CN110475871B - 用于确定靶核酸序列的存在的分析信号 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法。本发明可有助于显著改善使用不同检测温度及基准值检测靶核酸序列的方法。本发明可通过去除或调整可影响靶核酸序列的检测的信号区域，以更准确、有效、可重现的方式检测靶核酸序列。

Description

用于确定靶核酸序列的存在的分析信号
技术领域
本发明涉及从在相对高温检测温度及相对低温检测温度下检测的信号提供用于确定靶核酸序列的存在的分析信号的方法。
背景技术
为了检测靶核酸序列，作为实时检测方式广泛利用以一边监控靶扩增，一边检测靶核酸序列的实时检测方法。实时检测方法一般使用与靶核酸序列特异性杂化的已标记的探针或引物。作为利用标记的探针与靶核酸序列之间的杂化的方法的例有利用具有发夹结构的双重标记的探针的分子信标(Molecular beacon)方法(Tyagi et al.，NatureBiotechnology v.14MARCH 1996)、HyBeacon方法(French DJ et al.，Mol.Cell Probes，15(6)：363-374(2001))、利用分别标记成供体及受体的两个探针的杂化探针方法(Bernadet al，147-148Clin Chem2000；46)及使用单一标记的寡核苷酸的Lux方法(美国专利第7537886号)。在本技术领域中广泛利用TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)，上述TaqMan方法利用借助双标记的探针和脱氧核糖核酸(DNA)聚合酶的5‘-核酸酶活性的上述探针的切割。
作为利用标记的引物的方法的例有日出(Sunrise)引物方法(Nazarenko et al，2516-2521Nucleic Acids Research，1997，v.25no.12，及美国专利第6117635号)、蝎形(Scorpion)引物方法(Whitcombe et al，804-807，Nature Biotechnology v.17AUGUST1999及美国专利第6326145)及TSG引物方法(WO 2011/078441)。
作为替代方案，提出使用靶核酸序列的存在时形成的二聚物的实时检测方法，例如，侵入物(Invader)分析(美国专利第5691142号、第6358691号及第6194149号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTO cleavage AND extension，PTOCE)方法(WO第2012/096523号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂化(PTO Cleavage andExtension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization，PCE-SH)方法(WO第2013/115442号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂化(PTO Cleavage andExtension-Dependent Non-Hybridization，PCE-NH)方法(WO2014/104818)。
上述的现有实时检测技术在与靶扩增相关或无关的信号扩增工序中，在一个所选择的检测温度下检测从荧光标记产生的信号。根据现有实时检测技术，当在一个反应管中利用单一类型的标记来检测多个靶核酸序列时，互不分辨针对靶核酸序列产生的多个信号。因此，为了检测多个靶核酸序列，在现有实时检测技术中一般利用不同类型的标记。在利用单一类型的标记的情况下，利用Tm值差异的解链分析可检测多个靶核酸序列。但是，解链分析的进行时间长于实时技术进行时间，且随着靶核酸序列的增加，使具有不同的Tm值的探针的设计变得越来越困难。
因此，若开发不依赖于解链分析且在单一反应容器中使用单一类型的标记及单一类型的检测器来检测多个靶核酸序列的新方法或接近法，则能够以便利性、费用效果及效率性显著提高的方式检测多个靶核酸序列。并且，上述新方法与其他检测方法(例如，解链分析)的组合，能够以效率显著提高的方式在单一反应容器中使用单一类型的标记检测多个靶核酸序列。
为此，本发明人公开了在单一反应容器中通过使用单一类型检测器来检测多个靶核酸序列的方法(WO第2015/147412号)。在上述方法中，可根据相对高温检测温度下检测的信号及相对低温检测温度下检测的信号之间的差异来确定具有相对低温检测温度的靶核酸序列的存在。尤其，基于在相对低检测温度及相对高检测温度下的信号的强度互不相同的发现，本发明人导入反映在不同检测温度下信号的变化关系的基准值，获得相对高温检测温度及相对低温检测温度下的信号之间的差异。
典型地，使用仅包含具有相对高检测温度的靶核酸序列的对照组样品，通过重复实验获得特定范围的值后，在上述获得的值中选择适当的值来预先确定基准值。但是，观察到选择不适当的基准值可能导致一些反应中的错误结果。
因此，需要开发提供用于以更加准确的方式确定靶核酸序列的存在的分析信号的新方法，以使没有这种错误的结果。
在本说明书全文中，参考了多篇专利及文献，并用括号提供了其引用。为了更加明确地说明本发明及本发明所属技术领域，这种专利及文献的内容全部插入于本说明书作为参照。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供一种用于确定靶核酸序列的存在的分析信号的方法。
本发明的再一目的在于，提供一种计算机可读存储介质，包含用于实现处理器的指令，上述处理器执行用于提供样品中与靶核酸序列有关的分析信号的方法。
本发明的另一目的在于，提供一种用于提供为确定靶核酸序列的分析信号的装置。
本发明的还有一目的在于，提供一种储存于计算机可读存储介质计算机程序，实现用于执行用于提供为确定靶核酸序列的存在的分析信号的方法。
通过发明要求保护范围及附图和下述详细说明更加明确本发明的其他目的及优点。
附图说明
图1至图4为示出用于提供为确定靶核酸序列的存在的分析信号的本发明的实例100、实例200、实例300及实例400的流程图。
图5为示出根据使用探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应(PCR)方法的MuDT1技术(参照WO第2015/147412号)，在60℃及72℃的不同检测温度下癌检测与含100fg的淋病奈瑟菌(NG)的基因组脱氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原体(CT)的基因组脱氧核糖核酸、100fg的淋病奈瑟菌及10pg的沙眼衣原体的混合物及NTC(非靶对照组)的样品有关的信号。
图6A为示出使用式I-1从含10pg的沙眼衣原体靶的样品中提取与淋病奈瑟菌靶有关的信号的例。
图6B为示出从图6A的所提取的信号获得用于确定靶核酸序列的存在的多种分析信号的本发明的四种实例(中间左侧；中间右侧；下部左侧；上部右侧)。
图7A为示出使用式I-1的从含100fg的淋病奈瑟菌及10pg的沙眼衣原体靶的样品中提取与淋病奈瑟菌靶有关的信号的例。
图7B为示出从图7A的所提取的信号获的用于确定靶核酸序列的存在的多种分析信号的本发明的四种实例(中间左侧；中间右侧；下部左侧；上部右侧)。
图8A至图8D为示出从图5中的信号使用多种基准值(1.15、1.50、2.00或2.50)及式I-1获得的与淋病奈瑟菌靶的有关的所提取的信号(左列)，以及从根据本发明的实例200所提取的信号获得的与淋病奈瑟菌靶有关的分析信号(右列)。用箭头表示每个所提取的信号中的最小周期(具有最小信号值的周期)。
图9为示出根据使用TaqMan实时聚合酶链式反应方法的MuDT2技术(参照WO第2016/093619号)，在60℃及72℃的不同检测温度下检测的与含10pg的淋病奈瑟菌的基因组脱氧核糖核酸、1pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸、10pg的淋病奈瑟菌及1pg的沙眼衣原体的混合物及NTC(非靶对照组)的样品有关的信号。
图10A至图10D为示出从图9中的信号使用基准值(6.50、6.00、5.50或5.00)及式I-4获得与淋病奈瑟菌靶有关的所提取的信号(左列)，以及从根据本发明的实例200所提取的信号获得的与关淋病奈瑟菌靶有关的分析信号(右列)。用箭头表示每个所提取的信号中的最小周期。
图11A至图11D为示出从图9中的信号使用多种基准值(1.80、2.50、3.00或3.50)及式I-1获得的与沙眼衣原体靶有关的所提取的信号(左列)，以及从根据本发明的实例200所提取的信号获得的与沙眼衣原体靶有关的分析信号(右列)。用箭头表示每个所提取的信号中的最小周期。
图12为示出从图9中的信号使用多种基准值(1.80、2.50、3.00或3.50)及式I-2获得的与沙眼衣原体靶有关的所提取的信号(左列)，以及根据本发明的实例200所提取的信号获得的与沙眼衣原体靶有关的分析信号(右列)。用箭头表示每个所提取的信号中的最大周期(具有最大信号值的周期)。
具体实施方式
I.提供用于确定靶核酸序列的存在的分析信号
在本发明的一实施方式中，提供一种提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，包括：步骤a，在单一反应容器中，与能够产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构及能够产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构一起培养样品，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下通过单一类型检测器来检测信号；上述培养通过信号产生过程来进行；上述检测在信号产生过程的一个以上的周期中进行，从而分别在一个以上的周期中获得信号值；由上述两个信号产生机构产生的两种信号不被单一类型的检测器分辨；步骤b，通过使用第二基准值对在步骤a中获得的信号值进行加工来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者通过使用第一基准值对在步骤a中获得的信号值进行加工来提取与第二靶核酸序列有关的信号；上述第一基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，上述第二基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值；从使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构的对照组反应确定上述第一基准值，并从使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构的对照组反应确定第二基准值；步骤c，从与上述第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号中选择具有最大信号值或最小信号值的周期；以及步骤d，提供从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值作为用于确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的分析信号。
参照图1至图4的流程图，进一步详细说明本发明：
步骤a：培养及信号检测(S110；S210；S310；S410)
在步骤a中，在单一反应容器中，与可产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构及可产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构一起培养样品。然后，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下通过单一类型检测器来检测信号。
在本文所使用的术语“样品”是指经历本发明的方法的任意物质。尤其，术语“样品”是指含有或推测含有兴趣核酸(第一靶核酸序列及第二靶核酸序列中的一种或所有)的任意物质或者含有或推测含有兴趣靶核酸序列的作为核酸本身的任意物质。进一步地，使用于本文的术语“样品”包括生物学样品(例如，生物来源的细胞、组织及流体)及非生物学样品(例如，饮食、水及土壤)。非限定性地，生物学样品包括病毒、细菌、组织、细胞、血液、血清、血浆、淋巴液、咯痰、拭子(swab)、吸收液、支气管肺泡灌洗液、牛奶、尿液、粪便、眼液、唾液、精液、脑提取物、脊髓液(SCF)、阑尾、脾及扁桃体组织提取物、羊水及腹水。并且，样品可包括与生物学供给源分开的自然存在核酸分子及合成核酸分子。在本文中，样品包括在核酸提取过程中被放的或没有被放的。
使用于本文的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”是指用于分析、检测或定量的兴趣核酸序列。靶核酸序列包括双链及单链序列。靶核酸序列包括最初存在于样品内的序列及在反应中新生成的序列。
靶核酸序列可包含任意脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gDNA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))、核糖核酸(RNA)分子及它们的杂化体(嵌合核酸)。上述序列可以是双链或单链形态。在作为初始物质的核酸为双链的情况下，优选地，将上述两条链制备成单链或部分单链形态。非限定性地，作为用于链分离的公知的方法包括加热、碱、甲酰胺、尿素、及乙二醛处理、酶方法(例如，解旋酶作用)及结合蛋白质。例如，链分离可在80℃至105℃的温度范围下进行加热。这种处理的常规方法由文献[Joseph Sambrook，et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.(2001)]提供。
靶核酸序列包含任何天然原核细胞核酸、真核细胞核酸(例如，原生动物和寄生虫、真菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、EB病毒、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)或类病毒核酸。并且，上述核酸分子可以为通过重组生产或可生产的或者化学生产或可生产的任何核酸分子。因此，可在自然中发现或无法发现核酸分子。
靶核酸序列不应被解释为将序列限制为给定时间内已知的序列或给定时间之后可利用的序列，反而应被解释为包括可利用于现在或未来的某一时间点或者可以知道的序列。即，靶核酸序列在实施本发明时可能是已知的，也可能不是已知的。在未知的靶核酸序列的情况下，在实施本发明的方法之前，可根据现有的测序方法之一来确定其序列。
可使用于本发明的靶核酸序列包括第一靶核酸序列及第二靶核酸序列。术语“第一靶核酸序列”及“第二靶核酸序列”在本文中为了区分两个不同的靶核酸序列而使用。例如，第一靶核酸序列及第二靶核酸序列可以为感兴趣的两个不同的基因、两个不同的基因区域或两个不同的脱氧核糖核酸序列。尤其，第一靶核酸序列来源于一个有机体，相反，第二靶核酸序列可来源于另一个有机体。
在本发明的一实例中，两个靶核酸序列之一包含核苷酸变异，或者两个靶核酸序列之一包含一种类型的核苷酸变异，另一种包含另一种类型的核苷酸变异。
使用于本文的术语“核苷酸变异”是指序列在类似的连续的脱氧核糖核酸片段中特定位置的脱氧核糖核酸序列中的任何单一或多个核苷酸取代、缺失或插入。这种连续的脱氧核糖核酸片段包含一个基因或一个染色体的任何其他部位。这种核苷酸变异可以是突变(mutant)或多态性等位基因变异(polymorphic allele variations)。例如，在本发明中所检测的核苷酸变异包括单一核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism；SNP)、突变(mutation)、缺失、插入、取代及异位。作为核苷酸变异的例，包括人类基因组中的各种突变(例如，亚甲基氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase；MTHFR)基因突变、与病原体耐药性相关的变异及肿瘤形成突变。在本文中所使用的术语“核苷酸变异”包括核酸序列的特定位置中的任何变异。即，术语“核苷酸变异”包括核酸序列的特定位置中的野生型及其任何突变型。
在本发明中，为了获得与靶核酸序列有关的信号与两个信号产生机构一起培养样品(或样品中的靶核酸序列)。
使用于本文的术语“培养的”、“进行培养”或“培养”是指为了相互作用或反应而结合组分。尤其，上述术语是指使本文的组分经历信号产生过程。
使用于本文的术语“信号”是指可进行测定的产物。
信号变化可起到定量或定性示出分析物质(靶核酸序列)或不存在的指标作用。
作为有用的指标的例，包括荧光强度、发光强度、化学发光强度、生物发光强度、磷光强度、电荷传递、电压、电流、电功率、能量、温度、粘度、光散射、放射线强度、反射力、渗透度、吸光度。最广泛使用的指标为荧光强度。
信号包括从信号检测出的各种信号特征，例如，信号强度[例如，在执行RFU(相对荧光单位(relative fluorescence unit))值或扩增的情况下，在特定周期中，在所选择的周期中或最后点中的RFU值]、信号变化形状(或模式)或沙眼衣原体值、或者对上述特征进行数学加工来获得的值。
