lisby,Mol.Biotechnol.12(1)：75-99(1999)；Hatch et al.,Genet.Anal.15(2)：35-40(1999))及Qβ复制酶(Q-BeTaReplicase)(Lizardi eT al.，BiolTechnology6：1197(1988))，但并不限定于此。
在一实例中，扩增反应可在扩增靶分析物，具体地，扩增靶核酸分子的同时扩增信号。在一实例中，扩增反应可根据聚合酶链式反应或实时聚合酶链式反应实施。
在本发明的一实例中，具有核酸酶活性(例如，5’核酸酶活性或3’核酸酶活性)的核酸聚合酶可用于扩增靶核酸序列。在一实例中，没有核酸酶活性的核酸聚合酶可用于扩增靶核酸序列。
可用于本发明的核酸聚合酶为包括水生栖热菌(Thermus aquaticus，Taq)、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus，Tth)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermis flavus)、海滨嗜热球菌(Thermococcus literalis)、Thermus antranikianii、Thermus caldophilus、Thermus chliarophilus、黄栖热菌(Thermus flavus)、Thermusigniterrae、乳栖热菌(Thermus lacteus)、Thermus oshimai、红栖热菌(Thermus ruber)、红色栖热菌(Thermus rubens)、水管致黑栖热菌(Thermus scotoductus)、Thermussilvanus、Thermus species Z05、Thermus species sps 17、嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)、Thermococcus barossi、Thermococcus gorgonarius、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、沃氏热球菌(Pyrococcus woesei)、超嗜热古菌(Pyrococcushorikoshii)、深海热球菌(Pyrococcus abyssi)、隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)、嗜火产水菌(Aquifex pyrophilus)以及嗜热高温菌(Aquifex aeolieus)的从多种细菌获取的热稳定性脱氧核糖核酸聚合酶。尤其，上述热稳定性脱氧核糖核酸聚合酶为水生栖热菌聚合酶。
在一实例中，靶核酸序列的扩增通过非对称聚合酶链式反应(asymmetric PCR)实现。可考虑下游寡核苷酸的切割或杂交来选择引物的比率。
在一实例中，反应实施至少两周期、至少5周期、至少10周期、至少20周期、至少30周期、至少40周期、至少45周期或至少50周期。在一实例中，反应实施最多100周期、最多90周期、最多80周期、最多70周期或最多60周期。
步骤130：获取多个信号值
在反应的所有或一部分周期中，在分配给多个靶核酸序列的多个检测温度范围各自中的至少两个检测温度下获取多个信号值。多个检测温度范围分别包括与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围。
在反应过程中，可在多个检测温度下测定信号。
为了检测一个靶核酸序列，使用至少两个检测温度。
对于各个靶核酸序列，可从各个检测温度范围事先确定所要获取信号值的至少两个检测温度。
如一例，对于各个靶核酸序列确定至少两个检测温度，之后，组合起来最终确定用于整体反应的所有检测温度。如另一例，确定对于整体反应的所有检测温度，之后，可分配给与各个靶核酸序列有关的至少两个检测温度。
与各个靶核酸序列有关的检测温度范围可以为选择与相应的靶核酸序列有关的至少两个检测温度的温度范围。择一性地，检测温度范围可以为通过分配给各个靶核酸序列的至少两个检测温度形成或位于分配给各个靶核酸序列的至少两个检测温度的温度范围。
在一实例中，分配给各个靶核酸序列的检测温度范围需满足条件。
在本发明的一实例中，与各个靶核酸序列有关的至少两个检测温度至少满足与检测温度有关的条件，还需满足与检测温度范围有关的条件。
对于来源于各个靶核酸序列的二聚物，可考虑根据温度的信号值的变化来选择与各个靶核酸序列有关的至少两个检测温度(或者，与各个靶核酸序列有关的检测温度范围)。
能够以如下的方式分类影响二聚物的杂交/解离的温度：(i)以二聚物杂交的状态存在的温度范围；(ii)二聚物从杂交的状态变化为解离状态的温度范围(即，产生二聚物的解离或产生二聚物的杂交的温度范围)；以及(iii)二聚物以解离的状态存在的温度范围。
上述温度范围中的二聚物状态表示其的概率优势，并不绝对限定于该状态。
在存在多个二聚物的情况下，在低于二聚物从杂交的状态变为解离的状态的温度范围(即，产生解离的温度范围)的任意温度温度下，大部分的二聚物以杂交的状态存在，不会实质性改变二聚物的量，在大于二聚物从杂交的状态变为解离的状态的温度范围(即，产生解离的温度范围)的任意温度下，大部分的二聚物以解离的状态存在，不实质性改变二聚物的量。另一方面，在二聚物从杂交的状态变为解离的状态的温度范围(即，产生解离的温度范围)的情况下，在更高的温度下产生多的解离，由此，根据温度改变二聚物的量。
如在本申请中使用，术语“不是指性改变二聚物的量的温度范围”指温度范围中的单位温度的二聚物的量的变化为10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％以下的温度范围。
如在本申请中使用，术语“二聚物的量”指构成二聚物的相互杂交的两个链的量或数量。
在二聚物根据二聚物的形成提供信号值的情况下，二聚物可提供根据温度示出信号值的变化的解链曲线。
图2示出具有不同Tm值的三个二聚物的解链曲线。
在图2中，上述多个二聚物示出信号随着温度的增加减少的模式。在图2中，各个二聚物具有标记物，来在两个链杂交的情况下提供信号，在两个链解离的情况下不提供信号。例如，各个二聚物具有与其的一个链相连接的相互作用的双标记物。各个二聚物具有标记物，来在两个链杂交的情况下不提供信号，在两个链解离的情况下提供信号，在此情况下，信号随着温度的增加而增加。
在本发明的一实例中，检测温度范围(参照图2；第一检测温度范围、第二检测温度范围或第三检测温度范围)包括与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围。
在一实例中，与各自相应的靶核酸序列有关的至少一个检测温度属于与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围。.
产生二聚物的解离的温度范围的全部或一部分可以为与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围。
在一实例中，检测温度范围还可包括与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量不变的温度范围。例如，检测温度范围为与相应的靶核酸序列有关的二聚物的大部分处于杂交状态或解离状态的温度范围。在一实例中，与相应的靶核酸序列有关的至少一个检测温度属于大部分的二聚物处于杂交状态或解离状态的温度范围。
在一实例中，检测温度范围为与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量改变且与其他靶核酸序列有关的二聚物的量不变的温度范围。
图2例示与三个靶核酸序列有关的三个检测温度范围。各个检测温度范围分别与各个靶核酸序列相对应。例如，第一检测温度范围为用于检测第一靶核酸序列的温度范围，第二检测温度范围为用于检测第二靶核酸序列的温度范围，第三检测温度范围为用于检测第三靶核酸序列的温度范围。
在图2中，第一检测温度范围为与第一靶核酸序列有关的二聚物的量变化的范围，第二检测温度范围为与第二靶核酸序列有关的二聚物的量变化的范围，第三检测温度范围为与第三靶核酸序列有关的二聚物的量变化的范围。尤其，检测温度范围分别为与其他靶核酸序列有关的二聚物的量不变的温度范围。
如在本申请中使用，表达“与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化且与其他靶核酸序列有关的二聚物的量不变的温度范围”指不仅包括与其他靶核酸序列有关的二聚物的量完全不变的温度范围，还包括与其他靶核酸序列有关的二聚物的量几乎不变的温度范围。在一实例中，分别从通过与其他靶核酸序列有关的二聚物产生的信号的变化量比通过与相应的靶核酸序列有关的二聚物产生的信号的变化量比率为10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、2％或1％以下的温度范围选择多个检测温度范围。
例如，在样品中存在第一靶核酸序列、第二靶核酸序列及第三靶核酸序列的情况下，第一检测温度范围为与第一靶核酸序列有关的信号变化且与第二靶核酸序列及第三靶核酸序列有关的信号实际上不变的温度范围。第二检测温度范围为与第二靶核酸序列有关的信号变化且与第一靶核酸序列及第三靶核酸序列有关的信号实际上不变的温度范围。第三检测温度范围为与第三靶核酸序列有关的信号变化且与第一靶核酸序列及第二靶核酸序列有关的信号实际上不变的温度范围。
根据一实例，与靶核酸序列有关的检测温度范围可包括与其他靶核酸序列有关的多个二聚物的量变化的温度范围的受限部分。例如，在重叠的温度范围中通过与其他靶核酸序列有关的二聚物产生的信号的变化量可以为所产生的信号的总变化量的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％以下。例如，与靶核酸序列有关的温度范围能够以10℃、5℃、4℃、3℃、2.5℃、2℃、1.5℃或1℃和与其他靶核酸序列有关的温度范围重叠。
在一实例中，检测温度范围为包括与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围且不包括其他多个二聚物的量变化的温度范围或包括其他多个二聚物的量变化的温度范围的一部分的温度范围。
在一实例中，与靶核酸序列各自有关的检测温度范围可被确定为不和与靶核酸序列有关的检测温度范围重叠。
不同二聚物之间的Tm值的大差值可使多个检测温度范围不相互重叠。在不同二聚物之间的Tm值的差值小的情况下，可通过调节检测温度范围的数或间隔来使多个检测温度范围不相互重叠。
在一实例中，与相应的靶核酸序列有关的检测温度范围可和与其他靶核酸序列有关的检测温度范围重叠。尤其，所重叠的温度范围为10℃、5℃、4℃、3℃、2.5℃、2℃、1.5℃或1℃以下。
根据一实例，为了防止与多个靶核酸序列各自有关的二聚物的量不变的温度范围相互重叠，多个信号产生组合物以通过多个信号产生组合物提供的多个二聚物的Tm值充分的相互隔开的方式设计。在与多个靶核酸序列各自有关的多个二聚物的量变化的多个温度范围中的一部分相互重叠的情况下，多个检测温度范围使其重叠最小化。
在一实例中，各个检测温度范围包括与相应的靶核酸序列有关的二聚物的预测Tm值。
在一实例中，与靶核酸序列各自有关的检测温度范围为20℃、15℃、10℃、6℃、5℃、4℃或3℃以内。
在一实例中，可由最高检测温度和最低检测温度之间的范围表示检测温度范围。
在一实例中，与靶核酸序列各自有关的检测温度范围为Tm±10℃、Tm±8℃，Tm±5℃、Tm±3℃、Tm±2℃内、Tm±1.5℃或Tm±1℃以内，其中，Tm表示相应的二聚物的Tm值。
对于各个靶核酸序列，从至少两个检测温度获取多个信号值。
在一实例中，从分配给各个靶核酸序列的检测温度范围中的两个检测温度下获取多个信号值。
在择一性实例中，从分配给各个靶核酸序列的检测温度范围中的三个以上的检测温度下获取多个信号值。
在本发明的特定实例中，从分配给各个靶核酸序列的检测温度范围中的3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个检测温度下获取多个信号值。
在一实例中，从分配给各个靶核酸序列的检测温度范围中的2个以上、3个以上、5个以上、10个以上或15个以上的检测温度下获取多个信号值。
在一实例中，从分配给各个靶核酸序列的检测温度范围中的100个以下、70个以下、50个以下、40个以下、30个以下或20个以下的检测温度下获取多个信号值。
在一实例中，与各个靶核酸序列有关的两个以上的检测温度为相应的二聚物实质上提供不同信号值的多个检测温度。例如，在使用两个检测温度的情况下，两个检测温度相互隔开，来使相应的二聚物在上述两个检测温度下提供不同信号值。例如，两个检测温度以0.1℃、0.2℃、0.5℃或1℃以下隔开。择一性地，并不从二聚物处于杂交状态的温度范围选择两个检测温度，或者并不从二聚物处于解离状态的温度范围选择两个检测温度。
在一实例中，与各个靶核酸序列有关的至少两个检测温度为相应的二聚物实际上提供不同信号值的多个检测温度。
在一实例中，与各个靶核酸序列有关的至少两个检测温度包括从与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围选择的至少两个温度。
图3例示从相应的二聚物的量变化的温度范围选择两个检测温度。
在一实例中，从与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围选择与各个靶核酸序列有关的至少两个检测温度中的一部分，从与靶核酸序列有关的二聚物的量不变的温度范围选择剩余部分。
在一实例中，在与各个靶核酸序列有关的至少两个检测温度中，可从与二聚物处于杂交状态的温度范围选择一部分，可从二聚物处于解离状态的温度范围选择其他部分。
在一实例中，选择至少两个检测温度以使与各自相应的核酸序列有关的二聚物的预测Tm值包括于上述至少两个检测温度的最高检测温度和最低检测温度之间。
在一实例中，与各个靶核酸序列有关的多个检测温度的间隔为5℃、4℃、3℃、2.5℃、2℃、1.5℃、1℃、0.5℃或0.1℃以下。
在一实例中，至少两个检测温度包括相差为20℃以下、15℃以下、10℃以下、8℃以下、7℃以下、6℃以下、5℃以下、4℃以下或3℃以下的最高检测温度及最低检测温度。
在一实例中，与各个靶核酸序列有关的至少两个检测温度为Tm±10℃、Tm±8℃、Tm±5℃、Tm±2℃或Tm±1.5℃以内，其中，Tm表示相应的二聚物的Tm值。
在一实例中，与不同靶核酸序列有关的多个检测温度中的一部分可重叠。尤其，在根据本方法从多个检测温度中选择两个作为基准温度的情况下，可发生多个检测温度之间的重叠。
在一实例中，与两个不同靶核酸序列有关的重叠的多个检测温度的数量可以为1个、2个、3个、4个或5个。
