CN107208139B - 与靶核酸序列有关的信号的分辨 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与靶核酸序列有关的感兴趣的信号的分辨。在本发明中，通过使用数学方程式来获得在检测温度下检测出的总信号中所包括的个别信号值(即，变数)。基于方程式解法的本发明能够以系统性方式获得个别信号值，从而更准确地、方便地提供分析结果。

Description

与靶核酸序列有关的信号的分辨
技术领域
本发明涉及与靶核酸序列有关的感兴趣的信号的分辨。
背景技术
为了检测靶核酸序列，作为实时检测方式广泛利用以一边监控靶扩增，一边可检测靶核酸序列的实时检测方法。通常，在实时检测方法中使用与靶核酸序列特异性杂交的已标志的探针或引物。作为使用已标志的探针及靶核酸序列之间的杂交的方法的例，包括使用具有发夹结构的双重标志的探针的分子信标(Molecular beacon)方法(Tyag i etal,Nature Biotechnology v.14MARCH 1996)、HyBeacon方法(F rench DJ et al.,Mol.Cell Probes,15(6):363-374(2001))、利用分别标志成供体及受体的2个探针的杂交探针方法(Bernad et al,147-148Clin Chem 2000；46)及使用单一标志的寡核苷酸的Lux方法(美国专利第7537886号)。在本技术领域中广泛利用TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)，上述TaqMan方法(美国专利第5210015号及第5538848号)利用借助双重标志的探针及脱氧核糖核酸(D NA)聚合酶的5’-核酸酶活性的上述探针的切割。
作为使用标志的引物的方法的例，包括日出(Sunrise)引物方法(Nazarenko etal,2516-2521Nucleic Acids Research,1997,v.25n o.12及美国专利第6117635号)、蝎形(Scorpion)引物方法(Whitco mbe et al,804-807,Nature Biotechnology v.17AUGUST1999及美国专利第6326145号)及TSG引物方法(WO第2011/078441号)。
作为代替接近法，提出使用以依赖于靶核酸序列的存在的方式形成的二聚体的实时检测方法，例如，侵入物(Invader)分析(美国专利第5691142号、美国专利第6358691号及美国专利第6194149号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO cleavage andextens ion)方法(WO第2012/096523号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(PCE-SH，PTO Cleavage and Extensi on-Dependent SignalingOligonucleotide Hybridization)方法(WO第2013/115442号)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(P CE-NH，PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization)方法(第PCT/KR2013/012312号)。
如上所述的现有实时检测技术在与靶扩增相关或无关的信号扩增过程中，在一个所选择的检测温度下检测从荧光标志产生的信号。根据现有实时检测技术，在一个反应管中利用单一类型的标志来检测多个靶核酸序列时，互不分辨针对靶核酸序列产生的多个信号。因此，为了检测多个靶核酸序列，在现有实时检测技术中一般利用不同类型的标志。在利用单一类型的标志的情况下，利用Tm值差异的解链分析可检测多个靶核酸序列，但是，解链分析具有如下缺点：解链分析的进行时间长于实时技术进行时间，且随着靶核酸序列的增加，使具有不同的Tm值的探针的设计变得越来越难。
因此，若开发不依赖于解链分析且在一个反应容器及单一类型的检测器中使用单一类型的标志来检测多个靶核酸序列的新方法或接近法，则能够以便利性、费用效果及效率性大大提高的方式检测多个靶核酸序列。并且，若结合上述新方法与其他检测方法(例如，解链分析)，则能够以效率大大提高的方式在一个反应容器中使用单一类型的标志检测多个靶核酸序列。
在本说明书全文中，参照了多篇专利及文献，并用括号表示了其引用。为了更加明确地说明本发明及本发明所属技术领域的水平，这种专利及文献的公开内容全部插入于本说明书作为参照。
发明内容
本发明人为了开发检测靶核酸序列的方法，尤其为了开发以更准确且简单的方式定性或定量地检测的方法而进行了努力研究。其结果确认，本发明人在检测温度下与靶核酸序列有关的信号后，通过使用适合的方程式来处理检测结果，从而能够以便利性、费用效果及效率性大大提高的方式在一个反应容器中利用单一类型的标志及单一类型的检测器检测多个靶核酸序列。
因此，本发明的一目的在于，提供对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法及试剂盒。
本发明的再一目的在于，提供对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法及试剂盒。
本发明的另一目的在于，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法。
本发明的还有一目的在于，提供计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法。
本发明的又一目的在于，提供用于对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的装置。
本发明的又一目的在于，提供用于对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的装置。
本发明的又一目的在于，提供计算机程序，运行用于执行对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法的处理器且储存于计算机可读存储介质。
本发明的又一目的在于，提供计算机程序，运行用于执行对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法的处理器且储存于计算机可读存储介质。
通过结合发明要求保护范围及附图和下述详细说明更加明确本发明的其他目的及优点。
附图说明
图1A示出在第一检测温度(60℃)及第二检测温度(72℃)下对第一靶核酸序列(淋病奈瑟氏菌的基因组脱氧核糖核酸，NG)、第二靶核酸序列(沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸，CT)及它们的组合进行检测的结果。通过TaqMan探针方法来产生与淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体有关的信号。NTC表示无模板的对照组。
图1B示出基于图1A的检测结果获得基准值。在第一检测温度下的信号对在第二检测温度下的信号的比率为基准值的一例。
图1C示出对解联立方程式1来得到的ST1D1及ST2D1进行绘制的结果。使用通过实验来获得基准值。虚线表示为了确认所获得的扩增曲线的重要性而参照图1A中的淋病奈瑟氏菌单独样品及沙眼衣原体单独样品的结果来确定的阈值。
图1D示出对解联立方程式2来得到的ST1D2及ST2D2进行绘制的结果。使用通过实验来获得的基准值。虚线表示阈值。
图2A示出在第一检测温度(60℃)及第二检测温度(72℃)下对第一靶核酸序列(淋病奈瑟氏菌的基因组脱氧核糖核酸，NG)、第二靶核酸序列(沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸，CT)及它们的组合进行检测的结果。通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法来产生与淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体有关的信号。NTC表示无模板的对照组。以在60℃及72℃的温度下提供感兴趣的信号的方式涉及与沙眼衣原体有关的信号产生机构，以在60℃的温度下提供感兴趣的信号的方式涉及与淋病奈瑟氏菌有关的信号产生机构。
图2B示出基于图2A的检测结果获得基准值。在第一检测温度下的信号对在第二检测温度下的信号的比率为基准值的一例。
图2C示出对解方程式组2(ST1D2＝0)来得到的ST1D1及ST2D1进行绘制的结果。虚线表示为了确认所获得的扩增曲线的重要性而参照图2A中的淋病奈瑟氏菌单独样品及沙眼衣原体单独样品的结果来确定的阈值。
图2D示出对解方程式组2(ST1D2＝0)来得到的ST1D2及ST2D2进行绘制的结果。虚线表示阈值。
图2E示出对解方程式组3来得到的ST1D1及ST2D1进行绘制的结果，在上述方程式组3中使用通过实验来获得的基准值。虚线表示阈值。
图2F示出对解方程式组3来得到的ST1D2及ST2D2进行绘制的结果，在上述方程式组3中使用通过实验来获得的基准值。虚线表示阈值。
图2G示出对解方程式组4来得到的ST1D1及ST2D1进行绘制的结果，在上述方程式组4中使用作为RVT1D1/D2的任意选择的常数值(arb itrary-selected constant value)。虚线表示阈值。
图2H示出对解方程式组4来得到的ST1D2及ST2D2进行绘制的结果，在上述方程式组4中使用作为RVT1D1/D2的任意选择的常数值。虚线表示阈值。
图3A及3B示出在3个检测温度(60℃、72℃及95℃)下对3个靶核酸序列[淋病奈瑟氏菌(NG)的基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体(CT)的基因组脱氧核糖核酸及生殖器支原体(MG)的基因组脱氧核糖核酸]及它们的组合进行检测的结果。通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法来产生与淋病奈瑟氏菌及沙眼衣原体有关的信号，通过T aqMan探针方法来产生与生殖器支原体有关的信号。
图3C示出基于图3A的检测结果获得基准值。检测温度之间的信号比率为基准值的一例。
图3D及3E示出对解联立方程式5来得到的ST1D1、ST2D1及ST3D1进行绘制的结果。使用通过实验来获得基准值。虚线表示为了确认所获得的扩增曲线的重要性而参照图3A中的淋病奈瑟氏菌单独样品、沙眼衣原体单独样品及生殖器支原体单独样品的结果来确定的阈值。
图3F及3G示出对解联立方程式6来得到的ST1D2、ST2D2及ST3D2进行绘制的结果。使用通过实验来获得基准值。虚线表示阈值。
图3H及3I示出对解联立方程式7来得到的ST1D3、ST2D3及ST3D3进行绘制的结果。使用通过实验来获得基准值。虚线表示阈值。
具体实施方式
本发明的最大的特征是在一个反应容器中使用单一类型的标志及单一类型的检测器检测多个靶核酸序列。在利用不同检测温度及用于解变数的数学方程式的本发明中，可在一个反应容器中利用单一类型的标志检测多个靶核酸序列。根据本发明的特征选择本发明的结构，并成为用于检测靶核酸序列的惊人的工艺。
在现有的实时聚合酶链式反应(PCR)方法中，为了在一个反应容器中检测2个靶核酸序列而需要2种类型的荧光标志或解链分析。
本发明可实现在一个反应容器中使用单一类型的荧光标志来检测2个靶核酸序列的实时聚合酶链式反应方案。
I.与2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号的分辨
在本发明的一实施方式中，提供对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法，包括：
步骤(a)，与用于检测第一靶核酸序列(T1)的第一信号产生机构及用于检测第二靶核酸序列(T2)的第二信号产生机构一同培养上述样品，在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下检测信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的感兴趣的信号对各个靶核酸序列不被单一类型的检测器(single type of detector)分辨；
步骤(b)，提供包括表示在各个检测温度下对上述2个靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述2个方程式：
(I)：ST1D1+ST2D1＝SD1
(II)：ST1D2+ST2D2＝SD2
在上述式中，(SD1)为在第一检测温度下检测的信号，(SD2)为在第二检测温度检测的信号；(ST1D1)为表示在第一检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST2D1)为表示在第一检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST1D2)为表示在第二检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST2D2)为表示在第二检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为4个；
步骤(c)，提供分别包括选自由上述4个变数(ST1D1)、(ST2D1)、(ST1D2)及(ST2D2)组成的组中的至少一个变数的2个附加方程式；
步骤(d)，为了分辨分配在上述2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的4个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答(solution)。
根据使用扩增曲线的现有的实时聚合酶链式反应方法，使用提供不被分辨的相同信号的信号产生机构来分辨多个靶核酸序列，从而无法进行检测，这是本发明所属技术领域的普通常识。
本发明克服与本技术领域的普通常识相关的局限，带来以大大得到改善的方式检测靶核酸序列的意想不到的结果。
在本申请中，将本发明的方法作为对分别与样品内2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号进行分辨的方法来表达，可选地，作为检测样品内2个靶核酸序列中的至少一个的方法或者通过在2个靶核酸序列中的至少一个分配感兴趣的信号中的至少一个来确定样品内2个靶核酸序列中的至少一个的存在的方法来表达。
在本申请中所使用的术语“感兴趣的信号”是指借助本发明被分辨的信号。最终检测出的信号可为多个信号之和。例如，在检测温度下最终检测出的信号可包括(i)来自与第一靶核酸序列(T1)有关的第一信号产生机构的信号及(ii)来自与第二靶核酸序列(T2)有关的第二信号产生机构的信号。(i)信号及(ii)信号分别为借助本发明被分辨的感兴趣的信号。例如，本发明的目的在于，从检测出的信号分辨(i)信号和/或(ii)信号。感兴趣的信号的这种分辨可使感兴趣的信号分配到2个靶核酸序列中的至少一个。其结果，可通过感兴趣的信号的分辨来确定靶核酸序列是否存在于样品内。
根据现有技术，由2个信号产生机产生的感兴趣的信号不对各个靶核酸序列进行分辨。有趣的是，在本发明中，在对由2个信号产生机构产生的感兴趣的信号进行分辨来使用单一类型的检测器的情况下，也可使感兴趣的信号分配在上述2个靶核酸序列。
并且，在本发明中，可更加系统性、可信性、简单的方式并使用数学方程式来分辨感兴趣的信号。
以下，对本发明进行详细的说明。
步骤(a)：与信号产生机构一同培养样品以及信号检测
与用于检测第一靶核酸序列(T1)的第一信号产生机构及用于检测第二靶核酸序列(T2)的第二信号产生机构一同培养所要分析的样品后，在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下检测来自上述第一信号产生机构及第二信号产生机构的信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的感兴趣的信号对各个靶核酸序列不被单一类型的检测器分辨。
本发明为了提供与靶核酸序列有关的信号而利用信号产生机构。借助相应的信号产生机构检测各个靶核酸序列。
在本申请中所使用的术语“信号产生机构”是指在产生用于表示靶核酸序列存在的信号的过程中所使用的任何物质，例如，其包括寡核苷酸、标志及酶。可选地，在本申请中所使用的术语“信号产生机构”是指利用用于产生信号的物质的任何方法。
根据本发明的一实例，在可产生基于信号产生机构的信号的条件下进行培养。这种条件包括溶温度、盐浓度及溶液的pH。
例如，作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含与靶核酸序列特异性杂交的寡核苷酸(例如，探针及引物)；在与靶核酸序列杂交的探针或引物被切割而释放片段的情况下，作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含与上述片段特异性杂交的捕捉寡核苷酸；在与上述捕捉寡核苷酸杂交的片段延伸而形成延伸链的情况下，作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸；作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含与上述捕捉寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸；以及作为信号产生机构使用的寡核苷酸包含它们的组合。
即使信号产生原理相同，也可将包含不同序列的寡核苷酸的信号产生机构视为互不相同的信号产生机构。
标志可与寡核苷酸相连接或者可以为自由形态。在延伸反应期间标志可插入于延伸产物。
例如，在信号产生中使用上述寡核苷酸的切割的情况下，酶包括5’-核酸酶、3’-核酸酶、尤其包括具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶、具有3’-核酸酶活性的核酸聚合酶或FEN核酸酶。
在本发明中，可使用多种物质以多种方式产生信号。
根据一实例，2个信号产生机构中的至少一个为以依赖于二聚体形成的方式产生信号的信号产生机构。
根据一实例，与各个靶核酸序列有关的信号产生机构为以依赖于二聚体形成的方式产生信号的信号产生机构。
根据一实例，上述二聚体包含双链靶核酸序列。
在本申请中所使用的与信号产生机构相关的术语“以依赖于二聚体形成的方式产生信号”是指以依赖于2个核酸分子的结合或解离的方式提供被检测出的信号。上述表达包括根据以依赖于靶核酸序列存在的方式形成的二聚体(例如，包含具有标志的检测寡核苷酸及核酸序列)提供信号。并且，上述表达包括通过抑制二聚体(例如，具有标志的检测寡核苷酸及核酸序列)的杂交来提供信号，上述抑制随着其他二聚体的形成而产生。
尤其，通过与靶核酸序列及上述靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸之间的二聚体的形成产生上述信号。
在本申请中所使用的术语“检测寡核苷酸”是参与产生被检测的信号的寡核苷酸。根据本发明的一实例，检测寡核苷酸包含参与产生实质信号的寡核苷酸。例如，其他寡核苷酸(例如，包含与靶核酸序列或检测寡核苷酸互补的核苷酸序列的寡核苷酸)和检测寡核苷酸的杂交或非杂交确定信号产生。
根据本发明的一实例，检测寡核苷酸包含至少一个标志。
基于靶核酸序列及检测寡核苷酸之间的二聚体形成的信号可通过包括蝎形方法(Whitcombe et al,Nature Biotechnology 17:804-807(1999))、日出(或Amplifluor)方法(Nazarenko et al,Nucleic Acids Research,25(12):2516-2521(1997)及美国专利第6117635号)、LUX方法(美国专利第7537886号)、叩诊槌(Plexor)方法(Sherrill C B,etal.,Journal of the American Chemical Society,126:4550-45569(2004))、分子信标方法(Tyagi et al,Nature Biotechnology v.14M ARCH 1996)、HyBeacon方法(French DJet al.,Mol.Cell Probes,15(6):363-374(2001))、相邻的杂交探针方法(Bernard,P.S.etal.,A nal.Biochem.,273:221(1999))及LNA方法(美国专利第6977295号)的多种方法产生。
尤其，通过以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体产生信号。
在本申请中所使用的术语“介导寡核苷酸”为介导生成不包含靶核酸序列的二聚体的寡核苷酸。
根据本发明的一实例，介导寡核苷酸的切割本身不产生信号，在进行介导寡核苷酸的杂交及切割之后，通过上述切割形成的片段参与用于产生信号的连续反应。
根据一实例，介导寡核苷酸的杂交或切割本身不产生信号。
根据本发明的一实例，介导寡核苷酸以与靶核酸序列杂交且被切割的方式释放片段，从而包含介导二聚体生成的寡核苷酸。尤其，上述片段在捕捉寡核苷酸中介导基于上述片段的延伸的二聚体的生成。
根据本发明的一实例，介导寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，包含与靶核酸序列非-互补的核苷酸序列。
根据本发明的一实例，介导寡核苷酸的切割释放片段，上述片段与捕捉寡核苷酸特异性杂交，并在上述捕捉寡核苷酸中延伸。
根据本发明的一实例，与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而释放片段，上述片段与捕捉寡核苷酸特异性杂交，上述片段以延伸的方式形成延伸链，这导致形成上述延伸链及捕捉寡核苷酸之间的延伸二聚体，从而提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，在使用包含与上述延伸链互补的杂交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情况下，上述第三寡核苷酸及延伸链的杂交通过形成其他类型的二聚体，来提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，在使用包含与捕捉寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的第三寡核苷酸的情况下，第三寡核苷酸及上述捕捉寡核苷酸之间的二聚体形成受到上述延伸链及上述捕捉寡核苷酸之间的二聚体形成的抑制，从而提供表示靶核酸序列存在的信号。
根据本发明的一实例，上述片段、上述延伸链、上述捕捉寡核苷酸、上述第三寡核苷酸或它们的组合可起到检测寡核苷酸的作用。
基于以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号可通过包括探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTO cleavage and extensi on)方法(WO 2012/096523)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(PTO Cleavage andExtension-Dependent Si gnaling Oligonucleotide Hybridization)方法(WO 2013/115442)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(PTO Cleavage and Extension-Dependent Non-Hybridization)方法(PCT/KR2013/012312)的多种方法产生。
与在上述的文献中公开的术语相关地，与寡核苷酸的相应的例如下：介导寡核苷酸与探测和标记寡核苷酸(PTO)相应，捕捉寡核苷酸与捕捉和模板化寡核苷酸(CTO)相应，第三寡核苷酸分别与信号转导寡核苷酸(SO)或杂交寡核苷酸(HO)相应。信号转导寡核苷酸、杂交寡核苷酸、捕捉和模板化寡核苷酸、延伸链或它们的组合可起到检测寡核苷酸的作用。
以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号包含以由以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体抑制其他二聚体的形成的方式提供的信号(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交)。
例如，当通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方式产生基于以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号时，信号产生机构包含：上游寡核苷酸，包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；探测和标记寡核苷酸；捕捉和模板化寡核苷酸；适合的标志以及具有5’-核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶。探测和标记寡核苷酸包含：(i)3’-靶向部位，包含与靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；以及(ii)5’-标记部位，包含与靶核酸序列非互补的核苷酸序列。捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列；以及(ii)模板化部位，包含与探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位及3’-靶向部位非互补的核苷酸序列。
基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法的产生信号的特定例包括如下步骤。