在一实例中，与基准值或样品分析一起使用的术语“信号”不仅包含在检测温度下获得的信号本身，而且包含通过对上述信号进行数学加工来提供的修饰的信号。
在本发明的一实例中，在通过实时聚合酶链式反应获得扩增曲线的情况下，从扩增曲线选择多种信号值(或特征)并可用于确定靶存在(强度、沙眼衣原体值或扩增曲线数据)。
使用于本文的术语“与第一靶核酸序列有关的信号”及“第二靶核酸序列”分别指表示第一靶核酸序列及第二靶核酸序列的信号。与第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的信号的显著水平表示第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在。相反，信号的不显著水平(例如，背景信号)表示第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的不存在。
信号(尤其，信号强度)可根据其检测温度及所使用的信号产生机构而不同。
在本文中，根据使用信号产生机构的信号产生过程来进行培养。
使用于本文的术语“信号产生过程”是指能够以依赖于样品中靶核酸序列的存在的方式产生信号的任何过程。
使用于本文的术语“信号产生机构”是指表示靶核酸序列的存在的使用于信号的产生的任何物质，例如，包括寡核苷酸、标记及酶。选择性地，使用于本文的术语“信号产生机构”可用来表示使用用于信号产生的物质的任何方法。
尤其，使用于本文的术语“第一信号产生机构”及“第二信号产生机构”是指产生分别与第一靶核酸序列及第二靶核酸序列有关的信号的机构。第一信号产生机构及第二信号产生机构可包括使用于信号产生的共同成分(例如，单一类型的标记及单一类型的酶)或不同的成分(例如，不同类型的寡核苷酸)。尤其，第一信号产生机构及第二信号产生机构的特征在于具有单一类型的标记(相同的标记)。因此，无法根据现有的方法来区分来源于第一信号产生机构的标记的信号与来源于第二信号产生机构的标记的信号。
各种信号产生机构对于本技术领域的技术人员是已知的。信号产生机构包括所有具有标记本身及标记的寡核苷酸。标记包括荧光标记、发光标记、化学发光标记、电化学标记及金属标记。标记本身，例如，嵌入染料可用作信号产生机构。选择性地，单一标记或包含供体分子及收容分子的相互作用性双重标记可用作与至少一种寡核苷酸相结合的形态的信号产生机构。
信号产生机构可包含用于产生信号的额外的成分，如核酸降解酶(例如，5’-核酸酶及3’-核酸酶)。
信号产生过程伴随信号变化。信号变化可起到定量或定性示出靶核酸序列的存在或不存在的指标的作用。
“信号产生过程”的详细内容在本发明人申请的WO第2015/147412号中公开，其教导作为参照整体并入本文。
在一实例中，信号产生过程为信号扩增过程。
在本发明的一实例中，信号产生过程是伴随靶核酸序列的扩增或不伴随扩增的过程。
尤其，信号产生过程是伴随靶核酸分子的扩增的过程。进一步地，信号产生过程是伴随靶核酸分子的扩增且扩增靶核酸分子时可增加或减少信号(尤其，可增加信号)的过程。
使用于本文的术语“信号产生”包括信号的出现或消失及信号的增加或减少。尤其，术语“信号产生”是指信号的增加。
可根据本技术领域的技术人员已知的许多方法来实施信号产生过程。上述方法包括TaqManTM探针方法(美国专利第5210015号)、分子信标方法(Tyagi et al.，NatureBiotechnology，14(3)：303(1996))、蝎形方法(Whitcombe et al.，Nature Biotechnology17：804-807(1999))、日出或Amplifluor方法(Nazarenko et al.，Nucleic AcidsResearch，25(12)：2516-2521(1997)、及美国专利第6117635号)、Lux方法(美国专利第7537886号)、CPT(Duck P，et al.，Biotechniques，9：142-148(1990))、LNA方法(美国专利第6977295号)、Plexor方法(Sherrill CB，et al.，Journal of the American ChemicalSociety，126：4550-4556(2004))、HybeaconsTM(D.J.French，et al.，Molecular andCellular Probes(2001)13，363-374及美国专利第7348141号)、双标记的自淬火的探针(美国专利第5876930号)、杂化探针(Bernard PS，et al.，Clin Chem 2000，46，147-148)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTO cleavage and extension，PTOCE)方法(WO第2012/096523号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂化(PTOCleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization，PCE-SH)方法(WO第2013/115442号)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂化(PTOCleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization，PCE-NH)方法(WO第2014/104818号)及CER方法(WO第2011/037306号)。
在根据TaqManTM探针方法实施信号产生过程的情况下，信号产生机构包括引物对、具有相互作用性双重标记的探针及具有5’->3’核酸酶活性的脱氧核糖核酸聚合酶。在根据探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法实施信号产生过程的情况下，信号产生机构可包括引物对、探测和标记寡核苷酸(Probing and Tagging Oligonucleotide，PTO)、捕获和模板寡核苷酸(Capturing and Templating Oligonucleotide，CTO)及具有5’->3’核酸酶活性的脱氧核糖核酸聚合酶。探测和标记寡核苷酸或捕获和模板寡核苷酸可使用适当的标记来标记。
在一实例中，与靶扩增一起以包括信号扩增的过程来实施信号产生过程。
在一实例中，作为信号产生过程，扩增反应以靶核酸序列的扩增的同时信号扩增的方式来实施(例如，实时聚合酶链式反应)。选择性地，扩增反应不伴随靶核酸分子的扩增并以信号被扩增的方式来实施[例如，CPT方法(Duck P，et al.，Biotechniques，9：142-148(1990))，侵入分析(美国专利第6358691号及第6194149号)]。
已知扩增靶核酸分子的多种方法，非限制性地，包括聚合酶链式反应(polymerasechain reaction)、连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR，参照Wiedmann M，etal.，"Ligase chain reaction(LCR)-overview and applications."PCR methods andApplications 1994Feb；3(4)：S51-64)、间隙填充连接酶链反应(gap filling LCR，GLCR，see WO第90/01069号，EP第439182号及WO第93/00447号)、Q-beta(参照Q-beta replicaseamplification，Cahill P，et al.，Clin Chem.，37(9)：1482-5(1991)，美国专利第5556751号)、链置换扩增(strand displacement amplification，SDA，参照G T Walker et al.，Nucleic Acids Res.20(7)：16911696(1992)，EP第497272号)、依赖核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA，参照Compton，J.Nature 350(6313)：912(1991))、转录介导的扩增(Transcription-Mediated Amplification，TMA，参照Hofmann WP et al.，J Clin Virol.32(4)：289-93(2005)；美国专利第5888779号)或滚环扩增(Rolling Circle Amplification，RCA，参照Hutchison C.A.et al.，Proc.NatlAcad.Sci.USA.102：1733217336(2005))。
培养样品后，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下检测两个信号产生机构(即，第一信号产生机构及第二信号产生机构)中的信号。
本发明根据检测温度，可通过使用任何类型的信号产生机构来实施。将两个信号产生机构之一设计成靶核酸序列存在时均在两个检测温度下提供信号，另一种可设计成对应的靶核酸序列的存在时仅在相对低温检测温度下提供信号。选择性地，可将两个信号产生机构设计成以靶核酸序列存在时均在两个检测温度下提供信号。
在一实例中，通过考虑根据信号产生机构来产生信号的温度范围来预先确定检测温度。检测温度包括相对高温检测温度(例如，72℃)及相对低温检测温度(例如，60℃)。
在一实例中，相对高检测温度为可产生具有相对高检测温度的与靶核酸序列有关的信号的温度，相对低检测温度为均可产生具有相对低检测温度的与靶核酸序列有关的信号及具有相对高检测温度的与靶核酸序列有关的信号的温度。
在再一实例中，相对高温检测温度及相对低温检测温度为可均可产生具有相对低检测温度的与靶核酸序列有关的信号及具有相对高检测温度的与靶核酸序列有关的信号的温度。
本发明的一个特征为在不同的检测温度下通过检测示出两个靶核酸序列的存在的信号来区分并确定两个靶核酸序列的存在。
在一实例中，通过考虑根据信号产生机构产生信号的温度范围来预先确定与靶核酸序列有关的检测温度。
本发明基于存在以依赖于信号产生机构的方式产生信号的特定温度范围的事实。
例如，在两个核酸分子之间杂化(或结合)时信号产生机构产生信号且它们之间的非杂化(或解离)时不产生信号的情况下，在可使两个核酸分子之间杂化的温度下产生信号，但是在两个核酸分子之间非杂化的温度下不产生信号。像这样，存在产生信号(即，信号检测)的特定温度范围和不产生信号的其他温度范围。上述温度范围受使用于信号产生机构的两个核酸分子的杂化体的Tm值影响。
可通过考虑两个温度范围来确定与各个靶核酸序列有关的检测温度。相对高检测温度可选自前者的温度范围，上述相对高检测温度分配至第一靶核酸序列。相对低温检测温度可选自后者的温度范围，上述相对低温检测温度分配至第二靶核酸。
本发明的重要的技术特征在于，通过分析所有相对高检测温度下的信号及相对低检测温度下的信号来提取与第二靶核酸序列有关的信号或与第一靶核酸序列有关的信号。
信号的检测在检测器，尤其，在单一类型的检测器下进行。
使用于本文的术语“单一类型检测器”是指用于检测单一类型的信号的机构。在包括用于获得几种类型的信号的几个通道(例如，光二极管)的检测器中，各个通道(例如，光二极管)对应于“单一类型检测器”。
在本发明的一实例中，两个信号产生机构包括相同的标记，上述标记中的信号不会被单一类型的检测器分辨。
在信号产生过程的一个以上的周期中实施在相对高温检测温度及相对低温检测温度下从两个信号产生机构中的信号的检测，从而分别在一个以上的上述周期中获得信号值。
使用于本文的术语“周期”是指伴随状态变化的多个测定中状态的变化单位。例如，状态的变化包括温度、反应时间、反应次数、浓度、pH和/或靶核酸分子序列的复制次数的变化。因此，周期可包括时间或过程周期、单位运行周期及复制周期。例如，等温扩增在等温条件下反应时间的过程中对样品可进行多个测定，反应时间可对应于状态变化且反应时间的单位可对应于周期。
尤其，当重复一系列反应或者以规定时间间隔重复反应时，术语“周期”是指上述重复单位。
例如，在聚合酶链式反应中，周期是指反应单位，包括靶分子变性、靶分子与引物之间的退火(杂化)及引物延伸。反应的重复的增加可对应于状态变化且重复单位可对应于周期。
非限定性地，实施检测的周期的数包括1-5、1-10、1-20、1-25、1-30、1-35、1-40、1-45、1-50、1-55及1-60。在多个周期中实施检测的情况下，周期可以是顺序周期或无序周期。
信号的检测在信号产生过程的各周期中提供信号值。使用于本文的术语“信号值”是指在信号产生过程的各周期中实际测定的信号值(例如，通过扩增反应处理的荧光强度的实际值)或其修饰的值。上述修饰的值还可包括测定的信号值(例如，强度)的数学加工的值。测定的信号值的数学加工的值的例可包括测定的信号值的对数值及导函数。使用于本文的术语“信号”旨在包括术语“信号值”，因此可互换使用这些术语。
通过两个信号产生机构产生的信号不会被单一类型的检测器分辨。术语“会被单一类型的检测器分辨的信号”是指信号因这些相同或者实际上相同的信号特性(例如，光学特性、发光波长及电信号)而不会被单一类型的检测器分辨。
使用于本文的术语“单一类型的信号”是指提供相同或者实际上相同的信号特性(例如，光学特性、发光波长及电信号)的信号。例如，FAM及CAL Fluor 610提供不同类型的信号。
信号提供由信号产生过程产生的数据集。使用于本文的术语“数据集”是指一组数据点。使用于本文的术语“数据点”是指包括周期与上述周期中的信号值的坐标值。在信号产生过程中获得的数据点由直角坐标系统中的坐标值绘制，从而可提供曲线(例如，扩增曲线)。上述曲线可以为拟合或正规化的(例如，减去基线的)曲线。尤其，被检测出的信号根据周期来绘制。
在特定实例中，在信号、及其数据集、数据点及曲线中减去基线。
步骤b：用于提取与靶核酸序列有关的信号的信号值的加工(S120；S220；S320；S420)
然后，通过使用第二基准值对在步骤a中获得的信号值进行加工来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者使用第一基准值对在步骤a中获得的信号值进行加工来提取与第二靶核酸序列有关的信号。
使用于本文的术语“基准值”描述当在不同检测温度(即，相对高温检测温度及相对低温检测温度)下产生两个信号时，尤其，在数值上的信号的变化、信号变化或信号差异关系或程度。换句话说，“基准值”包括反映在不同检测温度下的信号变化的模式(规则)的任何值。并且，术语“基准值”是指示出对于特定靶核酸序列在相对高检测温度下检测的信号及在相对低检测温度下检测的信号之间的变化程度的值。基准值可以是指为了将在一种温度下检测的信号改变、转换、调节或修饰为另一种温度下的信号而使用的值基准值可根据靶核酸序列的类型、信号产生机构的类型及培养及检测的条件而不同。因此，对于不同或相同的靶核酸序列可确定多种基准值。
基准值可由多种方式表达。例如，基准值可由具有数值值、信号的存在/不存在或具有信号特征的结构表达。
术语“基准值”在本文中进一步描述为“第一基准值”或“第二基准值”。在上述术语中，术语“第一”及“第二”分别用来区分与第一靶核酸序列及第二靶核酸序列有关的基准值。
尤其，如本文所使用，术语“第一基准值”及“第二基准值”分别是指作为与第一靶核酸序列有关的预先确定的基准值及与第二靶核酸序列有关的预先确定的基准值分别用于步骤b中的第二靶核酸序列的信号提取及第一靶核酸的信号提取的基准值。
进一步地，第一基准值为示出在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的两个信号的变化关系的值，第二基准值为示出在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的两个信号的变化关系的值。
在一实例中，可通过考虑所选择的周期中的信号值来确定基准值。即，可通过考虑选自在相对高温检测温度及相对低温检测温度下检测的信号中的周期中的信号值来确定基准值。在此情况下，上述所选择的周期为扩增曲线的基线区域后的周期之一，尤其是停滞期区域的周期之一，进一步地可以是最后周期。
在选择性的实例中，可通过考虑不同的所选择的周期中的多个信号值来确定基准值。例如，可通过考虑不同的所选择的周期中的多个信号值的平均来确定基准值。
下面，详细说明基准值。
与信号产生机构一起培养相应的靶核酸序列，并在相对高温检测温度及相对低温检测温度下检测信号后，获得在相对高温检测温度及相对低温检测温度下检测的信号的变化关系，从而可预先确定基准值。
在一实例中，通过使用对应于核酸序列的标准物质来预先确定基准值。
在一实例中，从对照组反应预先确定初始基准值。例如，从使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构的对照组反应预先确定第一基准值，从使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构的对照组反应预先确定第二基准值。
在一实例中，含可通过使用相应的靶核酸序列的对照组样品来预先确定基准值。例如，可通过使用含第一靶核酸序列的对照组样品来预先确定第一基准值，可通过使用含第二靶核酸序列的对照组样品来预先确定第二基准值。
通过在各种条件(例如，靶核酸序列的浓度及引物的类型)下对对照组反应(或对照组样品)进行重复反应来获得特定范围的值，可通过从上述获得的值中选择适当的值来预先确定基准值。
在一实例中，能够以除去不会被所提取的与靶核酸序列有关的信号的方式选择基准值。在再一实例中，能够以不除去或尽可能少除去被所提取的与靶核酸序列有关的信号的方式选择基准值。在另一实例中，能够以除去不会被所提取的与靶核酸序列有关的信号且不除去或尽可能少除去被所提取的与靶核酸序列有关的信号的方式选择基准值。