在一实例中，与各个靶核酸序列有关的多个检测温度中的至少两个不和与其他靶核酸序列有关的多个检测温度重叠。
在一实例中，在所有或一部分周期中检测多个信号值。例如，在执行总共45周期的情况下，可在第一个周期至第四十五个周期的所有周期中检测多个信号值。
在一实例中，可从奇数个周期中获取多个信号值。例如，在执行总共45周期的情况下，可在第一个、第三个、第五个、第七个……第四十五个周期中检测多个信号值。
在一实例中，可从偶数个周期中获取多个信号值。例如，在执行总共45周期的情况下，可在第二个、第四个、第六个、第八个……第44个周期中检测多个信号值。当考虑第四十五个周期为反应的最后周期时，可在第四十五个周期中追加检测信号值。
在一实例中，可从使用人员指定的一个以上的周期中获取多个信号值。例如，可在执行反应的一个以上的周期之前确定所要检测多个信号值的一个以上的周期。例如，可指定第十个至第四十五个周期的周期，或者可指定第十个至第四十个周期的周期。所指定的周期可以为连续或不连续的，可以为规定间隔或不规定间隔。在一实例中，可不从初始周期获取多个信号值。例如，初始周期可以为第一个周期至第五个周期。经预测，在初始周期中，可检测低强度的信号，但是，信号变化值不显著，因此，可在初始周期中省略不必要的检测。这种在初始周期中省略多个信号值的检测可减少多个反应周期的总时间。
在一实例中，从至少两个检测温度下获取的多个信号值可被内插(interpolation)来生成另一温度下的预测信号值。通过内插获取的预测信号值可称为“内插信号值”，相应的检测温度可称为“内插温度”或“内插检测温度”。
在本发明的一实例中，内插温度为多个检测温度之间的任意温度。
在本发明的一实例中，通过将从周期获取的多个信号值内插来生成另一周期中的预测信号值。具有通过内插获取的预测信号值的周期可称为“内插周期”。
内插可通过线性内插法、双线性内插法、抛物线内插法、多项式内插法或仿样内插法实施，尤其，可通过线性内插法实施。
除非另行表示，则在本申请中使用的术语“检测温度”不仅包括通过内插生成的检测温度，还包括通过仪器测定信号的检测温度。
除非另行表示，则在本申请中使用的术语“信号值”不仅包括通过内插生成的多个信号值，还包括通过仪器测定获取的多个信号值。
在本发明的一实例中，在从至少两个检测温度内插多个温度及其的多个信号值的情况下，至少两个检测温度包括内插的多个检测温度。
如在本申请中使用，术语“信号值”指以规定比率定量化的在信号产生反应，尤其，扩增反应的周期中实际测定的信号值或其变形。上述变形可包括对实际测定的信号值进行数学加工的信号值。作为非限制性例，实际测定的信号值(即，原始数据集的信号值)的数学加工的信号值可包括所测定的信号值的对数值或所测定的信号值的倒数值(derivatives)。
步骤140：获取周期/信号变化值的数据集
获取从多个检测温度范围各自中的至少两个检测温度选择的两个基准温度之间的多个信号值的信号变化值，来获取与多个靶核酸序列各自有关的周期/信号变化值的数据集。
选择多个基准温度
从多个检测温度范围各自中的至少两个检测温度选择多个基准温度。
可事先确定所要从至少两个检测温度选择的多个基准温度。择一性地，多个基准温度可通过分析从多个检测温度获取的多个信号值来选择至少两个检测温度。
如在本申请中使用，术语“选择多个基准温度”不仅包括从至少两个检测温度选择事先确定的多个基准温度的情况，还包括在实施方法的过程中以规定基准为基础从至少两个检测温度选择多个基准温度的情况。
在一实例中，在与各个靶核酸序列有关的检测温度范围中存在两个检测温度的情况下，选择上述两个检测温度作为基准温度。
在一实例中，在与各个靶核酸序列有关的检测温度范围中存在三个以上的检测温度的情况下，选择上述三个以上的检测温度中的两个作为基准温度。
在一实例中，在与各个靶核酸序列有关的检测温度范围中存在三个以上的检测温度的情况下，选择最低检测温度及最高检测温度作为两个基准温度。
在一实例中，两个基准温度之间的任意温度中的多个信号值也可用于通过使用多个基准温度来生成信号变化值。
在一实例中，在与各个靶核酸序列有关的检测温度范围中存在三个检测温度且上述多个检测温度包括(多个)内插检测温度的情况下，从(i)上述多个检测温度、(ii)上述多个内插检测温度或者(iii)上述多个检测温度及多个内插检测温度选择多个基准温度。
在本发明的一实例中，与多个靶核酸序列有关的两个基准温度不相互重叠。即，与多个靶核酸序列有关的两个基准温度可相互不重叠。在本发明的一实例中，与靶核酸序列有关的两个基准温度不和与其他靶核酸序列有关的其他基准温度重叠。选择与各自的靶核酸序列有关的两个基准温度以使不相互重叠，这是因为，它们用于获取确定相应的靶核酸序列的存在或不存在的信号变化值。
在本发明的一实例中，与靶核酸序列有关的两个基准温度和与其他靶核酸序列有关的两个基准温度不同。
在一实例中，与靶核酸序列有关的两个基准温度属于与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围。
在一实例中，选择与靶核酸序列有关的两个基准温度以使其以规定间隔隔开。例如，两个基准温度以5℃、4℃、3℃、2℃或1℃隔开。
在一实例中，选择与靶核酸序列有关的两个基准温度以使其以在二聚物的Tm值周围隔开规定间隔。
在一实例中，选择与靶核酸序列有关的两个基准温度以使其以在与相应的靶核酸序列有关的二聚物的Tm值周围隔开规定间隔。在此情况下，可向周期/信号变化值的多个数据集适用相同的阈值来相互比较所获取的Ct值。
另一方面，在分析未知样品的情况下，根据样品中包含的成分或实验条件，样品中的与靶核酸序列有关的二聚物的实际反应Tm值可与预测Tm值不同。在此情况下，以预测Tm值为基准选择两个基准温度可导致方法的不准确性。在本发明中，对于各个靶核酸序列，可在多个检测温度下测定多个信号值，可从多个检测温度选择两个适合的基准温度。
可通过多种方法从与各个靶核酸序列有关的多个检测温度选择两个基准温度。
在一实例中，至少两个检测温度的数量为三个以上，方法还包括通过分析至少三个检测温度下的信号值来选择两个基准温度的步骤。
能够以多个检测温度下的多个信号值为基础选择多个基准温度。
在一实例中，至少两个检测温度为三个以上，多个信号变化值为了计算两个基准温度而使用至少三个检测温度下的多个信号值。
在一实例中，至少两个检测温度为三个以上，通过使用上述至少三个检测温度中的多个信号值来计算多个信号变化值，选择两个基准温度以使所计算的上述多个信号变化值中的最高信号变化值包括于上述两个基准温度之间。
在一实例中，将多个信号变化值分配给为了计算相应的信号变化值而使用的多个检测温度之间的温度。
在一实例中，将最高信号变化值分配给为了计算最高信号变化值而使用的多个检测温度之间的温度。
例如，通过使用紧邻的多个检测温度之间的多个信号值来计算多个信号变化值，选择两个基准温度以使所计算的上述多个信号变化值中的最高信号变化值包括于上述两个基准温度之间。
图4例示选择本发明一实例的两个基准温度。尤其，图4示出以从紧邻的多个检测温度之间的多个信号值计算的多个信号变化值为基础选择两个基准温度的过程。
图4示出选择T2及T4作为多个基准温度的例。
在一例中，至少一个周期中的多个信号值用于选择多个基准温度。1-80周期、1-50周期、1-30周期、5-80周期、5-50周期及5-30周期中的多个信号值用于选择多个基准温度。
在一例中，最终周期中的多个信号值用于选择多个基准温度。例如，在最终周期为第四十五个周期的情况下，在第四十五个周期中检测的多个信号值可用于选择多个基准温度。
在一例中，晚期(late)周期中的多个信号值用于选择多个基准温度。例如，在最终周期为第四十五个周期的情况下，在第41个至第四十五个周期(5个周期)中检测的多个信号值可用于选择多个基准温度。晚期周期由最终周期(end cycle)或邻近最终周期的多个周期构成。
图4例示以一周期中的多个信号值为基础选择多个基准温度。在以多个晚期周期(至少两周期)中的多个信号值为基础选择多个基准温度的情况下，能够以在晚期周期中计算的多个信号变化值的平均为基础选择多个基准温度。换言之，先在各个周期中计算多个信号变化值，之后，在相同温度下计算多个信号变化值的平均，由此，生成多个平均信号变化值。若生成多个平均信号变化值，则以多个平均信号变化值的大小为基础选择多个基准温度。
在另一例中，能够以从多个晚期周期中的多个平均信号值计算的多个平均信号变化值为基础选择多个基准温度。计算多个晚期周期中的相同温度下的多个信号值的平均来生成多个平均信号值，之后，计算上述多个平均信号值的变化值来生成平均信号变化值。
可从两个连续的检测温度中的多个信号值计算信号变化值。在一个周期中，若从5个检测温度中获取多个信号值，则从上述多个值计算4个信号变化值。可将与上述4个信号变化值相应的多个温度视作两个连续的检测温度之间的多个内插温度。可通过多个信号值的差值比多个检测温度的差值计算信号变化值。
若计算多个信号变化值，则能够以多个信号变化值的大小为基础选择多个基准温度。在一例中，多个基准温度可包括最高信号变化值。多个基准温度可包括最高信号变化值以及邻近上述最高信号变化值的两个信号变化值中的一个，计算最高信号变化值与两个邻近信号变化值中的任意两个信号变化值之间的差值，由此，包括邻近上述最高信号变化值的两个信号变化值中的一个作为基准温度。
在一实例中，将多个信号变化值分配给用于计算相应的多个信号变化值的多个检测温度之间的多个温度，将多个信号变化值中的最高信号变化值被分配为第一变化值，将邻近最高信号变化值的两个信号变化值中的高信号变化值及低信号变化值分别分配为第二信号变化值及第三信号变化值，在(i)第二信号变化值与第三信号变化值之间的差值与(ii)第一信号变化值与第三信号变化值之间的差值之比大于阈值的情况下，将最高信号变化值分配给与第一信号变化值有关的温度和与第二信号变化值有关的温度之间的中间温度，将与中间温度隔开的两个温度选择为两个检测温度。
在一实例中，将以相同间隔与中间温度隔开的两个温度沿双向选择为两个基准温度。
图4示出第二信号变化值与第三信号变化值的差值与第一信号变化值与第三信号变化值的差值之比大于0.4的阈值的例。上述阈值可设置为0.2、0.3、0.4、0.5或0.6以上的值。
如图4所示，上述比率超出阈值，因此，将最高信号变化值分配给与第一信号变化值有关的温度和与第二信号变化值有关的温度之间的中间温度，将以相同间隔与上述中间温度隔开的温度T2及T4沿双向选择为两个检测温度。
图5例示根据本发明的另一实例选择多个基准温度、
在一实例中，将多个信号变化值分配给用于计算相应的多个信号变化值的多个检测温度之间的多个温度，将多个信号变化值中的最高信号变化值分配为第一变化值，将邻近上述最高信号变化值的两个信号变化值中的高信号变化值及低信号变化值分别分配为第二信号变化值及第三信号变化值，在(i)第一信号变化值与第三信号变化值之间的差值与(iii)第二信号变化值与第三信号变化值之间的差值之比小于阈值的情况下，将最高信号变化值分配给与第一信号变化值有关的温度，将和与第一信号变化值有关的温度隔开的两个温度选择为两个检测温度。
在一实例中，将以相同间隔和与第一信号变化值有关的温度隔开的两个温度沿双向选择为两个基准温度。
图5示出第二信号变化值与第三信号变化值之间的差值与第一信号变化值与第三信号变化值之间的差值的比率为0.4的阈值以下的例。如图5所示，上述比率不超出阈值，因此，将最高信号变化值分配给与第一信号变化值有关的温度，选择以相同间隔和与上述第一信号变化值有关的温度隔开的两个温度。在此情况下，选择了T1和T2之间及T4和T5之间的多个内插温度。
例如，若T2、T3、T4及T5分别为70℃、72℃、74℃及76℃，则T2和T3之间的内插温度为71℃，T3和T4之间的内插温度为73℃，T4和T5之间的内插温度为75℃。因此，将71℃及75℃选择为多个基准温度。
能够以多种方式计算多个检测温度之间的信号变化值。
在一实例中，可通过扣除、比率或变化率计算两个邻近的检测温度之间的多个信号值的信号变化值。
在使用与相应的靶核酸序列有关的多个检测温度下的多个信号值来选择多个基准温度的另一方法中，包括：利用多个检测温度下的多个信号值来确定实际反应Tm值的步骤：以及选择与靶核酸序列有关的多个基准温度，来包括所测定的Tm值的步骤。
术语“实际反应Tm值为在相应的靶核酸序列的样品分析过程中形成的二聚物实际示出的Tm值。实际反应Tm值可根据反应环境(例如，温度、盐浓度、2价阳离子浓度、寡糖浓度、pH值等)不同。
术语“预测Tm值”为预测的在相应的靶核酸序列的样品分析过程中形成的二聚物所要示出的Tm值。可通过使用与靶核酸序列有关的标准的实验获取“预测Tm值”。择一性地，可使用本领域公知的Tm值分析程序来获取预测Tm值。
在一实例中，本发明还包括通过使用三个检测温度下的信号值来计算与相应的靶核酸序列有关的二聚物的实际反应Tm值的步骤。
在一实例中，选择两个基准温度以使与相应的靶核酸序列有关的二聚物的实际反应Tm值包括于上述两个基准温度之间。
在一实例中，可在用于获取与靶核酸序列有关的实际反应Tm值的至少周期中实施解链分析。可在最终周期或中间周期中执行解链分析。在一实例中，在规定温度范围中以0.5℃以下的温度间隔升高或降低温度获取温度/信号值的数据来实施解链分析。
在从实际反应结果选择适当的多个基准温度的情况下，预测为二聚物的量根据预测Tm值变化的温度范围可与二聚物的量实际变化的温度范围不同。如在本申请中使用，术语“多个基准温度属于二聚物的变化的温度范围”不仅包括多个基准温度属于二聚物的量根据预测Tm值变化的温度范围，还包括多个基准温度属于二聚物的量实际变化的温度范围。
在一实例中，可在每个反应容器选择与相应的靶核酸序列有关的多个基准温度。在一实例中，在不同的多个反应容器中检测相同的靶核酸序列的情况下(尤其，在多个反应容器中使用具有相同信号特性的一个标记物的情况下)，在每个反应容器选择与相应的靶核酸序列有关的多个基准温度，由此确定与相应的靶核酸序列有关的代表基准温度并适用于所有反应容器。在一实例中，在不同的多个反应容器中检测相同的靶核酸序列的情况下，从各个反应容器收集用于选择与相应的靶核酸序列有关的多个基准温度的信息，从上述信息确定代表基准温度并适用于所有反应容器。
从可提供表示靶核酸序列的存在的信号变化值的多个温度选择多个基准温度。
在一实例中，从与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围选择与各自靶核酸序列有关的两个基准温度。在另一实例中，从与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围选择与各自靶核酸序列有关的两个基准温度中的一个，从与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量不变的温度范围选择与各自靶核酸序列有关的两个基准温度中的另一个。在一实例中，从二聚物杂交的状态下的温度范围选择与各自靶核酸序列有关的两个检测温度中的一个，从二聚物解离的状态下的温度范围选择与资格靶核酸序列有关的两个检测温度中的另一个。