包括：步骤(a)，使靶核酸序列与上游引物及探测和标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸的条件下，使步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶相接触；上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸的切割，上述切割释放包含上述探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸释放的片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交；从上述捕捉和模板化寡核苷酸释放的片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，利用上述步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶进行延伸反应；通过使与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段延伸来形成延伸二聚体，上述延伸二聚体具有可通过(i)上述片段的序列和/或长度、(ii)上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度、(ⅲ)上述片段的序列和/或长度及上述捕捉和模板化寡核苷酸的序列和/或长度调节的Tm值，上述延伸二聚体根据(i)与上述片段和/或上述捕捉和模板化寡核苷酸相连接的至少一个标志、(ii)在延伸反应期间插入于延伸二聚体内的标志、(ⅲ)在延伸反应期间插入于延伸二聚体内的标志及与片段和/或捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标志或(ⅳ)插入标志提供靶信号；以及步骤(e)，上述延伸二聚体在维持其双链形态的预先确定的温度下测定靶信号，由此检测上述延伸二聚体，上述延伸二聚体的存在表示靶核酸序列的存在。在这种情况下，在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复实施上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
在语句“在反复循环之间变性”中，术语“变性”是指将双链核酸分子解离成单链核酸分子。
在探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法的步骤(a)中，替代上游寡核苷酸可使用用于扩增靶核酸序列的引物组。在这种情况下，在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
在使与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的探测和标记寡核苷酸片段延伸而形成延伸链后，探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法可分类为检测上述延伸的过程。探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法的特征在于，使用延伸链及捕捉和模板化寡核苷酸之间的二聚体检测延伸链的形成。
还存在检测延伸链形成的其他接近法。例如，可利用与上述延伸链特异性杂交的寡核苷酸，来检测延伸链的形成(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法)。在这种方法中，信号可从(i)连接在与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标志、(ii)连接在与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标志及与探测和标记寡核苷酸片段相连接的标志、(iii)连接在与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标志及在延伸反应期间插入于延伸链的标志或(iv)连接在与延伸链特异性杂交的寡核苷酸的标志及嵌入染料提供。可选地，信号可从(i)与延伸链相连接的标志或(ii)嵌入染料提供。
可选地，通过检测用于抑制与捕捉和模板化寡核苷酸及上述捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸之间的杂交的其他方法(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法)检测延伸链形成。将这种抑制视为用于表示靶核酸序列的存在。信号可从(i)连接在可与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的寡核苷酸的标志、(ii)与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标志、(iii)连接在可与捕捉和模板化寡核苷酸杂交的寡核苷酸的标志及与捕捉和模板化寡核苷酸相连接的标志或(iv)嵌入染料提供。
根据一实例，可与捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸具有与探测和标记寡核苷酸片段重叠的序列。
根据一实例，检测寡核苷酸包含：可与延伸链特异性杂交的寡核苷酸(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法)及可与捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法)。根据一实例，检测寡核苷酸包含在反应期间生成的延伸链或捕捉和模板化寡核苷酸。
通常，基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法伴随依赖于靶核酸序列的存在的延伸链的形成。在本申请中为了包括用于提供信号的多种方法使用术语“基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法”，上述多种方法包括通过探测和标记寡核苷酸的切割及延伸形成延伸链的步骤。
基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法产生信号的例包括如下的步骤，即，包括：步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游引物及探测和标记寡核苷酸杂交；步骤(b)，在用于上述探测和标记寡核苷酸的切割的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的酶与相接触，上述上游寡核苷酸或其延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的酶的探测和标记寡核苷酸的切割，上述切割释放包含探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分的片段；步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸释放的片段与捕捉和模板化寡核苷酸杂交，从上述探测和标记寡核苷酸释放的片段与捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；步骤(d)，使用步骤(c)的结果物及模板-依赖性核酸聚合酶进行延伸反应，与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交的片段被延伸，来形成延伸链；以及步骤(e)，通过检测与延伸链的存在依赖性地产生的信号来检测上述延伸链的形成。在步骤(a)中，替代上述上游寡核苷酸可使用用于扩增靶核酸序列的引物组。在这种情况下，在上述基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，在反复循环之间还包括变性，来反复实施上述步骤(a)～步骤(e)的全部或一部分。
根据一实例，基于二聚体的形成产生的信号包括基于二聚体杂交(例如，二聚体本身的杂交或第三寡核苷酸的杂交)被诱导的信号或基于抑制因二聚体形成而引起的第三寡核苷酸的杂交而被诱导的信号。
根据一实例，与靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列有关的信号产生机构是基于以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚体的信号产生机构。
根据一实例，与各个靶核酸序列有关的信号产生机构是基于以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成二聚体的信号产生机构。
根据一实例，在2个信号产生机构中的至少一个信号产生机构为以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构。
根据一实例，与各个靶核酸序列有关的信号产生机构为以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构。
尤其，在使检测寡核苷酸和靶核酸序列杂交后，基于检测寡核苷酸的切割产生信号。
在使检测寡核苷酸与靶核酸序列杂交后，基于上述检测寡核苷酸的切割的信号可通过包括TaqMan探针方法(美国专利第5210015号及美国专利第5538848号)的多种方法产生。
在通过TaqMan探针方法产生信号的情况下，信号产生机构包含用于扩增靶核酸序列的引物组、具有适当的标志(例如，相互作用性双重标志)的TaqMan探针及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶。在靶扩增期间，与靶核酸序列杂交的TaqMan探针被切割，并产生表示上述靶核酸序列存在的信号。
通过TaqMan探针方法产生信号的特定例包括如下的步骤，即，包括：步骤(a)，使引物组及具有适当的标志(例如，相互作用性双重标志)的TaqMan探针与靶核酸序列杂交；步骤(b)，使用上述步骤(a)的结果物及具有5’-核酸酶活性的核酸聚合酶，来扩增靶核酸序列，上述TaqMan探针被切割而释放标志；以及步骤(c)，从所释放的上述标志检测信号产生。
尤其，信号以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式借助检测寡核苷酸的切割产生。
根据一实例，与靶核酸序列中的至少一个靶核酸序列有关的信号产生机构为以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式借助检测寡核苷酸的切割产生信号的信号产生机构。
根据一实例，与各个靶核酸序列有关的信号产生机构为以依赖于与靶核酸序列特异性杂交的介导寡核苷酸的切割的方式借助检测寡核苷酸的切割产生信号的信号产生机构。
根据本发明的一实例，在与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而释放片段的情况下，上述片段与检测寡核苷酸特异性杂交，上述片段诱导检测寡核苷酸的切割。
根据本发明的一实例，在与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸被切割而释放片段的情况下，上述片段被延伸而切割包含与捕捉寡核苷酸互补的杂交核苷酸序列的检测寡核苷酸。
基于以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式的检测寡核苷酸的切割的信号可通过包括侵入物分析(美国专利第5691142号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性切割(PCEC，PTO Cleavage and Exte nsion-Dependent Cleavage)方法(WO第2012/134195号)及在美国专利第7309573号中记载的方法等多种方法产生。尤其，在美国专利第7309573号中记载的方法可被视为使用基于切割的产生信号的基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中的一种。在上述探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法中，检测基于延伸链的形成与捕捉和模板化寡核苷酸特异性杂交的寡核苷酸的切割，从而可检测上述延伸链的形成。在侵入物分析中，借助介导寡核苷酸的切割形成片段，并且以无片段的延伸的方式诱导连续的切割反应。
根据本发明的一实例，在以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的情况下，检测寡核苷酸的切割诱导信号变化或者释放所要检测的已标志的片段。
在信号产生机构不仅基于检测寡核苷酸的切割产生信号，而且基于二聚体的形成而产生信号的情况下，只要上述信号产生机构使用于基于切割产生信号的过程中，就可被视为基于切割提供信号的信号发生机构。
在基于检测寡核苷酸的切割产生信号的情况下，可在任意温度下检测基于上述切割而被释放的标志。
根据本发明的实例，与靶核酸序列有关的信号产生机构是基于检测寡核苷酸的切割的信号产生机构及基于二聚体的形成的信号产生机构的组合。
根据一实例，检测寡核苷酸包含至少一个标志。
根据本发明的一实例，检测寡核苷酸可包含至少一个寡核苷酸。根据本发明的一实例，当检测寡核苷酸包含多个寡核苷酸形成时，上述检测寡核苷酸能够以多种方式具有标志。例如，多个寡核苷酸中的一个寡核苷酸可具有至少一个标志、多个寡核苷酸均可具有至少一个标志或者寡核苷酸的一个部位可具有至少一个标志而其它部位能够不具有标志。
借助2个信号产生机构产生的信号不被单一类型的检测器分辨。术语“不被单一类型的检测器分辨的信号”是指因它们的相同或实质上相同的信号特性(例如，光学特性、释放波长及电信号)而信号不被单一类型的检测器相互分辨。例如，针对2个靶核酸序列使用相同的标志(例如，FAM)且为了检测从FAM的释放波长而使用单一类型的检测器时，则无法以分辨的方式检测信号。
在本申请中所使用的术语“单一类型的信号”是指提供相同或实质相同的信号特性(例如，光学特性、释放波长及电信号)的信号。例如，FAM及CAL Fluor 610提供不同类型的信号。
在本申请中所使用的术语“单一类型的检测器”是指用于单一类型的信号的检测机构。在包括用于多个不同类型的信号的多个通道(例如，光电二极管)的检测器中，各个通道(例如，光电二极管)相当于“单一类型的检测器”。
根据本发明的一实例，2个信号产生机构包含相同的标志，来自上述标志的信号不被单一类型的检测器分辨。
在本发明中，有用的标志包括在本技术领域中公知的多种标志。例如，在本发明中，有用的标志包括单一标志、相互作用性双重标志、嵌入染料及插入(incorporating)标志。
例如，单一标志包括荧光标志、发光标志、化学发光标志、电化学标志及金属标志。根据一实例，单一标志根据是否存在于双链或者是否存在于单链来提供不同的信号(例如，不同的信号强度)。根据一实例，单一标志为荧光标志。在本发明中所使用的单一荧光标志的优选种类及结合位点公开在美国专利号第7537886号及美国专利号第7348141号中，且其相关启示事项全部包含在本申请中作为参照。例如，单一荧光标志包含JOE、FAM、TAMRA、ROX及基于荧光素的标志。单一荧光标志可通过多种方法与寡核苷酸相连接。例如，标志可通过包含碳原子的隔区(例如，3-碳间隔区、6-碳间隔区或12-碳间隔区)与探针相连接。
作为一个代表性的相互作用性标志系统，荧光共振能量转移(FR ET，fluorescence resonance energy transfer)标志系统包含荧光报道分子(供体分子)及猝灭分子(受体分子)。在荧光共振能量转移中，能量供体可以为荧光性，能量受体可以为荧光性或非-荧光性。在相互作用性标志系统的再一形态中，能量供体为非-荧光性，例如，发色团(chromophore)，能量受体为荧光性。在相互作用性标志系统的另一形态中，能量供体为发光性，例如为生物发光性、化学发光性或电化学反光性，受体为荧光性。相互作用性标志系统包含基于“接触-介导猝灭(on contact-mediated quenching)”的双重标志(Salvatore et al.,Nucleic Acids Research,2002(30)no.21e122及Johansson et al.,J.AM.CHEM.SOC 2002(124)pp 6950-6956)。相互作用性标志系统包含基于至少2个分子(例如，染料)之间的相互作用诱导信号变化的任何标志系统。
在本发明中，有用的报道分子及猝灭分子可包括在本发明所属技术领域中公知的任何分子。作为它们的例如下：Cy2TM(506)、YO-P ROTM-1(509)、YOYOTM-1(509)、Calcein(517)、FITC(518)、FluorXTM(519)、AlexaTM(520)、Rhodamine 110(520)、Oregon GreenTM500(522)、Oregon GreenTM488(524)、RiboGreenTM(525)、Rhodamine GreenTM(527)、Rhodamine123(529)、Magnes ium GreenTM(531)、Calcium GreenTM(533)、TO-PROTM-1(533)、TOTO1(533)、JOE(548)、BODIPY530/550(550)、Dil(565)、BODIPY TMR(568)、BODIPY558/568(568)、BODIPY564/570(570)、Cy3TM(570)、AlexaTM546(570)、TRITC(572)、Magnes iumOrangeTM(575)、Phycoerythrin R&B(575)、Rhodamine Phall oidin(575)、CalciumOrangeTM(576)、Pyronin Y(580)、Rhoda mine B(580)、TAMRA(582)、Rhodamine RedTM(590)、Cy3.5TM(596)、ROX(608)、Calcium CrimsonTM(615)、AlexaTM594(615)、Texas Red(615)、Nile Red(628)、YO-PROTM-3(631)、YOYOTM-3(631)、R-phycocyanin(642)、C-Phycocyanin(648)、TO-PROTM-3(660)、TOTO3(660)、DiD DilC(5)(665)、Cy5TM(670)、Thiadicarbocyanine(671)、Cy5.5(694)、HEX(556)、TET(536)、Biosearch Blue(447)、CALFluor Gold 540(544)、CAL Fluor Orange 560(559)、CAL Fluor Red 590(591)、CALFluor Red 610(610)、CAL Fluor Red 635(637)、FAM(520)、Fluorescein(520)、Fluorescein-C3(520)、Pulsar 650(566)、Qua sar 570(667)、Quasar 670(705)及Quasar705(610)。括号内的数字为纳米单位的最大释放波长。优选地，报道分子-猝灭分子包含JOE、FAM、TAMRA、ROX及基于荧光素的标志。
在如下多种文献中公开适合的荧光分子及适合的报道-猝灭对：Pe sce et al.，editors，Fluorescence Spectroscopy(Marcel Dekker，New York，1971)；White et al.，Fluorescence Analysis：A Practical App roach(Marcel Dekker，New York，1970)；Berlman，Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules，2nd Edition(Academic Press，New York，1971)；Griffiths，Color AND Constitution of Or ganicMolecules(Academic Press，New York，1976)；Bishop，edit or，Indicators(PergamonPress，Oxford，1972)；Haugland，Handbo ok of Fluorescent Probes and ResearchChemicals(Molecular Probes，Eugene，1992)；Pringsheim，Fluorescence andPhosphorescence(Int erscience Publishers，New York，1949)；Haugland，R.P.，Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，6th Edition(Mole cular Probes，Eugene，Oreg.，1996)美国专利第3996345号及第4351760号。
需要留意的是，在本发明中，可使用能够对多种范围的波长或特定波长的荧光进行猝灭的非-荧光猝灭分子(例如，黑猝灭分子或黑暗猝灭剂)。
在包含报道分子及猝灭分子的信号转导系统中，报道分子包含荧光共振能量转移的供体，猝灭分子包含荧光共振能量转移的另一伙伴(受体)。例如，将荧光素染料作为报道分子使用，将罗丹明染料作为猝灭分子使用。
相互作用性双重标志可与二聚体中的一条链相连接。当包含上述相互作用性双重标志的链维持单链状态时，上述链通过形成发夹或无规卷曲结构来诱导相互作用性双重标志之间的猝灭。当上述链形成二聚体时，猝灭减少。可选地，当相互作用性双重标志与位于邻近链的位置的核苷酸相连接时，产生相互作用性双重标志之间的猝灭。在上述链形成二聚体后被切割的情况下，猝灭减少。
各个相互作用性双重标志可分别与二聚体的两条链相连接。上述二聚体的形成诱导猝灭，二聚体的变性不诱导猝灭。可选地，在两条链中的一条链被切割的情况下，可不诱导猝灭。
在本发明中例示的有用的嵌入染料包含SYBRTMGreen I、PO-PR OTM-1、BO-PROTM-1、SYTOTM43、SYTOTM44、SYTOTM45、SYTOX TMBlue、POPOTM-1、POPOTM-3、BOBOTM-1、BOBOTM-3、LO-PROTM-1、JO-PROTM-1、YO-PROTM1、TO-PROTM1、SYTOTM11、SYTOTM13、SYTOTM15、SYTOTM16、SYTOTM20、SYTOTM23、TOTOTM-3、YOYO TM3、GelStarTM及噻唑橙。嵌入染料特异性地插入于双链核酸分子内来产生信号
在能够以在延伸期间插入标志的方式产生信号的过程中使用插入标志(例如，Plexor方法，Sherrill C B,et al.,Journal of the Ameri can Chemical Society,126:4550-45569(2004))。并且，在基于以依赖于与靶核酸序列杂交的介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号产生过程中也可使用插入标志。
通常，插入标志可与核苷酸相结合。并且，还可使用具有非-天然碱基的核苷酸。
在本申请中所使用的术语“非-天然碱基”是指如腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)等的天然碱基的衍生物，它们可形成氢键碱基对。在本申请中所使用的术语“非-天然碱基”作为母体化合物，包含具有与天然碱基不同的碱基对模式的碱基，例如，公开于美国专利第5432272号、美国专利第5965364号、美国专利第6001983号及美国专利第6037120号中。非-天然碱基之间的碱基对与天然碱基相同，具有2个或3个氢键。并且，非-天然碱基之间的碱基对还以特定方式形成。在非-天然碱基的特定例中，在碱基对组合中包含如下碱基：iso-C/iso-G、iso-dC/iso-dG、K/X、H/J及M/N(参照美国专利第7422850号)。
在通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法产生信号的情况下，在进行延伸反应期间插入的上述核苷酸可具有第一非-天然碱基，捕捉和模板化寡核苷酸可具有核苷酸，上述核苷酸具有对上述第一非-天然碱基产生特异性结合亲和性的第二非-天然碱基。
在本申请中所使用的术语“靶核酸”、“靶核酸序列”或“靶序列”是指用于检测或定量的感兴趣的核酸序列。靶核酸序列不仅包含单链序列，还包含双链序列。靶核酸序列不仅包含起初存在于核酸试样内的序列，还包含在反应中新生成的序列。
靶核酸序列可包含任意脱氧核糖核酸(基因组脱氧核糖核酸(gD NA)及互补脱氧核糖核酸(cDNA))、核糖核酸分子及它们的杂化体(嵌合核酸)。上述序列可以为双链或单链形态。在作为初始物质的核酸为双链的情况下，优选地，将上述两条链制备成单链或部分单链形态。作为用于链分离的公知的方法包含加热、碱、甲酰胺、尿素及乙二醛处理、酶方法(如解旋酶作用)及结合蛋白质，但并不局限于此。例如，链分离可在80℃～105℃的温度范围下进行加热来实现。用于实现这种处理的常规方法由文献[Joseph Sambrook,et al.,Molec ular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)]提供。
当将信使核糖核酸(mRNA)用作初始物质时，在进行退火步骤之前必需进行反转录步骤，在文献[Joseph Sambrook,et al.,Molecula r Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Pre ss,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)；及Noonan,K.F.et al.,Nuclei c Acids Res.16:10366(1988)]中确认其相关详细内容。为了实现反转录，可利用能够与信使核糖核酸的聚腺苷酸尾杂交的寡核苷酸dT引物、随机引物或靶特异性引物。
靶核酸序列包含任何天然原核细胞核酸、真核细胞核酸(例如，原生动物和寄生虫、真菌类、酵母、高等植物、低等动物及包含哺乳动物和人类的高等动物)、病毒(例如，疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、EB病毒、肝炎病毒以及脊髓灰质炎病毒等)核酸或类病毒核酸。并且，核酸分子可以为通过重组生产的或可生产的任何核酸分子或化学合成或可化学合成的任何核酸分子。因此，可在自然中发现或无法发现核酸分子。靶核酸序列可包含已知或未知的序列。
在本申请中所使用的术语“样品”是指可根据本发明而利于评价的生物学样品或来自任意其他介质的任意细胞、组织或流体，其包含病毒、细菌、组织、细胞、血液、血清、血浆、淋巴、牛奶、小便、粪便、眼内液、唾液、精液、脑提取物、脊髓液(SCF)、阑尾、脾脏及扁桃组织提取物、羊水、腹水及非-生物学样品(例如，食品、水及土壤)。并且，样品包含从生物学供给源绝缘的自然核酸分子及合成核酸分子。