例如，在通过使用第二基准值来提取与第一靶核酸序列有关的信号的情况下，能够以除去与第二靶核酸序列有关的信号且不除去与第一靶核酸序列有关的信号的方式选择第二基准值。
更具体地，靶核酸序列包含“沙眼衣原体”及“淋病奈瑟菌”，在需要提取与“淋病奈瑟菌”有关的信号的情况下，能够以完全除去与沙眼衣原体有关的信号且不除去或尽可能少除去与淋病奈瑟氏菌有关的信号的方式选择与沙眼衣原体有关的基准值。
可通过重复实验以经验获得基准值。
基准值可选自通过重复实验以经验获得的特定范围中。与此相关，在上述范围中选择相对高的值作为基准值是有利的，因为与相对低的基准值相比，相对高的基准值除去不想提取的信号的可能性更高。例如，在获得1.1至1.50的范围的情况下，约1.50的值可能更适合作为基准值。选择性地，大于上述范围的值可被选为基准值。例如，大于上述范围的上限5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的值可被选为基准值。但是，要注意过高的基准值是不理想的，因为过高的基准值反而有可能除去所要提取的信号。
在一实例中，可根据在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号间的差异来计算基准值。
在一实例中，可通过对在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号进行数学加工来计算基准值。
在特定实例中，数学加工包括使用来源于信号或上述信号的其他值的计算(例如，加法、减法、乘法及除法)。
在本发明的一实例中，用于获得基准值的信号的数学加工是在相对低温检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号与在相对高温检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号之比的计算。在本发明的一实例中，用于获得基准值的信号的数学加工是在相对高温检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号与在相对低温检测温度下由相应的信号产生机构提供的信号之比的计算。
上述比率可以为在相对低温检测温度下检测的信号的一个周期中的信号值与在相对高温检测温度下检测的信号的上述周期中的信号值之比。选择性地，上述比率可以为在相对高温检测温度下检测信号的一个周期中的信号值与在相对低温检测温度下检测信号的一个周期中的信号值之比。用于比率计算所选择的周期可以为扩增曲线的基线区域后的周期之一。尤其，用于比率计算的周期可以为停滞期区域中的周期之一。进一步地，用于比率计算的周期可以为最后周期。
在一实例中，基准值可由几个周期，例如，连续的两个周期，三个周期、四个周期、五个周期等中之比的平均计算。并且，可通过考虑几个周期中之比来适当选择基准值。例如，基准值可选择略高于选择周期中的信号值之比或几个周期中的信号值之比的值。
在特定实例中，可根据数学式II计算基准值：
式II：与靶有关的基准值＝[仅含有靶的与样品有关的相对低温下的信号]÷[仅含有靶的与样品有关的相对高温下的信号]
用于获得基准值值的数学加工可以由多种方式进行。可通过使用机械来进行数学加工。例如，在检测器或实时聚合酶链式反应装置中可通过处理器对信号进行数学加工。选择性地，可根据预先确定的算法以手动对信号进行数学加工。
在本发明的一实例中，用于基准值的信号产生机构可与步骤a的信号产生机构相同。
在一实例中，步骤b中信号值的加工如下进行，即，从在步骤a中获得的信号中根据第二基准值去除与第二靶核酸序列有关的信号或者从步骤a中获得的信号中根据第一基准值去除与第一靶核酸序列有关的信号。
进一步地，由第二信号产生机构产生的信号的去除是从在步骤a中获得的信号数学上去除与第二靶核酸序列有关的信号，由第一信号产生机构产生的信号的去除是从在步骤a中获得的信号数学上去除与第一靶核酸序列有关的信号。
进一步地，由第二(或第一)信号产生机构产生的信号的去除是从在相对低温下检测的信号数学上去除与第二(或第一)靶核酸序列有关的信号，或者从在相对高温下检测的信号数学上去除与第二(或第一)靶核酸序列有关的信号。
本发明人通过使用不同的检测温度来开发对样品中多个靶核酸序列进行检测的两项技术。在前项技术中，第一信号产生机构在所有相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号，并且第二信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号(参照WO第2015/147412号)。在后项技术中，所有第一信号产生机构及第二信号产生机构在所有相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号(参照WO第2016/093619号)。前项及后项技术分别被称为MuDT1及MuDT2。
在将本发明适用于MuDT1技术(参照WO第2015/147412号)的情况下，本发明可以如下实施：
在一实例中，第一信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号，在步骤b中信号值的加工包括通过使用第一基准值对信号值进行数学加工来从在步骤a中获得的在相对低温检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。
进一步地，可通过下述数学式I-1来实施与第二靶核酸序列有关的信号的提取：
式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号)×(第一基准值)]；
在上述式中，第一基准值为在相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对高温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号之比。
在本文中所记载的数学式中，符号“－”为减法，尤其，表示减去信号。例如，减去信号可通过从在一个信号中一个周期中的信号值减去在另一周期中相应的周期中的信号值来在各个周期中进行。
在本文中记载的数学式中，符号“×”表示乘法。
在本文中记载的数学式中，符号“÷”表示除法。
在根据数学式I-1的与第二靶核酸序列有关的信号的提取，在相对低温检测温度下检测的信号反映与第一靶核酸序列有关的信号及与第二靶核酸序列有关的信号的组合，相反，在相对高温检测温度下检测的信号仅反映与第一靶核酸序列有关的信号。因此，在假设在相对高温检测温度及相对低温检测温度下与第一靶核酸序列有关的信号不变的情况下，可从在相对低温检测温度下检测的信号减去在相对高温检测温度下检测的信号来获得与第二靶核酸序列有关的信号。但是，当考虑信号根据检测温度而异时，在减去信号之前，有必要将在相对高温检测温度下检测的信号调整(转换)为在相对低温检测温度下预期的信号。为此，使用第一基准值。
在选择性的实例中，第一信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号，在步骤b中信号值的加工包括通过使用第一基准值对信号值进行数学加工来从在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。
进一步地，根据数学式I-2实施与第二靶核酸序列有关的信号的提取：
式I-2：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号)÷(第一基准值)]；
在上述式中，第一基准值为在相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对高温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号之比。
在MuDT1技术中，在相对高温检测温度下检测的信号可被视为与第一靶核酸序列有关的所提取的信号，因为与第一靶核酸序列有关的信号仅在相对高温检测温度下被检测到。
在数学式I-1及数学式I-2中，第一基准值由在相对低温检测温度下的信号与在相对高温检测温度下的信号之比表示。本技术领域的技术人员应理解，使用在相对高温检测温度下的信号与相对低温检测温度下的信号之比表示的第一基准值，可通过进行一定的修饰来提取与第二靶核酸序列有关的信号提取。本技术领域的技术人员应理解这种修饰属于本发明的主旨及范围内。
在将本发明适用于MuDT2技术(参照WO第2016/093619号)的情况下，本发明可以如下实施：
在一实例中，两个信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号。
在一实例中，在第二基准值大于第一基准值的情况下，(i)在步骤b中信号值的加工包括通过第一基准值从相对低温检测温度下的信号以数学方式提取与第二靶核酸序列有关的信号的步骤；或者(ii)在步骤b中信号值的加工包括通过使用第一基准值从步骤a中在相对高温检测温度下的信号以数学方式提取与第二靶核酸序列有关的信号的步骤；或者(iii)在步骤b中信号值的加工包括通过使用第二基准值从相对低温检测温度下的信号以数学方式提取与第一靶核酸序列有关的信号的步骤；或者(iv)在步骤b中信号值的加工包括通过使用第二基准值从步骤a中相对高温检测温度下的信号以数学方式提取与第一靶核酸序列有关的信号的步骤。
进一步地，通过第一基准值从相对低温检测温度下的信号中提取与第二靶核酸序列有关的信号是由下述数学式I-1进行；通过第二基准值从相对高温检测温度下的信号中提取与第二靶核酸序列有关的信号是由下述数学式I-2进行；通过第二基准值从相对低温检测温度下的信号中提取与第一靶核酸序列有关的信号是由下述数学式I-3进行；或者，通过第二基准值从相对高温检测温度下的信号中提取与第一靶核酸序列有关的信号是由下述数学式I-4进行：
式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号)×(第一基准值)]；
式I-2：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号)÷(第一基准值)]；
在上述式中，第一基准值为在相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对高温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号之比；
式I-3：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号)×(第二基准值)]；
式I-4：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对高温检测温度下信号]－[(在步骤a中获得的相对低温检测温度下信号)÷(第二基准值)]；
在上述式中，第二基准值为在相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号与在相对高温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号之比。
当参照数学式I-3时，在相对低温检测温度及相对高温检测温度下检测的各个信号反映与第一靶核酸序列有关的信号及与第二靶核酸序列有关的信号的组合。假设第二基准值大于第一基准值，相对高温检测温度下的信号与第二基准值的相乘将与第二靶核酸序列有关的信号(包括在相对高温检测温度下检测的信号)转换为预期在相对低温检测温度下检测的信号。并且，上述乘法将与第一靶核酸序列有关的信号(包括在相对高温检测温度下检测的信号)转换为大于预期在相对低温检测温度下检测的信号的信号。因此，可通过从在相对低温检测温度下检测的信号减去上述转换的信号来提取第一靶核酸序列的信号提取，因为这种减法去除与第二靶核酸序列有关的信号。
在式I-1、式I-2、式I-3及式I-4中，基准值由在相对低温检测温度下的信号与在相对高温检测温度下的信号之比表示。本技术领域的技术人员应理解，使用在相对高温检测温度下的信号与在相对低温检测温度下的信号之比表示的基准值，并可通过修饰来提取信号。本技术领域的技术人员应理解这种修饰属于本发明的主旨及范围内。
应注意，数学式I-1及数学式I-2均共同使用MuDT1技术及MuDT2技术；相反，数学式I-3及数学式I-4仅使用于MuDT2技术。因此，在根据本发明的方法适用数学式之前，必须确认实施了两项技术中的哪一个。
为了确定靶核酸序列的存在使用提取的信号时，当使用不适当的基准值时可导致假阳性或假阴性结果。为了克服此问题，本发明的方法仅提供特定区域作为用于确定核酸序列的存在的分析信号。
步骤c：具有最大或最小信号值的周期的选择(S130；S230；S330；S430)
在步骤c中，从第一靶核酸序列或与第二靶核酸序列有关的所提取的信号选择具有最大信号值或最小信号值的周期。
有趣的是，本发明人发现，具有最大信号值的周期(在本文中也被称为“最大周期”)或具有最小信号值的周期(在本文中也被称为“最小周期”)是用于分析所提取的信号，尤其是分析错误提取的信号的重要指标。
基于这些发现，具有最大信号值或最小信号值的周期用作用于分辨靶相关信号区域和靶无关信号区域的基准点。
如本文所用，术语“靶相关信号区域”是指在确定兴趣靶核酸序列的存在或不存在时被认为是显着的已提取信号的区域，因为上述区域包含与靶核酸序列相关的正确的信号。因此，“靶相关信号区域中的信号”用作用于确定靶核酸序列的存在/不存在的分析信号。
如本文所用，术语“靶无关信号区域”是指在确定兴趣靶核酸序列的存在或不存在时被认为可忽略的已提取信号的区域，因为上述区域包含与靶核酸序列无关的错误的信号。因此，“靶无关信号区域中的信号”用作用于确定靶核酸序列的存在/不存在的分析信号。
为了更好地理解当分析提取的信号时具有最大信号值或最小信号值的周期的作用，讨论了本发明的例示性实例，包括信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程和根据使用数学式I-1的MuDT1技术的提取过程。
在例示性的实例中，在使用第一靶核酸序列的适当的基准值的情况下，与第二靶核酸序列有关的所提取的信号可以示出(i)增加的模式或(ii)实际上为0，但是，在适用第一靶核酸序列的不适当的基准值的情况下，可示出产生的所提取的信号的全部或部分减少的模式。
通过考虑上述模式，具有最小信号值的周期可在解释所提取的信号，尤其是错误提取的信号中起重要作用。
典型地，具有最小信号值的周期可以是从信号减少的模式(即，向下模式)变为增加的模式(即，向上模式)的变曲点。
基于上述推理，示出减少的模式的具有最小信号值的周期之前的区域可被认为是反映错误提取，示出增加模式的具有最小信号值的周期之后的区域可被认为是反映适当的提取。
尤其，在具有最小信号值的周期之前出现的减少的模式表示未被适当地提取至与第二靶核酸序列有关的信号对在相对低温检测温度下的信号有实质贡献的水平(用于适当地提取的预期的水平)为止。
并且，具有最小信号值的周期中的信号值可表示与靶核酸序列有关的信号被提取到最低水平。相反，在具有最小信号值的周期之后出现的增加的模式表示适当提取与靶核酸序列有关的信号(信号值大于RFU 0的情况)或可表示改善或恢复错误提取的信号(信号值小于RFU0的情况)。
因此，在选择具有最小信号值的周期的情况下，示出增加的模式的区域被认为对确定靶核酸序列的存在或不存在显著，这对应于靶相关信号区域。
例如，这种推理可适用于，根据使用数学式I-2的MuDT1技术分析所提取的信号时具有最大信号值的周期的作用。在例示性实例中，在使用与第一靶核酸序列有关的适当的基准值的情况下，与第二靶核酸序列有关的所提取的信号可以示出(i)减少的模式或(ii)实际上为0，但是，在使用与第一靶核酸序列有关的不适当的基准值的情况下，可示出产生的所提取的信号的全部或部分增加的模式。
因此，在选择具有最大信号值的周期的情况下，示出减少的模式的区域被认为是对确定兴趣靶核酸序列的存在或不存在显著，这对应于靶相关信号区域。
在本发明的所有实例中，靶相关信号区域可用于确定靶核酸序列的存在，即使它们包含理论上不可预测的信号模式。可以认为靶相关区域对应于扩增曲线的指数。
应理解，靶相关信号区域可以包括单个周期或多个周期。例如，在最大信号值或具有最小信号值的周期为最后周期的情况下，靶相关信号区域包括一个周期；在最大信号值或具有最小信号值的周期为最后周期意外的任何周期的情况下，靶相关信号区域课包括多个周期。
如本文所用，最大信号值或具有最小信号值的周期可以是指“所选择的周期”或“选择周期”。
上述记载的所选择的周期可以是具有最大信号值(具有最大的信号值)的周期或最小信号值(具有最小的信号值)的周期，这根据使用于步骤b中的信号产生过程及提取过程而不同。
在本发明的一实例中，在与兴趣靶核酸序列有关的适当地提取的信号在样品中靶核酸序列的存在下示出增加的信号模式的情况下，上述记载的所选择的周期可以为具有最小信号值(具有最小的信号值)周期。
在本发明的一实例中，在与兴趣靶核酸序列有关的适当地提取的信号在样品中靶核酸序列的存在下示出减少的信号模式的情况下，记载的所选择的周期可以为具有最大信号值(具有最大的信号值)周期。
在将本发明适用于MuDT1技术(参照WO第2015/147412号)的情况下，所选择的周期可以如下实现：
(i)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最小信号值的周期；
(ii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况改下，所选择的周期可以为具有最大信号值的周期。