在本发明的一实例中，从属于与相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围且不属于与其他靶核酸序列有关的多个二聚物的量实质上不变的温度范围的多个温度选择与各自靶核酸序列有关的两个基准温度。
在一实例中，与各自靶核酸序列有关的检测温度范围中的多个检测温度中的至少两个温度包括其的信号值可表示靶核酸序列的存在的温度，从上述至少两个温度选择多个基准温度。
在一实例中，两个基准温度彼此相互擦5℃以内、4℃以内、3℃以内、2℃以内或1℃以内。即，第一基准温度和第二基准温度之间的相差为5℃以内、4℃以内、3℃以内、2℃以内或1℃以内。
在一实例中，两个基准温度具有0.1℃以上、0.5℃以上、1℃以上、1.5℃以上或2℃以上的温度相差。
在一实例中，两个基准温度为彼此相差1℃-5℃、1℃-4℃、1℃-3℃、2℃-5℃、2℃-4℃或2℃-3℃，尤其，彼此相差1℃-4℃或2℃-4℃。
本发明人确认，在使用包含标记物的寡核苷酸的二聚物，尤其，使用以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物来检测靶核酸序列的情况下，可通过使用具有5℃以下相差的两个基准温度也可检测靶核酸序列。并且，经确认，可使用比靶核酸序列的常规扩增子更短的长度的二聚物来以对于温度变化更灵敏的方式调节杂交，最终，可提供可在小的温度相差中也检测到的信号，即，有意义的信号变化值。
多个基准温度构成如下的温度范围：相比于通过与相应的靶核酸序列有关的二聚物产生的信号，从与其他靶核酸序列有关的二聚物产生的信号变化非常小的温度范围。例如，相比于从与相应的靶核酸序列有关的二聚物产生的信号的变化，从与其他靶核酸序列有关的二聚物产生的信号的变化可以为10％以下、9％以下、8％以下、7％以下、6％以下、5％以下、4％以下、3％以下、2％以下或1％以下。
获取信号变化值
从两个基准温度之间的多个信号值获取与相应的靶核酸序列有关的信号变化值。
如在本申请中使用，术语“两个基准温度之间的多个信号值”不仅包括两个基准温度中的多个信号值，还包括它们之间的所有或一部分温度中的多个信号值。
例如，在与相应的靶核酸序列有关的多个检测温度为60℃、61.5℃、63℃、64.5℃及65℃且选择61.5℃及64.5℃作为两个基准温度的情况下，“两个温度之间的多个信号值”可表示61.5℃及64.5℃中的多个信号值、61.5℃、63℃及64.5℃中的多个信号值或61.5℃及63℃中的多个信号值。
在一实例中，通过使用两个基准温度中的两个信号值来获取信号变化值。
术语“两个基准温度之间的多个信号值”可被“两个基准温度之间的任意温度中的多个信号值”代替。
在本发明的一实例中，“两个基准温度之间的多个信号值”在存在的情况下，包括一个以上的内插温度中的一个以上的信号值。
术语“获取两个基准温度之间的多个信号值的信号变化值”意味着通过所定义的方式获取两个基准温度之间的全部或一部分信号值的信号变化值。
能够以多种方式定义从多个信号值计算信号变化值。在一例中，可通过两个信号值的扣除、比率或变化率获取信号变化值。在另一例中，可通过多个基准温度之间的三个以上的信号值的扣除、比率或变化率获取信号变化值。具体地，通过如下的方式实现三个以上的信号值的扣除：获取在邻近的多个信号值之间扣除的值，并从上述扣除的值确定最高值、最低值或平均。可通过如下的方式实现三个以上的多个信号值的比率：获取邻近的多个信号值之间的多个比率值，并从上述比率值确定最高值、最低值或平均。三个以上的信号值的变化率可通过确定三个以上的信号值的平均斜率来实现。在存在三个以上的信号值的情况下，为了计算三个以上的信号值的扣除、比率或变化率，可使用多种方法。
在一实例中，可通过多个信号值的差值从两个基准温度中的多个信号值获取信号变化值。
在本发明的另一实例中，可通过多个信号值比温度变化值的差值从两个基准温度之间的信号值获取信号变化值。温度变化值可以为两个基准温度的相差。例如，若基准温度为61℃及63℃，则温度变化值为2℃。若在61℃的温度下检测到630RFU(相对荧光单位(relative fluorescentunits))且在63℃的温度下检测到600RFU，则多个信号值的差值为30RFU。在此情况下，信号变化值为30RFU/2℃＝15RFU/℃。
在一实例中，在以往的多个温度之间存在三个以上的多个信号值的情况下，绘制与三个以上的多个信号值拟合的直线，之后，可将上述直线的斜率作为信号变化值。
若确定与各自靶核酸序列有关的两个基准温度，则使用两个基准温度中的多个信号值及内插周期中的信号值来获取与相应的靶核酸序列有关的信号变化值，由此，获取周期/信号变化值的数据集。
可在每个靶核酸序列获取周期/信号变化值的数据集。周期/信号变化值的数据集包括从测定到信号值的周期和上述周期中的多个基准温度之间的多个信号值计算的信号变化值。
周期/信号变化值的数据集包括数据点。
如在本申请中使用，术语“数据点(data point)”意味着包括周期及上述周期中的信号变化值的一个坐标值(a coordinate value)。术语“数据”意味着构成数据集的所有信息。例如，周期及信号变化值分别为数据。
多个数据点可在二维正交坐标坐标系中由坐标值表示。在上述坐标值中，X轴表示周期数，Y轴表示在上述周期数中计算的信号变化值。
如在本申请中使用，术语“数据集”意味着多个数据点的集合。
可绘制数据集来获取扩增曲线。
在一实例中，通过信号产生反应获取的与靶核酸序列有关的数据集为表示靶核酸序列的存在或不存在的数据集。
步骤150：确定多个靶核酸序列的存在/不存在
通过周期/信号变化值的数据集确定样品中的多个靶核酸序列的存在或不存在。
周期/信号变化值的数据集针对多个靶核酸序列各自而生成，因此，周期/信号变化值的数据集可用于确定相应的靶核酸序列的存在或不存在。
在一实例中，通过周期/信号变化值的数据集是否大于阈值来确定靶核酸序列的存在或不存在。若周期/信号变化值的数据集大于阈值，则确定为与周期/信号变化值的数据集相应的靶核酸序列存在于样品中。阈值可设置为80RFU、90RFU、100RFU、110RFU、120RFU、130RFU以上。
在一实例中，通过使用与周期/信号变化值的数据集拟合的非线性函数来实施靶核酸序列的存在或不存在。在一例中，非线性函数可以为S型函数。
例如，S型函数可由数学式1表达。
数学式1：
在上述式中，f(x)为S型函数，a1为周期/信号变化值的数据集的最小值，a2、a3及a4通过与周期/信号值的数据集的拟合确定。
在本发明的一实例中，通过将与周期/信号变化值的数据集拟合的非线性函数的最大斜率、最大值或拟合准确率与各个阈值相比较来确定靶核酸序列的存在或不存在。在非线性函数的最大斜率、最大值及拟合准确率分别大于各自的阈值的情况下，确定为靶核酸序列存在。择一性地，若非线性函数的最大斜率、最大值或拟合准确率中的一个大于阈值，则确定为靶核酸序列存在。
例如，与最大斜率有关的阈值可设置为15、20、25、30、35、40等。与最大值有关的阈值可设置为80RFU、90RFU、100RFU、110RFU、120RFU、130RFU、140RFU、150RFU以下。
拟合准确率包括(a)非线性函数可多么接近的预测周期/信号变化值的数据集，即，拟合优度(goodness of fit)以及(b)解释变量(explanatory variable)在反应变量(response variable)中有多大用处的值。
拟合准确率可示出非线性函数和周期/信号变化值的数据集之间的匹配程度。并且，拟合准确率示出非线性函数和周期/信号变化值的数据集之间的差值。拟合准确率随着非线性函数和周期/信号变化值的数据集之间的匹配增加而增加。例如，拟合准确率可以为X-平方值(chi-square value)或R-平方值。
在本发明的一实例中，从周期/信号变化值的数据集恢复由所有或一部分周期各自中的信号值构成的周期/信号值的数据集，并使用其来确定靶核酸序列的存在或不存在。周期/信号值的数据集为从各个周期中检测多个信号值来生成的数据集。通常，在通过靶核酸序列的二聚物的量最大时的温度中检测多个信号值来生成周期/信号值的数据集。二聚物的量最大时的温度可以为通过上述二聚物的信号的强度最大时的温度。根据本发明，周期/信号值的数据集可来源于周期/信号变化值的数据集。
恢复周期/信号值的数据集
在一实例中，从与各自相应的靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集恢复多个信号值，由此，可获取周期/信号值的所恢复的数据集，通过使用上述周期/信号值的所恢复的数据集来确定样品中的多个靶核酸序列的存在或不存在。
在一实例中，所恢复的信号值为与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物生成最高信号值的温度中的信号值。
在一实例中，通过使用下述数学式2来从周期/信号变化值恢复周期/信号值数据集。
数学式2：
在上述式中，FDT为可通过使用人员指定的特定温度，FC表示最终周期，SCT为检测信号变化值的温度，BSV为背景信号值，SV表示信号值，表示信号变化值。
FDT可以为从二聚物的信号为最大时的温度。择一性地，FDT可以为检测温度范围内或检测温度范围外的特定温度。例如，在通过第一信号产生组合物产生的二聚物的Tm值为65℃的情况下，可将SCT设置为65℃、将FDT设置为60℃。
如下述数学式3至数学式4所示，可通过变量分离法导出数学式2。
在变量分离法中，可由f(T)、g(C)及“α”表达RFU(T，C)。RFU(T，C)为表示通过检测装置测定的信号值的函数。T表示温度，C表示周期。即，RFU(T，C)示出温度“T”和周期“C”作为函数的信号值。f(T)表示温度“T”作为函数的信号值，g(C)表示周期“C”作为函数的信号值。“α”表示背景信号(参照图6)。
以下，例示如何从65℃温度下的周期/信号变化值数据导出用于恢复60℃温度下的周期/信号变化值的数学式2。
数学式3示出根据变量分离法从60℃的温度及周期“C”中获取的周期/信号值数据集。“α”表示在45周期及85℃温度下测定的背景信号。
数学式3：RFU(60,C)＝f(60)g(C)+α
在数学式3中，以函数f(T)和函数g(C)的乘积表达RFU(60，C)。
数学式4示出根据变量分离法从65℃的温度及周期“C”中获取的周期/信号值数据集。
函数g(C)与温度无关，这是因为，仅周期“C”为函数。在温度“T”下微分量变时生成如RFU(65，C)和f(65)的通过信号变化值表达的函数g(C)。
数学式4：
数学式5示出在数学式3的g(C)代入数学式4的g(C)来获取的数学式。
数学式5：
数学式6示出第四十五个周期及在60℃的温度下检测的信号值。对于f(60)，整理数学式6。在此例中，第四十五个周期为最终周期。
数学式6：
数学式7示出以温度“T”微分数学式6来获取的数学式。对于相对于温度“T”的f(65)的微分整理数学式7。
数学式7：
数学式8示出通过将数学式6及数学式7中的相应的项代入一部分项而再次表达的数学式5。
数学式8：
可通过在各个周期排除65℃温度下的信号变化值且检测45周期中的信号值及信号变化值来获取数学式8的值。因此，可将数学式8简化为数学式9。
数学式9：/>
可通过在第四十五个周期中检测信号值和/或信号变化值来获取A和B，因此，由常数表他其。
最终，可通过包括(i)60℃的温度及第四十五个周期中的信号值、(ii)85℃的温度及第四十五个周期中的信号值、(iii)65℃的温度及各个周期中的信号变化值以及(iv)65℃的温度及第四十五个周期中的信号值的式生成各个周期中的60℃的温度下的多个信号值。
通常，在现有技术中，在60℃的温度下测定信号值来获取数据集，因此，所生成的数据集包含通过除靶核酸序列之外的核酸序列产生的信号，由此，可导致假阳性
与之相反，本发明通过使用65℃的温度下的多个信号变化值来获取周期/信号值数据集，因此，除非通过除靶核酸序列之外的核酸序列产生的信号在65℃的温度下改变，则所生成的数据集不包含通过除靶核酸序列之外的核酸序列产生的信号。因此，本发明具有相比于现有技术，显著减少假阳性的优点。
若将数学式9适用于两个靶核酸序列，则与第一靶核酸序列有关的信号值如数学式10所示，与第二靶核酸序列有关的信号值如数学式11所示。
数学式10：
数学式11：
在数学式10及11中，RFU1表示与第一靶核酸序列有关的信号值，RFU2表示与第二靶核酸序列有关的信号值。RFU1(60，Cycles)表示当第一靶核酸序列单独存在时，在60℃的温度下检测的多个周期及由上述多个周期中的多个信号值构成的周期/信号值数据集。RFU2(72，Cycles)示出当第二靶核酸序列单独存在时，在72℃的温度下检测的多个周期及由上述多个周期中的多个信号值构成的周期/信号值数据集。
并且，示出当第一靶核酸序列单独存在时，65℃的温度下及多个周期中的信号变化值。/>示出当在单一容器存在第一靶核酸序列及第二靶核酸序列两者时，65℃的温度下及多个周期中的信号变化值。在65℃的温度下，与第一靶核酸序列有关的信号值改变，与第二靶核酸序列有关的信号值实质上不变，因此，可推定，/>与/> 相同。
表示当第二靶核酸序列单独存在时，77℃的温度及周期中的信号变化值。/>表示当单一容器中存在第一靶核酸序列及第二靶核酸序列两者时，77℃的温度及周期中的信号变化值。在77℃的温度下，与第二靶核酸序列有关的信号值改变，与第一靶核酸序列有关的信号值实质上不变，因此，可推定，与/>相同。
因此，可将与第一靶核酸序列有关的周期/信号值数据集及与第二靶核酸序列有关的周期/信号值数据集简化为数学式12。
数学式12：
在数学式12中，可从在最终周期中检测到的多个信号值和/或多个信号变化值获取C、D、E，因此，由常数表他其。
总之，在本发明中，设计多个寡核苷酸以使与多个靶核酸序列有关的多个温度范围不相互重叠，由此，可从与多个靶核酸序列有关的多个信号变化值恢复周期/信号值数据集，各个温度范围为与相应的靶核酸序列有关的信号改变的范围。
如上述例示，本发明提供从包括下述步骤的第二温度中的周期/信号变化值数据集恢复第一温度中的周期/信号值数据集的方法：步骤(a)，在第二温度中获取周期/信号变化值数据集；步骤(b)，获取(i)最终周期及第一温度中的信号值、(ii)背景信号值以及(iii)最终周期及第二温度中的信号值；以及步骤(c)，将在步骤(b)中获取的多个值适用于可将第二温度中的周期/信号变化值数据集转换为第一温度中的周期/信号值数据集的数学式，由此获取第一温度中的周期/信号值数据集。
步骤(c)中的数学式可包括系数([最终周期中的信号值－背景信号值]/[最终周期及第二温度中的信号值])。