信号包括在信号检测中的多种信号特征，例如信号强度(例如，R FU(相对荧光单位)值或进行扩增的情况下，特定循环、被选择的循环或在端点中的RFU值)、信号变化形状(或图案)或Ct值或对上述特征进行数学处理来获得的值。
根据一实例，与基准值或样品分析相关的术语“信号”不仅包含在检测温度下获得的信号本身，而且包含通过对上述信号进行数学处理来提供的变形的信号。
根据本发明的一实例，在通过实时聚合酶链式反应(PCR)获得扩增曲线的情况下，为了在各个检测温度下分辨信号值(或特征)及检测靶核酸序列而可选择并使用从扩增曲线的多种信号值(或特征)(强度、Ct值或扩增曲线数据)。
根据本发明的一实例，可在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行步骤步骤(a)。根据本发明的一实例，以无核酸扩增的方式，在信号扩增过程中进行步骤(a)。
在本发明中，由信号产生机构产生的信号可与靶扩增一同进行扩增。可选地，在无靶扩增的情况下，信号可被扩增。
根据本发明的一实例，信号产生与靶扩增一同在包含信号扩增的过程中实施。
根据本发明的一实例，根据聚合酶链式反应实施靶扩增。为了靶扩增，在本发明所属技术领域中广泛利用聚合酶链式反应，聚合酶链式反应包括靶序列的变性、靶序列和引物之间的退火(杂交)及引物延伸的循环(Mullis et al.美国专利第4683195号、第4683202号及第4800159号；Saiki et al.,(1985)Science 230,1350-1354)。可通过在聚合酶链式反应的过程中适用上述的信号产生方法(例如，TaqMan方法及基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法)来扩增信号。根据一实例，本发明通过实时聚合酶链式反应方法提供信号。根据一实例，靶核酸序列的扩增通过聚合酶链式反应、连接酶链式反应(LCR，参照Wiedmann M,et al.,“Ligase chain reaction(LCR)-overview and a pplications.”聚合酶链式反应Methods and Applications 1994Feb；3(4):S51-64)、缺口填补连接酶链式反应(GLCR，参照WO第90/01069号、EP第439182号及WO第93/00447号)、Q-β复制酶扩增(Q-beta，Cahill P,et al.,Clin Chem.,37(9):1482-5(1991)，美国专利第5556751号)、链置换扩增(SDA，参照G T Walker et al.,Nucleic Aci ds Res.20(7):16911696(1992)，EP第497272号)、基于核酸序列的扩增(NASBA，Compton,J.Nature 350(6313):912(1991))，转录介导的扩增(TMA，参照Hofmann WP et al.,J Clin Virol.32(4):289-93(2005)；美国专利第5888779号)或滚环扩增(RCA，参照Hutchison C.A.et al.,Proc.NatlAcad.Sci.USA.102:1733217336(2005))实施。
上述记载的扩增方法可通过改变温度或者重复未改变温度的一系列反应来扩增靶序列。以“循环”表示包括重复一系列反应的扩增的单位。根据扩增方法能够以重复次数或时间表示循环的单位。
例如，可在扩增的各循环、选择的多个循环或反应的端点中进行信号检测。根据一实例，在至少2个循环中检测出信号的情况下，可在所有检测温度下或者在被选择的一部分的检测温度下实施各个循环中的信号检测。根据本发明的一实例，在奇数的循环中，在相对较高检测温度下进行检测，在偶数的循环中，在相对较高检测温度下进行检测。
根据本发明的一实例，在不仅可产生基于信号产生机构的信号，而且可实现靶扩增的条件下进行培养。
借助包含用于扩增的引物组及核酸聚合酶的靶扩增机构实现靶核酸序列的扩增。
根据本发明的一实例，可使用具有核酸酶活性(例如，5’核酸酶活性或3’核酸酶活性)的核酸聚合酶。根据本发明的一实例，可使用不具有核酸酶活性的核酸聚合酶。
本发明中，有用的核酸聚合酶为从各种细菌种得到的热稳定性脱氧核糖核酸聚合酶，上述脱氧核糖核酸聚合酶包含栖热水生菌(Therm us aquaticus(Taq))、极端嗜热菌(Thermus thermophilus(Tth))、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、黄栖热菌(Thermisflavus)、超好热性古细菌(Thermocus literalis)、典型嗜热菌(Thermus antranikianii)、卡德菲勒斯嗜热菌(Thermus caldophilus)、切拉罗菲勒斯嗜热菌(Thermuschliarophilus)、黄栖热菌(Thermus flavus)、火地栖热菌(Thermus igniterrae)、嗜齿菌(Thermus lacteus)、死亡嗜热菌(Thermus oshimai)、红栖热菌(Thermus ruber)、鲁本斯栖热菌(Thermus rubens)、水生栖热菌(Thermus scotoductus)、西凡纳斯热袍(Thermussilvanus)、栖热菌种Z05(Thermus species Z05)、栖热菌种sps 17(Thermus species sps17)、嗜热菌(Thermus ther mophilus)、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)、嗜热球菌(Thermococus litoralis)、巴罗西热袍菌(Thermococus bar ossi)、嗜热古细菌(Thermococus gorgonarius)、海栖热袍菌(Ther motoga maritima)、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)、非洲栖热腔菌(Thermosiphoafricanus)、沃氏热球菌(Pyrococus woe sei)、掘越氏热球菌(Pyrococus horikoshii)、深海热球菌(Pyrococ usabyssi)、隐蔽热网菌(Pyrodictium ocultum)、嗜火产液菌(Aqui fex pyrophilus)以及菌属超嗜热菌(Aquifex aeolieus)。尤其，热稳定性脱氧核糖核酸聚合酶为Taq聚合酶。
根据本发明的一实例，通过非对称性聚合酶链式反应实现靶核酸序列的扩增。可通过考虑下游寡核苷酸的切割或杂交来选择引物的比率。
根据本发明的一实例，在无核酸扩增的信号扩增工序中进行步骤(a)和/或步骤(b)。
在通过包括寡核苷酸的切割的方法产生信号的情况下，信号能够以无靶扩增的方式被扩增。例如，可通过CPT方法(Duck P,et al.,Biotechniques,9:142-148(1990))，侵入物分析(美国专利第6358691号及第6194149号)，基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法(例如，探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交方法、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交方法及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性切割方法)或CER方法(WO第2011/037306号)将步骤(a)实施为无靶序列的扩增的信号扩增。
上述的信号扩增方法可通过改变温度或者重复未改变温度的一系列反应来扩增靶序列。以“循环”表示包括重复一系列反应的信号扩增的单位。根据扩增方法能够以重复次数或时间表示循环的单位。
例如，可在扩增的各循环、选择的多个循环或反应的端点中进行信号的产生及检测。
在与提供信号的2个信号产生机构一同进行培养(反应)样品期间或之后，可通过使用如单一类型的检测器等检测器来检测信号。
可通过使用考虑用于检测多个靶核酸序列的检测温度的任意类型的信号产生机构来实施本发明。当存在靶核酸序列时，能够以均在2个检测温度下或仅在2个检测温度中的一个检测温度下提供信号的方式设计信号产生机构。在以仅在2个检测温度中的一个检测温度下提供信号的方式设计信号产生机构的情况下，信号产生机构在更低的温度下提供信号为有利。
根据一实例，借助可在所有检测温度下产生信号的信号产生机构检测2个靶核酸序列中的各个靶核酸序列。
根据一实例，借助可在一个检测温度下产生信号的信号产生机构检测2个靶核酸序列中的第一靶核酸序列，借助可在2个检测温度下产生信号的信号产生机构检测2个靶核酸序列中的第二靶核酸序列。
根据一实例，考虑可由信号产生机构产生信号的温度范围来预先确定检测温度。
在本发明中，利用存在能够以依赖于信号产生机构的方式产生信号的特定温度范围。
例如，当2个核酸分子之间进行杂交(或结合)时，信号产生机构产生信号，当它们之间进行非-杂交(或解离)时，在不产生信号的情况下，虽然在可实现2个核酸分子之间的杂交的温度下产生信号，但在2个核酸分子之间无法进行杂交的温度下不产生信号。如上所述，存在可产生信号(即，信号检测)的特定温度范围及不能够产生信号的其他温度范围。上述温度范围受在信号产生机构所使用的2个核酸分子的杂交物的Tm值的影响。
在利用使用切割后具有标志的被切割的片段的信号产生方法的情况下，在理论上，可在任何温度(例如，30～99℃)下检测信号。
检测温度选自可由信号发生机构产生信号的温度范围。
根据一实例，用于检测靶核酸序列的信号产生机构可以为在2个检测温度下提供互不相同的信号(例如，信号强度)或不同信号变化图案(例如，信号强度的变化程度)的信号产生机构。
根据一实例，在利用以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构(例如，TaqMan探针方法)情况下，在基于检测寡核苷酸和靶核酸序列的杂交的信号产生和/或来自染料的信号产生可受温度的影响的方面上，来自信号产生机构的信号可随着检测温度而不同。例如，利用荧光报道分子及猝灭分子标志的探针可根据检测温度产生不同的信号，与相对较高检测温度相比，可在相对较低检测温度下产生更高的信号。
根据一实例，先制造与2个靶核酸序列有关的信号产生机构后，再设定与2个靶核酸序列有关的检测温度之后，进行步骤(a)。
根据本发明的一实例，在信号产生机构以依赖于二聚体形成的方式产生信号的情况下，基于二聚体的Tm值选择检测温度。
根据本发明的一实例，在信号产生机构以依赖于二聚体形成的方式产生信号的情况下，可通过调节二聚体的Tm值来控制检测温度。
例如，在基于与靶核酸序列特异性杂交的检测寡核苷酸(例如，L UX探针、分子信标探针、HyBecon探针及相邻的杂交探针)产生信号的情况下，通过调节寡核苷酸的二聚体的Tm值，来在预先确定的温度下成功地实现信号的检测。在使用蝎形引物的情况下，通过调节与延伸链杂交的部位的Tm值，来在预先确定的温度下成功地实现信号的检测。
在基于根据靶核酸序列的存在形成的二聚体来产生信号的情况下，通过调节二聚体的Tm值，来在预先确定的温度下成功地实现信号的检测。例如，在通过探测和标记寡核苷酸切割及延伸方法产生信号的情况下，在捕捉和模板化寡核苷酸上通过调节通过探测和标记寡核苷酸片段的延伸形成的延伸二聚体的Tm值，来在预先确定的温度下成功地实现信号的检测。
基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法具有可容易调节二聚体及通过上述二聚体对杂交起到影响的第三杂化体的Tm值的优点。
根据本发明的一实例，在信号产生机构以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的情况下，任意选择检测温度。即，可选择可检测出借助检测寡核苷酸的切割产生的信号的任一温度。如上所述，在以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的情况下，可在多种温度下检测借助上述切割释放的标志。
能够以均在2个检测温度下均提供信号的方式设计与2个靶核酸序列有关的信号产生机构。根据一实例，可选择TaqMan探针方法、基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法或它们的组合作为在2个检测温度下均提供信号的信号产生机构。
可选地，能够以均在2个检测温度下提供信号的方式设计与2个靶核酸序列中的一个有关的信号产生机构，能够以在一个检测温度下(尤其，在相对更低的温度下)提供信号的方式设计与其他靶核酸序列有关的信号产生机构。根据一实例，以能够均在2个检测温度下提供信号的方式选择TaqMan探针方法、基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法，以能够在一个检测温度下提供信号的方式选择基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸的方法。
在本发明中所使用的检测器包括可检测信号的任何机构。例如，在使用荧光信号的情况下，可将适合于检测荧光信号的光电二极管作为检测器来使用。使用单一类型的检测器的检测意味着可检测单一类型的信号的检测器或者使用具有多个通道(即，光电二极管)的检测器的各个通道(即，光电二极管)来进行检测。
根据一实例，信号的产生包括从标志“产生或消灭信号”以及“信号增加或减少”。
步骤(b)：包括表示感兴趣的信号的变数的方程式的建立
提供包括表示在各个检测温度下对2个靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述2个方程式:
(I)：ST1D1+ST2D1＝SD1
(II)：ST1D2+ST2D2＝SD2
在上述式中，(SD1)为在第一检测温度下检测的信号，(SD2)为在第二检测温度检测的信号；(ST1D1)为表示在第一检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST2D1)为表示在第一检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST1D2)为表示在第二检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST2D2)为表示在第二检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为4个。
作为在第一检测温度(D1)下检测出的信号的(SD1)由作为在第一检测温度(D1)下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的(ST1D1)及作为在第一检测温度(D1)下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的(ST2D1)组成。作为在第一检测温度(D2)下检测出的信号的(SD2)由作为在第二检测温度(D2)下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的(ST1D2)及作为在第一检测温度(D2)下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的(ST2D2)组成。
(SD1)及(SD2)可为由检测器测定的信号，即，可为常数值。(S T1D1)，(ST2D1)，(ST1D2)及(ST2D2)为将所获得的未知变数。本发明涉及使用所测定的信号(SD1)及(SD2)来得到对变数(ST1D1)、(S T2D1)、(ST1D2)及(ST2D2)中的至少一个的解答的方法。
步骤(c)：附加方程式的建立
之后，提供分别包括选自由上述4个变数(ST1D1)、(ST2D1)、(ST1D2)及(ST2D2)组成的组中的至少一个变数的2个附加方程式。
建立2个方程式(I)及(II)后，再建立2个附加方程式，由此，为了通过数学处理来得到对方程式(I)及(II)中的变数中的至少一个(尤其，变数中的至少2个，更尤其，所有变数)的解答，而提供共4个方程式。
例如，在使上述2个附加方程式具有与方程式(I)及(II)相同的变数组的情况下(即，方程式(I)及(II)转换为联立方程式)，可通过解上述联立方程式(尤其，具有2个变数的线性联立方程式)来得到对方程式(I)及(II)中的变数中的至少一个的解答。可选地，可通过与解上述联立方程式的方法不同的方式来得到对方程式(I)及(II)中的变数中的至少一个的解答。
根据一实例，上述2个附加方程式选自由下述方程式组成的组中：
(III)：f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)，
(IV)：f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)，以及
(V)：ST1D2＝任意选择值
在上述式中，RVT1(D1D2)为表示在第一检测温度及第二检测温度下借助第一信号产生机构提供的信号变化关系(relationship of chang e)的第一靶核酸序列(T1)的基准值(RV)，RVT2(D1D2)为表示在第一检测温度及第二检测温度借助第二信号产生机构提供的信号变化关系的第二靶核酸序列(T2)的基准值(RV)；f(ST1D1，ST1D2)表示S T1D1及ST1D2的函数；f(ST2D1，ST2D2)表示ST2D1及ST2D2的函数；
当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，可选择方程式(V)中的ST1D2＝任意选择值。
根据本发明的一实例，在选择方程式(V)的情况下，不选择方程式(III)作为附加方程。
前述的实例说明用于得到对方程式(I)及(II)中的变数中的至少一个的解答的2个接近法。
第一接近法为使用方程式(III)及(IV)作为2个附加方程式。
有趣的是，本发明人确认，在一个反应容器中，在表示预先确定靶核酸序列的存在的2个检测温度下检测出的情况下，以特定关系(图案或者规则)存在信号变化。例如，针对靶核酸序列，在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号之间的信号变化呈特定关系(图案或者规则)。例如，上述信号的强度可相同或实质上相同，或者上述信号的强度虽然互不相同，但在2个检测温度下，可在特定范围内。
在本发明中，将上述发现适用于获得基准值并分辨与靶核酸序列有关的感兴趣的信号的过程中。仅以使检测温度不同的方式检测与靶核酸序列有关的信号(例如，无靶含量的变化或者无缓冲液条件的变化)，因此在2个检测温度之间的信号变化中存在特定关系(图案或者规则)。根据一实例，在允许在2个检测温度之间的与靶核酸序列有关的信号变化的特定关系(图案或者规则)的条件下实施本发明的方法。
靶核酸序列的“基准值(RV)”表示在2个检测温度下借助用于检测靶核酸序列的信号产生机构提供的信号变化的关系。
根据一实例，在使用RV值的情况下，在一个检测温度下的信号可表现在其他检测温度下的信号的方面。
在方程式(III)及(IV)中，作为基准值，RVT1(D1D2)及RVT2(D1D2)为预先确定的值。根据一实例，可通过使用与靶核酸序列相应的标准物质来获得基准值。例如，与相应的信号查收能你机构一同培养与靶核酸序列相应的标准物质后，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号后，获得在第一检测温度及第二检测温度下的信号变化关系。信号变化关系可表示为在第一检测温度及第二检测温度检测出的信号之间的差异。
通过对在第一检测温度及第二检测温度下借助信号产生机构提供的信号进行数学处理来获得基准值。这种数学处理为信号的函数。只要是为了获得基准值而使用的函数提供在第一检测温度及第二检测温度下借助信号产生机构提供的信号变化关系，上述函数包括任何函数。例如，函数可解析为信号的加法、乘法、减法及除法等数学处理。
在第一检测温度及第二检测温度下提供的信号的特征本身可使用于获得在第一检测温度及第二检测温度下的信号变化关系的过程中。可选地，可通过对上述信号的特征进行数学处理来使在第一检测温度及第二检测温度下的信号变形，并将上述信号特征使用于获得在第一检测温度及第二检测温度下的信号变化关系的过程中。
可选地，可使初期所获得的基准值变形，可作为基准值来使用。
根据一实例，与基准值相关的术语“信号”不仅包含在检测温度下获得的信号本身，还包含通过对信号进行数学处理来提供的变形的信号。
如上所述，作为基准值，RVT1(D1D2)及RVT2(D1D2)为预先确定的值，因此，RVT1(D1D2)及RVT2(D1D2)可起到(i)用于将方程式(I)及(II)中的2个变数(ST1D1)及(ST1D2)转换为选自上述2个变数中的一个变数的转换子及(ii)用于将方程式(I)及(II)中的2个变数(S T2D1)及(ST2D2)转换为选自上述2个变数中的一个变数的转换子作用。
根据一实例，方程式(III)使用于将方程式(I)及(II)中的2个变数(ST1D1)及(ST1D2)转换为选自上述2个变数中的一个变数的过程中，方程式(IV)使用于将方程式(I)及(II)中的2个变数(S T2D1)及(ST2D2)转换为选自上述2个变数中的一个变数的过程中。
根据一实例，上述2个附加方程式中的一个选自方程式(III)中，另一个选自方程式(IV)中。
能够以多种方式获得在本发明中所用的基准值。例如，可将预测值作为基准值来提供。考虑靶序列、信号产生机构及检测温度，可预测表示在第一检测温度及第二检测温度下的信号变化关系的基准值。可选地，可通过实施用于获得基准值的实验来将实验性值或实际性值作为基准值来提供。
根据一实例，(i)通过如下步骤获得RVT1(D1D2)：步骤(i-1)，与用于检测第一靶核酸序列的第一信号产生机构一同培养第一靶核酸序列；步骤(i-2)，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号；步骤(i-3)，获得在上述第一检测温度下检测出的信号及在上述第二检测温度下检测出的信号之间的差异，(ii)通过如下步骤获得RVT2(D1D2)：步骤(ii-1)，与用于检测第二靶核酸序列的第二信号产生机构一同培养第二靶核酸序列；步骤(ii-2)，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号；步骤(ii-3)，获得在上述第一检测温度下检测出的信号及在上述第二检测温度下检测出的信号之间的差异，上述RVT1(D1D2)与RVT2(D1D2)不同。
在获得基准值中，术语“在第一检测温度及第二检测温度下检测出的信号之间的差异”为在第一检测温度及第二检测温度下的信号变化关系的一实例。
根据一实例，在第一检测温度及第二检测温度下检测出的信号之间的差异包含对在第一检测温度下检测出的信号及在第二检测温度下检测出的信号进行数学处理来获得的差异。
根据一实例，在进行数学处理的情况下，信号的特征为应易于数学处理。在特定实例中，数学处理包括使用信号的计算(例如，加法、乘法、减法及除法)或者获得来源于信号的其他值的数学处理。
在第一检测温度及第二检测温度下的信号之间的差异可表现在多种方面。例如，可通过具有数值、信号的存在/不存在或信号特征的绘制表示上述差异。
可通过多种计算方法及它们的变形来进行用于获得差异的信号的数学处理。
尤其，可通过计算在第一检测温度及第二检测温度下的信号之间的比率来进行用于获得差异的信号的数学处理。
例如，可将在第二检测温度下检测出的信号的端点(end-point)对在第一检测温度下检测出的信号的端点强度的比率作为基准值来使用。
根据本发明的一实例，用于获得信号之间的差异的信号的数学处理相当于计算在相对较低检测温度下检测出的信号对较高检测温度下检测出的信号的比率。根据本发明的一实例，用于获得信号之间的差异的信号的数学处理相当于计算在相对较高检测温度下检测出的信号对较低检测温度下检测出的信号的比率。
根据一实例，可通过计算在相对较高检测温度下检测出的信号及在相对较低检测温度下检测出的信号之间的减法来获得基准值。
可利用多种方式进行用于获得差异的数学处理。可通过使用机器来进行数学处理。例如，可借助检测器或实时聚合酶链式反应装置内的处理器以数学方式处理信号。可选地，尤其，可根据预选确定的算法以手写、数学方式处理信号。
根据本发明的一实例，RVT1(D1D2)与RVT2(D1D2)不同。根据本发明的一实例，以使RVT1(D1D2)与RVT2(D1D2)不同的方式设计第一信号产生机构及第二信号产生机构。
在RV值互不相同的情况下，记述差异程度的定量性表述可随着计算RV值的接近法而不同。
根据一实例，根据共同的计算方法处理用于获得基准值的信号来可提供用于比较的基准值之后，使用用于比较的上述基准值，来可获得2个基准值之间的差异程度。根据一实例，共同计算方法为2个信号的除法。
例如，为了通过本发明的方法来获得在分析信号中所使用的基准值而根据减法对2个信号进行处理的情况下，为了获取用于比较的基准值而可根据除法对上述2个信号进行处理。
根据一实例、RVT1(D1D2)比RVT2(D1D2)至少还大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。可选地，RVT2(D1D2)比RVT1(D1D2)至少还大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。
根据一实例，在为了确定第一基准值是否与第二基准值相同而进行比较的情况下，根据除法计算上述基准值。根据一实例，用于确定第一基准值是否与第二基准值相同的基准值的计算方法可与用于检测靶核酸序列的基准值的计算方法相同或不同。
根据本发明的一实例，用于基准值的信号产生机构可与用于检测靶核酸序列的信号产生机构相同。
根据一实例，用于获得基准值的培养条件与用于分析样品的培养条件相同。
针对靶核酸序列，可在包括成分(例如，靶核酸序列、信号产生机构、酶或三磷酸脱氧核苷酸(dNTP))的量、缓冲液pH或反应时间的多种反应条件下获得基准值。根据本发明的一实例，可在反应结束时提供饱和信号，因此可在充分的反应条件下获得基准值。根据本发明的一实例，在计算基准值获得的信号之间的差异具有特定范围，在上述特定范围内或者参照上述特定范围来选择基准值。根据本发明的一实例，可选择上述特定范围的最大值或最小值作为基准值或者参照上述特定范围的最大值或最小值来选择基准值。尤其，考虑到在多种条件下获得的上述基准值的标准变化、允许误差范围、特异度或敏感度，可使基准值变形。
在“f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)或f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)”中，可通过用于计算RVT1(D1D2)或RVT2(D1D2)的数学表达来解析f(ST1D1，ST1D2)或f(ST2D1，ST2D2)。
