JP2004533801A - 単一および多重標的ｄｎａのためのインターカレーション色素を用いる実時間定量ｐｃｒ - Google Patents
単一および多重標的ｄｎａのためのインターカレーション色素を用いる実時間定量ｐｃｒ Download PDFInfo
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Abstract
ＰＣＲに基づくｄｓＤＮＡ定量法では、選択された時点でのそれぞれの増幅サイクルの間に、融解特性があらかじめ決定されている標的の蛍光を測定する。蛍光は、アニーリング相の直後（ＴＥ におけるＦＥ ）、標的／アンプリコンの融解の直下（ＴＭＳにおけるＦＭＳ）および上（ＴＭＥにおけるＦＭＥ）で測定される。基線傾斜（ＳＢ ＝−（ＦＭＳ−ＦＥ ）／（ＴＭＳ−ＴＥ ））から融解相傾斜（ＳＭ ＝−（ＦＭＥ−ＦＭＳ）／（ＴＭＥ−ＴＭＳ））への傾斜変化は、特異性増幅を示す。量（ＳＭ −ＳＢ ）がゼロより大きくなるために要する増幅サイクルの数（ＣＴ ）は、標的の開始濃度（Ｃ）と相関する。試料内の標的の濃度は、試料のＣＴ の値を標準曲線と比較して決定される。区別可能な融解曲線特性を有する標的を選択して、複数の標的を同時に検出できる。
Description
【０００１】
本出願は、２０００年３月７日付けの米国仮出願（ＵＳ）６０／１８７５３７号の利益を主張する。
発明の分野
本発明は分子生物学の分野そしてさらに特定するとＤＮＡに基づく診断プロトコールに関する。
発明の背景
多くの場合に、試料中の標的核酸のレベルを定量することが望ましい。例えば、食品または水試料中の病原性生物体の量、または作物中の遺伝子組換え生物体（ＧＭＯ）の量を決定することは重要であろう。
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、かかる検出のために感度が高くそして強力な方法である。ＰＣＲ技術の多数の特異性適用は、定性および定量検出の両方について当該技術分野では公知である。特に、増幅したＰＣＲ産物を検出および定量するために蛍光色素を用いることは公知である。均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ） ＰＣＲとしても知られるその場での増幅および検出もこれまでに記載されている。例えばヒグチら（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１１， １０２６−１０３０ページ（１９９３）） 、イシグロら（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｂｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｒ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２９， ２０−２１３ページ（１９９５）） 、およびヴィトヴァーら（Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｒａｐｉｄ ｃｙｃｌｅ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｖｏｌ．２２， １３０−１３８ページ（１９９７）） 参照。
【０００３】
これらの方法において、蛍光シグナルは、ＰＣＲ反応のアニーリング／伸長相の間にサイクルあたりに１回得られる。しかし、このようにして測定された蛍光は、特異的に増幅された標的ＰＣＲ産物（標的アンプリコン）、ならびに単一プライマー産物、プライマー−ダイマー、およびその他の異常なアンプリコンを含む非特異性アンプリコンの混合物の全蛍光を表す。これらのこれまで開示された方法は、特異性および非特異性アンプリコン間の区別ができず、そして標的コピー数が少ない場合には特に問題がある。
【０００４】
さらに、これらの方法は、それぞれのＰＣＲ反応内の単一標的ＤＮＡを検出するために使用できるだけであるが、しかし一つのＰＣＲ反応内の複数の標的核酸を同時に検出することがしばしば望まれる。
【０００５】
さらに、試料ＤＮＡが同時に増幅される場合に、同じ反応内での陽性対照を入手することが必要である。このような「内部陽性対照」は、ＰＣＲ反応のための陽性制御として、および試験試料により導入される不純物のために増幅効率が変動するＰＣＲ反応を校正するための両方の場合に役立つであろう。