代替性地，在将本发明适用于MuDT2技术(参照WO第2016/093619号)且第二基准值大于第一基准值的情况下，所选择的周期可以如下：
(i)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最小信号值的周期；
(ii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最大信号值的周期；
(iii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-3进行与第一靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最大信号值的周期；
(iv)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-4进行与第一靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最小信号值的周期；
(v)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最大信号值的周期；
(vi)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最小信号值的周期；
(vii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-3进行与第一靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最小信号值的周期；
(viii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-4进行与第一靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，所选择的周期可以为具有最大信号值的周期。
所选择的周期的确定可参照图6A及图6B、图7A及7B来例示。
如图6A所示，使用1.50的单一基准值从含10pg的沙眼衣原体靶的样品获得与淋病奈瑟菌靶有关的所提取的信号。然后，分析与淋病奈瑟菌有关的所提取的信号后，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第五十个周期)(图6B；参照上部左侧)。
如图7A所示，使用1.50的单一基准值从含100fg的淋病奈瑟菌靶及10pg的沙眼衣原体靶的样品获得与淋病奈瑟菌靶有关的所提取的信号。然后，分析与淋病奈瑟菌有关的所提取的信号后，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第三十五个周期)(图7B；参照上部左侧)。
在本发明的一实例中，只有在步骤b中所提取的信号错误时，才能选择最大信号值或具有最小信号值的周期。
以下，在下述“基准的使用”部分中详细说明上述实例：
“基准的使用”
在一实例中，在步骤b中准确提取步骤b中与靶核酸序列有关的信号的情况下，可以不选择最大信号值或具有最小信号值的周期，在步骤b中错误提取与靶核酸序列有关的信号的情况下，可选择最大信号值或具有最小信号值的周期。
在图3的300中例示上述实例。
上述实例在步骤b和步骤c之间还包括下述步骤：
步骤bc-1，确认所提取的信号是否满足准确性基准；上述准确性基准是所提取的信号不与阈值相交；
步骤bc-2，若与第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号不满足准确性基准，则进行步骤c，或者若与第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号满足准确性基准，则不进行步骤c，而将所提取的信号作为分析信号提供。
在以下详细说明步骤bc-1及步骤bc-2。
步骤bc-1：错误提取的信号的确认(S325)
在步骤bc-1中，确认所提取的信号是否满足准确性基准，上述准确性基准为所提取的信号不与阈值相交。
具体地，通过分析在步骤b中所提取的信号来确认是否准确或适当地提取。
术语“准确提取的信号”是指示出理论上预测的信号模式的所提取的信号，特别是在MuDT1或MuDT2技术中；术语“错误提取的信号”是指示出理论上未预测的信号模式的所提取的信号，特别是在MuDT1或MuDT2技术中。
当靶核酸序列存在于样品中时，在信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加或减少的常规的信号产生过程的情况下，与靶核酸序列有关的所提取的信号产生增加或减少的模式的可能性高，相反，在靶核酸序列不存在于样品中的情况下，与靶核酸序列有关的所提取的信号产生实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式的可能性高。
因此，在本发明的一实例中，在与兴趣靶核酸序列有关的适当地提取的信号在样品中靶核酸序列的存在下示出增加的信号模式而在样品中靶核酸序列的不存在下示出实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式的情况下，这两种模式被认为是理论上预测的模式，但是偏离这些信号模式的其他模式被认为是理论上未预测的模式。例如，具有小于0的信号值的信号模式可被认为是理论上未预测的模式。
在本发明的另一实例中，在与兴趣靶核酸序列有关的适当地提取的信号在样品中靶核酸序列的存在示出减少的信号模式而在样品中靶核酸序列的不存在下示出实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式的情况下，这两种模式被认为是理论上预测的模式，但是偏离这些信号模式的其他模式被认为是理论上未预测的模式。例如，具有大于0的信号值的信号模式可被认为是理论上未预测的模式。
在本文中应全面解释准确提取的信号及错误提取的信号，即，应注意，必须整体考虑所提取的信号。例如，具有示出理论上未预测的模式的至少一部分的信号被认为是错误提取的信号。
通过使用准确性基准来确认是否准确或适当提取信号。
针对于信号提取，使用于本文的术语“准确性基准”是指用于区分准确提取的信号与错误提取的信号的基准。例如，准确性基准可以指确认所提取的信号是否表示理论上预测的信号模式的基准。准确性基准可以指用于确认用于信号提取的基准值的适当性(准确性)的基准。
只要可以区分准确提取的信号与错误提取的信号，可由本技术领域的技术人员预先确定准确性基准。非限制性地，准确性基准可以为任何值。可根据经验预先确定准确性基准。
在一实例中，通过考虑在信号提取中理论上预测的信号的模式来预先确定准确性基准。
如上所述，信号提取的准确性基于所提取的信号是否满足准确性基准。
即，所提取的信号满足准确性基准的确认表示用于信号提取的基准值的适当性，相反，所提取的信号不满足准确性基准的确认表示用于信号提取的基准值的不适当性。
当考虑使用于步骤b的基准值适当时，所提取的信号表示理论上预测的信号模式的可能性高。例如，假设基准值适当且正常信号示出正值(例如，增加的或增长的模式)或实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式(例如，背景模式)，示出负值(例如，减少的模式)信号是可被确定为错误的。通过采用小于0的任何值作为阈值来适用为了提高这种确定的准确定的准确性基准，并且在所提取的信号具有与阈值相交的信号值的情况下，可以确定所提取的信号是错误的。相反，在示出正值(例如，增加的或增长的模式)的信号理论上是错误的且采用大于0的任何值作为阈值的情况下，具有与阈值相交的信号值的所提取的信号可被确定为是错误的。
可根据预先确定的阈值来例示准确性基准。
在本发明的一实例中，准确性基准是所提取的信号不具有与阈值相交，即所提取的不具有与阈值(或阈值线)相交的信号值。
在第一靶核酸序列或与第二靶核酸序列有关的所提取的满足准确性基准的情况下，不进行步骤c，而提供所提取的信号作为确定各个靶核酸序列的存在/不存在的分析信号。
例如，在所提取的信号不具有与阈值相交的信号值的情况下，结束本发明的方法的步骤。在此情况下，使用基准值提取的信号被认为是准确提取的信号并作为分析信提供。
通过不具有与阈值相交的信号值的所提取的信号来表示的准确性基准包括两个情况：具有大于阈值的信号值的所提取的信号及具有小于阈值的信号值的所提取的信号。
术语“具有大于阈值的信号值的所提取的信号”是指所提取的信号中所有周期中的信号值大于阈值。与此相同，术语“具有小于阈值的信号值的所提取的信号”是指所提取的信号中所有周期中的信号值小于阈值。
例如，在准确性基准为所提取的信号具有大于预先确定的阈值的信号值，且所提取的信号被确定为具有大于预先确定的阈值的信号值的情况下，不进行下一个步骤并提供所提取的信号(从第一个周期到最后周期)作为用于确定靶核酸序列的存在/不存在的分析信号。在准确性基准为所提取的信号具有小于预先确定的阈值的信号值，且所提取的信号被确定为具有小于预先确定的阈值的信号值的情况下，不进行下一个步骤并提供所提取的信号(从第一个周期到最后周期)作为用于确定靶核酸序列的存在/不存在的分析信号。
当本发明的信号提取时，可基于理论上预测的信号模式来预先确定上述阈值。
作为一例，在理论上预测的正常信号模式为正值(例如，增加或增长的模式)或实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式(例如，背景模式)的情况下，阈值可以为任何适当的负值，准确性基准可以为所提取的信号具有大于阈值的信号值。例如，阈值可以为RFU-10、RFU-20、RFU-30、RFU-40、RFU-50、RFU-60、RFU-70、RFU-80、RFU-90、RFU-100、RFU-200、RFU-300或小于其。在此情况下，具有阈值以下的信号值的所提取的信号，即，具有与阈值相交的信号值的所提取的信号可被视为异常提取的信号。
作为另一例，在理论上预测的正常信号模式为负值(例如，减少的模式)或实际上接近0值(例如，RFU 0)的模式(例如，背景模式)的情况下，阈值可以为适当的正值，准确性基准可以为所提取的信号具有小于阈值的信号值。例如，阈值可以为RFU 10、RFU 20、RFU30、RFU 40、RFU 50、RFU 60、RFU 70、RFU 80、RFU 90、RFU 100、RFU 200、RFU 300或大于其，但是并不局限于此。在此情况下，具有阈值以上的信号值的所提取的信号，即，具有与阈值相交的信号值的所提取的信号可以被视为异常提取的信号。
阈值可根据使用于步骤b的信号产生过程及提取过程而不同。
具体地，在将本发明适用于MuDT1技术(参照WO第2015/147412号)的情况下，阈值可以确定如下：
(i)进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为负值；
(ii)进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为正值。
代替性地，在将本发明适用于MuDT2技术(参照WO第2016/093619号)且第二基准值大于第一基准值的情况下，阈值可以如下确定：
(i)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为负值；
(ii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为正值；
(iii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-3进行与第一靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为正值；
(iv)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-4进行与第一靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为负值；
(v)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为正值；
(vi)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为负值；
(vii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-3进行与第一靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为负值；
(viii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-4进行与第一靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，阈值可以为正值。
应适当地选择阈值以避免将正常提取的信号误解为错误提取的信号，例如由于信号噪声或波动引起。
本领域技术人员应理解，使用于本步骤中的阈值不同于用于确定下述靶核酸核酸序列的存在的阈值。
步骤bc-2：步骤的进行或终止的确定
在第一靶核酸序列或与第二靶核酸序列有关的所提取的信号不满足准确性基准的情况下，进行下一个步骤c；在第一靶核酸序列或与第二靶核酸序列有关的所提取的信号满足准确性基准的情况下，方法不进行步骤c，而将所提取的信号作为分析信号提供。
在本步骤中，满足准确性基准的所提取的信号被视为准确提取，因此直接作为分析信号提供。相反，不满足准确性基准的所提取的信号被视为错误提取，因此适用于以下步骤中。
另一方面，通过分析所提取的信号来选择最大或具有最小信号值的周期后，实施下述步骤。
步骤d：提供从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值(S140；S240；S340；S440)
在步骤d中，提供从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为用于确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的分析信号。
如本文所用，术语“分析信号”是指用于确定兴趣靶核酸序列的存在而提供的信号。上述术语还指最终用于确定靶核酸序列的存在而使用的信号。
如上所述，本发明人发现，在确定兴趣靶核酸序列的存在或不存在时，从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值(靶无关区域)可忽略不计，在确定兴趣靶核酸序列的存在或不存在时，从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值(靶相关区域)显著。
基于上述发现，在本步骤中仅提供靶相关区域作为用于确定靶核酸序列的存在的分析信号。
可以对从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值(靶相关区域)进行如下修饰或未进行修饰并作为分析信号提供。
(i)提供未修饰的分析信号
可以将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为分析信号来提供，而无需要修改(图6B及图7B；参照中间左侧)。即，可以将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值本身用作用于确定靶核酸序列的存在的分析信号。
在步骤d中未经修饰的作为分析信号提供的(多个)信号值用于通过本领域熟知的方法确定靶核酸序列的存在。
在一实例中，可以将预先确定的阈值适用于为了确定靶核酸的存在而未经修饰提供的分析信号。
本领域技术人员应理解，步骤d中的阈值不同于用于确认在步骤bc-1中错误提取的信号的阈值。
例如，为了检测阳性信号可以将用于确定靶核酸序列的存在的阈值设定为RFU100，相反，为了检测阴性信号可以将用于确认错误提取的信号设定为RFU-100。
为了确定靶核酸序列的存在，适用于未修饰的分析信号的阈值可通过考虑最大信号值或最小信号值的大小来确定。
具体地，在选择具有最大信号值的周期的情况下，最大信号值越大阈值越大；在选择具有最小信号值的周期的情况下，最小信号值越小阈值越小。
在选择具有最大信号值的周期的情况下，确认最大信号值的大小后，确定相应于上述所确认的大小的阈值；在选择具有最小信号值的周期的情况下，确认最小信号值的大小后，确定相应于预上述确认的大小的阈值。
(ii)提供修饰的分析信号
在将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为分析信号提供之前对其进行修饰后，适用于靶核酸序列的存在的确定(图6B及7B；参照下部左侧)。为此，本方法还包括在将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为分析信号提供之前对其进行修饰的步骤。
如本文所用，“修饰”是指通过使用数学运算(加法、减法、乘法、除法、导数、积分等)将(多个)信号值转换为另一(多个)信号值的过程。
修饰是指在确定靶核酸序列的存在时为改善用户的便利性而进行的过程。
可以对所有提取的信号进行修饰，或者仅在满足特定基准时进行修饰。仅当所选择的周期中的信号值不在特定范围内(例如，约RFU 0)时才能进行修改。例如，在选择具有最大信号值的周期的情况下，只有当所选择的周期具有大于特定值(例如，RFU 0)的信号值时，才能进行修饰。在选择具有最小信号值的周期的情况下，只有所选择的周期具有小于特定值(例如，RFU 0)的信号值的时，才能进行修饰。