根据一实例，f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)包括ST1D1/ST1D2＝RV T1D1/D2(VI)或ST1D2/ST1D1＝RVT1D2/D1(VII)；f(ST2D1，ST2D2)＝RV T2(D1D2)包括ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2(VIII)或ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1(I X)。
在使用在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下的信号之间的比率来获得RV的情况下，可通过用于计算信号之间的比率的数学表达来解析f(ST1D1，ST1D2)或f(ST2D1，ST2D2)。在术语“RVT1(D1D2)”中，T1(D1D2)表示计算出的RV相应于与通过计算在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下的信号之间的差异来获得的第一靶核酸序列(T1)有关的基准值。当确定计算RV的方法时，可考虑上述计算方法来具体表达术语“T1(D1D2)”。
例如，术语“RVT1D1/D2”是指与通过计算在第一检测温度(D1)下检测出的信号对在第二检测温度(D2)下检测出的信号的比率来获得的第一靶核酸序列(T1)有关的基准值。可选地，术语“RVT1D2/D1”是指与通过计算在第二检测温度(D2)下检测出的信号对在第一检测温度(D1)下检测出的信号的比率来获得的第一靶核酸序列(T1)有关的基准值。
根据一实例，通过如下步骤获得RVT1D1/D2：步骤(i-1)，与用于检测第一靶核酸序列的第一信号产生机构一同培养第一靶核酸序列；步骤(i-2)，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号；步骤(i-3)，之后，计算在上述第一检测温度下检测出的信号对在上述第二检测温度下检测出的信号的比率，在进行步骤(i-1)及(i-2)之后，通过计算在上述第二检测温度下检测出的信号对在上述第一检测温度下检测出的信号的比率来获得RVT1D2/D1，通过如下步骤获得RVT2D1/D2：步骤(ii-1)，与用于检测第二靶核酸序列的第二信号产生机构一同培养第二靶核酸序列；步骤(ii-2)，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号；步骤(ii-3)，之后，计算在上述第一检测温度下检测出的信号对在上述第二检测温度下检测出的信号的比率，在进行步骤(ii-1)及(ii-2)之后，通过计算在上述第二检测温度下检测出的信号对在上述第一检测温度下检测出的信号的比率来获得RVT2D2/D1。
根据一实例，用于获得(ST1D1)、(ST1D2)、(ST2D1)及(ST2D2)的2个附加方程式包括下述方程式(VI)及(VII)中的一个及下述方程式(VIII)及(IX)中的一个：
(VI)：ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
(VII)：ST1D2/ST1D1＝RVT1D2/D1
(VIII)：ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
(IX)：ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1。
根据一实例，在所选择的2个检测温度下，可提供用于计算与特定靶核酸序列有关的RV的多个方程式(例如，在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下与第一靶核酸序列(T1)有关的方程式(VI)及(VII))。根据一实例，在此情况下，仅选择多个方程式中的一个方程式作为附加方程式中的一个。
方程式(III)及(IV)与式(I)及(II)一同使用于得到对变数中的至少一个的解答的过程中。如实施例1及图1A-1D所例示，在f(ST1D1，ST1D2)为ST1D1/ST1D2且f(ST2D1，ST2D2)为ST2D1/ST2D2的情况下，用于得到对变数的解答的方程式组包括如下：
ST1D1+ST2D1＝SD1
ST1D2+ST2D2＝SD2
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
RVT1D1/D2及RVT2D1/D2为通过实验来预先确定的值，因此，可通过上述4个方程式来得到变数、(ST1D1)、(ST2D1)、(ST1D2)及(ST2D2)的解答。
可选地，可通过计算在第一检测温度下检测出的信号及在第二检测温度检测出的信号之间的减法来获得基准值。
在用于得到对方程式(I)及(II)中的变数中的至少一个的解答的第二接近法中，作为2个附加方程式，使用方程式[(III)及(V)]或[(IV)及(V)]。当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下实质上不产生信号的方式制备的情况下，可选择方程式(V)中的ST1D2＝任意选择值。
在适用方程式(V)的情况下，可将任意选择值作为ST1D2来使用。根据一实例，在将零(0)作为ST1D2来使用(ST1D2＝0)的情况下，便于本发明的实施方式。可选地，可将负常数或正常数作为ST1D2来使用(ST1D2＝负常数或正常数)。
对除(ST1D2)之外的变数的解答的数值可随着在方程式(V)中所使用的常数值而不同。但是，可注意到对变数的解答的数值具有使用作为ST1D2来选择的常数的数值计算的值。可选地，用于解变数的这种接近法可表示为对除(ST1D2)之外的变数的解答的数值为通过使用作为为了提取信号而使用的ST1D2的值被选择的常数来获得的结果。
因此，在任意常数适用于方程式(V)的情况下，也可在各个检测温度下对与各个靶核酸序列有关的信号进行分辨，相反，计算出的变数随着上述常数而不同。
尤其，为了获得数据集而在多个循环检测信号，在各个循环进行信号分辨后，在将信号分辨结果对所有循环进行绘制的情况下，绝对信号值可随着方程式(V)中常数发生改变。但是，在所有循环中，产生或不产生信号变化(例如，信号变化图案)的情况不发生改变，由此，可成功实现用于靶检测的信号分辨。
根据一实例，能够以所定义的方式使对通过使用方程式(V)来计算出的变数的解答数学变形。但在变形过程中，能够以具有通过使用其他常数(例如，ST1D2＝0)计算出的值的方式使对变数的解答变形。
当确定感兴趣的靶核酸序列的存在或不存在时，不考虑为了得到对变数的解答而使用的方程式(V)中的常数的数值。
在通过对将方程式(V)作为附加方程式来使用而计算出的变数的解答来确定感兴趣的靶核酸序列的存在或不存在的情况下，可使用(i)对计算出的变数的解答本身或(ii)以所定义的方式数学变形的解答。并且，可考虑到方程式(V)中的常数的数值来建立用于计算出的解答或它们的数学变形的显著性的阈值，由此，最终确定感兴趣的靶核酸序列的存在或不存在。
根据一实例，在选择方程式(V)的情况下，不选择方程式(III)，而选择方程式(IV)。
本发明所属技术领域的普通技术人员可理解，在说明书及发明要求保护范围下对第二接近法的说明包括选择ST1D1＝任意选择值、ST2D1＝任意选择值或ST2D2＝任意选择值的实例。例如，当存在第二靶核酸序列时，也以使第二信号产生机构在第二检测温度下实质上不产生信号的方式制备的情况下，可选择ST2D2＝任意选择值。在选择方程式ST2D2＝任意选择值的情况下，不选择方程式(IV)，而选择方程式(III)。但是，可要求多种实例，避免因重复说明而导致的不必要的说明书的复杂性并可包含在一实例(ST1D2＝任意选择值)的说明中。
术语“不产生信号”不仅包括“信号的不产生”，还包括背景信号等“无显著性的信号产生”。
尤其，在为了获得数据集而在多个循环检测信号的情况下，术语“不产生信号”是指在循环之间无信号变化或无显著性信号变化。
对为了获得数据集而在多个循环检测信号的情况没有限制，可包括借助实时聚合酶链式反应等扩增反应获得信号扩增曲线的情况。
根据一实例，用于获得(ST1D1)、(ST1D2)、(ST2D1)及(ST2D2)的上述2个附加方程式包括下述方程式(VIII)及(IX)中的一个及(I X)及下述方程式(V)：
(VIII)：ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
(IX)：ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1
(V)：ST1D2＝任意选择值。
如实施例2及图2C-2D所例示，当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下实质上不产生信号的方式制备的情况下，对了得到对变数中的至少一个的解答而可选择f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)(IV)作为方程式(V)中的ST1D2＝0及附加方程式。在f(ST2D1，ST2D2)为ST2D1/ST2D2的情况下，用于得到对变数的解答的方程式组包括如下：
ST1D1+ST2D1＝SD1
ST1D2+ST2D2＝SD2
ST1D2＝0
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
RVT2D1/D2为预先确定的常数值，因此，可通过上述4个方程式来得到对变数(ST1D1)、(ST2D1)及(ST1D2)的解答。
将方程式(III)及(IV)作为2个附加方程式来使用的第一接近法的特定实例，当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，可选择RVT1(D1D2)作为任意选择值。
根据一实例，当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，RVT1(D1D2)为任意选择值。
如上所述，在第一靶核酸序列(T1)在第二检测温度(D2)下不产生信号的情况下，可将任意选择值作为ST1D2来使用，由此，RVT1(D1D2)可成为任意选择值。
尤其，以使ST1D2的解答(值)称为在方程式中任何值或上述值左右(例如，“0”或“0”左右)，可选择任意选择值作为RVT1(D1D2)。
与“任何值或上述值左右”相关的术语“上述值左右”是指考虑为任何值的显著水平内的任意数。
尤其，在通过用于计算在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下的信号之间的比率的数学表达来解析f(ST1D1，ST1D2)的情况下，可选择RVT1(D1D2)作为任意选择值。
实际上，当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，通常产生具有非常弱的强度的信号(例如，背景信号)。尤其，作为RVT1(D1D2)的任意选择值可与利用实际上获得的信号值来计算出的RVT1(D1D2)相同，或者可小于上述RVT1(D1D2)，或者可大于上述RVT1(D1D2)。
本发明所属技术领域的普通技术人员可理解，在说明书及发明要求保护范围下对第一接近法的说明包括RVT1(D1D2)或RVT2(D1D2)为任意选择值的实例。例如，当存在第二靶核酸序列时，也以使第二信号产生机构在第二检测温度下实质上不产生信号的方式制备的情况下，R VT2(D1D2)可为任意选择值。但是，可要求多种实例，避免因重复说明而导致的不必要的说明书的过度复杂性并可包含在上述实例(作为任意选择值的RVT1(D1D2))的说明中。
方程式(III)及(IV)与方程式(I)及(II)一同使用于得到对变数中的至少一个的解答的过程中。如实施例2及图2G-2H所例示，当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下实质上不产生信号的方式制备的情况下，RVT1(D1D2)可为任意选择值。在f(ST1D1，ST1D2)为ST1D1/ST1D2且f(ST2D1，ST2D2)为ST2D1/ST2D2的情况下，用于得到对变数的解答的方程式组包括如下：
ST1D1+ST2D1＝SD1
ST1D2+ST2D2＝SD2
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
RVT1D1/D2为任意选择值，因此，可通过上述4个方程式来得到对变数(ST1D1)、(ST2D1)、(ST1D2)及(ST2D2)的解答。
有趣的是，本发明的方法可使由各个信号产生机构的信号量(例如，信号强度)定量化。如上所述，对变数(ST1D1)、(ST2D1)、(S T1D2)及(ST2D2)的解答可使由各个信号产生机构的信号量(例如，信号强度)定量化，这可适用于靶核酸序列的定量化。
步骤(d)：得到对变数的解答
最后，为了分辨分配在2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的上述4个方程式来得到对变数中的至少一个的解答。
如上所述，在步骤(b)及(c)中所提供的方程式使用于为了分辨分配在2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个而得到对变数中的至少一个的解答的过程中，
尤其，为了分辨分配在2个靶核酸序列中的至少一个(最尤其，所有)的感兴趣的信号中的至少2个(更尤其，至少3个，最尤其，至少4个)，使用在步骤(b)及步骤(c)中所提供的4个方程式来得到对变数中的至少2个(更尤其，至少3个，最尤其，至少4个)的解答。
根据一实例，为了得到对上述2个变数的解答(值)而使用本发明的方法，上述2个变数中的一个选自与第一靶核酸序列有关的变数中，其他变数选自与第二靶核酸序列有关的变数中。
根据一实例，根据产生信号的接近法，为了分析所得到的对变数的解答(值)是否显著而可利用阈值。
当确定阈值时，可考虑阴性对照组、敏感度或所使用的标志。根据本发明的一实例，可由使用人员确定阈值，或者可自动确定阈值。
根据一实例，仅使用第一靶核酸序列或者仅使用第二靶核酸序列并参照检测出的信号来确定阈值。
根据一实例，以与基于聚合酶链式反应的靶扩增相关的实时方式实时方式产生信号的情况下，利用基准值对在各个扩增循环或一部分已选择的循环中的信号进行数学处理，针对循环绘制上述计算结果，并使用于分辨感兴趣的信号(例如，确定靶核酸序列的存在)的过程中。
根据本发明的一实例，2个靶核酸序列包含核苷酸变异，上述2个靶核酸序列中的一个包含一种类型的核苷酸变异，另一个包含另一类型的核苷酸变异。
在本申请中所使用的术语“核苷酸变异”意味着在类似的连续的脱氧核糖核酸片段中特定位置的脱氧核糖核酸序列中的任意单一或多个核苷酸置换、缺失或插入。这种连续的脱氧核糖核酸片段包含一个基因或一个染色体的任意其他部位。这种核苷酸变异可以为突变或多态性等位基因变异。例如，在本发明中检测出的核苷酸变异包括单核苷酸多态性(SNP)、突变、缺失、插入、置换以及移位。例示的核苷酸变异的包括人类基因组内的各种变异(例如，在亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因中的变异)、与病原体的药剂耐性相关的变异以及肿瘤形成诱发变异。在本申请中所使用的术语核苷酸变异包含核酸序列的特定位置的任意变异。即，术语核苷酸变异包含核酸序列的特定位置的野生型及其任意突变型。
根据本发明的一实例，在本发明中检测出的核苷酸变异是单核苷酸多态性。
根据本发明的一实例，通过使用与第一靶核酸序列有关的信号产生机构，来检测由第一单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子，通过使用与第二靶核酸序列有关的第二信号产生机构，来检测由第二单核苷酸多态性等位基因构成的纯合子，通过使用上述第一信号产生机构及第二信号产生机构构，来检测由第一单核苷酸多态性等位基因及第二单核苷酸多态性等位基因构成的杂合子。
II.与至少3个靶核酸序列有关的感兴趣的信号的分辨
在本发明的再一实施方式中，提供对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法，包括：
步骤(a)，与用于检测N个靶核酸序列的N个信号产生机构一同培养上述样品，在N个检测温度下检测信号；借助相应的信号产生机构检测各个上述靶核酸序列；由上述N个信号产生机构产生的感兴趣的信号对各个靶核酸序列不被单一类型的检测器分辨；N为2以上的整数
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述N个方程式：
Figure GDA0001317491430000501
在上述式中，(SD1)至(SDN)分别为在各个检测温度下检测出的信号；(ST1D1)至(STNDN)分别为表示在各个检测温度下由各个信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为N2个；
步骤(c)，提供分别包括选自由变数(ST1D1)至(STNDN)组成的组中的至少一个变数的(N2-N)个附加方程式；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述N个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的N2个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
在本申请中，将本发明的方法作为对分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号进行分辨的方法来表达，作为检测样品内至少一个靶核酸序列的方法或者通过在至少一个靶核酸序列中的至少一个分配感兴趣的信号来确定样品内至少一个靶核酸序列的存在的方法来表达。
在原则上上述第二实施方式基于上述的本发明的第一实施方式的技术性原理及特征，因此，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。在为了说明第二实施方式，提起与第一实施方式有关的说明的情况下，需要留意第二实施方式与第一实施方式一部分不同。因此，本发明所属技术领域的普通技术人员需要理解与第一实施方式有关的一部分说明直接可适用于与第二实施方式有关的说明，其他说明可通过一些变形适用于与第二实施方式有关的说明。
以下，对本发明进行更详细的说明。
步骤(a)：与样品和信号产生机构的培养及信号检测
首先，与用于检测N个靶核酸序列的N个信号产生机构一同培养待分析的样品，然后在N个检测温度下检测来源于信号产生机构的信号；各个靶核酸序列由相应的信号产生机构检测；由N个信号产生机构产生的感兴趣的信号不会被单一类型的检测器分辨各靶核酸序列；N为2以上的整数。
在本发明中并不限定所检测的靶核酸序列的数量，包括2、3、4、5、6、7、8、9及10个以上的靶核酸序列。
例如，当靶核酸序列的数量为3个时，N为3，靶核酸序列可分别表现成T1、T2及T3。
根据一实例，当靶核酸序列的数量为N个时，使用N个信号产生机构。
当靶核酸序列的数量为N个时，使用N个检测温度。例如，当靶核酸序列的数量为3个时，N为3，使用3个检测温度。检测温度可分别表现成D1、D2及D3。
在本发明中，为了提供与靶核酸序列有关的信号而利用信号产生机构。各个靶核酸序列由相应的信号产生机构检测。例如，N个靶核酸序列中的第g靶核酸序列可由第g信号产生机构检测，上述术语“g”为选自1至N的整数。
根据本发明的一实例，上述培养在由信号产生机构产生信号的条件下进行。
根据本发明的一实例，上述培养在包括N个信号产生机构的单一反应容器中进行。
用于本发明的第二实施方式的信号产生机构可参照用于本发明的第一实施方式的信号产生机构。
在本发明中可使用多种物质并以多种方式产生信号。
根据一实例，N个信号产生机构中的至少一个为以依赖于二聚体形成的方式产生信号的信号产生机构。
根据一实例，与各个靶核酸序列有关的信号产生机构为以依赖于二聚体形成的方式产生信号的信号产生机构。
尤其，信号根据与靶核酸序列及上述靶核酸序列特异性杂交的检测用寡核苷酸之间的二聚体形成而产生。
尤其，信号根据以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体而产生，上述每个寡核苷酸与靶核酸序列特异性杂交。
根据以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式形成的二聚体的信号可通过包括探测和标记寡核苷酸切割及延伸(PTOCE，PTO cleavage an d extension)的方法(WO第2012/096523号)、探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性信号转导寡核苷酸杂交(PCE-SH，PTOCleavage and Extension-Dependent Signaling Oligonucleotide Hybridization)方法(WO第2013/115442号)及探测和标记寡核苷酸切割及延伸-依赖性非杂交(PCE-NH，PTOCleavage and Extension-Dependent Non-Hy bridization)方法(第PCT/KR2013/012312号)在内的多种方法产生。
根据一实例，N个信号产生机构中的至少一个为以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构。
根据一实例，与各个靶核酸序列有关的信号产生机构为以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式产生信号的信号产生机构。
尤其，在实现检测寡核苷酸和靶核酸序列的杂交后，根据检测寡核苷酸的切割产生信号。在实现检测寡核苷酸和靶核酸序列的杂交后根据检测寡核苷酸的切割的信号可通过TaqMan探针法(美国专利第5210015号及第5538848号)在内的多种方法产生。
尤其，信号以依赖于介导寡核苷酸的切割的方式并根据检测用寡核苷酸的切割产生，上述介导寡核苷酸与靶核酸序列实现特异性杂交。根据本发明的一实例，介导寡核苷酸的切割释放片段，上述片段在二聚体的形成或捕获寡核苷酸上介导根据上述片段的延伸的检测寡核苷酸的切割。
根据本发明的一实例，与N个靶核酸序列中的至少一个有关的信号产生机构为根据检测寡核苷酸的切割的信号产生机构，与其他靶核酸序列有关的信号产生机构为根据二聚体的形成的信号产生机构。
根据一实例，各个靶核酸序列由可在所有检测温度下产生信号的信号产生机构检测。
根据一实例，N个靶核酸序列中的第g靶核酸序列由可在最少“g”个检测温度下产生信号的信号产生机构检测。例如，靶核酸序列中第3个靶核酸序列由可在3个以上的检测温度下产生信号的信号产生机构检测。
根据本发明的一实例，N个信号产生机构包括相同的标志，来源于上述标志的信号不被单一类型的检测器分辨。
根据本发明的一实例，步骤(a)在伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行。
在本发明中，由信号产生机构产生的信号可与靶扩增一同进行扩增。选择性地，信号可在无靶扩增的情况下进行扩增。
根据本发明的一实例，信号的产生可与靶扩增一同在包括信号扩增的过程中进行。
根据本发明的一实例，靶扩增根据聚合酶链式反应(PCR)进行。
根据本发明的一实例，培养不仅在由信号产生机构产生信号的条件下进行，还在可实现靶扩增的条件下进行。
根据本发明的一实例，步骤(a)在无核酸扩增的信号扩增过程中进行。
当根据包括寡核苷酸的切割的方法产生信号时，上述信号可在无靶扩增的条件下进行扩增。
在与用于提供信号的信号产生机构一同培养(反应)样品的过程或之后，上述信号使用检测器来进行检测，例如使用单一类型检测器来进行检测。根据本发明，在单一类型检测器的情况下也可决定2个靶核酸序列的存在或不存在。
在检测温度的观点上，本发明可使用任一类型的信号产生机构来进行。
信号产生机构可被设计成在N个检测温度中的所有或一部分的条件下提供信号。
尤其，信号产生机构可被设计成在变更检测温度时提供不同的信号。
根据一实例，考虑到可由信号产生机构产生信号的温度范围，预先确定检测温度。
检测温度选自可由信号产生机构产生信号的温度范围。
根据一实例，N个检测温度互不相同。
根据一实例，用于检测靶核酸序列的信号产生机构可以为在N个检测温度分别提供互不相同的信号(例如，信号强度)的信号产生机构。
根据一实例，在首先制备与2个靶核酸序列有关的信号产生机构后，分配与2个靶核酸序列有关的检测温度，然后进行步骤(a)。
根据本发明的一实例，当信号产生机构以依赖于检测寡核苷酸的切割的方式生成信号时，任意选择检测温度。即，只要是可检测根据检测寡核苷酸的切割而产生的信，则可使用任意温度。如上所述地，当信号以依赖于检测用寡核苷酸的切割的方式产生时，根据切割释放的标志可在多种温度下检测。
使用于本发明的检测器包括可检测信号的任意机构。例如，当使用荧光信号时，可将适用于荧光信号的检测的光电二极管利用成检测器。使用单一类型的检测器的检测是指使用可检测单一类型的信号的检测器或者使用具有多个通道(即，光电二极管)的检测器的各个通道(即，光电二极管)来进行检测。
步骤(b)：包括表示感兴趣的信号的变数的方程式的制定
提供分别包括表示在各个检测温度下对上述靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述2个方程式：
Figure GDA0001317491430000561
在上述式中，(SD1)至(SDN)分别为在各个检测温度中检测的信号；(ST1D1)至(STNDN)分别为表示在各个检测温度下由各个信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为N2个。
在上述数学方程式中，水平虚线“……”表示变数或多个变数，其数量依赖于N的数量。例如，当N为3时，没有由上述水平虚线表示的附加变数。当N为4时，存在由上述水平虚线表示的(N-3)个附加变数。并且，垂直虚线“……”表示方程式或多个方程式，其数量依赖于N的数量。例如，当N为3时，没有由上述垂直虚线表示的附加方程式。当N为4时，存在由上述垂直虚线表示的(N-3)个附加方程式。
当N为2时，如下的提示方程式组中：
(1)：ST1D1+ST2D1＝SD1
(2):ST1D2+ST2D2＝SD2
作为在第一检测温度(D1)中检测的信号的(SD1)由N个感兴趣的信号形成，上述N个感兴趣的信号在第一检测温度(D1)下由与N个靶核酸序列有关的N个信号产生机构产生。即，作为在第一检测温度下检测的信号的(SD1)由作为感兴趣的信号的(ST1D1)至作为感兴趣的信号的(STND1)形成，上述(ST1D1)在第一检测温度下由与第一靶核酸序列有关的第一信号产生机构产生，上述(STND1)在第一检测温度下由与第N个靶核酸序列有关的第N个信号产生机构产生。