【０００６】
低いコピー数の試料中の標的核酸濃度を信頼できるように決定し、標的アンプリコンと非特異性アンプリコンとを区別でき、そして複数の標的核酸を同時に検出および定量するために使用できる定量ＰＣＲ方法を得るという要求がある。本出願で開示する本発明は、これらおよびその他の要求を満足する。
発明の要旨
標的核酸分子の融解が温度ＴＭＳで開始しそして温度ＴＭＥで完了する、試料内の標的核酸分子の量を実時間で検出するための方法であって、
Ａ．ｉ）適当な蛍光色素の存在下で、既知の開始濃度（Ｃ）を有し、変性、アニーリング、および連鎖伸長サイクルを介して標的核酸分子をＰＣＲ増幅し、ここで、色素が二本鎖核酸分子と結合すると蛍光が増加し、ここで連鎖伸長は連鎖伸長温度ＴＥ で起き；
ｉｉ）蛍光（Ｆ）を、それぞれの増幅サイクルの間に、温度がＴＥ から上昇を開始する直前の温度において（ＴＥ におけるＦＥ ）、ＴＥ とＴＭＳとの間のなんらかの温度点（ＴＢ ）において（ＴＢ におけるＦＢ ）、ＴＭＳにおいて（ＴＭＳにおけるＦＭＳ）およびＴＭＥにおいて（ＴＭＥにおけるＦＭＥ）測定し；
ｉｉｉ）（ＴＢ −ＴＥ ）で割った−（ＦＢ −ＦＥ ）により定義される基線傾斜（ＳＢ ）、および（ＴＭＥ−ＴＭＳ）で割った−（ＦＭＥ−ＦＭＳ）により定義されるアンプリコン融解相傾斜（ＳＭ ）を算出し；
ｉｖ）量（ＳＭ −ＳＢ ）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ）を記録し；
ｖ）関係する濃度の適当な範囲内で段階ｉ）からｖ）までを反復し、そして
ｖｉ）標的核酸配列のための標準曲線を得るためにＣをＣＴ に対してプロットする；
ことにより標準曲線を確定し、そして
Ｂ．標的核酸分子の未知濃度を含む試料について段階（Ａ）（ｉ）から（Ａ）（ｖ）までを反復して試料についてのＣＴ 値を入手し、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定する
ことを含んでなる方法。
【０００７】
上記の本発明の方法は、試料内の複数の標的を検出するために使用してもよい。特に、試料がｎ種の標的核酸分子を含む場合、ここでｎは３より大きい整数であり、ここで、第一標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ１ で開始しそして温度ＴＭＥ１ で完了し、第二標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ２ で開始しそして温度ＴＭＥ２ で完了し、第（ｎ−１）標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ（ｎ−１） で開始しそして温度ＴＭＥ（ｎ−１） で完了し、第ｎ標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳｎ で開始しそして温度ＴＭＥｎ で完了し、そしてここでＴＭＳｎ はＴＭＥ（ｎ−１） より高い。多重検出のための本方法は、
Ａ．単一標的検出の方法に従って標的核酸分子のそれぞれのための標準曲線を確定し；
Ｂ．標的核酸分子の未知濃度を含む試料を同時ＰＣＲ増幅して、試料についてのＮ１ 、Ｎ２ ．．．およびＮｎ 値を入手し、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定することを含んでなる。
【０００８】
好ましい態様に従うと、第一および第二標的核酸分子は生物体の同じゲノム上に存在し、そして第一標的核酸分子のゲノムあたりのコピー数は既知であり、これにより、第二標的核酸分子のゲノムあたりのコピー数を決定する。
【０００９】
本発明の他の態様に従うと、第一標的核酸はインベルターゼ遺伝子またはレクチン遺伝子であり、そしてここで、第二標的核酸は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、Ｃｒｙ９Ｃ遺伝子、ＧＡ２１遺伝子よりなる群より選ばれる。
【００１０】
特に好ましい態様に従うと、核酸分子は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９および配列番号１０よりなる群より選ばれる。
【００１１】
最も好ましい態様に従うと、標的核酸分子は、遺伝子組換え生物体内に含まれる導入遺伝子の部分である核酸断片である。
【００１２】
［発明の詳細な説明］