可以使用本领域熟知的许多方法进行信号的修饰，只要上述修饰不会对靶核酸序列的存在或不存在的确定产生不利影响。
作为一例，修饰包括向上或乡下移动从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值。
如本文所用，“移动”或“移动的”是指(多个)信号值沿着Y轴以相同的大小垂直移动。
在本发明的一实例中，修饰包括上移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选择的周期具有大于特定值且为0以下的信号值，或者下移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选择的周期具有小于值且为0以上的信号值。
上述特定值可以为接近0的不为0的值，选择性地，在还包括步骤bc-1及步骤bc-2的情况下，上述特定值可以为使用于步骤bc-1的阈值。
在本发明的特定实例中，修饰包括上移或下移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选择的周期具有0的信号值。
具体地，在将本发明适用于MuDT1技术(参照WO第2015/147412号)的情况下，修饰，尤其移动可以如下进行：
(i)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括上移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值；
(ii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括下移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使从所选择的周期具有0的信号值。
代替性地，在将本发明适用于MuDT2技术(参照WO第2016/093619号)且第二基准值大于第一基准值的情况下，阈值可以如下确定：
(i)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括上移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值；
(ii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括下移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值；
(iii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-3进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括下移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值；
(iv)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而增加的信号产生过程并根据数学式I-4进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括上移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值；
(v)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-1进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括下移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值；
(vi)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-2进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括上移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值；
(vii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-3进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括上移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值；
(viii)在进行信号强度随着靶核酸序列的扩增而减少的信号产生过程并根据数学式I-4进行与第二靶核酸序列有关的信号的提取的情况下，修饰包括下移从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选的周期具有0的信号值。
作为另一例，可通过基线(baselining)(减去基线)来执行修改(US 8,219,324；US2003/0148332；US 2006/0269947；KR 10-2012-0097215)。
作为分析信号的从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值不含基线区域。因此，可通过假设从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值为基线区域(背景水平)来进行减去基线。例如，在所选择的周期为第三十五个周期的情况下，可通过假设从第一个周期到第三十四个周期的区域为基线区域来进行减去基线。
上述记载的移动及减去基线可产生相同的结果。
在本发明中，还可将信号调整后的从第一个周期到所选的周期的上一个周期的(多个)信号值作为分析信号来提供(参照图2的S250及图4的S450)，
在本发明的一实例中，上述方法还包括将将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值调整到不影响确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的程度并将所调整的上述多个信号值与从所选择的上述周期到最后周期的(多个)信号值组合来作为分析信号提供的步骤。
即，还可提供靶无关区域，即，调整从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的信号区域后将其作为分析信号。
本发明人发现，由于从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值是靶无关区域，因此为了获得更准确的结果，在靶核酸序列的存在的确定上可忽略不计上述(多个)信号值。并且，本发明人发现，在准确提取从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值的情况下，其对应于背景区域。
因此，为了进一步将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值作为分析信号提供，应将(多个)信号值适用于信号调整过程。
如本文所用，术语“进行调整”或“调整”是指将(多个)信号值转换为单一值或特定范围内的值。
在本发明的一实例中，调整包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值调整为背景水平(或背景信号)。上述调整是指将(多个)信号值转换为任意靶核酸序列的不存在下产生的信号的过程或者将(多个)信号值转换为示出任意靶核酸序列的不存在的信号的过程。
在本发明的另一实例中，调整到背景水平包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值调整到与所选择的周期中的信号值实际上相同。
语句“与所选择的周期中的信号值实际上相同”是指通过考虑所选择的周期中的信号值来预先确定的特定范围内的值或与所选择的周期中的信号值相同的值。
在一例中，调整到背景水平包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值调整到通过考利所选择的周期中的信号值来预先确定的特定范围内的值。
在另一例中，调整到背景水平包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值调整到与所选择的周期中的信号值相同。
注意，被调整的(多个)信号值可包括所选择的周期中的信号值。在所选择的周期为第三十五个周期的情况下，可调整从第一个周期到第三十五个周期的信号值。选择性地，可调整从第一个周期到第三十四个周期的信号值。
在本发明中，提供包括从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值和从所选择的周期到最后周期的未调整的(多个)信号值的所有信号值作为用于确定靶核酸序列的存在的分析信号。
为了确定靶核酸序列的存在，可以直接提供从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值，而无需进一步修改(图6B及图7B；参照中间右侧)，或者可提供进一步修改来的从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值(图6B及图7B；参照下部右侧)。
在一实例中，上述方法还包括对从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值进行修改，而不管从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值的修改的步骤。
在一实例中，上述方法还包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值和从所选择的周期到最后，将上述调整的周期的(多个)信号值作为分析信号提供之前进行修改的步骤。
上述修改包括如上所述的移动或基线。
作为一例，修改包括上移或下移从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值和从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值。
在本发明的一实例中，修改包括上移从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值和从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选择的周期具有大于特定值且为0以下的信号值，或者下移从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值和从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值，以使所选择的周期具有小于特定值且为0以上的信号值；从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的修改的信号值不影响第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的确定(图6B及图7B，参照下部右侧)。
上述特定值可以为接近0的不为0的值。选择性地，上述特定值可以为使用于步骤bc-1的阈值。
在本发明的实例中，修改包括上移或下移信号，以使所选择的周期具有0的信号值。
在另一例中，修改包括基线(减去基线)。
可与准确性基准的使用组合如上所述的调整及修改。
在将本发明适用于MuDT1技术(WO第2015/147412号)的情况下，本发明可以如下：
在一实例中，第一信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号，并且第二信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号，步骤b中信号值的加工包括使用第一基准值对信号值进行数学加工来从在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。
在一实例中，可根据数学式I-1来实施与第二靶核酸序列有关的信号的提取。
在一实例中，通过分析所提取的信号来选择具有最小信号值的周期。然后，提供上述从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为用于确定第二靶核酸序列的存在的分析信号。
在一实例中，上述方法包括在将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为分析信号提供之前进一步修改的步骤。
在一实例中，上述方法还包括调整从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值后，将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值与上述调整的(多个)信号值组合来作为分析信号提供的步骤。
在一实例中，上述方法还包括在将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值和从所选择的周期到最后周期的未调整的(多个)信号值作为分析信号提供之前进行修改的步骤。
选择性地，第一信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号，并且第二信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号，步骤b中信号值的加工包括使用第一基准值对信号值进行数学加工来从在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。
在一实例中，可根据数学式I-2来实施与第二靶核酸序列有关的信号的提取。
在一实例中，通过分析所提取的信号来选择具有最小信号值的周期。然后，提供上述从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为用于确定第二靶核酸序列的存在的分析信号。
在一实例中，在将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为分析信号提供之前进行修改。
在一实例中，上述方法还包括调整从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值后，将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值与上述调整的(多个)信号值组合来作为分析信号提供。
在一实例中，上述方法还包括在将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的调整的(多个)信号值及从所选择的周期到最后周期的未调整的(多个)信号值作为分析信号提供之前进行修改的步骤。
在将本发明适用MuDT2技术(WO第2016/093619号)的情况下，本发明可以如下实现：
在一实例中，两个信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号。
更具体地，第二基准值大于第一基准值，(i)在步骤b中信号值的加工包括通过第一基准值从相对低温检测温度下的信号以数学方式提取与第二靶核酸序列有关的信号的步骤；或者(ii)在步骤b中信号值的加工包括通过使用第一基准值从步骤a中相对高温检测温度下的信号以数学方式提取与第二靶核酸序列有关的信号的步骤；或者(iii)在步骤b中信号值的加工包括通过使用第二基准值从相对低温检测温度下的信号以数学方式提取与第一靶核酸序列有关的信号的步骤；或者(iv)在步骤b中信号值的加工包括通过使用第二基准值从步骤a中相对高温检测温度下的信号以数学方式提取与第一靶核酸序列有关的信号的步骤。
更具体地，在理论上预测的信号模式为正模式(例如，增加的模式)的情况下，通过分析所提取的信号来选择具有最小信号值的周期。然后，提供上述从所选择的周期到最后周期的信号作为用于确定第二靶核酸序列的存在的分析信号。选择性地，在理论上预测的信号模式为负模式(例如，减少模式)的情况下，通过分析所提取的信号来选择具有最大信号值的周期。然后，提供上述从所选择的周期到最后周期的信号作为用于确定第二靶核酸序列的存在的分析信号。
本发明的方法可用于提供用于确定两个靶核酸序列中的至少一个的存在的分析信号。表达“两个靶核酸序列中的至少一个”是指两个靶核酸序列中的任一个或两个。
类似地，本发明的方法可用于提供用于确定三个以上的靶核酸序列的存在的分析信号。
在MuDT1技术及MuDT2技术中，以与前述的方法类似的方式，可使用基准值从三个以上的与靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号。在此情况下，本发明的方法还可适用于提供用于确定靶核酸序列的存在的分析信号。在本发明中，提供从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为用于确定靶核酸序列的存在的分析信号。
在从样品中两个与靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的实例中，样品中两个靶核酸序列选自样品中三个以上的靶核酸序列中。
本发明的方法可涉及从可产生用于三个以上的靶核酸序列的信号的反应中提取一个与靶核酸序列有关的信号。
并且，以与两个与靶核酸序列有关的信号提取类似的方式实施三个与靶核酸序列有关的信号提取。
即，从样品中三个以上的与靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号可包括从样品中两个与靶核酸序列有关的信号提取一个与靶核酸序列有关的信号的一实施方式。