针对其他检测温度的方程式，可如上地解释第一检测温度。
例如，作为在第N个检测温度(DN)向检测的信号的(SDN)由在第N个检测温度(DN)下由与N个靶核酸序列有关的N个信号产生机构产生的N个感兴趣的信号形成。作为在第N个检测温度下检测的信号的(SDN)由作为感兴趣的信号的(ST1DN)至作为感兴趣的信号的(STNDN)形成，上述(ST1DN)在第N个检测温度下由与第一靶核酸序列有关的第一信号产生机构产生，上述(STNDN)在第N个检测温度下由与第N个靶核酸序列的第N个信号产生机构产生。
(SD1)至(SDN)可以为由检测器检测出的信号，即，可以为常数值。(ST1D1)至(STNDN)为所要获得的未知的变数。本发明涉及通过使用所检测的信号(SD1)至(SDN)来获得对变数(ST1D1)至(STN DN)中的至少一个的解答的方法。
在具体的例子中，样品内的N个靶核酸序列包含T1、T2及T3，当N个检测温度包含60℃、72℃及95℃时，可提供分别包括表示在各个检测温度下对靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述N个方程式：
ST1D1+ST2D1+ST3D1＝SD1
ST1D2+ST2D2+ST3D2＝SD2
ST1D3+ST2D3+ST3D3＝SD3
步骤(c)：附加方程式的建立
然后，提供选自由变数(ST1D1)至(STNDN)组成的组中的最少一个变数的(N2-N)个附加方程式。
在方程式(1)至方程式(N)制定后，制定(N2-N)个附加方程式，上述附加方程式是为了借助数学处理来获得对方程式(1)至方程式(N)中的变数中的至少一个(优选为变数中的最少2个，更优选为变数中的最少3个，进一步优选为变数中的最少4个，最优选为变数中的最少5个)的解答而提供。
在数学方面，在步骤(b)及步骤(c)提供的N2个方程式可提供对变数中的至少一的解答。
例如，当方程式(1)至方程式(N)可具有相同的变数组时(即，方程式(1)至方程式(N)变换成联立方程式的情况)，附加方程式会解上述联立方程式(尤其，具有N个变数的线性联立方程式)，从而在方程式(1)至方程式(N)中可获得对变数中的至少一个的解答。选择性地，能够以与上述联立方程式的解法不同的方式获得对方程式(1)至方程式(N)中的变数中的至少一个的解答。
根据一实例，(N2-N)个附加方程式选自由下述方程式组成的组中：
(X)：f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)，及
(XI)：STjDK＝任意选择值
Tj中的j表示从1到第N个整数为止的所有整数；对于各个第j靶核酸序列，α及β一同表示选自1至N中的2个整数的组合；上述组合的数由NC2表示；对于各个第j靶核酸，K为选自1至N中的整数中的至少一个；RVTj(DαDβ)为反映在第α检测温度及第β检测温度下借助第j信号产生机构提供的信号变化关系的第j靶核酸序列(Tj)的基准值(RV)；f(STjDα，STjDβ)表示STjDα及STjDβ的函数。
当存在第j靶核酸序列时，也以使第j信号产生机构在第K检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，能够选择方程式(XI)中的S TjDK＝任意选择值。
在将上述方程式(XI)作为附加方程式来选择的情况下，其他附加方程式选自与第j靶核酸序列有关的α或β和与第j靶核酸序列有关的K不同的方程式(X)。
根据一实例，将零(0)作为STjDK(STjDK＝0)有利于本发明的实施方式。选择性地，可将负常数或正常数使用成STjDK(STjDK＝负常数或STjDK＝正常数)。
当第j靶核酸序列(Tj)存在时，STjDα及STjDβ分别示出在第α检测温度(Dα)及第β检测温度(Dβ)下由第j信号产生机构提供的信号。
为了将多个方程式作为单一普通方程式来说明而提供方程式(X)。
在数学方程式(X)中，Tj中的j表示从1到第N个整数为止的所有整数，α及β一同表示选自1至N中的2个整数的组合。与α及β相关地，术语“组合”是指具有从一个集合(collection)选择项目的方式的数学组合，选择顺序并不重要。α及β的组合是指N个检测温度中的2个组合。α及β的组合数由NC2表示。
根据一实例，当靶核酸序列为N个时，方程式(X)可说明“Nx[N C2]”个方程式。
例如，当N为3时，j包含1、2及3，α及β的组合包含(1，2)、(1，3)及(2，3)。在此情况下，方程式(X)说明9个方程式。
例如，“f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)”可包括下述内容：
(i)当j＝1时；
f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)，
f(ST1D1，ST1D3)＝RVT1(D1D3)，
f(ST1D2，ST1D3)＝RVT1(D2D3)，
(ii)当j＝2时；
f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)，
f(ST2D1，ST2D3)＝RVT2(D1D3)，
f(ST2D2，ST2D3)＝RVT2(D2D3)，
(ii)当j＝3时
f(ST3D1，ST3D2)＝RVT3(D1D2)，
f(ST3D1，ST3D3)＝RVT3(D1D3)，以及
f(ST3D2，ST3D3)＝RVT3(D2D3)。
根据一实例，当从方程式(X)选择(N2-N)个附加方程式时，这些(N-1)个方程式可选自与各个j有关的方程式组。
更优选地，这种(N-1)个方程式的选择用于提供具有N个变数的联立方程式，以使相对各个j所选择的(N-1)个方程式借助方程式(1)至方程式(N)来获得对变数中的至少一个的解答。
N为3，在分析检测温度D1中的信号的特定例中，相对各个j的2个方程式(即，N–1＝3–1＝2)选自3个可提供的方程式中。选自所记载的上述9个方程式地6个附加方程式如下：
f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)
f(ST1D1，ST1D3)＝RVT1(D1D3)
f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)
f(ST2D1，ST2D3)＝RVT2(D1D3)
f(ST3D1，ST3D2)＝RVT3(D1D2)
f(ST3D1，ST3D3)＝RVT3(D1D3)
尤其，(N2-N)个附加方程式包括选自由方程式(X)表示的方程式组中的方程式。
根据一实例，(N2-N)个附加方程式中的一部分可选自下属方程式组中：
STjDK＝任意选择值(XI)
当存在第j靶核酸序列时，第j信号-提供机构也不会在第K检测温度下产生信号，在此情况下，提供使STjDK具有任意选择值的方程式。
根据一实例，可调节第j信号产生机构的特征，由此在多种检测温度下不会产生信号。
为了将多个方程式记述成单一普通方程式而提供方程式(XI)。
当为了防止产生对各个N个靶核酸序列的信号而选择检测温度时，提供在上述检测温度下使与靶核酸序列有关的信号具有任意选择值的方程式。上述方程式可由方程式(XI)表示。
例如，靶核酸序列为N个(即，N＝3)，对第一靶核酸序列的第一信号产生机构被设计成在第二检测温度及第三检测温度下不产生信号，对第二靶核酸序列的第二信号产生机构被设计成在第三检测温度下不产生信号，在此情况下，方程式(XI)“STjDK＝任意选择值”包括ST1D2＝任意选择值、ST1D3＝任意选择值及ST2D3＝任意选择值。可选择上述3个方程式中的全部或一部分。
根据一实例，附加方程式不仅包括选自由方程式(XI)表示的方程式组或多个方程式，还包括选自由方程式(X)表示式或多个方程式。
在上述的实例中说明用于获得对方程式(1)至方程式(N)中的变数中的至少一个的解答的2个接近法。
在第一接近法中，作为(N2-N)个附加方程式而使用方程式(X)。
在方程式(X)中，作为基准值，RVTj(DαDβ)为预先设置的值。
上述基准值通过在2个检测温度下借助信号产生机构所提供的信号的数学处理来获得。这种数学处理为信号的函数。只要是上述函数在2个检测温度下借助信号产生机构来提供的信号变化关系，则为了获得基准值而使用的函数可包括任意函数。例如，上述函数可作为信号的加法、乘法、减法及除法等的数学处理提供。
如上所述地，作为基准值的RVTj(DαDβ)为预先确定的值，因此RV Tj(DαDβ)可起到在方程式(1)至方程式(N)中将变数(STjD1)至变数(STjDN)转换成选自变数(STjD1)至变数(STjDN)中的一个变数的转换者的作用。
根据一实例，包括第j靶核酸序列(Tj)的基准值(RV)的方程式(X)用于在方程式(1)至方程式(N)中将变数(STjD1)至变数(S TjDN)转换成选自变数(STjD1)至变数(STjDN)中的1个变数。
在本发明中使用的基准值RVTj(DαDβ)可通过多种方式获得。例如，基准值可由预期值形成。考虑到靶序列、信号产生机构及检测温度，可预期表示检测温度中的信号变化关系的基准值。选择性地，可通过进行获得基准值的实验来以实验值或实际值形成基准值。
根据一实例，通过如下步骤获得RVTj(DαDβ)：步骤(i-1)，与用于检测第j靶核酸序列的第j信号产生机构一同培养第j靶核酸序列；步骤(i-2)，在第α检测温度及第β检测温度下检测信号；步骤(i-3)，之后，获得在上述第α检测温度下检测出的信号及在上述第β检测温度下检测出的信号之间的差异。
术语“在第α检测温度及第β检测温度中检测出的信号之间的差异”为第α检测温度及第β检测温度中的信号变化关系地一实例。
根据一实例，在第α检测温度及第β检测温度中检测出的信号之间的压抑包括通过对在第α检测温度及第β检测温度中检测出的信号进行数学处理来获得的差异。
根据一实例，当进行数学处理时，信号的特征需要容易进行数学处理。在特定实例中，数学处理包括使用信号的计算(例如，加法、乘法、减法及除法)或来源于信号的其他值。
在第α检测温度及第β检测温度中检测出的信号之间的差异可由数值或具有信号特征的绘制来表示。
可通过多种计算方法及他们的变形来进行用于获取差异的信号的数学处理。
尤其，用于获得差异的信号地数学处理可同构计算第α检测温度及第β检测温度下的信号之间的比率来进行。
例如，可将在第β检测温度下检测出的信号的端点强度(end-poi nt intensity)与在第α检测温度下检测出的信号的端点强度之间的比率作为基准值使用。
用于获得差异的数学处理可通过多种方式进行。数学处理可通过使用设备来进行。例如，可借助检测器或实时聚合酶链式反应装置内的处理器以数学方式处理信号。选择性地，尤其，可根据预先确定的算法对信号进行手动的数学处理。
根据本发明的一实例，在N个检测温度下对N个靶核酸序列的R V互不相同。
尤其，对使用相同的个检测温度之间的信号来计算的不同的靶核酸序列的基准值互不相同。例如，当存在3个靶核酸序列时，RVT1(DαDβ)、RVT2(DαDβ)及RVT3(DαDβ)可互不相同。根据一实例，信号产生机构用于对不同的靶核酸序列提供不同的基准值。
当RV值互不相同时，用于记述差异程度的定量表达可根据计算R V值的接近法而不同。
根据一实例，可根据共同的计算方法进行处理来使用于获得基准值的信号提供用于进行比较的基准值，然后，使用用于进行比较的上述基准值来获得2个基准值之间的差异程度。根据一实例，共同的计算方法为2个信号的除法。
例如，根据本发明的方法，当为了获得在分析信号的过程中使用的基准值而根据减法处理2个信号时，为了获得用于进行比较的基准值，可根据除法处理上述2个信号。
根据一实例，与其它基准值相比，一个基准值至少还大1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.5倍、1.7倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、5倍或10倍。
根据一实例，在本发明中使用的基准值中的一部分可相同。
根据本发明的一实例，用于基准值的信号产生机构可与用于检测靶核酸序列的信号产生机构相同。
根据一实例，用于获得基准值的培养条件可与用于分析样品的培养条件相同。
针对靶核酸序列，可在包括成分(例如，靶核酸序列、信号产生机构、酶或三磷酸脱氧核苷酸(dNTP))的量、缓冲液pH或反应时间的多种反应条件下获得基准值。根据本发明的一实例，基准值可在完成反应时提供饱和信号的充分的反应条件下获得。根据本发明的一实例，在获得基准值时所获得的信号之间的差异具有特定范围，基准值在上述特定范围内或者参照上述特定范围来选择。根据本发明的一实例，可选择上述特定范围的最大值或最小值作为基准值或者参照上述特定范围的最大值或最小值来选择基准值。尤其，考虑到在多种条件下获得的上述基准值的标准变化、允许误差范围、特异度或敏感度，可变更基准值。
在“f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)”中，f(STjDα，STjDβ)可作为用于计算RVTj(DαDβ)的数学表达提供。
根据一实例，f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)包括STjDα/STjDβ＝RVTj Dα/Dβ(XII)或STjDβ/STjDα＝RVTjDβ/Dα(XIII)。
当使用第α检测温度及第β检测温度下的信号之间的比率来获得RV时，在“f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)”中，f(STjDα，STjDβ)可作为用于计算STjDα及STjDβ之间的比率的数学表达提供。在术语“RVTj(DαDβ)”中，Tj(DαDβ)表示计算出的RV与通过计算第α检测温度(Dα)及第β检测温度(Dβ)下的信号之间的差异来获得的对第j靶核酸序列的基准值相应。
当确定RV计算方法时，术语“Tj(DαDβ)”可通过考虑上述计算方法来具体表达。例如，术语“RVTjDα/Dβ”是指通过计算在第α检测温度下检测出的信号与在第β检测温度下检测出的信号之间的比率来获得的对第j靶核酸序列的基准值。
根据一实例，通过如下步骤获得RVTjDα/Dβ：步骤(i-1)，与用于检测第j靶核酸序列的第j信号产生机构一同培养第j靶核酸序列；步骤(i-2)，在第α检测温度及第β检测温度下检测信号；步骤(i-3)，之后，计算在上述第α检测温度下检测出的信号对在上述第β检测温度下检测出的信号的比率，在进行步骤(i-1)及(i-2)之后，通过计算在上述第β检测温度下检测出的信号对在上述第α检测温度下检测出的信号的比率来获得RVTjDβ/Dα。
根据一实例，N2-N个附加方程式选自下述方程式组中：
(XII)：STjDα/STjDβ＝RVTjDα/Dβ；
(XIII)：STjDβ/STjDα＝RVTjDβ/Dα。
在上述式中，在第α检测温度及第β检测温度下与各个第j靶核酸有关的方程式选自上述方程式(XII)及方程式(XIII)中。尤其，在第α检测温度及第β检测温度下与各个第j靶核酸有关的方程式选自方程式(XII)及方程式(XIII)中的一个。
与方程式(1)至方程式(N)一同选自由方程式(X)表示的方程式组的(多个)附加方程式用于获得对变数中的至少一个的解答。
在具体例(N＝3)中，方程式(XII)或方程式(XIII)如下：
当(i)j＝1时；
f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)可包括如下情况：
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2或ST1D2/ST1D1＝RVT1D2/D1；
f(ST1D1，ST1D3)＝RVT1(D1D3)可包括如下情况：
ST1D1/ST1D3＝RVT1D1/D3或ST1D3/ST1D1＝RVT1D3/D1；
f(ST1D2，ST1D3)＝RVT1(D2D3)可包括如下情况：
ST1D2/ST1D3＝RVT1D2/D3或ST1D3/ST1D2＝RVT1D3/D2。
当(ii)j＝2时；
f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)可包括如下情况：
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2或ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1；
f(ST2D1，ST2D3)＝RVT2(D1D3)可包括如下情况：
ST2D1/ST1D3＝RVT2D1/D3或ST2D3/ST2D1＝RVT2D3/D1；
f(ST2D2，ST2D3)＝RVT2(D2D3)可包括如下情况：
ST2D2/ST2D3＝RVT2D2/D3或ST2D3/ST2D2＝RVT2D3/D2。
当(ii)j＝3时；
f(ST3D1，ST3D2)＝RVT3(D1D2)可包括如下情况：
ST3D1/ST3D2＝RVT3D1/D2或ST3D2/ST3D1＝RVT3D2/D1；
f(ST3D1，ST3D3)＝RVT3(D1D3)可包括如下情况：
ST3D1/ST3D3＝RVT3D1/D3或ST3D3/ST3D1＝RVT3D3/D1
f(ST3D2，ST3D3)＝RVT3(D2D3)可包括如下情况：
ST3D2/ST3D3＝RVT3D2/D3或ST3D3/ST3D2＝RVT3D3/D2。
根据一实例，为了在所选择的2个检测温度下计算对特定靶核酸序列的RV，可提供多个方程式。根据一实例，在上述情况下，在多个方程式中选择单一方程式。例如，当j＝1(即，T1)且2个检测温度为60℃(D1)及72℃(D2)时，“f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)可包括ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2及ST1D2/ST1D1＝RVT1D2/D1。在上述2个特定方程式中，将单一方程式使用于对靶核酸序列(T1)的RV计算。
当分析检测温度D1下的信号时，选自上述的方程式的6个附加方程式可以为如下：
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2(或ST1D2/ST1D1＝RVT1D2/D1)
ST1D1/ST1D3＝RVT1D1/D3(或ST1D3/ST1D1＝RVT1D3/D1)
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2(或ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1)
ST2D1/ST2D3＝RVT2D1/D3(或ST2D3/ST2D1＝RVT2D3/D1)
ST3D1/ST3D2＝RVT3D1/D2(或ST3D2/ST3D1＝RVT3D2/D1)
ST3D1/ST3D3＝RVT3D1/D3(或ST3D3/ST3D1＝RVT3D3/D1)
最终，用于获得对变数的解答的方程式组可包括如下的方程式：
ST1D1+ST2D1+ST3D1＝SD1
ST1D2+ST2D2+ST3D2＝SD2
ST1D3+ST2D3+ST3D3＝SD3
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
ST1D1/ST1D3＝RVT1D1/D3
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
ST2D1/ST2D3＝RVT2D1/D3
ST3D1/ST3D2＝RVT3D1/D2
ST3D1/ST3D3＝RVT3D1/D3
RVT1D1/D2、RVT1D1/D3、RVT2D1/D2、RVT2D1/D3、RVT3D1/D2及RVT3D1/D3为实验性地预先确定的值，因此对变数(ST1D1)、(ST2D1)、(ST3D1)、(ST1D2)、(ST2D2)、(ST3D2)、(ST1D3)、(ST2D3)及(ST3D3)的解答可根据上述9个方程式获得。
用于获得对方程式(1)至方程式(N)中的变数中的至少一个的解答的第二接近法作为(N2-N)个附加方程式而使用方程式(X)及方程式(XI)。当存在第j靶核酸序列时，也以使第j信号产生机构在第K检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，能够选择方程式(XI)中的STjDK＝任意选择值。
根据一实例，当作为附加方程式而选择方程式(XI)时，其他附加方程式可选自使对第j靶核酸序列的α或β与对第j靶核酸序列的K不同的方程式(X)中。
即，作为附加方程式，当最少一个方程式选自由方程式(XI)表示的方程式组时，从其他附加方程式排除由使对第j靶核酸序列的α或β与对第j靶核酸序列的K相同的方程式(X)表示的方程式组的一部分，并且其他附加方程式选自除所排除的上述一部分之外的方程式(X)中。
因此，在本文中使用的句子“当作为附加方程式而选择方程式(X I)时，其他附加方程式可选自使对第j靶核酸序列的α或β与对第j靶核酸序列的K不同的方程式(X)中”可记述成“当作为附加方程式而选择方程式(XI)时，其他附加方程式选自除了使对第j靶核酸序列的α或β与对第j靶核酸序列的K相同的方程式之外的方程式(X)中”。
在分析3个靶核酸序列(即，N＝3及j包括1、2及3)、当T1存在时也以在72℃(D2)及95℃(D3)检测温度下实质上不会产生信号的方式制备对靶核酸序列(T1)的信号产生机构、当T2存在时也以在95℃检测温度(D3)下实质上不会产生信号的方式制备对靶核酸序列(T2)的信号产生机构的特定例(参照图3A)中，方程式(XI)可包括下述方程式：
ST1D2＝0(j＝1及K＝2)，
ST1D3＝0(j＝1及K＝3)，以及
ST2D3＝0(j＝2及K＝3)。
另一方面，方程式(X)“f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)”可包括如下：
当(i)j＝1时；
f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)，
f(ST1D1，ST1D3)＝RVT1(D1D3)，
f(ST1D2，ST1D3)＝RVT1(D2D3)，
当(ii)j＝2时；
f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)，
f(ST2D1，ST2D3)＝RVT2(D1D3)，
f(ST2D2，ST2D3)＝RVT2(D2D3)，
当(ii)j＝3时；
f(ST3D1，ST3D2)＝RVT3(D1D2)，
f(ST3D1，ST3D3)＝RVT3(D1D3)，及
f(ST3D2，ST3D3)＝RVT3(D2D3)。
当将“ST2D3＝0(j＝2及K＝3)”作为附加方程式中的一个使用时，其他附加方程式可包括方程式(X)(j＝1)中的2个方程式，即，方程式(X)(j＝3)中的2个方程式及方程式(X)(j＝2)中的1个方程式。在特定实例中，在选择这种方程式的过程中，排除对靶核酸序列(j＝2，即，T2)的α或β与对靶核酸序列(j＝2，即，T2)的K相同的方程式。即，排除“f(ST2Dα，ST2Dβ)＝RVT2(DαDβ)”中的包括D3检测温度的方程式。
当分析检测温度60℃(D1)下的信号时，可如下的选择包括含D1的变数的方程式：
ST2D3＝0
f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)
f(ST1D1，ST1D3)＝RVT1(D1D3)
f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)
f(ST3D1，ST3D2)＝RVT3(D1D2)
f(ST3D1，ST3D3)＝RVT3(D1D3)
代替所使用的“ST2D3＝0(j＝2及K＝3)”，可将ST1D2＝0(j＝1及K＝2)及ST1D3＝0(j＝1及K＝3)使用成2个附加方程式。其他附加方程式可包括方程式(X)(j＝2)中的2个方程式及方程式(X)(j＝3)中的2个方程式。在特定实例中，针对这种方程式的选择，排除使对靶核酸序列(j＝1，即，T1)的α或β与对靶核酸序列(j＝1，即，T1)的K(即，2或3)相同的方程式。即，从“f(ST1Dα，ST1Dβ)＝RVT1(DαDβ)”排出作为检测温度的而包括D2或D3的方程式。当分析检测温度60℃(D1)下的信号时，可如下的选择包括含D1的变数的方程式：
ST1D2＝0
ST1D3＝0
f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)
f(ST2D1，ST2D3)＝RVT2(D1D3)
f(ST3D1，ST3D2)＝RVT3(D1D2)
f(ST3D1，ST3D3)＝RVT3(D1D3)
根据一实例，N2-N个附加方程式选自下述方程式组中：
(XII)：STjDα/STjDβ＝RVTjDα/Dβ
(XIII)：STjDβ/STjDα＝RVTjDβ/Dα
(XI)：STjDK＝任意选择值
在上述式中，在第α检测温度及第β检测温度下与各个第j靶核酸有关的方程式选自上述方程式(XII)及方程式(XIII)。
当上述方程式(XI)选自附加方程式时，其他附加方程式选自使与第j靶核酸序列有关的α或β与对第j靶核酸序列的K不同的方程式(XII)及方程式(XIII)。
作为具体例，在分析3个靶核酸序列(即，N＝3且j包括1、2及3)、当T1存在时也以在72℃(D2)及95℃(D3)的检测温度下实质上不产生信号的方式制备与靶核酸序列(T1)有关的信号产生机构、当T2存在时也以在95℃的检测温度(D3)下实质上不产生信号的方式制备与靶核酸序列(T2)有关的信号产生机构的特定例(参照图3A)中，存在可利用于获得对变数的解答的多种方程式组。
在将“ST2D3＝0(j＝2及K＝3)”使用成1个附加方程式的情况下，获得对变数的解答的方程式组中的一个可包括下述方程式：
ST1D1+ST2D1+ST3D1＝SD1
ST1D2+ST2D2+ST3D2＝SD2
ST1D3+ST2D3+ST3D3＝SD3
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
ST1D1/ST1D3＝RVT1D1/D3
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
ST2D3＝0
ST3D1/ST3D2＝RVT3D1/D2
ST3D1/ST3D3＝RVT3D1/D3
RVT1D1/D2、RVT1D1/D3、RVT2D1/D2、RVT3D1/D2及RVT3D1/D3为实验性或任意性地确定的常数，因此对变数(ST1D1)、(ST2D1)、(ST3D1)、(ST1D2)、(ST2D2)、(ST3D2)、(ST1D3)、(ST3D3)的解答可根据上述9个方程式获得。