非限制性地，步骤(c)中的数学式的例包括数学式2。
用于检测靶的不同信号产生方法的组合
在一实例中，信号产生组合物包含含有标记的寡核苷酸的组合物，上述标记的寡核苷酸用于产生可通过依赖于多个靶核酸序列中的一个存在的切割反应检测的信号，标记的寡核苷酸在二聚物反应中被核酸酶切割，在与多个靶核酸序列中的其他靶核酸序列有关的所有二聚物杂交或解离而不产生信号的温度下获取信号值，用于产生可通过切割反应检测的信号的标记的寡核苷酸中的标记物具有与二聚物中的标记物相同的信号特性。
如上所述的本方法形成与靶核酸序列有关的多个二聚物并从多个二聚物获取两个不同温度之间的多个信号变化值，由此，确定关注靶核酸序列的存在或不存在。
与不同多个靶核酸序列有关的多个二聚物包含具有相同信号特性的多个标记物。因此，通过检测仪检测的多个信号无法区别何种二聚物产生信号。但是，多个二聚物具有互不相同的Tm值，因此，多个二聚物可提供表示相应的靶核酸序列的存在的多个信号变化值。
在本方法中，可通过切割以依赖于上述靶核酸序列的存在的方式标记的寡核苷酸并测定在一个温度中通过上述切割产生的信号来检测多个靶核酸序列中的一个。尤其，与通过切割产生信号的寡核苷酸相连接的标记物可具有用于多个二聚物的多个标记物相同的信号特性。
在一实例中，检测寡核苷酸的切割诱导信号变化或释放所要检测的标记的片段。
在通过标记的寡核苷酸的切割产生信号的情况下，可从任意温度检测来自通过上述切割释放的标记物的信号。因此，只要可检测通过检测寡核苷酸的切割产生的信号，可选择任意温度。
在一实例中，在与多个靶核酸序列中的其他靶核酸序列有关的所有多个二聚物杂交或解离而不产生信号的温度下检测通过切割标记的寡核苷酸来产生的信号。
例如，在标记多个二聚物来使解离为单链的多个二聚物不产生信号的情况下，在预测所要形成的所有二聚物充分解离的温度中检测通过切割标记的寡核苷酸来产生的信号。
例如，在标记多个二聚物来使杂交的多个二聚物不产生信号的情况下，在预测所要形成的所有二聚物充分杂交的温度中检测通过切割标记的寡核苷酸来产生的信号。
通过切割标记的寡核苷酸来产生的来自释放的标记物的信号的强度可根据温度改变。这种现象可在通过形成二聚物来确定靶核酸序列的存在的过程中导致假阳性结果。本发明可在为了计算信号变化值而选择的两个基准温度之间适用5℃以下、4℃以下、3℃以下或2℃以下的间隔来减少这种错误结果的可能性。
在一实例中，通过形成二聚物产生信号来检测至少两个靶核酸序列，通过切割标记的寡核苷酸产生信号来检测一个靶核酸序列。根据一实例，通过形成二聚物产生信号来检测多个靶核酸序列中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个，通过切割标记的寡核苷酸产生信号来检测一个靶核酸序列。
在一实例中，信号产生组合物包含含有标记的寡核苷酸的组合物，上述标记的寡核苷酸用于产生可通过以依赖于多个靶核酸序列中的一个的存在的切割反应检测的信号，上述标记的寡核苷酸在反应过程中被核酸酶切割。
尤其，可使用如下的信号产生组合物：将标记的寡核苷酸与靶核酸序列杂交后，切割上述标记的寡核苷酸来产生信号。
可通过包括TaqMan探针方法(美国专利第5210015号及美国专利第5538848号)的多种方法产生检测寡核苷酸与靶核酸序列杂交后切割检测寡核苷酸来产生的信号。
在通过TaqMan方法产生信号的情况下，信号产生组合物包含用于扩增靶核酸序列的引物组、具有适合的标记物(例如，相互作用双标记物)的TaqMan探针以及具有5’核酸酶活性的聚合酶。与靶核酸序列杂交的TaqMan探针在靶扩增过程中被切割来产生表示靶核酸序列的存在的信号。
通过TaqMan探针方法产生信号的具体例包括：步骤(a)，将具有引物组及适合的标记物(例如，相互作用双标记物)的TaqMan探针与靶核酸序列杂交；步骤(b)，使用步骤(a)的产物及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶来扩增靶核酸序列，上述TaqMan探针被切割来释放标记物；以及步骤(C)，检测从释放的标记物产生的信号。
尤其，可使用以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式通过切割检测寡核苷酸来产生信号的信号产生组合物。
在一实例中，在介导寡核苷酸-干预裂解释放片段的情况下，上述片段与检测寡核苷酸特异性杂交，上述片段诱导检测寡核苷酸的切割。
在一实例中，在介导寡核苷酸-干预裂解释放片段的情况下，上述片段被延伸来切割包含与捕获寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的标记的寡核苷酸。
可通过包括侵入物(Invader)分析(美国专利第5691142号)、介导寡核苷酸与检测和标记寡核苷酸裂解和依赖于延伸的裂解(PCEC，PTO Cleavage and Extension-Dependent Cleavage)(WO2012/134195)、介导寡核苷酸与检测和标记寡核苷酸裂解和依赖于信号的寡核苷酸裂解(PCE-SC，PTO Cleavage and Extension-dependent SignalingOligonucleotide Cleavage)(WO 2013/157821)以及在美国专利第7309573号中记载的方法的多种方法产生通过以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式切割检测寡核苷酸而产生信号。尤其，在美国专利第7309573号中记载的方法可视为使用通过切割来产生信号的以检测和标记寡核苷酸裂解和延伸为基础的多个方法中的一个，在上述方法中，可通过检测通过形成延伸链来与捕获和模板寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸的切割来检测延伸链的形成。侵入物分析通过切割介导寡核苷酸来形成片段并诱导没有片段延伸的连续切割反应。
在一实例中，(i)对于靶核酸序列，以依赖于切割标记的寡核苷酸的方式产生信号的信号产生组合物(例如，TaqMan方法)和(ii)对于其他核酸序列，通过以依赖于切割介导寡核苷酸-干预裂解，尤其介导寡核苷酸的方式形成的二聚物提供信号的信号产生组合物的组合可诱导出乎意料的结果。
使用检测寡核苷酸的切割的方法通常为了切割检测寡核苷酸而使用具有5’核酸酶活性的酶(尤其，Taq聚合酶)。在通过检测探针的直接杂交产生信号的现有方法(例如，分子信标方法、杂交探针方法或Hybeacon方法)中，检测探针被具有5’核酸酶活性的酶(尤其，Taq聚合酶)切割的可能性非常高。检测探针的切割可导致消耗检测探针引起的敏感度的减少(例如，杂交探针方法)或在切割-依赖性信号产生方法(例如，分子信标方法)中引起假阳性信号。标记的引物方法(例如，Sunrise方法或Scorpion方法)不会作为探针方法承受切割的问题，但是，它们具有为了调节检测温度而控制扩增子本身的Tm值的缺点。相反，包括介导寡核苷酸的切割步骤的方法利用与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割，因此，它们不受具有5’核酸酶活性的酶(尤其，Taq聚合酶)的影响。并且，包括介导寡核苷酸的切割步骤的方法，尤其，基于检测和标记寡核苷酸裂解和延伸的方法容易调节所形成的二聚物的Tm值，由此，可便于选择检测温度。
II.使用信号变化值来检测样品中的靶核酸序列
在本发明的再一实施方式中，提供检测样品中的靶核酸序列的方法，包括：在反应容器中使上述样品与用于检测上述靶核酸序列的信号产生组合物相接触的步骤，上述信号产生组合物形成与上述靶核酸序列有关的二聚物，上述二聚物提供表示靶核酸序列的存在或不存在的信号；为了(i)上述二聚物的形成及(ii)所形成的上述二聚物的杂交和/或解离而实施至少两周期的反应的步骤；在上述反应的所有或一部分周期中，在分配给上述靶核酸序列的检测温度范围中的至少两个检测温度下获取多个信号值的步骤，上述检测温度范围包括二聚物的量变化的温度范围；获取从上述检测温度中的至少两个检测温度选择的两个基准温度之间的多个信号值的信号变化值，来获取与上述靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集的步骤；以及通过与上述靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集确定样品中的靶核酸序列的存在或不存在的步骤。
本发明从原则上遵循前述的本发明的第一实施方式，为了避免引起本说明书的复杂性的过多重复，将省略它们之间的共同说明。
在一实例中，信号产生组合物包含用于形成多个二聚物的多个寡核苷酸，上述多个二聚物提供表示相应的靶核酸序列的存在的信号，上述多个寡核苷酸包含标记的多个寡核苷酸，上述多个二聚物包含标记的寡核苷酸，所形成的二聚物的杂交和/或解离提供能够检测的信号。
在一实例中，二聚物为(i)通过靶核酸序列与标记的寡核苷酸之间的杂交形成的二聚物、(ii)通过包含与靶核酸序列互补的杂交序列的寡核苷酸和与上述杂交序列的至少一部分互补的标记的寡核苷酸之间的杂交形成的二聚物或(iii)以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物(上述介导寡核苷酸与靶核酸序列杂交)。
在一实例中，以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物为以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物，上述延伸链通过借助介导寡核苷酸-干预裂解释放的片段的延伸形成。
在一实例中，以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物为通过借助介导寡核苷酸-干预裂解释放的片段与对应寡核苷酸的杂交形成的二聚物。
在一实例中，在从至少两个检测温度内插多个温度及其的多个信号值的情况下，上述至少两个检测温度包括多个内插检测温度。
在一实例中，至少两个检测温度为2～10个。
在一实例中，两个基准温度彼此相差为5℃以下、4℃以下、3℃以下、2℃以下或1℃以下。
在一实例中，至少两个检测温度为三个以上，方法还包括分析至少三个检测温度中的多个信号值来选择至少两个基准温度的步骤。
在一实例中，样品包含追加的靶核酸序列，信号产生组合物还包含含有标记的寡核苷酸的组合物，上述标记的寡核苷酸用于产生可通过依赖于追加的靶核酸序列的存在的切割反应检测的信号，标记的寡核苷酸在二聚物反应中被核酸酶切割，在与其他靶核酸序列有关的二聚物杂交或解离而不产生信号的温度下获取信号值，用于产生可通过切割反应检测的信号的标记的寡核苷酸中的标记物具有与多个二聚物中的多个标记物相同的信号特性。
III.用于通过两个基准温度中的信号变化值检测多个靶核酸序列的存储介质及装置
下述记载的本发明的存储介质、装置及计算机程序用于在计算机中实施本发明的方法，因此，为了避免引起本说明书的复杂性的过多重复，将省略它们之间的共同说明。
在本发明的另一实施方式中，提供计算机可读存储介质，包含使处理器执行用于检测样品中的多个靶核酸序列的方法的指示，方法包括：接收多个信号值的步骤；获取从上述多个检测温度范围各自中的上述至少两个检测温度选择的两个基准温度之间的多个信号值的信号变化值，来获取与上述多个靶核酸序列各自有关的周期/信号变化值的数据集的步骤；以及通过与上述多个靶核酸序列各自有关的上述周期/信号变化值的数据集确定样品中的多个靶核酸序列的存在或不存在的步骤，获取上述多个信号值的步骤包括：步骤(i)，在单一反应容器中使样品与用于检测多个靶核酸序列的信号产生组合物相接触，上述信号产生组合物形成与上述多个靶核酸序列有关的多个二聚物，上述多个二聚物分别提供表示各自相应的靶核酸序列的存在或不存在的信号，上述多个二聚物具有互不相同的Tm值；步骤(ii)，为了上述多个二聚物的形成及所形成的上述多个二聚物的杂交或解离而实施至少两周期的反应；以及步骤(iii)，在上述反应的所有或一部分一部分周期中，在分配给上述多个靶核酸序列的多个检测温度范围各自中的至少两个检测温度下获取多个信号值，上述多个检测温度范围分别包括与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物的量变化的温度范围。
在本发明的还有一实施方式中，提供计算机可读存储介质，包括使处理器执行方法的指示，上述方法包括：接收信号值的步骤；获取从上述检测温度范围中的上述至少两个检测温度选择的两个基准温度之间的多个信号值的信号变化值，来获取与靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集的步骤；以及通过与靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集确定样品中的靶核酸序列的存在或不存在的步骤，获取上述信号值的步骤包括：步骤(i)，在反应容器中使样品与用于检测靶核酸序列的信号产生组合物相接触，上述信号产生组合物形成与上述靶核酸序列有关的二聚物，上述二聚物提供表示靶核酸序列的存在或不存在的信号；步骤(ii)，为了(i)二聚物的形成及(ii)所形成的上述二聚物的杂交和/或解离而实施至少两周期的反应；以及步骤(iii)，在上述反应的所有或一部分周期中，在分配给靶核酸序列的检测温度范围中的至少两个检测温度下获取信号值，上述检测温度范围包括二聚物的量变化的温度范围。
根据本发明的又一实施方式，提供存储于计算机可读存储介质的计算机程序，使处理器执行所记载的上述方法。
在处理器，如独立计算机(stand alone computer)、联网计算机或实时聚合酶链式反应装置的数据获取装置中执行所记载的上述本方法。
计算机可读存储介质的类型包括如刻录光盘(CD-R)、紧凑型光盘只读储存器(CD-ROM)、数字通用光盘(DVD)、闪存、软盘、硬盘驱动器、便携式硬盘驱动器(HDD)、通用串行总线(USB)、磁带、迷你光碟(MINIDISC)、非易失性存储卡、带电可擦可编程只读存储器(EEPROM)、光盘、光存储介质、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、系统内存及网络服务器等的多种存储介质。在一实例中，计算机可读存储介质为非易失性计算机可读存储介质。
可通过集中机制接收与信号相关的数据(例如，强度、扩增周期数及检测温度)。例如，可通过位于聚合酶链式反应数据收集装置的处理器获取数据。可在收集数据的同时实时提供给处理器，或者，数据存储于存储单元或缓冲区并在时间结束后提供给处理器。相似地，可通过与上述收集装置的联网(例如，局域网(LAN)、虚拟专用网络(VPN)、互联网及内联网)或直接联接(例如，通用串行总线或其他直接有线联接或无线连接)向如台式计算机的独立的系统提供数据集，或者，在如小型镭射盘(CD)、数字通用光盘、软盘，便携式硬盘驱动器等的便携式介质上向独立计算机系统提供数据集。相似地，可通过如笔记本计算机或台式计算机系统的与对于客户端的联网(例如，局域网、虚拟专用网络、互联网、内联网及无线通信网络)向服务器系统提供数据集。