在一实例中，本发明的方法可用于提供用于确定三个以上的靶核酸序列中的一个或两个的存在的分析信号。
在一例中，详细记载从样品中的三个与靶核酸序列有关的信号提取与靶核酸序列有关的信号的方法。
在MuDT1技术中，使用三个信号产生机构(例如，第一信号产生机构、第二信号产生机构及第三信号产生机构)和三个检测温度(例如，相对高温检测温度、相对中间检测温度及相对低温检测温度)。
第一信号产生机构在相对高温检测温度、相对中间检测温度及相对低温检测温度下产生信号；第二信号产生机构在相对中间检测温度及相对低温检测温度下产生信号；第三信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号。
在单一反应容器中与可产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构、可产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构及可产生与第三靶核酸序列有关的信号的第三信号产生机构一起培养样品，并在相对高温检测温度、相对中间检测温度及相对低温检测温度下通过单一类型检测器检测信号。然后，使用第一基准值以数学方式加工在相对高温检测温度下检测的信号及在相对中间检测温度下检测的信号来提取与第二靶核酸序列有关的信号；第一基准值为表示在相对高温检测温度及相对中间检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值。确认第一基准值的适合性。
然后，若从上述提取步骤的结果确定第一靶核酸序列及第二靶核酸序列中的一个不存在，则与样品中两个靶核酸序列存在一样，可根据本发明的方法实施从在相对低温检测温度下检测的信号及在相对中间检测温度下检测的信号提取信号。
另一方面，若确定均存在第一靶核酸序列及第二靶核酸序列，则可通过作出如下变形来适用本发明的方法：通过使用与第一靶核酸序列及第二靶核酸序列有关的混合物的基准值以数学方式加工在相对低温检测温度下检测的信号及在相对中间检测温度下检测的信号来提取与第三靶核酸序列有关的信号；与第一靶核酸序列及第二靶核酸序列有关的混合物的基准值为表示在相对中间检测温度及相对低温检测温度由第一信号产生机构及第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值。
然后，各个与第二靶核酸序列有关的所提取的信号及与第三靶核酸序列有关的所提取的信号经本发明的方法的步骤c。
像这样，与提取与两个靶核酸序列有关的信号类似的方式，可提取三个与靶核酸序列有关的信号。
因此，本技术领域的技术人员应理解，可通过对本发明的方法作出略微的变形来使用于提取三个以上的与靶核酸序列有关的信号。
在一实例中，培养包括多个培养，单独提供与培养有关的分析信号。
使用于本文的术语“多个培养”是指在不同的反应容器、管或孔中进行的培养。在多个培养中进一步强调了本发明的优点。假设多个培养包括未知量的“淋病奈瑟菌”靶序列及“沙眼衣原体”靶序列的特定组合，则通常使用与各个靶核酸序列有关的单一基准值来分析多个培养。本发明人发现这种单一基准值的使用可能会导致错误的检测结果。在一实例中，将与“淋病奈瑟菌”靶序列有关的基准值或“沙眼衣原体”靶序列有关的基准值适用于所有培养后，在需要的情况下，分析信号与个别培养分开提供。
II.用于信号提取的存储介质、计算机程序及装置
以下记载的本发明的存储介质、装置及计算机是用于在计算机中执行本发明的方法的，因此为了避免导致本说明书的复杂性的过度的重复而省略它们之间的共同内容。
在本发明的另一实施方式中，提供一种计算机可读存储介质，包含用于实现处理器的指令，上述处理器执行用于提供样品中与靶核酸序列有关的分析信号的方法，包括：步骤a，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下从样品接收信号值；通过第一信号产生机构检测样品中第一靶核酸序列，并且通过第二信号产生机构检测样品中第二靶核酸序列；上述检测在信号产生过程的一个以上的周期中进行，从而分别在上述一个以上的周期中获得信号值；由上述两个信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；步骤b，通过使用第二基准值对在步骤a中获得的信号值进行加工来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者通过使用第一基准值对在步骤a中获得的信号值进行加工来提取与第二靶核酸序列有关的信号；上述第一基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，上述第二基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值；从使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构的对照组反应确定上述第一基准值，并从使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构的对照组反应确定第二基准值；步骤c，从与上述第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号中选择具有最大信号值或最小信号值的周期；以及步骤d，提供从所选择的上述周期到最后周期的(多个)信号值作为用于确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的分析信号。
在一实例中，第一基准值(或第二基准值)储存于计算机可读存储介质。在一实例中，在实施本方法中，计算机可读存储介质包含用于输入第一基准值(或第二基准值)的指令。在一实例中，计算机可读存储介质还包含实现处理器的指令，上述处理器执行用于获得第一基准值(或第二基准值)的方法。
在本发明的又一实施方式中，提供一种储存于处理器的计算机可读存储介质的计算机程序，用于实现处理器，上述处理器执行用于提供从样品中与靶核酸序列有关的分析信号的方法，包括：步骤a，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下从样品接收信号值；通过第一信号产生机构检测样品中第一靶核酸序列，并且通过第二信号产生机构检测样品中第二靶核酸序列；上述检测在信号产生过程的一个以上的周期中进行，从而分别在一个以上的周期中获得信号值；由上述两个信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨；步骤b，使用第二基准值对在步骤a中获得的信号值进行加工来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者使用第一基准值对在步骤a中获得的信号值进行加工来提取与第二靶核酸序列有关的信号；上述第一基准值为示出在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，上述第二基准值为表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值；通过使用第一靶核酸序列及第一信号产生机构的对照组反应来确定上述第一基准值，通过使用第二靶核酸序列及第二信号产生机构的对照组反应来确定第二基准值；步骤c，从与上述第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号中选择具有最大信号值或最小信号值的周期；以及步骤d，提供从所选择的上述周期到最后周期的(多个)信号值作为用于确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的分析信号。
在本发明的一实例中，上述计算机程序包含第一基准值(或第二基准值)。在本发明的一实例中，在执行本方法中，上述计算机程序包含用于输入第一基准值(或第二基准值)的指令。在本发明的一实例中，上述计算机程序还包含用于实现处理器的指令，上述处理器执行用于获得第一基准值(或第二基准值)的方法。
在通过处理器执行的情况下，通过启动上述程序指令来使处理器执行上述记载的本发明。用于执行本方法的上述程序指令可包括：在相对高温检测温度及相对低温检测温度下利用样品从信号产生过程接收信号值的令；对用于提取信号而接收的信号值进行加工的指令；选择最大信号值或具有最小信号值的周期的指令；以及将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为分析信号提供的指令。在一实例中，用于执行本方法的程序指令还可包括用于获得第一基准值(或第二基准值)的指令。
上述记载的本发明的方法在处理器中执行，例如，在独立计算机、联网计算机或实时聚合酶链式反应设备等的数据收集装置中的处理器中执行。
计算机可读存储介质的类型包括刻录光盘(CD-R)、只读储存器(CD-ROM)、数字多功能光盘(DVD)、闪存存储器、软盘、硬盘驱动器、便携式硬盘、通用串行总线(USB)、磁带、迷你光碟(MINIDISC)、非易失性存储卡、电可擦只读存储器(EEPROM)、光盘(CD)、光存储介质、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、系统存储器及网页服务器等多种存储介质。
可由几种设备接收信号产生过程的信号值。例如，信号值可由聚合酶链式反应数据获得装置中的处理器来获得。在进行收集期间可实时向处理器提供信号值或者可储存于存储器机构或缓冲区，在完成实验后可在处理器提供上述信号值。类似地，通过与上述获得装置的网络连接(例如，局域网(LAN)、虚拟专用网络(VPN)、互联网及内联网)或直接连接(例如，通用串行总线、其它直接有线连接或无线连接)向独立计算机系统等额外的系统提供信号值，或者可向光盘、数字多功能光盘、软盘、便携式硬盘或独立计算机系统等便携式介质提供信号值。类似地，可通过与笔记本电脑或台式计算机系统等客户端的网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、互联网，内联网及无线通信网络)向服务器系统提供上述数据集。
在接收及获得信号值后，执行信号值的加工，并通过第二基准值来提取与第一靶核酸序列有关的信号，或者通过第一基准值来提取与第二靶核酸序列有关的信号。处理器选择最大信号值或具有最小信号值的周期并将上述从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值作为分析信号来提供。
虽然可向便携式硬盘、通用串行总线、软盘、光盘及数字多功能光盘等的任何软件存储介质提供上述指示，但是可进行下载且可存储于存储器模块(例如，硬盘驱动器、本地或附着随机存取存储器、只读存储器等其他存储器)。用于运行本发明的计算机代码可运行为如C、C++、Java、Visual Basic、VBS cript、Java Script、Perl及XML等多种代码语言。并且，多种语言及协议可利用于基于本发明的数据和命令的外部及内部存储和传送。
在本发明的又一实施方式中，提供一种用提供样品中与靶核酸序列有关的分析信号的装置，包括：(a)计算机处理器；以及(b)如上所述的计算机可读存储介质，与上述计算机处理器相连接。
在一实例中，装置还包括：反应容器，用于收容样品及信号产生机构；温度调节机构，用于调节上述反应容器的温度；和/或检测器，用于检测周期中信号。
在一实例中，计算机处理器不仅在信号产生过程的一个以上的周期中接收信号值，而且根据基准值对获得的信号值进行加工来提取信号并选择具有最大信号值或最小信号值的周期。能够使单一处理器执行几种行为的方式构建处理器。选择性地，能够使多个处理器分别执行几种行为的方式构建处理器单元。
在一实例中，可通过在用于靶核酸序列的检测的现有的装置(例如，实时聚合酶链式反应装置)中设置软件来实现处理器。
例如，可在实时聚合酶链式反应系统中实现本发明的装置。上述系统包括用于执行实时聚合酶链式反应扩增的实时聚合酶链式反应装置及通过电缆与实时聚合酶链式反应装置相连接的逻辑系统以用于提取信号并显示校准产物。上述计算机系统根据用户需求可由曲线图、表及文字等多种形态显示提取产物。上述计算机系统可包括用于执行本发明的方法的包括在计算机可读储存介质中的指令。可在一个系统中合并实时聚合酶链式反应装置及计算机系统。
可由多种方式接收信号值呈扩增曲线。例如，可通过实时聚合酶链式反应装置的数据收集器中的处理器来接收及收集信号值。当收集信号值时，由实时方式向处理器提供这些，但是在储存在内存单元或缓冲区后，在完成实验后可在处理器提供信号值。
类似地，可通过网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、内联网及互联网)或直接连接(例如，通用串行总线及直接有线连接或无线连接)或者光盘、数字多功能光盘、软盘及便携式硬盘等便携式介质，从实时聚合酶链式反应装置中向台式计算机系统等的计算机系统提供信号值。选择性地，可通过与笔记本电脑或台式计算机系统等客户端连接的网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、互联网，内联网及无线通信网络)向服务器系统提供信号值。
在接收或获得信号值后，信号值处理器根据基准值提取信号。本发明的信号提取可通过设置于计算机系统的应用(即，程序)来执行。选择性地，这可通过应用商店服务器或应用提供商服务器由直接设置的应用来执行，可在计算机系统的操作体系中操作应用。运行体系包括移动操作体系，如设置于windows电脑、麦金塔电脑及智能手机和平板电脑等移动终端上的iOS及安卓。
如上所述，在上述计算机系统中可由提供商设置或由用户直接设置的应用(即，程序)来实现本发明的信号提取方法，并可记录于计算机可读储存介质。
实现本发明的方法的计算机程序可实现用于信号提取的所有功能。计算机程序可以为包括程序指令的程序，上述程序指令存储于实现用于执行本发明的方法的处理器的计算机可读储存介质中。
计算机程序可通过使用C、C++、Java、Visual Basic、VBS cript、Java Script、Perl、XML及代码语言等适当的计算机语言来编码。上述程序可包括用于上述记载的数学功能的功能代码及由计算机系统的处理器依次实现处理器的控制代码。
上述代码可包括存储器参考码，由处理器实现上述功能所需的附加信息或介质在计算机系统的内部或外部储存器的位置(地址)处被参照。
在计算机系统需要与另一个远程计算机或服务器通信以实现处理器的功能的情况下，上述代码还可包括处理器编码的通信相关代码，处理器编码的通信相关代码通过使用通信模块(例如，有线/或无线通信模块)来如何与远程的另一种计算机或服务器进行通信或者传递某种信息或介质。
用于实现本发明的功能性程序及代码(代码片段)可通过考虑用于解读储存介质并执行程序的计算机的系统环境来很容易地由本技术领域的程序员推断或变形。
在计算机系统中可分布有与网络连接的储存介质，计算机可读代码能够以分布方式储存并执行。在此情况下，多个分布的计算机中的至少一台计算机可实现一些功能，并实现一些功能且可将实现结果传输给至少一台能够传输给计算机的至少一台计算机中。
用于实施本发明的记录有应用(即，程序)的储存介质包括应用商店或包括在应用提供商服务器的储存介质(例如，硬盘)、应用提供商服务器、上述程序及具有其储存介质的其他计算机。
可解读储存介质的计算机系统不仅包括台式计算机或笔记本电脑等的普通计算机、智能手机、平板电脑、掌上电脑(PDA)(个人数字助理装置)及移动通信终端等的移动终端，还可包括所有可执行计算的装置。
III.靶核酸的检测
与靶核酸序列有关的分析信号可用于其检测。靶核酸序列的检测包括样品中的靶核酸序列的存在的确定。靶检测可由本技术领域中已知的多种方法来实现。例如，靶检测可通过在所提取的信号的图形中适用阈值并确认图形及阈值之间是否有相交点来实现。在有相交点的情况下，定靶核酸序列的存在；在没有相交点的情况下，确定靶核酸序列的不存在。
本发明的特征及优点如下：
(a)本发明可通过去除或调整可对靶核酸的检测有不利影响的信号区域来能够以更加准确、有效、可重现的方式检测靶核酸序列。
(b)本发明可通过使用不同的检测温度及基准值来有助于显著改善检测靶核酸序列的方法。
(c)尤其，在使用缩退性引物组的核糖核酸把检测或具有低浓度的相对较低检测温度的靶核酸序列的情况下，更加突出本发明的有用性。
(d)在本发明中，用于检测靶核酸序列的更准确的信号提取开发用于执行信号提取的本发明的方法，从而实用。
通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于对本发明进行更具体的说明，在所附的发明要求保护范围中所公开的本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例
实施例1：基于MuDT1技术的信号检测及提取
在MuDT1技术(参照WO 2015/147412号)的一实例中，第一信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号，信号值的加工通过使用第一基准值来进行，从而从在相对低温检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。
1-1.准备模板及寡核苷酸
作为在不同的检测温度下以实时方式检测信号的实时聚合酶链式反应接近法使用了探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法(WO第2012/096523号)。