代替“ST2D3＝0(j＝2及K＝3)”的使用，可将ST1D2＝0(j＝1及K＝2)及ST1D3＝0(j＝1及K＝3)使用成2个附加方程式。用于获得对变数的解答的方程式组中的一个可包括下属方程式：
ST1D1+ST2D1+ST3D1＝SD1
ST1D2+ST2D2+ST3D2＝SD2
ST1D3+ST2D3+ST3D3＝SD3
ST1D2＝0
ST1D3＝0
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
ST2D1/ST2D3＝RVT2D1/D3
ST3D1/ST3D2＝RVT3D1/D2
ST3D1/ST3D3＝RVT3D1/D3
RVT2D1/D2、RVT2D1/D3、RVT3D1/D2及RVT3D1/D3为实验性或任意性地确定的常数，因此对变数(ST1D1)、(ST2D1)、(ST3D1)、(ST2D2)、(ST3D2)、(ST2D3)、(ST3D3)的解答可根据上述9个方程式获得。
根据一实例，即使在第j靶核酸序列存在的情况下也以在第K检测温度下不产生信号的方式制备第j信号产生机构，也不会将方程式“S TjDK＝任意选择值”使用成附加方程式。在此情况下，α或β与K相同的RVTj(DαDβ)可以为经实验获得的值。
根据一实例，在第j靶核酸序列存在的情况下也以在第K检测温度下不产生信号的方式制备第j信号产生机构，在此情况下，α或β与K相同的RVTj(DαDβ)为任意选择值。
尤其，在方程式(X)中，当借助用于计算第α检测温度(Dα)及第β检测温度(Dβ)下的信号之间的比率的数学表达来提供f(STjDα，STjDβ)时，，RVTj(DαDβ)可作为任意选择值选择。
尤其，作为RVTj(DαDβ)，任意选择值在方程式组的解答过程中能够以使STjDK的解答成为任意值或其周围值(例如，“0”或“0”周围)的方式选择。
根据一实例，作为RVTj(DαDβ)，任意选择值可与实际上利用所获得的信号值来计算的RVTj(DαDβ)相同或者小于上述RVTj(DαDβ)。
实际上，即使在第j靶核酸序列存在的情况下也以在第K检测温度下不产生信号的方式制备第j信号产生机构，通常也会产生具有非常弱的强度的信号(例如，背景信号)。因此，可经实验获得α或β与K相同的RVTj(DαDβ)。
本发明的方法可实现由各个信号产生机构产生的信号量(例如，信号强度)的定量。如上所述地，对变数(ST1D1)至变数(STNDN)的解答可实现由各个信号产生机构产生的信号量(例如，信号强度)的定量，这可适用于靶核酸序列的定量。
步骤(d)：获得对变数的解答
最终，为了分辨分配在N个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，而借助在步骤(b)及步骤(c)中提供的N2个方程式获得对上述变数中的至少一个的解答。
如上所述地，在步骤(b)及步骤(c)提供的N2个方程式为了分辨分配在N个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个而使用，由此可决定对N个靶核酸序列中的至少一个的存在与否。
尤其，为了分辨分配在靶核酸序列中的最少1个(例如，最少2个、最少3个、最少4个、最少5个、最少6个、最少7个、最少8个、最少9个及最少10个或最少N个)的感兴趣的信号中的最少1个(例如，最少2个、最少3个、最少4个、最少5个、最少6个、最少9个、最少16个、最少25个或最少N2个)而使用步骤(b)及步骤(c)中提供的N2个方程式来获得对变数中的最少一个(例如，最少2个、最少3个、最少4个、最少5个、最少6个、最少9个、最少16个、最少25个或最少N2个)的解答。
根据一实例，本方法为了获得对分别选自与各靶核酸序列有关的变数组的N个变数的解答(值)而使用。
根据一实例，根据产生信号的方式，为了确认针对变数而获得的解答是否显著而利用阈值。阴性对照组、敏感度及所使用的标志可用于确定阈值。根据本发明的一实例，阈值可由使用人员或者自动确定。
根据一实例，阈值在检测温度中仅使用靶核酸序列中的一个并参照所检测的信号来决定。
根据一实例，阈值对各个靶核酸序列或各个检测温度可特定地使用。
根据一实例，当以与根据聚合酶链式反应的靶扩增相关的实时方式产生信号时，利用基准值对各个扩增循环或部分选择的循环中的信号进行数学处理，计算结果使用于对循环进行绘制且分辨感兴趣的信号(例如，决定靶核酸序列的存在与否)。
根据一实例，为了确定感兴趣的信号的显著性，阈值适用于绘制结果。
根据本发明的一实例，靶核酸序列包括变异。
在本文中使用的术语“核苷酸变异”是指向序列类似的连续的脱氧核糖核酸(DNA)片段中取代、缺失或插入特定位置的脱氧核糖核酸序列中的任意单一或多个核苷酸。这种连续的脱氧核糖核酸片段包括一个基因或一个染色体的任一其它部位。这种核苷酸变异可以是突变或多态性等位基因的变异。例如，在本发明中检测的核苷酸变异包括单核苷酸多态性(SNP)、突变、缺失、插入、取代及易位。所例示的核苷酸变异包括人类基因组内的多种变异(例如，亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因中的变异)、与病原体的耐药性相关的变异及肿瘤形成诱发突变。在本文中使用的术语核苷酸变异包括核酸序列的特定位置中的任一变异。即，术语核苷酸变异包括核酸序列的特定位置中的野生型及其任意的突变型。
根据本发明的一实例，在本发明中检测的核苷酸变异为单核苷酸多态性(SNP)。
III.用于分辨对靶核酸序列的感兴趣的信号的试剂盒
在本发明的还有一实施方式中提供如下的试剂盒，用于对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨，上述试剂盒包括：(a)2个信号产生机构，用于对用于检测上述第一靶核酸序列(T1)的第一信号产生机构及用于检测第二靶核酸序列(T2)的第二信号产生机构的上述2个靶核酸序列进行检测；及(b)说明书，记载标题为“对2个靶核酸序列感兴趣的信号的分辨”的实施方式I的本发明的方法。
在本发明的附加实施方式提供如下的试剂盒，用于对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨，上述试剂盒包括：(a)N个信号产生机构，用于检测上述N个靶核酸序列；及(b)说明书，记载标题为“对至少3个靶核酸序列感兴趣的信号的分辨”的实施方式II的本方法。
本发明的试剂盒为了进行本发明的方法而制备，为了去除导致本发明复杂的过度的重复，省略了本发明的试剂盒与方法之间的共同的说明。
上述的本发明的所有试剂盒可为选择性地包括进行缓冲液、脱氧核糖核酸聚合酶辅因子及脱氧核苷酸-5-三磷酸等的靶扩增反应(例如，聚合酶链式反应反应)所需的试剂。选择性地，试剂盒还可以包括多种多核苷酸分子、逆转录酶、多种缓冲液、试剂以及用于抑制脱氧核糖核酸聚合酶活性的抗体。并且，试剂盒可包括进行阳性对照组及阴性对照组所需的试剂。在特定反应中使用的试剂的最佳量可由熟知本公开事项的优点的技术人员容易地确定。试剂盒的组成成分可存在于单独容器或者多个结构要素可存在于一个容器内。
用于记载或进行本发明的方法的说明书可记载在适合的存储介质。例如，说明书可印刷在纸及塑料等的基板上。在再一实例中，说明书能够以存在于只读储存器(CD-ROM)及软盘等的适合的计算机可读存储介质的电子存储数据文件方式存在。在另一实例中，可在试剂盒内不包括实质的说明书，只是提供从远程数据源通过互联网获得说明书的机构。上述实例中的一例是包含可浏览说明书的网址和/或可下载说明书的网址的试剂盒。
IV.用于分辨对与靶核酸序列有关的感兴趣的信号的存储介质及装置
在以下记述的存储介质、装置及计算机程序用于在计算机中实施本发明，为了避免导致本说明书的复杂性的过多的重复，省略它们之间的共同内容。
在本发明的另一实施方式中提供如下的计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法，上述对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法包括下述步骤：
步骤(a)，接收在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下检测出的信号；借助第一信号产生机构检测上述样品内第一靶核酸序列(T1)，借助第二信号产生机构检测第二靶核酸序列(T2)；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的感兴趣的信号不被单一类型的检测器分辨；
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对上述2个靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述2个方程式：
(I)：ST1D1+ST2D1＝SD1
(II)：ST1D2+ST2D2＝SD2
在上述式中，(SD1)为在第一检测温度下检测的信号，(SD2)为在第二检测温度检测的信号；(ST1D1)为表示在第一检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST2D1)为表示在第一检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST1D2)为表示在第二检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST2D2)为表示在第二检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为4个；
步骤(c)，提供分别包括选自由上述4个变数(ST1D1)、(ST2D1)、(ST1D2)及(ST2D2)组成的组中的至少一个变数的2个附加方程式；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的4个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
根据本发明的一实例，计算机可读存储介质不仅包含方程式(I)及方程式(II)，还包含附加方程式。根据本发明的一实例，作为第一靶核酸序列(T1)的基准值(RV)的RVT1(D1D2)和/或作为第二靶核酸序列(T2)的基准值(RV)的RVT2(D1D2)存储在计算机可读存储介质。
根据本发明的一实例，计算机可读存储介质包含指令，上述指令不仅用于提供方程式(I)及方程式(II)，还用于提供附加方程式。根据本发明的一实例，计算机可读存储介质包含在进行上述方法的过程中用于输入RVT1(D1D2)和/或RVT2(D1D2)的指令。根据本发明的一实例，计算机可读存储介质还包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行用于获得RVT1(D1D2)和/或RVT2(D1D2)的方法。
在本发明的又一实施方式提供如下的计算机程序，即，运行用于执行对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法的处理器且储存于计算机可读存储介质，上述计算机程序的特征在于，上述对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法包括下述步骤：
步骤(a)，接收在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下检测出的信号；借助第一信号产生机构检测上述样品内第一靶核酸序列(T1)，借助第二信号产生机构检测第二靶核酸序列(T2)；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的感兴趣的信号不被单一类型的检测器分辨；
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对上述2个靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述2个方程式：
(I)：ST1D1+ST2D1＝SD1
(II)：ST1D2+ST2D2＝SD2
在上述式中，(SD1)为在第一检测温度下检测的信号，(SD2)为在第二检测温度检测的信号；(ST1D1)为表示在第一检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST2D1)为表示在第一检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST1D2)为表示在第二检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，(ST2D2)为表示在第二检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为4个；
步骤(c)，提供分别包括选自由上述4个变数(ST1D1)、(ST2D1)、(ST1D2)及(ST2D2)组成的组中的至少一个变数的2个附加方程式；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的4个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
根据本发明的一实例，计算机程序不仅包含方程式(I)及方程式(II)，还包含附加方程式。根据本发明的一实例，计算机程序包含R VT1(D1D2)和/或RVT2(D1D2)。根据本发明的一实例，计算机程序不仅包含方程式(I)及方程式(II)，还包含附加方程式。根据本发明的一实例，计算机程序包含在进行本方法的过程中用于输入RVT1(D1D2)和/或RVT2(D1D2)的指令。根据本发明的一实例，计算机程序还包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行用于获得RVT1(D1D2)和/或RVT2(D1D2)的方法。
当由上述处理器进行时，会运行上述程序指令，并使处理器进行上述的本发明的方法。程序指令可包含用于接收在第一检测温度(D1)及第二检测温度(D2)下检测的信号的指令，并且可包含如下的指令，即，通过使用从用于分辨分配在2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个的步骤(b)及步骤(c)提供的4个方程式来获得对变数中的至少一个的解答。
上述的本发明的方法由处理器实现，例如，由设置于独立型计算机(stand-alonecomputer)、网络连接电脑(network attached comput er)或实时聚合酶链式反应及其等的数据采集装置(data acquisition d evice)的处理器实现。
计算机可读存储介质的类型包括刻录光盘(CD-R)、只读储存器(CD-ROM)、数字多功能光盘(DVD)、闪存存储器、软盘、硬盘驱动器、便携式硬盘、通用串行总线(USB)、磁带、迷你光碟(MI NIDISC)、非易失性存储卡、电可擦只读存储器(EEPROM)、光盘(CD)、光存储介质、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(RO M)、系统存储器及web服务器等多种存储介质。
与信号相关的数据(例如，强度、扩增循环数及检测温度)可通过几个设备来接收。例如，数据可借助位于聚合酶链式反应数据收集装置的处理器收集。在进行收集期间可实时提供数据或者可储存于存储器单元或缓冲区，在完成实验后可在处理器提供数据。类似地，通过与上述收集装置的网络连接(例如，局域网(LAN)，虚拟专用网络(VPN)、互联网及内联网)或直接连接(例如，通用串行总线、其它直接有线连接或无线连接)向独立计算机系统等额外的系统提供上述数据集或者可向光盘、数字多功能光盘、软盘、便携式硬盘或独立计算机系统等便携式介质提供上述数据集。类似地，可通过与笔记本电脑或台式计算机系统等客户端的网络连接(例如，局域网、虚拟专用网络、互联网，内联网及无线通信网络)向服务器系统提供上述数据集。在接收或收集上述数据后，进行上述数据分析步骤，并通过使用从用于分辨分配在2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个的步骤(b)及步骤(c)提供的4个方程式来获得对变数中的至少一个的解答。例如，处理器通过处理所接收的数据来获得在第一检测温度及第二检测温度下检测的信号之间的差异。用于实现运行本发明的处理器的指示可包含在逻辑系统。虽然可向便携式硬盘、通用串行总线、软盘、光盘及数字多功能光盘等的任何软件存储介质提供上述指示，但是可进行下载且可存储于存储器模块(例如，硬盘驱动器、本地或附着随机存取存储器、只读存储器等其他存储器)。用于运行本发明的计算机代码可运行为如C、C++、Java、Visual Ba sic、VBS cript、JavaScript、Perl及XML等多种代码语言。并且，多种语言及协议可利用于基于本发明的数据和命令的外部及内部存储和传送。
在本发明的又一实施方式中提供用于对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列(T1)及第二靶核酸序列(T2)的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的装置，其特征在于，包括：(a)计算机处理器；以及(b)计算机可读存储介质，与上述计算机处理器耦合。
根据一实例，上述装置还包括：反应容器，用于收容样品及信号产生机构；温度调节机构，用于调节上述反应容器的温度；和/或单一类型的检测器，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号。
根据一实例，计算机处理器不仅可使单一类型的检测器在第一检测温度及第二检测温度下检测信号，还可获得对变数中的至少一个的解答。上述处理器能够以使一个处理器进行2中动作的方式制造：与2个检测温度下的检测及解答的计算相关的指令。选择性地，处理器单元能够使2个处理器分别进行2中动作的方式制造。
上述装置的第一个必要特征为具有可使上述装置在2个检测温度下检测信号的处理器。根据一实例，当信号与靶核酸序列的扩增一同产生时，上述装置包括可在每次扩增循环中在上述2个检测温度下检测信号的处理器。
上述装置的第二个必要特征为具有通过处理上述2个检测温度下的信号来获得对变数的解答的处理器。根据一实例，对变数的解答可由经过数学处理的数值表示。
根据一实例，上述处理器可通过在用于检测靶核酸序列的现有的装置(例如，实时聚合酶链式反应装置)安装软件来实现。根据一实例，上述装置包括可在2个检测温度下检测信号且可对2个检测结果进行数学处理的处理器。
在本发明的又一实施方式中提供如下的计算机可读存储介质，即，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法，上述对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法包括下述步骤：
步骤(a)，接收在N个检测温度下检测出的信号；借助相应的信号产生机构检测各个上述靶核酸序列；由上述N个信号产生机构产生的感兴趣的信号对各个靶核酸序列不被单一类型的检测器分辨；N为2以上的整数；
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述N个方程式：
Figure GDA0001317491430000831
在上述式中，(SD1)至(SDN)分别为在各个检测温度下检测出的信号；(ST1D1)至(STNDN)分别为表示在各个检测温度下由各个信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为N2个；
步骤(c)，提供分别包括选自由变数(ST1D1)至(STNDN)组成的组中的至少一个变数的(N2-N)个附加方程式；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述N个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的N2个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
根据本发明的一实例，计算机可读存储介质不仅存储方程式(1)至方程式(N)，还存储附加方程式。根据本发明的一实例，作为基准值的RVTj(DαDβ)存储在计算机可读存储介质。
根据本发明的一实例，计算机可读存储介质包含如下的指令，即，上述指令不仅提供方程式(1)至方程式(N)，还提供附加方程式。根据本发明的一实例，计算机可读存储介质包含在进行本方法的过程中输入RVTj(DαDβ)的指令。根据本发明的一实例，计算机可读存储介质还包含用于实现处理器的指令，上述处理器用于进行获得RVTj(DαDβ)的方法。
在本发明的又一实施方式中提供如下的计算机程序，即，运行用于执行对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法的处理器且储存于计算机可读存储介质，上述执行对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法包括：
步骤(a)，接收在N个检测温度下检测出的信号；借助相应的信号产生机构检测各个上述靶核酸序列；由上述N个信号产生机构产生的感兴趣的信号对各个靶核酸序列不被单一类型的检测器(single type of detector)分辨；N为2以上的整数；
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述N个方程式：
Figure GDA0001317491430000841
Figure GDA0001317491430000851
在上述式中，(SD1)至(SDN)分别为在各个检测温度下检测出的信号；(ST1D1)至(STNDN)分别为表示在各个检测温度下由各个信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为N2个；
步骤(c)，提供分别包括选自由变数(ST1D1)至(STNDN)组成的组中的至少一个变数的(N2-N)个附加方程式；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述N个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的N2个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
根据本发明的一实例，计算机程序不仅包含方程式(1)至方程式(N)，还包含附加方程式。根据本发明的一实例，计算机程序包含R VTj(DαDβ)。根据本发明的一实例，计算机程序包含如下的指令，上述指令不仅提供方程式(1)至方程式(N)，还提供附加方程式。根据本发明的一实例，计算机程序包含在进行本方法的过程中输入RVTj(DαDβ)的指令。根据本发明的一实例，计算机程序还包含用于实现用于进行获得RVTj(DαDβ)的方法的处理器的指令。
当由上述处理器实现时，使上述程序指令运行，并使处理器进行上述的本发明的方法。程序指令可包括接收在N个检测温度下检测的信号的指令以及为了分辨分配在N个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个而获得对变数中的至少一个的解答的指令。
在本发明的又一施方式中提供用于对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的装置，上述装置包括：(a)计算机处理器；以及(b)上述的计算机可读存储介质，与上述计算机处理器耦合。
根据一实例，上述装置还包括：反应容器，用于收容样品及信号产生机构；温度调节机构和/或单一类型的检测器，上述温度调节机构用于调节上述反应容器的温度，上述检测器N个检测温度下检测信号。
根据一实例，计算机处理器不仅可使单一类型的检测器在N个检测温度下检测信号，还可获得对变数中的至少一个的解答。上述处理器能够以使一个处理器进行2中动作的方式制造：与N个检测温度下的检测及解答的计算相关的指令。选择性地，处理器单元能够以使2个处理器分别进行2中动作的方式制造
上述装置的第一个必要特征为具有可使上述装置在N个检测温度下检测信号的处理器。根据一实例，当信号与靶核酸序列的扩增一同产生时，上述装置包括可对应每次扩增循环在N个检测温度下检测信号的处理器。
上述装置的第二个必要特征为具有通过处理N个检测温度下的信号来获得对变数的解答的处理器。根据一实例，对变数的解答可由经过数学处理的数值表示。
根据一实例，上述处理器可通过在用于检测靶核酸序列的现有的装置(例如，实时聚合酶链式反应(PCR)装置)安装软件来实现。根据一实例，上述装置包括可在N个检测温度下检测信号且可对检测结果进行数学处理的处理器。
如下的总结本发明的特征及优点：
(a)在利用不同检测温度的本发明中，在一个反应容器中仅用单一类型的标志，也能够以现有的实时方式检测多个靶核酸序列。在现有技术中，在完成靶扩增后，通过解链分析检测多个靶核酸序列。与此不同地，由于本发明在靶扩增后无需解链分析，从而大大缩短分析时间。
(b)本发明可通过使用数学方程式来获得在检测温度下检测出的总信号中所包含的单独的信号值(即，变数)。基于方程式解法的本发明能够以系统化的方式获得单独的信号值，因此能够以更准确且便利的方式提供分析结果。
(c)本发明在为了靶核酸序列的检测而选择信号产生机构的方面非常自由。尤其，本发明可使用(i)相对各个靶核酸序列而在所有检测温度下产生信号的信号产生机构，(ii)相对靶核酸序列的一部分在所有检测温度下产生信号的信号产生机构及相对靶核酸序列的一部分而在部分检测温度下产生信号的信号产生机构，以及(iii)相对不同的靶核酸序列而具有不同的信号产生温度范围的信号产生机构。
(d)本发明可实现在2个检测温度之间存在由信号产生机构产生的信号变化的特定的关系(方式或规则)的发现。尤其，本发明为了检测靶核酸序列而引入被称为“表示信号变化的上述关系(方式或规则)的基准值”的新概念。本发明使用包含基准值的方程式。上述基准值的利用能够以更逻辑的方式提供个别信号，并且能够以更便利的方式提供附加方程式。
通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅用于对本发明进行更具体的说明，在所附的发明要求保护范围中所公开的本发明的范围并不局限于这些实施例，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例
实施例1：包括不同温度下的号检测的TaqMan实时聚合酶链式反应的实施及借助方程式解答的2个靶检测