实现执行本发明的处理器的指示可包括于逻辑系统中。可向如便携式硬盘驱动器、通用串行总线、软盘、小型镭射盘及数字通用光盘的任意软件存储介质提供上述指示，上述指示可下载，还可存储于存储模块(例如，如硬盘驱动器或本地存储器或附着随机存取存储器或只读存储器的存储器)。可通过如C、C++、Java、Visual Basic、VBScript、JavaScript、Perl及XML的多种编码语言执行实施本发明的计算机编码。并且，多种语言及协议可用于本发明中的数据和指令的外部存储及内部存储和传递。
在本发明的又一实施方式中，提供包括(a)计算机处理器以及(b)连接于计算机处理器的计算机可读存储介质的用于检测样品中的靶核酸序列的装置。
在一实例中，装置还包括用于收容样品及信号产生组合物的反应容器、用于调节上述反应容器的温度的温度调节单元和/或用于在周期数检测信号的检测仪。
计算机处理器可使单一处理器执行几种指示。择一性地，处理器单元可使多个处理器分别执行几种指示。在一实例中，可通过在用于检测靶核酸序列的以往的装置(例如，实时聚合酶链式反应装置)安装软件来体现处理器。
分析系统包括扩增装置及分析装置。分析系统确定样品中的靶核酸序列的存在或不存在，可向使用人员显示结果。能够以阳性表达样品中的靶核酸序列的存在，能够以阴性表达样品中的靶核酸序列的不存在。
扩增装置为执行核酸扩增反应、酶反应或微生物生长等的装置。例如，在扩增装置实施核酸扩增反应的情况下，扩增装置可反复执行提升或降低样品的温度的工作。扩增装置可通过测定在每个周期从样品产生的信号来获取数据集。
扩增装置可通过电缆与分析装置相连接，或者，扩增装置可通过无线与分析装置相连接。扩增装置通过有线或无线连接向分析装置传输所获取的数据集。
分析装置从扩增装置获取数据集。分析装置通过分析数据集来确定样品中的靶核酸序列的存在或不存在。即，分析装置对于样品确定阳性或阴性。
分析装置包括显示装置。显示装置可表示数据集，或通过图表显示浮动数据集。显示装置可表示S型函数、结阶梯函数等。并且，显示装置可表示靶分析物的存在或不存在，可表示每个样品的检测结果。
分析装置可读取包括于存储介质的数据集。存储介质存储数据集或在分析装置中使用的程序等。存储介质可以为小型镭射盘或通用串行总线等。
分析装置可以为计算机、智能手机、平板电脑或可穿戴设备。分析装置包括处理器、存储器及显示装置。
本发明实施方式
通过实施例更加详细说明本发明。这些实施例用于更具体的例示，发明要求保护范围所提出的本发明的范围并不局限于实施例，这对普通技术人员而言是显而易见的。
实施例
实施例1：靶核酸序列的检测(单靶)
实施例1例示了以与靶核酸序列有关的二聚物的预测Tm值为基础确定两个检测温度，并将其用作基准温度的本发明的一实例。
制备信号产生组合物
为了检测沙眼衣原体L(Chlamydia trachomatis serovars L(CT))，将4个样品分别与AllplexTM STI-GU试剂盒(Seegene,Inc.，目录号：SD9802X)中包含的信号产生组合物(即，寡核苷酸混合物及酶主混合物)相混合。
信号产生组合物包含用于形成二聚物的组合物，上述二聚物通过检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法提供与靶核酸序列有关的能够检测的信号。在样品中存在靶核酸序列的情况下，与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸(即，检测和标记寡核苷酸)被具有5’核酸酶活性的聚合酶切割，切割片段与捕获寡核苷酸(即，捕获和模板寡核苷酸)杂交而延伸，由此，形成提供能够检测的信号的延伸二聚物。
在CT存在的情况下，上述延伸二聚物的预测Tm为64.5℃。捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Cal Red 610及BHQ2的双标记物。上述4个样品分别包含以106拷贝/反应、104拷贝/反应、103拷贝/反应及102拷贝/反应的量克隆CT序列的质粒脱氧核糖核酸(pDNA)。利用AllplexTM STI-GU试剂盒制备用于扩增实时聚合酶链式反应的反应混合物：包含5μl的4×GU MOM、5μl的EM1、5μl的RNase-free水及5μl的质粒脱氧核糖核酸样品的最终体积为20μl的反应混合物。MOM为寡核苷酸混合物，EM1为Taq聚合酶。
反应及获取信号值
在CFX96(ver.1.6，Bio-Rad，Inc.)中使用4个反应混合物来执行实时聚合酶链式反应扩增反应。上述扩增反应的温度及时间表如下述表1所示。
表1
为了初始反应的活化，在1-5周期(3-6步骤)中的时间设定的比6周期以后的其他周期更长。在1-5周期检测多个信号值并加工成RFU 0。在63℃及66℃的温度下检测6-45周期(7-11步骤)中的多个信号值。在Cal Red 610通道中测定多个信号值。
获取多个信号变化值
从6-45周期分别从63℃的温度下的信号值扣除66℃的温度下的信号值，由此，获取多个信号变化值。
获取周期/信号变化值的数据集
使用6-45周期中的多个信号变化值来获取周期/信号变化值的数据集，并以周期比信号变化值绘制。
确定靶核酸序列的存在或不存在
利用S型函数拟合周期/信号变化值的数据集，向所拟合的上述数据集适用阈值(RFU 110)来确定靶核酸序列的存在或不存在。
图7示出对于4个样品绘制周期/信号变化值的数据集来获取的扩增曲线，虚线表示在各个周期计算的信号变化值，实线表示使用数学式1的S型函数的S型拟合值：RFU，S型函数的最大信号值；df，S型函数的最大斜率；a4，S型函数的形状；以及CT，S型函数与阈值交叉的周期。
在CT质粒脱氧核糖核酸的量为106拷贝/反应的情况下，R2为最大信号值(RFU)，df、a4及Ct分别被分析为0.99773、601.44648、70.3056、0.20484以及17.4272。在CT质粒脱氧核糖核酸的量为104拷贝/反应的情况下，R2、最大信号值(RFU)、df、a4及Ct分别被分析为0.99982、696.38351、84.569、0.21059以及23.5245。在CT质粒脱氧核糖核酸的量为103拷贝/反应的情况下，R2、最大信号值(RFU)、df、a4及Ct分别被分析为0.99933、576.43263、69.6769、0.20955以及27.3389。在CT质粒脱氧核糖核酸的量为102拷贝/反应的情况下，R2、最大信号值(RFU)、df、a4及Ct分别被分析为0.99946、354.57686、47.39、0.22683以及31.295。
结果，4个样品被分析为具有大于阈值RFU 110的S型拟合的曲线的最大值，因此，对于CT，呈阳性。并且，随着靶核酸序列的量的减少，所测定的Ct值增加(17.4272、23.5245、27.3389以及31.295)。
这些结果表明，本发明通过从各个扩增周期中的信号变化值获取的周期/信号变化值的数据集以准确且可靠的方式确定靶核酸序列的存在或不存在。
实施例2：检测靶核酸序列(多个靶)
实施例2例示以与靶核酸序列有关的二聚物的预测Tm值为基础确定两个检测温度并将其用作基准温度的本发明的一实例。
制备信号产生组合物
为了检测沙眼衣原体L及梅毒螺旋体(Treponema pallidum(TP))，将4个样品分别与AllplexTM STI-GU试剂盒(Seegene,Inc.，目录号：SD9802X)中包含的信号产生组合物相混合。
在CT存在的情况下，延伸二聚物的预测Tm为64.5℃。与CT有关的捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Cal Red 610及BHQ2的双标记物。在TP存在的情况下，延伸二聚物的预测Tm为76℃。与TP有关的捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Cal Red 610以及BHQ2的双标记物。
如表2所示，以包含CT及TP的质粒脱氧核糖核酸分子的方式制备上述5个样品。
表2
利用AllplexTM STI-GU试剂盒制备了用于扩增实时聚合酶链式反应的反应混合物：包含5μl的4×GU MOM、5μl的EM1、5μl的RNase-free水以及5μl的质粒脱氧核糖核酸样品的最终体积为20μl的反应混合物。
反应及多个信号值的获取
在CFX96(ver.1.6，Bio-Rad，Inc.)中使用5个反应混合物来执行实时聚合酶链式反应扩增反应。上述扩增反应的温度及时间表如表3所示。
表3
为了初始反应的活化，在1-5周期(3-6步骤)中的时间设定的比6周期以后的其他周期更长。在1-5周期检测多个信号值并加工成RFU 0。在检测温度中检测6-45周期(7-11步骤)中的多个信号值。在检测CT的情况下，在63℃及66℃的温度下测定多个信号值，在检测TP的情况下，在74.5℃及77.5℃的温度下测定多个信号值。
获取信号变化值
通过6-45周期各自的多个信号值的差值获取多个信号变化值。在63℃的温度下的多个信号值扣除66℃的温度下的多个信号值来获取用于检测CT的多个信号变化值，在74.5℃的温度下的多个信号值扣除77.5℃的温度下的多个信号值来获取用于检测TP的多个信号变化值。
获取周期/信号变化值的数据集
通过使用6-45周期的多个信号变化值来获取周期/信号变化值的数据集并以周期比信号变化值绘制。
确定靶核酸序列的存在或不存在
利用S型函数拟合周期/信号变化值的数据集，向所拟合的上述数据集适用阈值(RFU 110)来确定靶核酸序列的存在或不存在。
图8-12示出通过绘制与5个样品有关的周期/信号变化值的多个数据集来获取的多个扩增曲线。虚线表示在各个周期计算的多个信号变化值，实线表示使用数学式1的S型函数的S型拟合值：在图8-12中，左侧曲线表示与CT有关的扩增曲线，右侧曲线表示与TP有关的扩增曲线。
5个样品具有大于阈值RFU 110的S型拟合的多个曲线的最大值，因此，对于CT及TP，呈阳性。这些结果表明，在存在多个靶核酸序列的情况下，本发明可通过从各个扩增周期中的信号变化值获取的周期/信号变化值的数据集以同时且准确的方式确定多个靶核酸序列的存在或不存在。
并且，在上述5个样品中，随着靶核酸序列的量的减少，所测定的Ct值增加。在图8-10中，在存在CT 104拷贝/反应的情况下，随着TP质粒脱氧核糖核酸的量减少(104拷贝/反应、103拷贝/反应以及102拷贝/反应)，Ct值增加(26.1393、29.4043及34.0292)；在图8、11及12中，在存在TP 104拷贝/反应的情况下，随着CT质粒脱氧核糖核酸的量减少(104拷贝/反应、103拷贝/反应以及102拷贝/反应)，Ct值增加(24.1816、27.9323以及32.2068)。
结果，本发明人确认，本发明可通过从各个扩增周期中的信号变化值获取的周期/信号变化值的数据集在单一反应容器中同时且可靠地确定多个靶核酸序列的存在或不存在。
实施例3：通过使用从三个以上的检测温度选择的多个基准温度来检测靶核酸序列
在实施例1-2中，以与靶核酸序列有关的二聚物的预测Tm值为基础确定两个检测温度，并将其用作基准温度。实施例3例示在对于各个靶核酸序列确定至少三个检测温度来获取多个信号值后，考虑上述多个信号值来从上述至少三个检测温度中选择两个检测温度的本发明的一实例。
制备信号产生组合物
为了检测血红蛋白Β(HBB)基因、人乳头瘤病毒(HPV)35型及人乳头瘤病毒18型，将16个样品分别与AnyplexTMHPV HR试剂盒(Seegene,Inc.，目录号：HP7E00X)中包含的信号产生组合物相混合。
信号产生组合物包含用于形成二聚物的组合物，上述二聚物通过检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法提供与靶核酸序列有关的能够检测的信号。在样品中存在靶核酸序列的情况下，与上述靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸(即，检测和标记寡核苷酸)被具有5’核酸酶活性的聚合酶切割，切割片段与捕获寡核苷酸(即，捕获和模板寡核苷酸)杂交来延伸，由此，形成提供能够检测的信号的延伸二聚物。
在存在血红蛋白Β基因的情况下，上述延伸二聚物的预测Tm为63℃。与血红蛋白Β基因有关的捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Q670及BHQ2的双标记物。在存在人乳头瘤病毒35型的情况下，上述延伸二聚物的预测Tm为70.5℃。与人乳头瘤病毒35型有关的捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Q670及BHQ2的双标记物。在存在人乳头瘤病毒18型的情况下，上述延伸二聚物的预测Tm为76.5℃。与人乳头瘤病毒18型有关的捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Q670及BHQ2的双标记物。
以50拷贝/反应的量使用克隆血红蛋白Β基因、人乳头瘤病毒35型序列或人乳头瘤病毒18型序列的质粒脱氧核糖核酸来以表4的方式制备16个样品。
表4
利用AnyplexIITMHPV HR试剂盒制备用于扩增实时聚合酶链式反应的反应混合物：包含5μl的4×人乳头瘤病毒HRTOM、5μl的EM1、5μl的RNase-free水及5μl的质粒脱氧核糖核酸样品的最终体积为20μl的反应混合物。TOM为寡核苷酸混合物，EM1为Taq聚合酶。
反应
在CFX96(ver.1.6，Bio-Rad，Inc.)中使用16个反应混合物来执行实时聚合酶链式反应扩增反应，在一个通道(Q670通道)检测信号。上述扩增反应的温度及时间表如表5所示。
表5
上述扩增反应执行50个周期。2-4步骤相当于奇数周期，5-21步骤相当于偶数周期。仅在偶数周期测定多个信号值。
在多个检测温度中获取多个信号值
对于各个靶核酸序列，在包含与相应的靶核酸序列有关的二聚物的预测Tm值的检测温度范围中设定6个检测温度。在血红蛋白Β基因的情况下，将多个检测温度设置为60℃、61.5℃、63℃、64.5℃、66℃及67.5℃；在人乳头瘤病毒35型序列的情况下，将检测温度设置为66℃、67.5℃、69℃、70.5℃、72℃及73.5℃；在人乳头瘤病毒18型序列的情况下，将检测温度设置为73.5℃、75℃、76.5℃、78℃、79.5℃及81℃。以1.5℃的间隔设置检测温度。