为了上游引物及下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸(Probing and TaggingOligonucleotide，PTO)的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋病奈瑟菌(NG)的基因组脱氧核糖核酸及沙眼衣原体(CT)的基因组脱氧核糖核酸用作靶核酸序列。
作为信号产生机构通过使用探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法来检测淋病奈瑟菌及沙眼衣原体的探测和标记寡核苷酸包括(i)包含与靶核酸序列非互补的核苷酸序列序列的5’-靶向部位及(ii)包含与靶核酸序列互补的杂化核苷酸序列的3’-靶向部位。捕获和模板寡核苷酸包括从3’到5’的方向(i)包含与探测和标记寡核苷酸的5’-靶向部位或上述5’-靶向部位的部分互补的核苷酸序列的捕捉部位及(ii)包含与探测和标记寡核苷酸的5’-靶向部位及3’-靶向部位非互补的核苷酸序列的模板化部位。捕获和模板寡核苷酸在5’-末端标记为淬灭分子(BHQ-2)及在模板化部位标记为荧光报道分子(CAL Fluor Red610)。探测和标记寡核苷酸及捕获和模板寡核苷酸在3’-末端用碳垫片阻断，以防止延伸。
探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时方法为了检测两个不同的靶核酸序列而使用单一类型的荧光标记(CAL Fluor Red 610)，因此不可能由单一检测器在单一反应容器中分辨两个与靶核酸序列有关的信号。
在探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时方法中，在靶序列存在的情况下，切割与上述靶核酸序列杂化的探测和标记寡核苷酸，并生成探测和标记寡核苷酸片段。上述探测和标记寡核苷酸片段退火到捕获和模板寡核苷酸的捕捉部位，并在捕获和模板寡核苷酸的模板化部位上延伸，从而形成于捕获和模板寡核苷酸延伸的二聚体(Duplexed CTO)。上述延伸二聚体的形成提供信号，可通过在延伸二聚体形成温度下测定信号来获得扩增曲线。
在本实施例中，各个延伸二聚体的序列及长度以与沙眼衣原体有关的二聚体可在72℃的温度下形成且与淋病奈瑟氏菌有关的延伸二聚体可在60℃的温度下形成而不是72℃的温度下形成的方式设计。
因此，在72℃的检测温度下，仅检测与沙眼衣原体有关的信号，相反，在60℃的检测温度下，不仅检测与淋病奈瑟氏菌有关的信号，还检测与沙眼衣原体有关的信号。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸及捕获和模板寡核苷酸的序列如表1所示。
表1
I：脱氧肌苷
探测和标记寡核苷酸：探测及标记寡核苷酸
捕获和模板寡核苷酸：捕捉及模板化寡核苷酸
BHQ：淬灭(黑洞淬灭)
加下划线的字符：探测和标记寡核苷酸的5’-靶向部位
1-2.实时聚合酶链式反应及不同温度下的信号检测
在含有靶核酸(100fg的淋病奈瑟菌基因组脱氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸、100fg的淋病奈瑟菌基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋病奈瑟菌靶扩增的上游引物(序列：1)、5pmole的下游引物(序列：2)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列：3)及1pmole的捕获和模板寡核苷酸(序列：4)、5pmole的用于沙眼衣原体靶扩增的上游引物(序列：5)、5pmole的下游引物(序列：6)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列：7)及1pmole的捕获和模板寡核苷酸(序列：8)、及5μl的4X主混合液(最终浓度，200μM的dNTPs、2mM的MgCl2、2U的Taq脱氧核糖核酸polymerase)(Enzynomics，Korea)的20μl的最终体积进行了探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法的实时聚合酶链式反应。在将含上述反应混合物的管放置在50℃的温度下的实时热循环仪(CFX96实时热循环仪，伯乐公司(Bio-Rad))5分钟，并且以在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下60秒钟、在72℃的温度下30秒钟的方式进行变性，并实施50个循环。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。上述结果如图5所示。
如图5所示，仅含有淋病奈瑟菌靶(100fg)的样品在60℃的温度下检测出信号，但是在72℃的温度下没有检测出信号(参照第一列)；仅含有沙眼衣原体靶(10pg)的样品在60℃及72℃的温度下均检测出信号(参照第二列)；含有所有淋病奈瑟菌及沙眼衣原体靶(100fg的淋病奈瑟菌+10pg的沙眼衣原体)的样品在60℃及72℃的温度下均检测出信号(参照第三列)；不含靶的样品(NTC)在60℃及72℃的温度下未检测出信号(参照第四列)。
1-3.与靶核酸序列有关的信号的提取
如图5所示，可从在72℃的温度下检测出的信号直接获得与沙眼衣原体靶有关的信号，因为在72℃的温度下没有检测到与淋病奈瑟菌靶有关的信号。相反，在60℃的温度下与沙眼衣原体靶有关的信号一同检测出与淋病奈瑟氏菌靶有关的信号，而没有在72℃的温度下检测到与淋病奈瑟菌靶有关的信号，因此，为了提取和淋病奈瑟氏菌靶有关的信号，从60℃的温度下的信号应去除与沙眼衣原体靶有关的信号。应注意的是，靶核酸，尤其，与沙眼衣原体有关的信号强度可根据检测温度而不同，即，在60℃的温度下的信号的强度可能更大于在72℃的温度下的信号。因此，在72℃的温度下检测的与沙眼衣原体靶有关的信号应适当转换为在60℃的温度下预测的信号。为此，本方法使用了基准值。
具体地，据式I-1，可使用示出与沙眼衣原体靶有关的在72℃及60℃的温度下的信号的变化关系的基准值来提取与淋病奈瑟氏菌靶有关的信号：
式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[相对低温检测温度下的信号]－[(相对高温检测温度下的信号)×(第一基准值)]；
在上述式中，第二靶核酸序列为淋病奈瑟菌靶，相对低温检测温度为60℃，相对高温检测温度为72℃，第一基准值为与沙眼衣原体靶有关的基准值。
可绘制与淋病奈瑟菌靶有关的所提取的信号。
可根据式II-1计算与沙眼衣原体靶有关的基准值：
式II-1：与沙眼衣原体靶有关的基准值＝[与仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品有关的60℃的温度下的信号]÷[与仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品有关的72℃的温度下的信号]
与沙眼衣原体靶有关的基准值可根据反应条件而不同。因此，通过重复实验可获得与沙眼衣原体有关的一些不同的基准值。即，可从仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品中在特定范围的值中获得与沙眼衣原体有关的基准值。
对于本技术领域的技术人员而言，从仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品中从特定范围中获得与沙眼衣原体有关的基准值，为了从60℃的温度下的信号中去除与沙眼衣原体靶有关的信号，在上述基准值中选择一个适当的基准值是普遍的。本发明人发现，当单一基准值对单个反应不合适时，将与沙眼衣原体靶有关的单一基准值适用于所有反应可能导致错误的信号。
例如，图6A示出在含有10pg的沙眼衣原体靶的样品中提取与淋病奈瑟菌靶有关的信号的一实例。根基数学式I-1使用(i)与第一靶核酸序列(沙眼衣原体)有关的基准值1.50以及(ii)在相对低温检测温度(60℃)及相对高温检测温度(72℃)下检测的信号提取与第二靶核酸序列(淋病奈瑟菌)有关的信号。由于上述样品仅含有沙眼衣原体靶，因此，在适用与沙眼衣原体靶有关的适当的单一基准值的情况下，通过去除沙眼衣原体靶信号来提取的与淋病奈瑟菌靶有关的信号在所有周期中理论上为约RFU 0。与这样的预期不同，因去除大于来源于沙眼衣原体靶的信号的信号，而与沙眼衣原体靶有关的基准值(1.50)的适用产生显著低于RFU 0的错误的信号。
作为另一例，图7A示出在含有100fg的淋病奈瑟菌及10pg的沙眼衣原体靶的样品提取与淋病奈瑟菌靶有关的信号的一实例。根据数学式I-1使用(i)与第一靶核酸序列(沙眼衣原体)有关的基准值1.50以及(ii)在相对低温检测温度(60℃)及相对高温检测温度(72℃)下检测的信号提取与第二靶核酸序列(淋病奈瑟菌)有关的信号。在图7A中，一些产生的所提取的信号示出理论上未预测预期的模式(小于RFU 0)。
这样的结果证明，在为了与靶核酸序列有关的信号提取在所有反应中适用单一基准值的情况下，因对特定反应的基准值的不适合性而可导致产生错误的信号。
实施例2：基于MuDT1技术的用于确定靶核酸序列的存在的分析信号的提供
尽管所提取的信号包含错误的信号，但确认本发明的方法可提供用于确定靶核酸序列的存在的分析信号。
图6B示出从图6A的所提取的信号获得用于确定靶核酸序列的存在的多种分析信号的本发明的四种实例(中间左侧；中间右侧；下部左侧；上部右侧)。在本发明的第一实例中，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第五十个周期)(上部左侧)；并提供上述从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值(所选择的所有周期及最后周期均为第五十个周期)作为用于确定淋病奈瑟菌的存在的分析信号(中间左侧)。在本发明的第二实例中，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第五十个周期)(上部左侧)；对从上述所选择的周期到最后周期(第五十个周期)的(多个)信号值进一步修改(例如，移动)后，作为用于确定淋病奈瑟菌的存在的分析信号提供(下部左侧)。在本发明的第三实例中，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第五十个周期)(上部左侧)；调整从第一个周期到上述所选择的周期的上一个周期的(从第一个周期道第四十九个周期的)(多个)信号值以使与上述所选择的周期中的信号值相同；从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(从第一个周期道第四十九个周期的)所调整的(多个)信号值及从所选择的周期到最后周期(第五十个周期)的(多个)信号值作为用于确定淋病奈瑟菌的存在的分析信号一起提供(中间右侧)。在本发明的第四实例中，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第五十个周期)(上部左侧)；调整从第一个周期到上述所选择的周期的上一个周期的(从第一个周期道第四十九个周期的)(多个)信号值以使与所选择的周期中的信号值相同；对从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(从第一个周期道第四十九个周期的)所调整的(多个)信号值及从所选择的周期到最后周期(第五十个周期)的(多个)信号值进行进一步修改(例如，移动)后，作为用于确定淋病奈瑟菌的存在的分析信号提供(下部右侧)。
图7B为示出从图7A的所提取的信号获的用于确定靶核酸序列的存在的多种分析信号的本发明的四种实例(中间左侧；中间右侧；下部左侧；上部右侧)。在本发明的第一实例中，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第三十五个周期)(上部左侧)；并提供从上述所选择的周期到最后周期的(从第三十五个周期到第五十个周期的)(多个)信号值作为用于确定淋病奈瑟菌的存在的分析信号(中间左侧)。在本发明的第二实例中，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第三十五个周期)(上部左侧)；对从上述所选择周期到最后周期的(从第三十五个周期到第五十个周期的)(多个)信号值进行进一步修改(例如，移动)后，作为用于确定淋病奈瑟菌的存在的分析信号提供(下部左侧)。在本发明的第三实例中，选择具有最小信号值的周期(用“最小周期”表示；对应于第三十五个周期)(上部左侧)；调整从第一个周期到上述所选择的周期的上一个周期的(从第一个周期到第三十四个周期的)(多个)信号值以使与所选择的周期中的信号值相同；从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(从第一个周期到第三十四个周期的)所调整的(多个)信号值及从所选择的周期到最后周期的(从第三十五个周期到第五十个周期的)(多个)信号值作为用于确定淋病奈瑟菌的存在的分析信号一起提供(中间右侧)。在本发明的第四实例中，选择具有最小信号值的周期用“最小周期”表示；对应于第三十五个周期)(上部左侧)；并调整从第一个周期到上述所选择的周期的上一个周期的(从第一个周期到第三十四个周期的)(多个)信号值以使与所选择的周期中的信号值相同；对从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(从第一个周期到第三十四个周期的)所调整的(多个)信号值及所选择的周期到最后周期的(从第三十五个周期到第五十个周期的)(多个)信号值进行进一步修改(例如，移动)后，作为用于确定淋病奈瑟菌的存在的分析信号提供(下部右侧)。
在上述图6B及7B中，预期与兴趣靶核酸序列有关的已适当的提取的信号在样品中靶核酸序列的存在下呈增加的信号模式，因此要注意选择了具有最小信号值的周期。但是，本领域技术人员将理解，根据用于步骤b的信号产生过程及提取过程，可以代替性地选择具有最大信号值的周期。
为了证明本发明的方法的适用可能性，使用了图8A至图8D的左列中示出与淋病奈瑟菌靶有关的所提取的信号(使用多种基准值，例如1.15、1.50、2.00及2.50)。
2-1.具有最小信号值的周期的选择
通过分析实施例1的所提取的信号(图8A至图8D，参照左列)来选择具有最小信号值的周期。然后，将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值视为靶无关信号区域，并将从所选择的周期到最后周期的(多个)信号值视为靶相关信号区域。
2-2.靶无关信号区域的调整
针对于各个所提取的信号，调整从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值(靶无关信号区域)，以使不影响对淋病奈瑟菌靶的存在的确定。具体地，调整上述(多个)信号值以使与所选择的周期(具有最小值的周期)中的信号值相同。
2-3.整个信号值的移动
上移包含从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的所调整的(多个)信号值及从所选择的周期到最后周期的未调整的(多个)信号值的所有信号值使所选择的周具有0的信号值。提供获得的信号作为用于确定淋病奈瑟菌靶的存在的分析信号。
在图8A至图8D的右列中示出通过上述步骤获得的与淋病奈瑟菌靶有关的分析信号。
如图8B所示，在仅含有10pg的沙眼衣原体的样品的情况下，发现错误提取的信号(左列)通过本发明的方法被校准成准确提取的信号(右列)。
并且，如图8C所示，在含有100fg的淋病奈瑟菌及10pg的沙眼衣原体的样品的情况下，错误提取的信号(左列)通过本发明的方法被校准成准确提取的信号(右列)。
2-4.靶核酸序列的存在的确定
使用在步骤3中提供的分析信号，确定靶核酸序列的存在及量。为此使用了RFU100的阈值。
在下述表2中概括结果。
表2
如表2所示，针对于仅含有10pg的沙眼衣原体的样品及100fg的淋病奈瑟菌及10pg的沙眼衣原体的样品，假阴性结果及一些Ct值被校准。
实施例3：基于MuDT2技术的信号检测及提取
在MuDT2技术(参照WO第2016/093619号)的一实例中，两个信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号。通过实施信号值的加工来根据第一基准值从在相对低温检测温度下的信号或在相对高温检测温度下的信号提取与第二靶核酸序列有关的信号。与此相同，通过实施信号值的加工来根据第二基准值从在相对低温检测温度下的信号或在相对高温检测温度下的信号提取与第一靶核酸序列有关的信号。
3-1.模板及寡核苷酸的制备
作为在不同检测温度下以实时方式用于检测信号的实时聚合酶链式反应接近法使用了TaqMan方法。
将具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶用于上游引物及下游引物的延伸及TaqMan探针的切割。将淋病奈瑟菌(NG)的基因组脱氧核糖核酸及沙眼衣原体(CT)的基因组脱氧核糖核酸用作靶核酸序列。
在TaqMan实时聚合酶链式反应中存在靶核酸的情况下，TaqMan探针被切割并释放标记的片段。上述标记的片段的释放可通过提供信号并从上述标记的片段测定信号来获得扩增曲线。
用于淋病奈瑟菌的TaqMan探针在5’-末端由荧光报道分子(Quasar 670)及在3’-末端由淬灭分子(序列：9)标记，用于沙眼衣原体的TaqMan探针在5’-末端由荧光报道分子(Quasar 670)及在内部网站中由淬灭分子(BHQ-2)标记(序列：12).