本发明者通过使用包括不同温度下的信号检测的TaqMan实时聚合酶链式反应及单一检测通道来调查在1个反应容器中是否能够检测2个靶核酸序列。列具有变数的方程式，上述变数用于表示在2个检测温度下检测出的感兴趣的信号，并解开上述方程式来分辨感兴趣的信号，由此确定多个靶核酸序列的存在或不存在。
为了上游引物和下游引物的延伸及TaqMan探针的切割，而使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。淋球菌(Neisseria gonorrhoeae(NG))的基因组脱氧核糖核酸及沙眼衣原体(Chlamyd ia trachomatis(CT))的基因组脱氧核糖核酸用作靶核酸序列。准备4种类型的样品(淋球菌、沙眼衣原体、淋球菌+沙眼衣原体及无靶的对照组)并进行了分析。
为了淋球菌及沙眼衣原体检测而使用TaqMan实时聚合酶链式反应。在靶核酸存在的情况下，TaqMan探针被切割，并放出标志的片段。可通过从标志的片段测定信号，来获取扩增曲线。
与淋球菌有关的TaqMan探针在其的5’-末端由荧光报道分子(Q uasar 670)标志以及在其的3’-末端由猝灭分子标志(序列：3)，与沙眼衣原体有关的TaqMan探针在其的5’-末端由荧光报道分子(Qua sar 670)标志以及内部部分由猝灭分子(BHQ-2)标志(序列：6)。
作为信号检测温度而选择“60℃”及“72℃”。
通过使用表示在60℃及72℃的检测温度下借助淋球菌及沙眼衣原体提供的感兴趣的信号的变数、淋球菌及沙眼衣原体的基准值(RV)及在2个检测温度下检测出的信号来列方程式。
<方程式组1>
ST1D1+ST2D1＝SD1
ST1D2+ST2D2＝SD2
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
ST1D1表示在60℃的检测温度下借助淋球菌而提供的感兴趣的信号的变数，T1表示淋球菌，D1表示60℃的检测温度；
ST2D1表示在60℃的检测温度下借助沙眼衣原体而提供的感兴趣的信号的变数，T2表示沙眼衣原体，D1表示60℃的检测温度；
ST1D2表示在72℃的检测温度下借助淋球菌而提供的感兴趣的信号的变数，T1表示淋球菌，D2表示72℃的检测温度；
ST2D2表示至72℃的检测温度下借助沙眼衣原体而提供的感兴趣的信号的变数，T2表示沙眼衣原体，D2表示72℃的检测温度；
SD1为常数，在60℃的温度下检测信号，由此以实验的方式获得；
SD2为常数，在72℃的温度下检测信号，由此以实验的方式获得；
RVT1D1/D2为常数，在端点计算60℃的温度下的RFU÷72℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU为对单独含有淋球菌的样品的检测。T1表示淋球菌，D1及D2分别表示60℃及72℃的检测温度；及
RVT2D1/D2为常数，在端点计算60℃的温度下的RFU÷72℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU为对单独含有沙眼衣原体的样品的检测。T2表示沙眼衣原体，D1及D2分别表示60℃及72℃的检测温度。
用于解开上述方程式组的接近法如下：在重新制定具有针对各个靶核酸序列选择的2个变数的线性联立方程式后，获得对上述2个变数的解答。例如，可制定下述4个线性联立方程式：
联立方程式1
ST1D1+ST2D1＝SD1
1/RVT1D1/D2×ST1D1+1/RVT2D1/D2×ST2D1＝SD2
联立方程式2
RVT1D1/D2×ST1D2+RVT2D1/D2×ST2D2＝SD1
ST1D2+ST2D2＝SD2
联立方程式3
ST1D1+RVT2D1/D2×ST2D2＝SD1
1/RVT1D1/D2×ST1D1+ST2D2＝SD2
联立方程式4
RVT1D1/D2×ST1D2+ST2D1＝SD1
ST1D2+1/RVT2D1/D2×ST2D1＝SD2
然后，选择上述4个线性联立方程式中的一个。在各循环中获得相应的对变数的解答后，对其进行绘制。绘制结果可被视为由相应的变数表示的靶序列的扩增曲线。最后，确定靶序列的存在或不存在。
在本实施例中，使用线性联立方程式1、2。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物及探针的序列如下：
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(序列：1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(序列：2)
NG-P 5’-[Quasar 670]TGCCCCTCATTGGCGTGTTTCG[BHQ-2]-3’(序列：3)
CT-F1 5’-TCCGAATGGATAAAGCGTGACIIIIIATGAACTCAC-3’(序列：4)
CT-R1 5’-AACAATGAATCCTGAGCAAAGGIIIIICGTTAGAGTC-3’(序列：5)
CT-P 5’-[Quasar 670]CATTGTAAAGA[T(BHQ-2)]ATGGTCT GCTTCGACCG[C3spacer]-3’(序列：6)
(I：脱氧肌苷)
利用包含靶核酸序列(1pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸，10p g的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸或1pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5pmo le的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及10pmole的下游引物(序列2)、1.5pmole的TaqMan探针(序列3)、5pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列4)，10pmole的下游引物(序列5)、3pmole的TaqMan探针(序列6)以及5μl的4×主混合液(最终，200μM的三磷酸脱氧核苷酸(dNTPs)、2mM的MgCl2及2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最终体积进行了实时聚合酶链式反应。在50℃的温度下在实时热循环仪(CFX96，伯乐公司(Bio-Rad))中将含有上述反应混合物的管放入5分钟，在95℃的温度下变性15分钟，并且以在95℃的温度下30秒钟、在60℃的温度下60秒钟、在72℃的温度下30秒钟的方式反复实施50次。在每个循环的60℃及72℃的温度下进行了信号的检测。
如图1A所示，当淋球菌、沙眼衣原体或淋球菌+沙眼衣原体存在时，在60℃及72℃温度下均检测出了信号。当靶核酸不存在时，未检测出信号。通过使用淋球菌独立样品或沙眼衣原体独立样品的信号来计算了与各个靶序列有关的基准值。如图1B所示，与淋球菌及沙眼衣原体靶有关的基准值分别为1.8及5.8。
图1C示出了通过解开联立方程式1来获得的绘制结果。对ST1D1的绘制结果可被视为60℃的温度下的淋球菌的扩增曲线，对ST2D1的绘制结果可被制备60℃的温度下的沙眼衣原体的扩增曲线。为了确认所获得的扩增曲线的显著性，而参照淋球菌样品及沙眼衣原体样品的结果来选择适合的阈值。如图1C所示地，60℃的温度下的淋球菌或沙眼衣原体的扩增曲线可保湿各样品被的靶核酸序列的存在或不存在。
图1D示出如下的内容，即，可通过解开联立方程式2来获得72℃的温度下的淋球菌或沙眼衣原体的扩增曲线，由此，确认各样品内的靶核酸序列的存在或不存在。
上述结果证实，可列包含变数、基准值及在各检测温度下检测的信号的方程式，并通过解开上述方程式的方式来从在各检测温度下检测出的信号提取或分辨对各靶序列的感兴趣的信号。
因此，可使用包括相同温度下的信号检测的TaqMan实时聚合酶链式反应及单一检测通道来在一个反应容器中检测2个靶核酸序列，由此可知，本发明的方程式解答方式能够以更便利且具有更可信性的方式确定靶序列的存在与否。
实施例2：包括相同温度下的信号检测的探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应的执行及借助方程式解答的2个靶检测
本发明者通过使用包括相同温度下的信号检测地探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应及单一检测通道来调查在1个反应容器中是否能够检测2个靶核酸序列。列具有变数的方程式，上述变数用于表示在2个检测温度下检测出的感兴趣的信号，并解开上述方程式来分辨感兴趣的信号，由此确定多个靶核酸序列的存在或不存在。
为了上游引物和下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸用作靶核酸序列。准备4种类型的样品(淋球菌、沙眼衣原体、淋球菌+沙眼衣原体及无模板的对照组)并进行了分析。
通过使用探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应来检测了沙眼衣原体及淋球菌。在靶存在的情况下，探测和标记寡核苷酸被切割，并生成探测和标记寡核苷酸片段。上述探测和标记寡核苷酸片段在捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位被退火，在捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位上延伸，而形成捕捉和模板化寡核苷酸和延伸二聚体(二聚的捕捉和模板化寡核苷酸)。延伸二聚体的形成提供信号，并通过在延伸二聚体形成温度下测定信号，来可获取扩增曲线。
作为信号检测温度而选择“60℃”及“72℃”。
在本实施例中以在60℃及72℃的温度下形成上述二聚体并提供信号的方式设计对沙眼衣原体的上述延伸二聚体的序列及长度。另一方面，对淋球菌的上述延伸二聚体的序列及长度被设计成如下，即，虽然在60℃的温度下形成二聚体并提供信号，但在72℃的温度下不形成二聚体，而使被解离从而无法提供信号。在72℃的检测温度下，产生对上述沙眼衣原体的信号，并被检测出。在60℃的检测温度下，不仅产生对上述沙眼衣原体的信号，还产生对上述淋球菌的信号，并被检测出。
为了上述探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的延伸，它们的3’-末端被碳间隔区阻断。上述CTO的5’-末端被猝灭分子(B HQ-2)标志以及其模板部位被荧光报道分子(CAL Fluor Red 610)标志(序列8及序列12)。
<方程式组2>
ST1D1+ST2D1＝SD1
ST1D2+ST2D2＝SD2
ST1D2＝0
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
ST1D1、ST2D1、ST1D2、ST2D2、SD1、SD2及RVT2D1/D2与方程式组1中的定义相同。
在方程式组2中，代替淋球菌的基准值RVT1D1/D2而使用方程式S T1D2＝0。针对淋球菌的信号产生机构被制备成在存在淋球菌时在72℃的检测温度(D2)下也不会实质性地产生信号，因此在本实施例中可选择方程式ST1D2＝0。
在各个循环中获得对变数的相应的解答后，对其进行绘制。
<方程式组3>
ST1D1+ST2D1＝SD1
ST1D2+ST2D2＝SD2
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
ST1D1、ST2D1、ST1D2、ST2D2、SD1、SD2、RVT1D1/D2及RVT2D1/D2与方程式组1中的定义相同。
在本实施例中，针对淋球菌的信号产生机构被制备成在存淋球菌时在72℃的检测温度(D2)下也不会实质性地产生信号。但是，在实际实验中通常检测出的72℃的检测温度(D2)下的非常微弱的信号(例如，背景信号)也可使用在实际提供RVT2D1/D2的方面。
如解联立方程式1，能够以相同的方式并使用联立方程式1及联立方程式2来获得解答。在各个循环中获得对变数的相同的解答后，对其进行绘制。
<方程式组4>
ST1D1+ST2D1＝SD1
ST1D2+ST2D2＝SD2
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
ST1D1、ST2D1、ST1D2、ST2D2、SD1、SD2及RVT2D1/D2与方程式组1中的定义相同。
在方程式组4中，RVT1D1/D2为任意选择常数值(arbitrary-selected constantvalue)。在本实施例中，针对淋球菌的信号产生机构被制备成在存在淋球菌时在72℃的检测温度(D2)下也不会实质性地产生信号，因此代替经实验所获得的值，可使用针对RVT2D1/D2的任意选择值。在此情况下，针对RVT2D1/D2的任意选择值为108，其更大于在方程式组3中经实验所获得的值。
如解联立方程式1，能够以相同的方式并使用联立方程式1及联立方程式2来获得解答。在各个循环中获得对变数的相应的解答后，对其进行绘制。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸切割及延伸以及捕捉和模板化寡核苷酸的序列如下：
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(序列：1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(序列：2)
NG-PTO 5’-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTC G[C3spacer]-3’(序列：7)
NG-CTO 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluo r Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3spacer]-3’(序列：8)
CT-F2 5’-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATA AC-3’(序列：9)
CT-R2 5’-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGG AGA-3’(序列：10)
CT-PTO 5’-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTG GCTGCG[C3spacer]-3’(序列：11)
CT-CTO 5’-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(CAL Fl uor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3spacer]-3’(序列：12)
(I：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
利用包含靶核酸序列(10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸或10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5p mole的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及5pmole的下游引物(序列2)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列7)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列8)，5pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列9)、5pmole的下游引物(序列10)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列11)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列12)以及10μl的2×主混合液(最终，200μM的三磷酸脱氧核苷酸、2mM的MgCl2及2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最终体积进行了实时聚合酶链式反应。在50℃的温度下在实时热循环仪(CFX96，伯乐公司(Bio-Rad))中将含有上述反应混合物的管放入5分钟后，在95℃的温度下变性15分钟，并在95℃的温度下进行30秒、在60℃的温度下进行60秒、在72℃的温度下进行30秒的过程循环反复50次。信号的检测在每次循环均在60℃及72℃的温度下进行。
如图2A所示，当淋球菌、沙眼衣原体或淋球菌+沙眼衣原体存在时，在60℃的温度下检测信号。当沙眼衣原体单独存在时，在60℃及72℃的温度下均检测出信号。当淋球菌单独存在时，在60℃的温度下检测出信号，但在72℃的温度下未检测出。当靶核酸序列不存在时，未检测出信号。各个靶的基准值使用淋球菌样品或沙眼衣原体样品的信号来计算，并示出在图2B。如图2B所示，针对淋球菌及沙眼衣原体的基准值分别为36.7及1.2。
图2C-图2H示出通过解开方程式组2、3及4来获得的绘制结果。针对ST1D1、ST2D1、ST1D2及ST2D2的绘制结果可分别被视为60℃的温度下的淋球菌的扩增曲线、60℃的温度下的沙眼衣原体的扩增曲线、72℃的温度下的淋球菌的扩增曲线以及72℃的温度下的沙眼衣原体的扩增曲线。为了确认所获得的扩增曲线的显著性，参照淋球菌样品及沙眼衣原体样品的结果来选择适合的阈值。
如图2C、图2E及图2G所示地，60℃的温度下的淋球菌或沙眼衣原体的扩增曲线可确认各样品内的靶核酸序列的存在或不存在。
上述结果证实，可列包含变数、基准值及在各检测温度下检测的信号的方程式，并通过解开上述方程式的方式来从在各检测温度下检测出的信号提取或分辨对各靶序列的感兴趣的信号。
因此，可使用包括相同温度下的信号检测的TaqMan实时聚合酶链式反应及单一检测通道来在一个反应容器中检测2个靶核酸序列，由此可知，本发明的方程式解答方式能够以更便利且具有更可信性的方式确定靶序列的存在与否。
实施例3：包括相同温度下的信号检测地TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应的执行及借助解答方程式的3个靶检测
本发明者通过使用包括不同温度下的信号检测地TaqMan/探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应及单一检测通道来调差在一个反应容器中是否能够检测3个靶核酸序列。列具有变数的方程式，上述变数用于表示在3个检测温度下检测出的感兴趣的信号，并解开上述方程式来分辨感兴趣的信号，由此确定多个靶核酸序列的存在或不存在。
为了上游引物和下游引物的延伸、探测和标记寡核苷酸的切割及探测和标记寡核苷酸片段的延伸，而使用了具有5’核酸酶活性的Taq脱氧核糖核酸聚合酶。将淋球菌(Neisseria gonorrhoeae(NG))的基因组脱氧核糖核酸、沙眼衣原体的(Chlamydiatrachomatis(CT))基因组脱氧核糖核酸及生殖支原体(Mycoplasma genitalium(MG))的基因组脱氧核糖核酸作为靶核酸序列使用。准备分别包括淋球菌、沙眼衣原体、生殖支原体、淋球菌及沙眼衣原体的混合物；淋球菌及生殖支原体的混合物；沙眼衣原体及生殖支原体的混合物；淋球菌、沙眼衣原体及生殖支原体的混合物及不存在模板的对照组的8个反应管。
为了检测生殖支原体，而使用TaqMan实时聚合酶链式反应。为了检测沙眼衣原体及淋球菌，而使用探测和标记寡核苷酸切割及延伸实时聚合酶链式反应。
作为信号检测温度而选择“60℃”、“72℃”及“95℃”。
在本实施例中，以在60℃及72℃的温度下提供信号且在95℃的温度下不提供信号的方式设计针对沙眼衣原体的上述延伸二聚体的序列及长度。另一方面，以在60℃的温度下提供信号且在72℃及95℃的温度下不提供信号的方式设计针对淋球菌的上述延伸二聚体的序列及长度。在95℃的检测温度下，产生并检测出针对上述生殖支原体的信号。在72℃的检测温度下，不仅产生并检测出针对上述生殖支原体的信号，还产生并检测出针对上述沙眼衣原体的信号。并且，在60℃的检测温度下，不仅产生并检测出针对上述生殖支原体及沙眼衣原体的信号，还产生并检测出针对上述淋球菌的信号。
TaqMan探针的5’-末端被荧光报道分子(CAL Fluor Red 610)标记以及其3’-末端被猝灭分子(BHQ-2)标记(序列：15)。为了上述探测和标记寡核苷酸及捕捉和模板化寡核苷酸的延伸，它们的3’-末端被碳间隔区阻断。上述CTO被猝灭分子(BHQ-2)标记以及其模板部位被荧光报道分子(CAL Fluor Red 610)标记(序列：8及12)。
在本实施例中，利用来源于各靶的基准值及3个检测温度(95℃，72℃及60℃)的信号的绘制方法来提供表示各靶核酸序列的存在和不存在的扩增曲线。将联立方程式作为绘制方法使用，并适用于从各检测温度中提取靶信号的方面。用于获得针对各靶核酸序列的扩增曲线的基准值的计算及联立方程式如下：
<方程式组5>
ST1D1+ST2D1+ST3D1＝SD1
ST1D2+ST2D2+ST3D2＝SD2
ST1D3+ST2D3+ST3D3＝SD3
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
ST1D1/ST1D3＝RVT1D1/D3
ST1D2/ST1D3＝RVT1D2/D3
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
ST2D1/ST2D3＝RVT2D1/D3
ST2D2/ST2D3＝RVT2D2/D3
ST3D1/ST3D2＝RVT3D1/D2
ST3D1/ST3D3＝RVT3D1/D3
ST3D2/ST3D3＝RVT3D2/D3
ST1D1为表示在60℃的检测温度下借助淋球菌而提供的感兴趣的信号的变数，T1表示淋球菌，D1表示60℃的检测温度；
ST2D1为表示在60℃的检测温度下借助沙眼衣原体而提供的感兴趣的信号的变数，T2表示沙眼衣原体，D1表示60℃的检测温度；
ST3D1为表示在60℃的检测温度下借助生殖支原体而提供的感兴趣的信号的变数，T3表示生殖支原体，D1表示60℃的检测温度；
ST1D2为表示在72℃的检测温度下借助淋球菌而提供的感兴趣的信号的变数，T1表示淋球菌，D2表示72℃的检测温度；
ST2D2为表示在72℃的检测温度下借助沙眼衣原体而提供的感兴趣的信号的变数，T2表示沙眼衣原体，D2表示72℃的检测温度；
ST3D2为表示在72℃的检测温度下借助生殖支原体而提供的感兴趣的信号的变数，T3表示生殖支原体，D2表示72℃的检测温度；
ST1D3为表示在95℃的检测温度下借助淋球菌而提供的感兴趣的信号的变数，T1表示淋球菌，D3表示95℃的检测温度；
ST2D3为在95℃的检测温度下借助沙眼衣原体而提供的感兴趣的信号的变数，T2表示沙眼衣原体，D3表示95℃的检测温度；
ST3D3表示在95℃的检测温度下借助生殖支原体而提供的感兴趣的信号的变数，T3表示生殖支原体，D3表示95℃的检测温度；
SD1为常数，在60℃的温度下下检测信号，由此以实验的方式获得；
SD2为常数，在72℃的温度下下检测信号，由此以实验的方式获得；
SD3为常数，在95℃的温度下下检测信号，由此以实验的方式获得；
RVT1D1/D2为常数，在端点计算60℃的温度下的RFU÷72℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有淋球菌的样品中检测。T1表示淋球菌，D1及D2分别表示60℃及72℃的检测温度；
RVT1D1/D3为常数，在端点计算60℃的温度下的RFU÷95℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有淋球菌的样品中检测。T1表示淋球菌，D1及D3分别表示60℃及95℃的检测温度；
RVT1D2/D3为常数，在端点计算72℃的温度下的RFU÷95℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有淋球菌的样品中检测。T1表示淋球菌，D2及D3分别表示72℃及95℃的检测温度；
RVT2D1/D2为常数，在端点计算60℃的温度下的RFU÷72℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有淋球菌的样品中检测。T1表示淋球菌，D1及D2分别表示60℃及72℃的检测温度；。
RVT2D1/D3为常数，在端点计算60℃的温度下的RFU÷95℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有沙眼衣原体的样品中检测。T2表示沙眼衣原体，D1及D3分别表示60℃及95℃的检测温度；
RVT2D2/D3为常数，在端点计算72℃的温度下的RFU÷95℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有沙眼衣原体的样品中检测。T2表示沙眼衣原体，D2及D3分别表示72℃及95℃的检测温度；
RVT3D1/D2为常数，在端点计算60℃的温度下的RFU÷72℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有生殖支原体的样品中检测。T3表示生殖支原体，D1及D2分别表示60℃及72℃的检测温度；
RVT3D1/D3为常数，在端点计算60℃的温度下的RFU÷95℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有生殖支原体的样品中检测。T3表示生殖支原体，D1及D3分别表示60℃及95℃的检测温度；及
RVT3D2/D3为常数，在端点计算72℃的温度下的RFU÷95℃中的R FU，由此以实验的方式获得，RFU从单独含有生殖支原体的样品中检测。T3表示生殖支原体，D2及D3分别表示72℃及95℃的检测温度。
用于解开上述方程组的接近法如下：在重新制定具有针对各个靶核酸序列选择的3个变数的线性联立方程式后，获得对上述3个变数的解答。例如，在方程式组5中使用9个联立方程式中的适合的6个方程式来指定下述3个线性联立方程式：
联立方程式5
ST1D1+ST2D1+ST3D1＝SD1
1/RVT1D1/D2×ST1D1+1/RVT2D1/D2×ST2D1+1/RVT3D1/D2×ST3D1＝SD2
1/RVT1D1/D3×ST1D1+1/RVT2D1/D3×ST2D1+1/RVT3D1/D3×ST3D1＝SD3
联立方程式6
RVT1D1/D2×ST1D2+RVT2D1/D2×ST2D2+RVT3D1/D2×ST3D2＝SD1