在奇数周期中，通过在偶数周期中的多个信号值的内插使多个信号值近似。在本实施例中，将偶数的邻近周期中的多个信号值的平均值确定为奇数周期中的多个信号值。
通过多个检测温度及多个检测温度中的多个信号值的内插将多个检测温度之间的多个温度及多个检测温度之间的多个温度中的多个信号值近似。在本实施例中，将邻近的多个检测温度中的多个信号值的平均自确定为邻近的多个检测温度的平均温度中的多个信号值。
选择多个基准温度
以如下的方式选择与靶核酸序列有关的多个基准温度：为了选择多个基准温度，使用了46-50周期中的多个信号值。对于血红蛋白Β基因，使用在各个周期中在6个检测温度下测定的多个信号值来计算5的信号变化值。通过邻近的多个检测温度中的多个信号值的扣除计算上述多个信号变化值，将其分配给邻近的多个检测温度的多个内插温度(即，2个邻近的多个检测温度的平均温度)。计算46-50周期中的相同检测温度中的多个信号变化值的平均值来生成相应的多个检测温度中的多个平均信号变化值。将最高平均信号变化值分配为第一平均信号变化值，将与最高平均信号变化值有关的邻近的平均信号值中的高平均信号变化值跟配为第二平均信号值，将其他平均信号变化值分配为第三平均信号变化值。计算(第二平均信号变化值与第三平均信号变化值之间的差值)与(第一平均信号变化值与第三平均信号变化值之间的差值)之比。在上述比率大于阈值0.4的情况下，将最高平均信号变化值分配为与第一平均信号变化值有关的温度和与第二平均信号变化值有关的温度之间的中间温度，将距上述中间温度以相同间隔(例如，1.5℃)隔开的两个温度沿双向选择为两个基准温度。在上述比率为阈值0.4以下的情况下，将第一平均信号变化值最终确定为最高平均信号变化值，将距与第一平均信号变化值相应的内插温度以相同间隔隔开(例如，1.5℃)的两个温度沿双向选择为两个基准温度。
以与血红蛋白Β基因相同的方式，通过使用46-50周期中的6个检测温度中的多个信号值来选择了用于检测人乳头瘤病毒35型及人乳头瘤病毒18型的两个基准温度。
表6示出用于计算信号变化值的与各个样品有关的两个基准温度，上述信号变化值用于检测血红蛋白Β基因。
表6
本发明人以与血红蛋白Β基因有关的二聚物的预测Tm(63℃)为基础预测了与血红蛋白Β基因有关的两个检测温度为61.5℃及64.5℃。在样品B3、B4及C4中，两个检测温度与以预测Tm为基础预测的两个检测温度相同。在样品A3、A4、C3、D3及D中，所选择的两个检测温度为62.25℃及65.25℃。通过邻近的多个检测温度中的多个信号值的内插获取了62.25℃及65.25℃的温度下的多个信号值。
表7示出用于计算多个信号变化值的与各个样品有关的两个基准温度，上述多个信号变化值用于检测人乳头瘤病毒35型序列。
表7
本发明人以与人乳头瘤病毒35型序列有关的二聚物的预测Tm(70.5℃)为基础预测了与人乳头瘤病毒35型序列有关的两个检测温度为69℃及72℃。在所有样品中，所选择的两个检测温度为69.75℃及72.75℃。通过邻近的多个检测温度中的多个信号值的内插获取了69.75℃及72.75℃的温度下的多个信号值。
表8示出用于计算多个信号变化值的与各个样品有关的两个基准温度，上述多个信号变化值用于检测人乳头瘤病毒18型序列。
表8
本发明人以与人乳头瘤病毒18型序列有关的二聚物的预测Tm(76.5℃)为基础预测了与人乳头瘤病毒18型序列有关的两个检测温度为75℃及78℃。在所有样品中，所选择的两个检测温度为75.75℃及78.75℃中。通过邻近的多个检测温度中的多个信号值的内插获取了75.75℃及78.75℃中的多个信号值。
获取周期/信号变化值的数据集
通过从所选择的上述两个基准温度中扣除多个信号值来计算与各个样品及靶核酸序列有关的多个信号变化值。
确定靶核酸序列的存在或不存在
利用S型函数拟合周期/信号变化值的数据集，向所拟合的上述数据集适用阈值(RFU 50)来确定靶核酸序列的存在或不存在。
表9-11示出样品中的靶核酸序列的Ct值。
表9：血红蛋白Β
样品 1 2 3 4
A - - 35.70 37.86
B - - 35.67 39.79
C - - 36.76 39.21
D - - 37.16 39.98
表10：人乳头瘤病毒35型
样品 1 2 3 4
A - 35.84 - 35.77
B - 36.24 - 35.45
C - 35.26 - 36.22
D - 35.60 - 34.91
表11：人乳头瘤病毒18型
样品 1 2 3 4
A - - - -
B - - - -
C 34.40 34.10 34.15 34.71
D 33.43 35.00 34.20 34.61
上述结果表明，可考虑至少三个检测温度中的多个信号值来从至少三个检测温度选择多个基准温度，可通过多个扩增周期中的所选择的上述多个基准温度之间的多个信号变化值确定靶核酸序列的存在或不存在。
与靶核酸序列有关的二聚物的所预测或所计算的Tm值与如样品、反应温度、盐浓度、2价阳离子浓度、寡核苷酸浓度及pH值的反应条件下的实际反应Tm值不同。因此，与靶核酸序列有关的二聚物的实际反应Tm值具有反应之间的偏差。在选择适合于实际反应Tm值的多个基准温度的方面，使用考虑多个检测温度的多个信号值来确定的多个基准温度的本发明非常有利于准确地检测多个靶核酸序列。
实施例4：通过使用从三个以上的检测温度选择的多个基准温度来检测靶核酸序列
以与在实施例3中使用的包含不同的靶核酸序列及不同报道分子标记物的二聚物例示使用从大于3个的检测温度选择的多个基准温度的本发明的另一实例。
制备信号产生组合物
为了检测人乳头瘤病毒33型、人乳头瘤病毒39型及人乳头瘤病毒52型，将16个样品分别与信号产生组合物相混合。上述信号产生组合物包含用于形成二聚物的组合物，上述二聚物通过检测和标记寡核苷酸裂解和延伸方法提供与靶核酸序列有关的能够检测的信号。
在存在人乳头瘤病毒33型的情况下，延伸二聚物的预测Tm为63℃。与人乳头瘤病毒33型有关的捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Cal red 610及BHQ2的双标记物。在存在人乳头瘤病毒39型的情况下，延伸二聚物的预测Tm为70℃。与人乳头瘤病毒39型有关的捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Cal red 610及BHQ2的双标记物。在存在人乳头瘤病毒52型的情况下，延伸二聚物的预测Tm为76℃。与人乳头瘤病毒52型有关的捕获和模板寡核苷酸的模板部位具有Cal red 610及BHQ2的双标记物。
以50拷贝/反应的量使用克隆人乳头瘤病毒33型序列、人乳头瘤病毒39型序列或人乳头瘤病毒52型序列的质粒脱氧核糖核酸以表12的方式制备16个样品。
表12
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、检测和标记寡核苷酸及捕获和模板寡核苷酸的序列如下：
33-F 5'-AATGGTATTTGTTGGGGCAATIIIIIATTTGTTAC-3'(序列：1)
33-R 5'-TCCTGIAAACTASCAGATGGAGGIIIIITTAAACCAA-3'(序列：2)
33-PTO 5'-AACGGTACGACGGCACACARGTAACTAGTGACAGTACATATAAAAATGA[C3spacer]-3'(序列：3)
33-CTO 5'-[BHQ2]TTATATTTTATTTTATTATA[T(CAL Red 610)]ACTGCCGTCGTACCGTT-3'(序列：4)
39-F5'-GAYACTACCCGTAGTACCAACTTTACIIIIICTACCTCTA-3'(序列：5)
39-R 5'-CTGGCAGATGGTGGAGGAGIIIIIGCRAAATTC-3'(序列：6)
39-PTO 5'-ACGGCGCAATACCTCCTCCACGTGCCTKRTATATTCCTTAAA[C3spacer]-3'(序列：7)
39-CTO 5'-[BHQ2]TATTATTATTAAGAGCTGCT[T(CAL Red 610)]CCGAGGTATTGCGCCGT-3'(序列：8)
52-F 5'-CAGGGCCACAATAATGGCAIIIIITGGGGCAAT-3'(序列：9)
52-R 5'-CCTTTCCTTTAGGTGGTGTGTIIIIITGACAWGT-3'(序列：10)
52-PTO 5'-TGTCGATCGCGTCCAGTCCTCTAAAATAGTGGCATCCATYTTAT[C3spacer]-3'(序列：11)
52-CTO 5'-[BHQ2]TGCGATATGTCGGGTACGAC[T(CAL Red 610)]GGTGGACGCGATCGACA-3'(序列：12)
(I：脱氧肌苷)
(标有下划线部分表示检测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
以包含样品、用于检测人乳头瘤病毒33型靶的多个寡核苷酸[6pmole的正向引物(序列：1)、6pmole的反向引物(序列：2)、3pmole的检测和标记寡核苷酸(序列：3)、1pmole的捕获和模板寡核苷酸(序列：4)]、用于检测人乳头瘤病毒39型靶的多个寡核苷酸[4pmole的正向引物(序列：5)及4pmole的反向引物(序列：6)、3pmole的检测和标记寡核苷酸(序列：7)、1pmole的捕获和模板寡核苷酸(序列：8)]、用于检测人乳头瘤病毒52型靶的多个寡核苷酸[3pmole的正向引物(序列：9)及3pmole的反向引物(序列：10)、2pmole的检测和标记寡核苷酸(序列：11)、1pmole的捕获和模板寡核苷酸(序列：12)]以及10μl的EM4(Taq聚合酶)的方式制备最终体积为20μl的用于扩增实时聚合酶链式反应的反应混合物。
反应
在CFX96(Ver.1.6，Bio-Rad，Inc.)中使用16个反应混合物来实施实时聚合酶链式反应扩增反应，在一个通道(Cal red 610通道)检测信号。扩增反应的温度及时间表与实施例3中的表相同。
从多个检测温度获取多个信号值
对于各个靶核酸序列，在包含与相应的靶核酸序列有关的二聚物的预测Tm值的检测温度范围中设置6个检测温度。在人乳头瘤病毒33型基因的情况下，将检测温度设置为60℃、61.5℃、63℃、64.5℃、66℃及67.5℃；在人乳头瘤病毒39型序列的情况下，将检测温度设置为66℃、67.5℃、69℃、70.5℃、72℃及73.5℃；在人乳头瘤病毒52型序列的情况下，将检测温度设置为73.5℃、75℃、76.5℃、78℃、79.5℃及81℃。以1.5℃的相差设置多个检测温度。
通过偶数周期中的多个信号值的内插使奇数周期中的多个信号值近似。在本实施例中，将邻近的偶数周期中的多个信号值的平均值确定为奇数周期中的多个信号值。
通过多个检测温度及多个检测温度中的多个信号值的内插使多个检测温度之间的多个温度及上述多个检测温度之间的多个温度中的多个信号值近似。在本实施例中，将邻近的多个检测温度中的多个信号值的平均值设置为邻近的多个检测温度的平均温度中的多个信号值。
选择多个基准温度
以如实施例3中所记载的方式选择与多个靶核酸序列有关的多个基准温度。
表13示出用于计算多个信号变化值的与各个样品有关的两个基准温度，上述多个信号变化值用于检测人乳头瘤病毒33型。
表13
本发明人以与人乳头瘤病毒33型有关的二聚物的预测Tm(63℃)为基础预测了与人乳头瘤病毒33型有关的两个检测温度为61.5℃及64.5℃。在样品A3、B3、C3、D3、A4及B4中，所选择的两个检测温度为62.25℃及65.25℃。在样品C4及D4中，所选择的两个检测温度为63℃及66℃。在邻近的多个检测温度中，通过多个信号值的内插获取了62.25℃及65.25℃中的多个信号值。
表14示出用于计算多个信号变化值的与各个样品有关的两个基准温度，上述多个信号变化值用于检测人乳头瘤病毒39型序列。
表14
本发明人以与人乳头瘤病毒39型序列有关的二聚物的预测Tm(70℃)为基础预测了与人乳头瘤病毒39型序列有关的两个检测温度为69℃及72℃。在所有样品中，所选择的两个检测温度为69℃及72℃。表15示出用于计算多个信号变化值的与各个样品有关的两个基准温度，上述多个信号变化值用于检测人乳头瘤病毒52型序列。
表15
/>
本发明人以与人乳头瘤病毒52型序列有关的二聚物的预测Tm(76℃)为基础预测了与人乳头瘤病毒52型有关的两个检测温度为75℃及78℃。在所有样品中，所选择的两个检测温度为75.75℃及78.75℃。通过邻近的多个检测温度中的多个信号值的内插获取了75.75℃及78.75℃的温度下的多个信号值。
获取周期/信号变化值的数据集
通过从所选择的上述两个基准温度中扣除多个信号值来计算与各个样品及靶核酸序列有关的信号变化值。
确定靶核酸序列的存在或不存在
利用S型函数拟合周期/信号变化值的数据集，向所拟合的上述数据集适用阈值(RFU 50)来确定16个样品中的靶核酸序列的存在或不存在。
表16-18示出样品中的靶核酸序列的Ct值。
表16：人乳头瘤病毒33型
样品 1 2 3 4
A - - 37.51 39.12
B - - 36.70 39.90
C - - 40.17 40.49
D - - 38.84 41.47
表17：人乳头瘤病毒39型
样品 1 2 3 4
A - 34.15 - 34.59
B - 34.96 - 35.01
C - 34.48 - 34.63
D - 34.80 - 34.86
表18：人乳头瘤病毒52型
样品 1 2 3 4
A - - - -
B - - - -
C 35.07 33.88 34.53 35.81
D 32.74 35.58 34.75 34.72
上述结果表明，可考虑至少三个检测温度中的多个信号值来从至少三个检测温度选择多个基准温度，可通过从多个扩增周期中选择的多个基准温度之间的多个信号变化值确定靶核酸序列的存在或不存在。
以上，详细说明了本发明的特定部分，对于本领域的普通技术人员而言，这种具体说明仅为优先的实例，本发明的范围并不局限于此，这是显而易见的。因此，本发明的实质性范围通过发明要求保护范围及其等同技术方案定义。
序列表
<110> SEEGENE, INC.
<120> 用于检测样品中的多个靶核酸序列的方法及装置
<130> SG-PP19001
<150> KR 10-2018-0046375
<151> 2018-04-20
<160> 12
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 33-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n是脱氧肌苷
<400> 1
aatggtattt gttggggcaa tnnnnnattt gttac 35