在本实施例中，均在60℃及72℃的温度下检测到与淋病奈瑟氏菌有关的信号及与沙眼衣原体有关的信号。使用于两个靶的TaqMan探针在两个检测温度下提供不同的信号变化关系((即，不同的基准值)。尤其，本实施例中以与沙眼衣原体有关的在60℃及72℃下的信号差异大于与淋病奈瑟菌有关的方式设计了TaqMan探针。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物及TaqMan探针的序列如表3所示。
表3
I：脱氧肌苷
BHQ：淬灭(黑洞淬灭)
3-2.实时聚合酶链式反应及不同温度下的信号检测
在含有靶核酸(10pg的淋病奈瑟菌基因组脱氧核糖核酸、1pg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸、10pg的淋病奈瑟菌基因组脱氧核糖核酸及1pg的沙眼衣原体基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋病奈瑟菌靶扩增的上游引物(序列：1)、10pmole的下游引物(序列：2)及1.5pmole的TaqMan探针(序列：9)、5pmole的用于沙眼衣原体靶扩增对上游引物(序列：10)、10pmole的下游引物(序列：11)及3pmole的TaqMan探针(序列：12)、及5μl的4X主混合液(最终浓度，200μM的dNTPs、2mM的MgCl2、2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)(Enzynomics，Korea)的20μl的最终体积进行了TaqMan方法的实时聚合酶链式反应。将含有上述反应混合物的管放置在50℃的温度下的实时热循环仪(CFX96实时循环仪，伯乐公司)5分钟，并且以在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下60秒钟、在72℃的温度下30秒钟的方式进行变性，并实施50个循环。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。上述结果如图9所示。
如图9所示，在淋病奈瑟菌、沙眼衣原体、或淋病奈瑟菌+沙眼衣原体靶的存在下，于60℃及72℃的温度下均检测信号。在靶不存在下(NTC)未检测到。
3-3.与靶核酸序列有关的信号的提取
如图9所示，从在60℃或72℃的温度下检测的信号不能直接获得与各个靶有关的信号。因此，为了提取与各个靶有关的信号，从各个检测温度下的信号中应去除与其他靶有关的信号。
可通过使用与各个靶有关的在72℃及60℃的温度下的信号变化关系的基准值来提取与各个靶有关的信号。在本实施例中，根据数学式I-1及数学式I-4提取信号：
式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[相对低温检测温度下的信号]－[(相对高温检测温度下的信号)×(第一基准值)]；
在上述式中，第二靶核酸序列为沙眼衣原体靶；第一基准值为在相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对高温检测温度下由第一信号产生机构下提供的信号之比。
式I-4：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[相对高温检测温度下的信号]－[(相对低温检测温度下的信号)÷(第二基准值)]；
在上述式中，第一靶核酸序列为淋病奈瑟菌靶；第二基准值为在相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号与在相对高温检测温度下由第二信号产生机构下提供的信号之比。
可绘制对各个靶的所提取的信号。
可根据数学式II-1及数学式II-2计算与各个靶有关的基准值：
式II-1：与沙眼衣原体靶有关的基准值＝[与仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品有关的在60℃下的信号]÷[与仅含有沙眼衣原体靶的对照组样品有关的在72℃下的信号]
式II-2：与淋病奈瑟菌靶有关的基准值＝[与仅含有淋病奈瑟菌靶的对照组样品有关的在60℃下的信号]÷[与仅含有淋病奈瑟菌靶的对照组样品有关的在72℃下的信号]
如图10A至图10D所示，使用与沙眼衣原体靶有关的基准值从72℃的温度下的信号提取与淋病奈瑟菌靶有关的信号。与沙眼衣原体有关的基准值预先被确定为“6.50、6.00、5.50或5.00”。在含有1pg的沙眼衣原体靶的样品中，与沙眼衣原体靶有关的基准值(5.50或5.00)的适用因去除了大于来源于沙眼衣原体靶的信号的信号而导致产生错误的信号(参照图10B)。上述错误的信号表示上述基准值不适合。
如图11A至图11D所示，使用与淋病奈瑟菌靶有关的基准值从在60℃的温度下的信号提取与沙眼衣原体靶有关的信号。与淋病奈瑟菌靶有关的基准值预先被确定为“1.80、2.50、3.00或3.50”。与淋病奈瑟菌靶有关的基准值(2.50、3.00或3.50)的适用因去除大于来源于淋病奈瑟氏菌靶的信号的信号而导致产生错误的信号(参照图11A及图11C)。上述错误的信号表示述基准值不适合。
这些结果表明，当为了提取靶核酸序列的信号而在所有反应中适用单一基准值时，因对于特定样品的基准值的不适合性而导致产生错误的信号。
实施例4：用于确定基于MuDT2技术的靶核酸序列的存在的分析信号的提供
以与实施例2类似的方法，通过分析实施例3的所提取的信号选择有最小信号值的周期。预期适当地提取的信号示出增加的信号模式，在本实施例中选择具有最小信号值的周期。然后，调整从第一个周期到上述所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值(靶无关区域)以使与所选择的周期(具有最小值的周期)中的信号值相同。然后，上移包含从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的所调整的(多个)信号值及从所选择的周期到最后周期的未调整的(多个)信号值的所有信号值以使所选择的周期具有0的信号值。并提供获得的信号作为用于确定淋病奈瑟菌靶或沙眼衣原体靶的存在的分析信号。
如图10A至图10D的右列，示出通过上述步骤获得的与淋病奈瑟菌靶有关的分析信号。并且，如图11A至图11D的右列，示出通过上述步骤获得的与沙眼衣原体靶有关的分析信号。
如图10B所示，在仅含有1pg的沙眼衣原体的样品的情况下，错误提取的信号(左列)通过本发明的方法被校准成准确提取的信号(右列)。
并且，如图11A所示，在仅含有10fg的淋病奈瑟菌的样品及含有10pg的淋病奈瑟菌及1pg的沙眼衣原体的样品的情况下，错误提取的信号(左列)通过本发明的方法被校准成准确提取的信号(右列)。
并且，使用上述分析信号，确定靶核酸序列的存在及量。为此针对于沙眼衣原体及淋病奈瑟菌靶分别使用了阈值200及阈值150。
在表4及表5中概括结果。
表4
表5
如表4所示，对于仅含有10pg的淋病奈瑟菌的样品及含有10pg的淋病奈瑟菌及1pg的沙眼衣原体的样品，校准了一些Ct值。
并且，如表5所示，对于仅含有1pg的沙眼衣原体的样品，校准了Ct值，对于含有10pg的淋病奈瑟菌及1pg的沙眼衣原体的样品，还校准了假阴性结果和一些Ct值。
实施例5：本发明的方法对以不同的方式提取的信号的适用性
调查了本发明的方法能否适用于在实施例3中使用式I-2代替式I-1来提取的与第二靶核酸序列(即，沙眼衣原体靶)有关的信号。
为此，对于含有10pg的淋病奈瑟菌及1pg的沙眼衣原体的混合物的样品，将在60℃及72℃的温度下检测两种信号(参照图9中第三列)适用于用于沙眼衣原体靶的信号检测。为了沙眼衣原体靶的信号提取，使用了下述数学式I-2：
式I-2：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号]－[(在步骤a获得的相对低温检测温度下的信号)÷(第一基准值)]；
在上述式中，第二靶核酸序列为沙眼衣原体靶；第一基准值为在相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号与在相对高温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号之比。
第一基准值使用了1.80、2.50、3.00及3.50。
图12的左列示出与沙眼衣原体靶有关的所提取的信号。
若所使用的基准值合适，则使用式I-2提取的信号在靶存在下示出减少模式或者在靶不存在下实际上示出0。因此，偏离这种已预测的信号模式的信号，例如具有显著大于RFU 0的(多个)信号值的信号对应于所提取的信号。
如图12的左列所示，与淋病奈瑟菌靶有关的基准值(2.50、3.00或3.50)的适用产生显著大于RFU 0的错误的信号。
以与实施例4类似的方法，通过分析所提取的信号选择具有最大信号值的周期。预期适当地提取的信号示出减少的信号模式，因此在本实施例中选择具有最大信号值的周期。然后，调整从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的(多个)信号值(靶无关信号区域)以使与所选择的周期(具有最大值的周期)中的信号值相同。然后，向下应包含从第一个周期到上述所选择的周期的上一个周期的所调整的(多个)信号值及从上述从所选择的周期到最后周期的未调整的(多个)信号值的所有信号值以使所选择的周期具有0的信号值。提供获得的信号作为用于确定沙眼衣原体靶的存在的分析信号。
在图12的右列示出通过上述步骤获得的与沙眼衣原体靶有关的分析信号。
如图12所示，异常提取的信号(左列)通过本发明的方法校准成准确提取的信号(右列)。
从这些结果可以推出，本发明的方法可通过将特定信号区域用作分析信号来以更准确地方式监测靶核酸序列。
详述了本发明的优选的实例，应理解的是，属于本发明的主旨的变形及修改对于本技术领域的技术人员而言是显而易见的，本发明的范围限定于所附的发明要求保护范围及其等同技术方案。
序列表
<110> SEEGENE, INC.
<120> 用于确定靶核酸序列的存在的分析信号
<130> PP180015
<150> KR 10-2017-0039306
<151> 2017-03-28
<160> 12
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n表示脱氧肌苷
<400> 1
tacgcctgct actttcacgc tnnnnngtaa tcagatg 37
<210> 2
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n表示脱氧肌苷
<400> 2
caatggatcg gtatcactcg cnnnnncgag caagaac 37
<210> 3
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG_PTO
<400> 3
gtacgcgata cgggcccctc attggcgtgt ttcg 34
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG_CTO
<400> 4
tttttttttt tttttttttg tactgcccgt atcgcgtac 39
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n表示脱氧肌苷
<400> 5
gagttttaaa atgggaaatt ctggtnnnnn tttgtataac 40
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(30)
<223> n表示脱氧肌苷
<400> 6
ccaattgtaa tagaagcatt ggttgnnnnn ttattggaga 40
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT_PTO
<400> 7
gattacgcga ccgcatcaga agctgtcatt ttggctgcg 39
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT_CTO
<400> 8
gcgctggata ccctggacga tatgtgcggt cgcgtaatc 39
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> NG_P
<400> 9
tgcccctcat tggcgtgttt cg 22
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT2_F
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(26)
<223> n表示脱氧肌苷
<400> 10
tccgaatgga taaagcgtga cnnnnnatga actcac 36
<210> 11
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT2_R
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(27)
<223> n表示脱氧肌苷
<400> 11
aacaatgaat cctgagcaaa ggnnnnncgt tagagtc 37
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CT2_P
<400> 12
cattgtaaag atatggtctg cttcgaccg 29

Claims (12)

1.一种提供用于确定样品中第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在单一反应容器中，与能够产生与第一靶核酸序列有关的信号的第一信号产生机构及能够产生与第二靶核酸序列有关的信号的第二信号产生机构一起培养样品，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下通过检测器来检测信号；
上述各个信号产生机构包含具有标记的寡核苷酸；
上述第一信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号；
上述培养通过靶扩增反应来进行；
上述检测在靶扩增反应的一个以上的周期中进行，从而分别在一个以上的周期中获得信号值；
由上述两个信号产生机构产生的两种信号不被检测器分辨；
步骤(b)，
(1)由下述数学式I-3或I-4提取与第一靶核酸序列有关的信号：
式I-3：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号)×(第二基准值)]；
式I-4：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对高温检测温度下信号]－[(在步骤a中获得的相对低温检测温度下信号)÷(第二基准值)]；
上述第二基准值：
是表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值，且
如下确定：
(i)在与步骤(a)中的容器不同的容器中用上述第二信号产生机构培养仅包含上述第二靶核酸序列的对照样品，
(ii)在相对高的检测温度和相对低的检测温度下检测信号，及
(iii)计算在相对高的检测温度和相对低的检测温度下的信号强度之比；或
(2)由下述数学式I-1或I-2提取与第二靶核酸序列有关的信号：
式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号)×(第一基准值)]；
式I-2：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号)÷(第一基准值)]；
上述第一基准值：
是表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，且
如下确定：
(i)在与步骤(a)中的容器不同的容器中用上述第一信号产生机构培养仅包含上述第一靶核酸序列的对照样品，
(ii)在相对高的检测温度和相对低的检测温度下检测信号，及
(iii)计算在相对低的检测温度下的信号强度与在相对高的检测温度下的信号强度之比；
步骤(c)，从与上述第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号中选择具有最大信号值或最小信号值的周期；以及
步骤(d)，提供从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值作为用于确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的分析信号。
2.根据权利要求1所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，在步骤(b)与步骤(c)之间还包括：
步骤(bc-1)，向所提取的信号应用预先确定的阈值，其中所述阈值是区分准确提取的信号与错误提取的信号的信号强度；
步骤(bc-2)，若与第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号与阈值相交，则进行步骤(c)，或者若与第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号不与阈值相交，则不进行步骤(c)，而将所提取的信号作为分析信号提供。
3.根据权利要求1所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，在与靶核酸序列有关的适当地提取的信号示出在样品中靶核酸的存在下增加的信号模式的情况下，上述所选择的周期为具有最小信号值的周期；或者在与靶核酸序列有关的适当地提取信号示出样品中靶核酸的存在下减少的信号模式的情况下，上述所选择的周期为具有最大信号值的周期。
4.根据权利要求1所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述方法还包括将从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值作为分析信号提供之前进行修饰的步骤。
5.根据权利要求4所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述修饰包括上移或下移从所选择的上述周期到最后周期的信号值的步骤。
6.根据权利要求1所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述方法还包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的多个信号值调整到不影响确定第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的程度并将所调整的上述多个信号值与从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值组合来作为分析信号提供的步骤。
7.根据权利要求6所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述调整包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的多个信号值调整到背景水平的步骤。
8.根据权利要求6所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述调整包括将从第一个周期到所选择的周期的上一个周期的多个信号值调整到与所选择的周期中的信号值实际上相同的步骤。
9.根据权利要求6所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述方法还包括在将从第一个周期到所选择的周期的上一个调整的多个信号值及从所选择的周期到最后周期的多个信号值作为分析信号提供之前进行修饰的步骤。
10.根据权利要求9所述的提供用于确定样品中靶核酸序列的存在的分析信号的方法，其特征在于，上述修饰包括上移或下移从第一个周期到所选择的周期的上一个调整的多个信号值及从所选择的周期到最后周期的多个信号值的步骤。
11.一种计算机可读存储介质，包含用于实现处理器的指令，上述处理器执行用于提供样品中与第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的分析信号的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，在相对高温检测温度及相对低温检测温度下从样品接收信号值；
通过第一信号产生机构检测样品中第一靶核酸序列，并且通过第二信号产生机构检测样品中第二靶核酸序列；
上述各个信号产生机构包含具有标记的寡核苷酸；
上述第一信号产生机构在相对高温检测温度及相对低温检测温度下产生信号，第二信号产生机构在相对低温检测温度下产生信号；
上述检测在靶扩增反应的一个以上的周期中进行，从而分别在上述一个以上的周期中获得信号值；
由上述两个信号产生机构产生的信号不被检测器分辨；
步骤(b)，
(1)由下述数学式I-3或I-4提取与第一靶核酸序列有关的信号：
式I-3：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号)×(第二基准值)]；
式I-4：与第一靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对高温检测温度下信号]－[(在步骤a中获得的相对低温检测温度下信号)÷(第二基准值)]；
上述第二基准值：
是表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第二信号产生机构提供的信号的变化关系的值，且
如下确定：
(i)在与步骤(a)中的容器不同的容器中用上述第二信号产生机构培养仅包含上述第二靶核酸序列的对照样品，
(ii)在相对高的检测温度和相对低的检测温度下检测信号，及
(iii)计算在相对高的检测温度和相对低的检测温度下的信号强度之比；或
(2)由下述数学式I-1或I-2提取与第二靶核酸序列有关的信号：
式I-1：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号)×(第一基准值)]；
式I-2：与第二靶核酸序列有关的所提取的信号＝[在步骤a中获得的相对高温检测温度下的信号]－[(在步骤a中获得的相对低温检测温度下的信号)÷(第一基准值)]；
上述第一基准值：
是表示在相对高温检测温度及相对低温检测温度下由第一信号产生机构提供的信号的变化关系的值，且
如下确定：
(i)在与步骤(a)中的容器不同的容器中用上述第一信号产生机构培养仅包含上述第一靶核酸序列的对照样品，
(ii)在相对高的检测温度和相对低的检测温度下检测信号，及
(iii)计算在相对低的检测温度下的信号强度与在相对高的检测温度下的信号强度之比；
步骤(c)，从与上述第一靶核酸序列或第二靶核酸序列有关的所提取的信号中选择具有最大信号值或最小信号值的周期；以及
步骤(d)，提供从所选择的上述周期到最后周期的多个信号值作为第一靶核酸序列或第二靶核酸序列的存在的确定的分析信号。
12.一种用于提供样品中与靶核酸序列有关的分析信号的装置，其特征在于，包括：(a)计算机处理器；以及(b)与上述计算机处理器相连接的权利要求11的计算机可读存储介质。
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