ST1D2+ST2D2+ST3D2＝SD2
1/RVT1D2/D3×ST1D2+1/RVT2D2/D3×ST2D2+1/RVT3D2/D3×ST3D2＝SD3
联立方程式7
RVT1D1/D3×ST1D3+RVT2D1/D3×ST2D3+RVT3D1/D3×ST3D3＝SD1
RVT1D2/D3×ST1D3+RVT2D2/D3×ST2D3+RVT3D2/D3×ST3D3＝SD2
ST1D3+ST2D3+ST3D3＝SD3
然后，在各个循环中获得相应的对变数的解答后，对其进行绘制。绘制结果可被视为由相应的变数表示的靶序列的扩增曲线。最后，确定靶序列的存在或不存在。
在本实施例中，针对淋球菌的信号产生机构被制备成在存在淋球菌时在72℃及95℃的检测温度下也不会实质性地产生信号，针对沙眼衣原体的信号产生机构被制备成在存在沙眼衣原体时在95℃的检测温度下也不会实质性地产生信号。因此，可代替方程式组5而使用其他方程式组。
作为方程式组5的第一变形例，代替包含针对淋球菌的基准值中的RVT1D1/D2、RVT1D1/D3或RVT1D2/D3的方程式而使用方程式ST1D2＝0及ST1D3＝0，代替包含针对沙眼衣原体的基准值中的RVT2D1/D3或RVT2D2/D3的方程式而使用方程式ST2D3＝0。
作为第二变形例，可代替经实验所获得的值而使用针对RVT1D1/D2、RVT1D1/D3、RVT1D2/D3、RVT2D1/D3及RVT2D2/D3的任意选择值。
第一变形例及第二变形例的组合也可使用于本方法。
在本实施例中使用的上游引物、下游引物、探测和标记寡核苷酸切割及延伸以及捕捉和模板化寡核苷酸及TaqMan探针的序列如下：
NG-F 5’-TACGCCTGCTACTTTCACGCTIIIIIGTAATCAGATG-3’(序列：1)
NG-R 5’-CAATGGATCGGTATCACTCGCIIIIICGAGCAAGAAC-3’(序列：2)
NG-PTO 5’-GTACGCGATACGGGCCCCTCATTGGCGTGTTTC G[C3spacer]-3’(序列：7)
NG-CTO 5’-[BHQ-2]TTTTTTTTTTTTTTTTTTTG[T(CAL Fluo r Red 610)]ACTGCCCGTATCGCGTAC[C3spacer]-3’(序列：8)
CT-F2 5’-GAGTTTTAAAATGGGAAATTCTGGTIIIIITTTGTATA AC-3’(序列：9)
CT-R2 5’-CCAATTGTAATAGAAGCATTGGTTGIIIIITTATTGG AGA-3’(序列：10)
CT-PTO 5’-GATTACGCGACCGCATCAGAAGCTGTCATTTTG GCTGCG[C3spacer]-3’(序列：11)
CT-CTO 5’-[BHQ-2]GCGCTGGATACCCTGGACGA[T(CAL Fl uor Red 610)]ATGTGCGGTCGCGTAATC[C3spacer]-3’(序列：12)
MG-F 5’-AAAACCCACGGAAATGATGAGAIIIIIATTGGTTCTA C-3’(序列：13)
MG-R 5’-CTCGTTAATTTACCTATTCCATTTTGIIIIICTGATAA AAG-3’(序列：14)
MG-P 5’-[CAL Fluor Red 610]GAGTTCTTTCAAGAACAGCAA GAGGTGT[BHQ-2]-3’(序列：15)
(I：脱氧肌苷)
(下划线文字表示探测和标记寡核苷酸的5’-标记部位)
靶核酸序列(利用包含靶核酸序列(10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸、10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸、10pg的生殖支原体的基因组脱氧核糖核酸、10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物、10pg的淋球菌的基因组脱氧核糖核酸及10pg的生殖支原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物、10pg的沙眼衣原体的基因组脱氧核糖核酸及10pg的生殖支原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物或者分别为10pg的淋球菌、沙眼衣原体及生殖支原体的基因组脱氧核糖核酸的混合物)、5pmole的用于淋球菌的靶扩增的上游引物(序列1)及5pmole的下游引物(序列2)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列7)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列8)、5pmole的用于沙眼衣原体的靶扩增的上游引物(序列9)、5pmole的下游引物(序列10)、3pmole的探测和标记寡核苷酸(序列11)、1pmole的捕捉和模板化寡核苷酸(序列12)以及10μl的2×主混合液(最终，200μM的三磷酸脱氧核苷酸、2mM的MgCl2及2U的Taq脱氧核糖核酸聚合酶)的20μl的最终体积进行了实时聚合酶链式反应。在50℃的温度下在实时热循环仪(CFX96，伯乐公司(Bio-Rad))中将含有上述反应混合物的管放入5分钟后，在95℃的温度下变性15分钟，并在95℃的温度下进行30秒、在60℃的温度下进行60秒、在72℃的温度下进行30秒的过程循环反复50次。信号的检测在每次循环均在60℃、72℃及95℃的温度下进行。
如图3A及图3B所示地，当存在淋球菌、沙眼衣原体、生殖支原体及混合靶时，在60℃的温度下检测信号。当沙眼衣原体单独存在时，在60℃及72℃的温度下均检测出信号，但在95℃的温度下未检测出信号。当淋球菌单独存在时，在60℃的温度下检测出信号，但在95℃及72℃的温度下未检测出信号。当靶核酸序列不存在时，未检测出信号。各靶的基准值使用淋球菌单独样品、沙眼衣原体单独样品或生殖支原体单独样品的信号来计算，并示出在图3C。
针对ST1D1、ST2D1、ST3D1、ST2D1、ST2D2、ST2D3、ST3D1、ST3D2及ST3D3的绘制结果可分别被视为60℃的温度下的淋球菌的扩增曲线、60℃的温度下的沙眼衣原体地扩增曲线、60℃的温度下的生殖支原体的扩增曲线、72℃的温度下的淋球菌的扩增曲线、72℃的温度下的沙眼衣原体地扩增曲线、72℃的温度下的生殖支原体的扩增曲线、95℃的温度下的淋球菌的扩增曲线、95℃的温度下的沙眼衣原体的扩增曲线及95℃的温度下的生殖支原体的扩增曲线。为了确认所获得的扩增曲线的显著性，参照淋球菌单独样品、沙眼衣原体单独样品及生殖支原体单独样品的结果来选择适合的阈值。
如图3D及图3E所示地，60℃的温度下的淋球菌、沙眼衣原体或生殖支原体的扩增曲线可确认各样品内的靶核酸序列的存在或不存在。
上述结果证实，可列包含变数、基准值及在各检测温度下检测的信号的方程式，并通过解开上述方程式的方式来从在各检测温度下检测出的信号提取或分辨对各靶序列的感兴趣的信号。
因此，可使用包括不同温度下的信号检测的TaqMan实时聚合酶链式反应及单一检测通道来在一个反应容器中检测3个靶核酸序列，由此可知，本发明的方程式解答方式能够以更便利且具有更可信性的方式确定3个靶序列的存在与否。
详细记述了本发明的优选实例，可进行根据本发明的原理的变形及修改，这对本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的，本发明的范围可根据所附的发明要求保护范围和其的等同技术方案定义。

Claims (17)

1.一种对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列T1及第二靶核酸序列T2的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，与用于检测第一靶核酸序列T1的第一信号产生机构及用于检测第二靶核酸序列T2的第二信号产生机构一同培养上述样品以扩增上述样品中的第一靶核酸序列T1和第二靶核酸序列T2，在第一检测温度D1及第二检测温度D2下检测信号；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的感兴趣的信号对各个靶核酸序列不被单一类型的检测器分辨；
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对上述2个靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述2个方程式：
(I)：ST1D1+ST2D1＝SD1
(II)：ST1D2+ST2D2＝SD2
在上述式中，
SD1为在第一检测温度下检测的信号，
SD2为在第二检测温度检测的信号；
ST1D1为表示在第一检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，
ST2D1为表示在第一检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，
ST1D2为表示在第二检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，
ST2D2为表示在第二检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；
变数的总数为4个；
步骤(c)，提供选自由下述方程式组成的组中的2个附加方程式：
(III)：f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)，
(IV)：f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)，以及
(V)：ST1D2＝0
在上述式中，
RVT1(D1D2)为表示在第一检测温度及第二检测温度下借助第一信号产生机构提供的信号变化关系的第一靶核酸序列T1的基准值RV，
RVT2(D1D2)为表示在第一检测温度及第二检测温度借助第二信号产生机构提供的信号变化关系的第二靶核酸序列T2的基准值RV；
f(ST1D1，ST1D2)表示ST1D1及ST1D2的函数；
f(ST2D1，ST2D2)表示ST2D1及ST2D2的函数；
当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，能够选择方程式(V)中的ST1D2＝0；
其中，
f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)包括：
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2 (VI)、或
ST1D2/ST1D1＝RVT1D2/D1 (VII)；
f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)包括：
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2 (VIII)、或
ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1 (IX)；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的4个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，通过在上述2个靶核酸序列中的至少一个分配上述感兴趣的信号中的至少一个来实施所述方法以检测样品内2个靶核酸序列中的至少一个。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
当将上述方程式(I)及(II)中的2个变数ST1D1及ST1D2转换为选自上述2个变数中的一个变数时，使用上述方程式(III)，且
当将上述方程式(I)及(II)中的2个变数ST2D1及ST2D2转换为选自上述2个变数中的一个变数时，使用上述方程式(IV)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
通过如下步骤获得RVT1D1/D2：
步骤(i-1)，与用于检测第一靶核酸序列的第一信号产生机构一同培养第一靶核酸序列；
步骤(i-2)，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号；之后
步骤(i-3)，计算在上述第一检测温度下检测出的信号对在上述第二检测温度下检测出的信号的比率，
通过如下步骤获得RVT1D2/D1：
步骤(i-1)，与用于检测第一靶核酸序列的第一信号产生机构一同培养第一靶核酸序列；
步骤(i-2)，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号；之后
步骤(i-3)，计算在上述第二检测温度下检测出的信号对在上述第一检测温度下检测出的信号的比率，
通过如下步骤获得RVT2D1/D2：
步骤(ii-1)，与用于检测第二靶核酸序列的第二信号产生机构一同培养第二靶核酸序列；
步骤(ii-2)，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号；之后
步骤(ii-3)，计算在上述第一检测温度下检测出的信号对在上述第二检测温度下检测出的信号的比率，及
通过如下步骤获得RVT2D2/D1：
步骤(ii-1)，与用于检测第二靶核酸序列的第二信号产生机构一同培养第二靶核酸序列；
步骤(ii-2)，在第一检测温度及第二检测温度下检测信号；之后
步骤(ii-3)，计算在上述第二检测温度下检测出的信号对在上述第一检测温度下检测出的信号的比率。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于获得ST1D1、ST1D2、ST2D1及ST2D2的上述2个附加方程式包括下述方程式(VI)及(VII)中的一个及下述方程式(VIII)及(IX)中的一个：
(VI)：ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2
(VII)：ST1D2/ST1D1＝RVT1D2/D1
(VIII)：ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
(IX)：ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于获得ST1D1、ST1D2、ST2D1及ST2D2的上述2个附加方程式包括下述方程式(VIII)及(IX)中的一个及下述方程式(V)：
(VIII)：ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2
(IX)：ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1
(V)：ST1D2＝0。
7.一种对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法，其特征在于，包括：
步骤(a)，与用于检测N个靶核酸序列的N个信号产生机构一同培养上述样品以扩增上述样品中的N个靶核酸序列，在N个检测温度下检测信号；借助相应的信号产生机构检测各个上述靶核酸序列；由上述N个信号产生机构产生的感兴趣的信号对各个靶核酸序列不被单一类型的检测器分辨；N为2以上的整数；
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述N个方程式：
Figure FDA0002679932300000041
Figure FDA0002679932300000051
在上述式中，SD1至SDN分别为在各个检测温度下检测出的信号；ST1D1至STNDN分别为表示在各个检测温度下由各个信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为N2个；
步骤(c)，提供选自由下述方程式组成的组中的N2-N个附加方程式：
(X)：f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)，以及
(XI)：STjDK＝0
在上述式中，
Tj中的j表示从第1至第N的所有整数；
对于各个第j靶核酸，α及β一同表示选自1至N中的2个整数的组合；
上述组合的数由NC2表示；
对于各个第j靶核酸，K为选自1至N中的整数中的至少一个；
RVTj(DαDβ)为反映在第α检测温度及第β检测温度下借助第j信号产生机构提供的信号变化关系的第j靶核酸序列Tj的基准值RV；
f(STjDα，STjDβ)表示STjDα及STjDβ的函数；
当存在第j靶核酸序列时，也以使第j信号产生机构在第K检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，能够选择方程式(XI)中的STjDK＝0；
其中f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)包括：
STjDα/STjDβ＝RVTjDα/Dβ(XII)、或
STjDβ/STjDα＝RVTjDβ/Dα(XIII)；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述N个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的N2个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，通过在上述靶核酸序列中的至少一个分配上述感兴趣的信号中的至少一个来实施所述方法以检测样品内靶核酸序列中的至少一个。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将上述方程式(1)至(N)中的变数STjD1至STjDN转换为选自上述变数STjD1至STjDN中的一个变数时，使用包括第j靶核酸序列Tj的基准值RV的方程式(X)。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，
通过如下步骤获得RVTjDα/Dβ：
步骤(i-1)，与用于检测第j靶核酸序列的第j信号产生机构一同培养第j靶核酸序列；
步骤(i-2)，在第α检测温度及第β检测温度下检测信号；之后
步骤(i-3)，计算在上述第α检测温度下检测出的信号对在上述第β检测温度下检测出的信号的比率，
通过如下步骤获得RVTjDβ/Dα：
步骤(i-1)，与用于检测第j靶核酸序列的第j信号产生机构一同培养第j靶核酸序列；
步骤(i-2)，在第α检测温度及第β检测温度下检测信号；之后
步骤(i-3)，计算在上述第β检测温度下检测出的信号对在上述第α检测温度下检测出的信号的比率。
11.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，上述N2-N个附加方程式选自下述方程式组中：
(XII)：STjDα/STjDβ＝RVTjDα/Dβ
(XIII)：STjDβ/STjDα＝RVTjDβ/Dα
在上述式中，在第α检测温度及第β检测温度下与各个第j靶核酸有关的方程式选自上述方程式(XII)及(XIII)中。
12.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，上述N2-N个附加方程式选自下述方程式组中：
(XII)：STjDα/STjDβ＝RVTjDα/Dβ
(XIII)：STjDβ/STjDα＝RVTjDβ/Dα
(XI)：STjDK＝0
在上述式中，在第α检测温度及第β检测温度下与各个第j靶核酸有关的方程式选自上述方程式(XII)及(XIII)中；
在将上述方程式(XI)作为附加方程式来选择的情况下，其他附加方程式选自与第j靶核酸序列有关的α或β和与第j靶核酸序列有关的K不同的方程式(XII)及(XIII)中。
13.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，在伴随核酸扩增或无伴随核酸扩增的信号扩增过程中进行上述步骤(a)。
14.一种计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列T1及第二靶核酸序列T2的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法，上述方法包括：
步骤(a)，接收在第一检测温度D1及第二检测温度D2下检测出的信号；借助第一信号产生机构扩增并检测上述样品内第一靶核酸序列T1，借助第二信号产生机构扩增并检测第二靶核酸序列T2；由上述第一信号产生机构及第二信号产生机构产生的感兴趣的信号不被单一类型的检测器分辨；
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对上述2个靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述2个方程式：
(I)：ST1D1+ST2D1＝SD1
(II)：ST1D2+ST2D2＝SD2
在上述式中，SD1为在第一检测温度下检测的信号，SD2为在第二检测温度检测的信号；ST1D1为表示在第一检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，ST2D1为表示在第一检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，ST1D2为表示在第二检测温度下由第一信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数，ST2D2为表示在第二检测温度下由第二信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为4个；
步骤(c)，提供选自由下述方程式组成的组中的2个附加方程式：
(III)：f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)，
(IV)：f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)，以及
(V)：ST1D2＝0
在上述式中，
RVT1(D1D2)为表示在第一检测温度及第二检测温度下借助第一信号产生机构提供的信号变化关系的第一靶核酸序列T1的基准值RV，
RVT2(D1D2)为表示在第一检测温度及第二检测温度借助第二信号产生机构提供的信号变化关系的第二靶核酸序列T2的基准值RV；
f(ST1D1，ST1D2)表示ST1D1及ST1D2的函数；
f(ST2D1，ST2D2)表示ST2D1及ST2D2的函数；
当存在第一靶核酸序列时，也以使第一信号产生机构在第二检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，能够选择方程式(V)中的ST1D2＝0；
其中，
f(ST1D1，ST1D2)＝RVT1(D1D2)包括：
ST1D1/ST1D2＝RVT1D1/D2 (VI)、或
ST1D2/ST1D1＝RVT1D2/D1 (VII)；
f(ST2D1，ST2D2)＝RVT2(D1D2)包括：
ST2D1/ST2D2＝RVT2D1/D2 (VIII)、或
ST2D2/ST2D1＝RVT2D2/D1 (IX)；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述2个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的4个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
15.一种计算机可读存储介质，包含用于运行处理器的指令，上述处理器执行对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的方法，上述方法包括：
步骤(a)，接收在N个检测温度下检测出的信号；借助相应的信号产生机构扩增并检测样品内的各个上述靶核酸序列；由上述N个信号产生机构产生的感兴趣的信号对各个靶核酸序列不被单一类型的检测器分辨；N为2以上的整数；
步骤(b)，提供分别包括表示在各个检测温度下对靶核酸序列产生的感兴趣的信号的变数的下述N个方程式：
Figure FDA0002679932300000091
在上述式中，SD1至SDN分别为在各个检测温度下检测出的信号；ST1D1至STNDN分别为表示在各个检测温度下由各个信号产生机构产生的感兴趣的信号的变数；变数的总数为N2个；
步骤(c)，提供选自由下述方程式组成的组中的N2-N个附加方程式：
(X)：f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)，以及
(XI)：STjDK＝0
在上述式中，
Tj中的j表示从第1至第N的所有整数；
对于各个第j靶核酸，α及β一同表示选自1至N中的2个整数的组合；
上述组合的数由NC2表示；
对于各个第j靶核酸，K为选自1至N中的整数中的至少一个；
RVTj(DαDβ)为反映在第α检测温度及第β检测温度下借助第j信号产生机构提供的信号变化关系的第j靶核酸序列Tj的基准值RV；
f(STjDα，STjDβ)表示STjDα及STjDβ的函数；
当存在第j靶核酸序列时，也以使第j信号产生机构在第K检测温度下不产生信号的方式制备的情况下，能够选择方程式(XI)中的STjDK＝0；
其中f(STjDα，STjDβ)＝RVTj(DαDβ)包括：
STjDα/STjDβ＝RVTjDα/Dβ (XII)、或
STjDβ/STjDα＝RVTjDβ/Dα (XIII)；以及
步骤(d)，为了分辨分配在上述N个靶核酸序列中的至少一个的感兴趣的信号中的至少一个，借助在步骤(b)及步骤(c)中所提供的N2个方程式来得到对上述变数中的至少一个的解答。
16.一种用于对作为分别与样品内包含第一靶核酸序列T1及第二靶核酸序列T2的2个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的装置，其特征在于，包括：
(a)计算机处理器；以及
(b)权利要求14所述的计算机可读存储介质，与上述计算机处理器耦合。
17.一种用于对作为分别与样品内N个靶核酸序列有关的感兴趣的信号且不被单一类型的检测器分辨的信号进行分辨的装置，其特征在于，包括：
(a)计算机处理器；以及
(b)权利要求15所述的计算机可读存储介质，与上述计算机处理器耦合。
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