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 33-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> n是脱氧肌苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)
<223> s是鸟嘌呤或胞嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(28)
<223> n是脱氧肌苷
<400> 2
tcctgnaaac tascagatgg aggnnnnntt aaaccaa 37
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 33-PTO
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)
<223> r是腺嘌呤或鸟嘌呤
<400> 3
aacggtacga cggcacacar gtaactagtg acagtacata taaaaatga 49
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 33-CTO
<400> 4
ttatatttta ttttattata tactgccgtc gtaccgtt 38
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 39-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)
<223> y是胞嘧啶或胸腺嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(31)
<223> n是脱氧肌苷
<400> 5
gayactaccc gtagtaccaa ctttacnnnn nctacctcta 40
<210> 6
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 39-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(24)
<223> n是脱氧肌苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)
<223> r是腺嘌呤或鸟嘌呤
<400> 6
ctggcagatg gtggaggagn nnnngcraaa ttc 33
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 39-PTO
<220>
<221> misc_feature
<222> (28)
<223> k是鸟嘌呤或胸腺嘧啶
<220>
<221> misc_feature
<222> (29)
<223> r是腺嘌呤或鸟嘌呤
<400> 7
acggcgcaat acctcctcca cgtgcctkrt atattcctta aa 42
<210> 8
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 39-CTO
<400> 8
tattattatt aagagctgct tccgaggtat tgcgccgt 38
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 52-F
<220>
<221> misc_feature
<222> (20)..(24)
<223> n是脱氧肌苷
<400> 9
cagggccaca ataatggcan nnnntggggc aat 33
<210> 10
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 52-R
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n是脱氧肌苷
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)
<223> w是腺嘌呤或胸腺嘧啶
<400> 10
cctttccttt aggtggtgtg tnnnnntgac awgt 34
<210> 11
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 52-PTO
<220>
<221> misc_feature
<222> (40)
<223> y是胞嘧啶或胸腺嘧啶
<400> 11
tgtcgatcgc gtccagtcct ctaaaatagt ggcatccaty ttat 44
<210> 12
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸: 52-CTO
<400> 12
tgcgatatgt cgggtacgac tggtggacgc gatcgaca 38

Claims (34)

1.一种用于检测样品中的多个靶核酸序列的方法，其包括：
在单一反应容器中使上述样品与用于检测上述多个靶核酸序列的信号产生组合物相接触的步骤，其中上述信号产生组合物形成与上述多个靶核酸序列有关的多个二聚物，上述多个二聚物分别提供表示各自相应的靶核酸序列的存在或不存在的信号，上述多个二聚物具有互不相同的Tm值；
为了(i)上述多个二聚物的形成及(ii)所形成的上述多个二聚物的杂交或解离而实施至少两周期的反应的步骤；
在上述反应的所有或一部分周期中，在分配给上述多个靶核酸序列的多个检测温度范围各自中的至少两个检测温度下获取多个信号值的步骤，其中上述多个检测温度范围分别包括与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物量变化的温度范围；
获取从上述多个检测温度范围各自中的上述至少两个检测温度选择的两个基准温度之间的多个信号值的信号变化值，来获取与上述多个靶核酸序列各自有关的周期/信号变化值的数据集的步骤；以及
通过与上述多个靶核酸序列各自有关的上述周期/信号变化值的数据集确定样品中的多个靶核酸序列的存在或不存在的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号产生组合物包含用于形成多个二聚物的标记的多个寡核苷酸，上述多个二聚物提供表示各自相应的靶核酸序列的存在的信号，所形成的上述多个二聚物包含上述标记的多个寡核苷酸，所形成的上述多个二聚物的杂交和/或解离提供能够检测的信号。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个二聚物包含标记的多个寡核苷酸，上述标记的多个寡核苷酸包含具有相同信号特性的一个标记物。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个二聚物为(i)通过靶核酸序列和标记的寡核苷酸之间的杂交形成的二聚物、(ii)通过包含与靶核酸序列互补的杂交序列的寡核苷酸和与上述杂交序列的至少一部分互补的标记的寡核苷酸之间的杂交形成的二聚物或(iii)以依赖于与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的二聚物。
5.根据权利要求4所述的方法，其中以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的上述二聚物为以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物，上述延伸链通过从介导寡核苷酸-干预裂解释放的片段的延伸来形成。
6.根据权利要求4所述的方法，其中以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的上述二聚物为通过从介导寡核苷酸-干预裂解释放的片段与对应寡核苷酸的杂交形成的二聚物。
7.根据权利要求4所述的方法，其中
以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的上述二聚物为以依赖于延伸链的形成的方式形成的二聚物，上述延伸链通过如下步骤形成：
步骤(i)，使介导寡核苷酸与靶核酸序列进行杂交；
步骤(ii)，通过核酸酶切割介导寡核苷酸或包含介导寡核苷酸的扩增子来生成片段；
步骤(iii)，使上述片段与包含所要与上述片段杂交的5’-捕获部位的捕获寡核苷酸进行杂交；以及
步骤(iv)，在3’-模板部位上实施与捕获部位杂交的片段的延伸反应来形成延伸链。
8.根据权利要求7所述的方法，其中将介导寡核苷酸用作引物来扩增靶核酸序列并通过在扩增子切割与介导寡核苷酸互补的序列的一部分来释放片段来生成上述包含介导寡核苷酸的扩增子。
9.根据权利要求4所述的方法，其中
以依赖于介导寡核苷酸-干预裂解的方式形成的上述二聚物为通过如下步骤形成的二聚物：
步骤(i)，使介导寡核苷酸与靶核酸序列进行杂交；
步骤(ii)，通过核酸酶切割介导寡核苷酸来生成片段；以及
步骤(iii)，使上述片段与具有与上述片段互补的序列的对应寡核苷酸进行杂交。
10.根据权利要求5所述的方法，其中以依赖于延伸链的形成的方式形成的上述二聚物为(i)延伸链与捕获寡核苷酸之间的二聚物、(ii)捕获寡核苷酸与捕获寡核苷酸-杂交寡核苷酸之间的二聚物、(iii)延伸链-捕获寡核苷酸与被上述延伸链-捕获寡核苷酸捕获的延伸链中的双延伸链之间的二聚物、(iv)双延伸链与上述双延伸链-杂交寡核苷酸之间的二聚物或(v)双延伸链-捕获寡核苷酸与所要与上述延伸链-捕获寡核苷酸杂交的寡核苷酸之间的二聚物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中在从至少两个检测温度内插多个温度及其多个信号值的情况下，上述至少两个检测温度包括多个内插检测温度。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个检测温度为2～10个。
13.根据权利要求1所述的方法，其中选择上述至少两个检测温度以使与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物的预测Tm值包含于上述至少两个检测温度中的最高检测温度与最低检测温度之间。
14.根据权利要求1所述的方法，其中在上述至少两个检测温度为两个检测温度的情况下，将上述两个检测温度选择为上述两个基准温度。
15.根据权利要求1所述的方法，其中将上述两个基准温度选择为上述至少两个检测温度中的最高检测温度及最低检测温度。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述两个基准温度为6℃以下且互不相同。
17.根据权利要求1所述的方法，其中通过使用上述两个基准温度之间的所有或一部分信号值来计算上述信号变化值。
18.根据权利要求1所述的方法，其中通过使用上述两个基准温度中的两个信号值来获取上述信号变化值。
19.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个检测温度为三个以上，在上述方法中，为了选择两个基准温度而分析至少三个检测温度中的多个信号值。
20.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个检测温度为三个以上，为了选择两个基准温度而使用至少三个检测温度中的多个信号值来计算多个信号变化值。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个检测温度为三个以上，通过使用上述至少三个检测温度中的多个信号值来计算多个信号变化值，选择两个基准温度以使所计算的上述多个信号变化值中的最高信号变化值包含于上述两个基准温度之间。
22.根据权利要求21所述的方法，其中将上述最高信号变化值分配给用于计算最高信号变化值的多个检测温度之间的温度。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少两个检测温度为三个以上，通过使用相邻的多个检测温度之间的多个信号值来计算多个信号变化值，选择两个基准温度以使所计算的上述多个信号变化值中的最高信号变化值包含于上述两个基准温度之间。
24.根据权利要求23所述的方法，其中将上述最高信号变化值分配给用于计算上述最高信号变化值的多个检测温度之间的温度。
25.根据权利要求23所述的方法，其中
将上述信号变化值分配给用于计算相应的多个信号变化值的多个检测温度之间的多个温度；
将上述多个信号变化值中的最高信号变化值分配为第一变化值，将与最高信号变化值相邻的两个信号变化值中的高信号变化值及低信号变化值分别分配为第二信号变化值及第三信号变化值；
在(i)第二信号变化值与第三信号变化值之间的差值与(ii)第一信号变化值与第三信号变化值之间的差值之比大于阈值的情况下，将最高信号变化值分配给与第一信号变化值有关的温度和与第二信号变化值有关的温度之间的中间温度，将距中间温度以相同间隔隔开的两个温度沿双向选择为两个基准温度。
26.根据权利要求23所述的方法，其中
将上述信号变化值分配给用于计算相应的信号变化值的多个检测温度之间的多个温度；
将上述信号变化值中的最高信号变化值分配为第一变化值，将与最高信号变化值相邻的两个信号变化值中的高信号变化值及低信号变化值分别分配为第二信号变化值及第三信号变化值；
在(i)第二信号变化值与第三信号变化值之间的差值与(ii)第一信号变化值与第三信号变化值之间的差值之比小于阈值的情况下，将最高信号变化值分配给与第一信号变化值有关的温度，将距与上述第一信号变化值有关的温度以相同间隔隔开的两个温度沿双向选择为两个基准温度。
27.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括通过使用三个检测温度中的多个信号值来计算与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物的实际反应Tm值的步骤。
28.根据权利要求1所述的方法，其中选择上述两个基准温度以使与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物的实际反应Tm值包含于两个基准温度之间。
29.根据权利要求1所述的方法，其中通过信号值的扣除、比率或变化率获取上述信号变化值。
30.根据权利要求1所述的方法，其中与上述多个靶核酸序列有关的两个基准检测温度相互不重叠。
31.根据权利要求1所述的方法，其中通过在单一反应容器及不同反应容器中分析与相同靶核酸序列有关的多个信号变化值来选择上述两个基准温度。
32.根据权利要求1所述的方法，其中
上述信号产生组合物包含提供能够通过依赖于上述多个靶核酸序列之一的存在的切割反应检测的信号的标记的寡核苷酸；
上述标记的寡核苷酸在二聚物反应中被核酸酶切割，在与上述多个靶核酸序列中的其他靶核酸序列有关的所有二聚物被杂交或解离而不提供信号的温度下获取上述信号值，其中用于产生能够通过切割反应检测的信号的标记的寡核苷酸中的标记物具有与多个二聚物中的标记物相同的信号特性。
33.根据权利要求1所述的方法，其中
上述方法还包括从与相应的靶核酸序列有关的周期/信号变化值的数据集恢复多个信号值来获取周期/信号值的恢复的数据集的步骤，
通过使用上述周期/信号值的恢复的数据集来确定样品中的多个靶核酸序列的存在或不存在。
34.根据权利要求33所述的方法，其中恢复的上述多个信号值为与各自相应的靶核酸序列有关的二聚物在生成最高信号值的温度下的多个信号值。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4355903A1 (en) * 2021-06-17 2024-04-24 Seegene, Inc. Detection of multiple target nucleic acid using multiple detection temperatures
EP4388132A1 (en) * 2021-08-19 2024-06-26 Luminex Corporation Digital amplification assay analysis method
WO2023195780A1 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 Seegene, Inc. Method for detecting three target nucleic acids in sample
WO2024080818A1 (ko) * 2022-10-14 2024-04-18 주식회사 씨젠 상이한 tm 값을 가지는 2개의 프로브를 이용하여 샘플 내 타겟 핵산을 검출하는 방법
WO2024106890A1 (ko) * 2022-11-16 2024-05-23 주식회사 씨젠 퀀칭-pto 절단 및 연장(quenching-pto cleavage and extension; q-ptoce) 어세이에 의한 타겟 핵산의 검출

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102959092A (zh) * 2011-01-11 2013-03-06 Seegene株式会社 借助于探测和标记的寡核苷酸切割以及延长试验的靶核酸序列检测
CN107208139A (zh) * 2014-12-09 2017-09-26 Seegene株式会社 与靶核酸序列有关的信号的分辨
CN107208134A (zh) * 2014-12-09 2017-09-26 Seegene株式会社 使用不同检测温度及基准值的靶核酸序列检测

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4351760A (en) 1979-09-07 1982-09-28 Syva Company Novel alkyl substituted fluorescent compounds and polyamino acid conjugates
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US5210015A (en) 1990-08-06 1993-05-11 Hoffman-La Roche Inc. Homogeneous assay system using the nuclease activity of a nucleic acid polymerase
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US5965364A (en) 1990-10-09 1999-10-12 Benner; Steven Albert Method for selecting functional deoxyribonucleotide derivatives
US6037120A (en) 1995-10-12 2000-03-14 Benner; Steven Albert Recognition of oligonucleotides containing non-standard base pairs
US5541311A (en) 1992-12-07 1996-07-30 Third Wave Technologies, Inc. Nucleic acid encoding synthesis-deficient thermostable DNA polymerase
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US6117635A (en) 1996-07-16 2000-09-12 Intergen Company Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon
AU4657500A (en) 1999-04-21 2000-11-02 Pangene Corporation Locked nucleic acid hybrids and methods of use
CA2377707A1 (en) 1999-06-22 2000-12-28 Invitrogen Corporation Improved primers and methods for the detection and discrimination of nucleic acids
NZ521593A (en) 2000-03-29 2004-11-26 Lgc Ltd Hybridisation beacon and method of rapid sequence detection and discrimination
CN1592792B (zh) 2000-05-19 2010-12-01 伊拉根生物科学公司 检测核酸的材料和方法
US7309573B2 (en) 2000-11-21 2007-12-18 Stratagene California Methods for detection of a nucleic acid by sequential amplification
US7153658B2 (en) * 2002-09-19 2006-12-26 Applera Corporation Methods and compositions for detecting targets
JP4454265B2 (ja) * 2003-08-13 2010-04-21 アークレイ株式会社 融解曲線解析法
US20050053950A1 (en) 2003-09-08 2005-03-10 Enrique Zudaire Ubani Protocol and software for multiplex real-time PCR quantification based on the different melting temperatures of amplicons
EP2351766B1 (en) * 2004-10-18 2014-12-03 Brandeis University Methods for nucleic acid amplification
KR20080037128A (ko) 2006-10-25 2008-04-30 주식회사 씨젠 뉴클레오타이드 변이 검출 방법
WO2009081965A1 (ja) * 2007-12-26 2009-07-02 Arkray, Inc. 融解曲線解析方法および融解曲線解析装置
US8039215B2 (en) 2009-03-10 2011-10-18 Roche Molecular Systems, Inc. Multiplex quantitative nucleic acid amplification and melting assay
AR077841A1 (es) * 2009-08-11 2011-09-28 Univ Brandeis Metodos kits y composiciones de deteccion de acido nucleico a multiples temperaturas, con sonda unica
JP5843501B2 (ja) * 2010-07-07 2016-01-13 アークレイ株式会社 核酸の存在比測定装置、核酸の存在比測定方法、核酸の存在比測定プログラム、判定方法、及び核酸の存在比測定キット
GB201100150D0 (en) 2011-01-06 2011-02-23 Epistem Ltd Mutational analysis
AU2015203677B2 (en) * 2011-01-11 2016-06-23 Seegene, Inc. Detection of Target Nucleic Acid Sequences by PTO Cleavage and Extension
KR20120105811A (ko) * 2011-03-16 2012-09-26 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단 및 연장-의존적 시그널 발생에 의한 타겟 핵산서열의 검출
US11078525B2 (en) 2011-03-29 2021-08-03 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by PTO cleavage and extension-dependent cleavage
KR20130101952A (ko) 2012-02-02 2013-09-16 주식회사 씨젠 Ｐｔｏ 절단과 연장-의존적 혼성화를 이용한 타겟 핵산서열의 검출
US9683259B2 (en) 2012-04-19 2017-06-20 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequence by PTO cleavage and extension-dependent signaling oligonucleotide cleavage
WO2015147370A1 (en) * 2014-03-28 2015-10-01 Seegene, Inc. Detection of target nucleic acid sequences using different detection temperatures
JP6688318B2 (ja) 2015-05-01 2020-04-28 ジェン−プローブ・インコーポレーテッド 多重侵入切断アッセイ
EP3305912B1 (en) 2015-06-04 2021-10-06 Mizuho Medy Co., Ltd. Kit for together detecting multiple target nucleic acids differing from each other and detection method using the same
IL259466B (en) * 2015-11-20 2022-09-01 Seegene Inc A method for calibrating a target analyte data set
WO2017105104A1 (en) 2015-12-15 2017-06-22 Seegene, Inc. Signal extraction for a target nucleic acid sequence
KR101961642B1 (ko) 2016-04-25 2019-03-25 (주)진매트릭스 절단된 상보적인 태그 절편을 이용한 표적 핵산 서열 검출 방법 및 그 조성물
WO2017209563A1 (en) * 2016-06-02 2017-12-07 Seegene, Inc. . Method for detecting a target analyte in a sample using a signal change-amount data set
KR102468174B1 (ko) 2016-09-15 2022-11-17 에프. 호프만-라 로슈 아게 멀티플렉스 pcr 수행 방법
EP3688760A4 (en) 2017-09-28 2021-07-14 Seegene, Inc. METHOD AND DEVICE FOR ANALYSIS OF A TARGET ANALYTE IN A SAMPLE
WO2019066461A2 (en) 2017-09-29 2019-04-04 Seegene, Inc. DETECTION OF TARGET NUCLEIC ACID SEQUENCES BY CLEAVAGE ANALYSIS AND EXTENSION OF PTO

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102959092A (zh) * 2011-01-11 2013-03-06 Seegene株式会社 借助于探测和标记的寡核苷酸切割以及延长试验的靶核酸序列检测
CN107208139A (zh) * 2014-12-09 2017-09-26 Seegene株式会社 与靶核酸序列有关的信号的分辨
CN107208134A (zh) * 2014-12-09 2017-09-26 Seegene株式会社 使用不同检测温度及基准值的靶核酸序列检测

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Multiplex detection and SNP genotyping in a single fluorescence channel;Guoliang Fu, Andrea Miles, Luke Alphey;《PLoS One》;第7卷(第1期);1-8 *
电化学生物传感器中的信号放大技术的研究进展;谢顺碧;袁若;;《化学传感器》(第02期);16-30 *

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