本発明のＰＣＲに基づく方法は、選定された時点でそれぞれの増幅サイクルの間に増幅した標的（「標的アンプリコン」）の蛍光を測定して二本鎖核酸分子（「ｄｓＤＮＡ」または「標的」）を検出および定量する。
【００１３】
専門家には周知のように、ｄｓＤＮＡの２本の鎖は、温度がその融解温度より高い場合には分離すなわち融解する。ｄｓＤＮＡ分子の融解は一つのプロセスであり、そしてある与えられた溶液条件下では、融解はある温度（本明細書中で以後ＴＭＳと呼ぶ）で開始し、そして別の温度（本明細書中で以後ＴＭＥと呼ぶ）で完了する。慣用の用語Ｔｍ は、融解が５０％完了する温度を示す。本発明の方法のために、標的アンプリコンの融解曲線特性があらかじめ決定される。
【００１４】
典型的なＰＣＲサイクルは、標的ｄｓＤＮＡが融解する変性相、プライマーが生成した一本鎖に結合するために温度が最適であるプライマーアニーリング相、およびＤＮＡポリメラーゼが機能するために温度が最適である連鎖延伸相（ＴＥ ）を含む。本発明に従うと、ＴＭＳはＴＥ より高くなければならず、そしてＴＭＥは、ＤＮＡポリメラーゼが熱で不活性化される温度より低く（しばしば本質的に低く）なければならない。当然ながら、融解曲線特性は、与えられたｄｓＤＮＡ分子の固有の特性である。望ましい融解曲線は、標的アンプリコンの長さおよび／またはＧＣ含有量を選定して通常は達成される。融解曲線特性は、これらを増幅するためにに使用されるＰＣＲプライマーを交換して変更してもよい。例えば、プライマーの５’末端にＧＣ−リッチオーバーハングを付加すると、増幅した標的のＴｍ が上昇する。
【００１５】
二本鎖核酸分子は、これらがある種の色素を結合すると紫外線下で蛍光を示し、そして蛍光の強度はｄｓＤＮＡの濃度に比例するであろう。ｄｓＤＮＡを検出および定量するためにかかる関係を利用する方法は、当該技術分野では公知である。多数の色素が公知でありそしてこれらの目的に当該技術分野で使用される。本方法もかかる関係を利用する。かかる色素の例には、インターカレーション色素が含まれる。かかる色素の例には、これらに限定はされないが、ＳＹＢＲ−グリーン−Ｉ（Ｒ） 、エチジウムブロミド、プロピジウムヨージド、ＴＯＴＯ（Ｒ） −１｛キノリニウム、１−１’−〔１，３−プロパンジイルビス〔（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル〕〕ビス〔４−〔（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル〕〕−、テトラヨージド｝、およびＹｏＰｒｏ（Ｒ） ｛キノリニウム、４−〔（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリリデン）メチル〕−１−〔３−（トリメチルアンモニオ）プロピル〕−、テトラヨージド｝が含まれる。本発明にもっとも好ましい色素は、非不斉シアニド色素、例えばＭｏｌｅｄｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）により製造されるＳＹＢＲ−グリーン−Ｉ（Ｒ） である。ＳＹＢＲ−グリーン（Ｒ） ／ＤＮＡ複合体、およびＳＹＢＲ−グリーン（Ｒ） 単独は、固有の温度依存性蛍光を有する。温度が上昇すると、ＳＹＢＲ−グリーン（Ｒ） ／ＤＮＡ複合体の蛍光は、ｄｓＤＮＡ鎖が分離しなくても自然に低下する。変化の割合は、ＤＮＡの濃度に比例して増加する。ｄｓＤＮＡ鎖分離による変化からこの温度依存性変化を区別するために、反応内のそれぞれのアンプリコンを取りまく測定の前およびその間に閾値を事前に確定する必要がある。
【００１６】
本発明によると、それぞれのＰＣＲサイクルについて、ＰＣＲ反応混合物の蛍光（Ｆ）は、温度がＴＥ から上昇を開始する直前の温度において（ＴＥ におけるＦＥ ）、ＴＥ とＴＭＳとの間のなんらかの温度点（ＴＢ ）において（ＴＢ におけるＦＢ ）、溶融の開始温度の直下において（ＴＭＳにおけるＦＭＳ）および溶融の完了の直上において（ＴＭＥにおけるＦＭＥ）測定される。
【００１７】
ＰＣＲ反応中および種々の蛍光値の測定中に使用される装置に応じて、種々の蛍光測定を行う場合の期間内に温度を一定に保持する必要があるであろう。例えば、パーキンエルマー７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ） を用いる場合には、０．５〜６０秒間の間のいずれかの期間が適当である。好ましくは１〜４５秒間、さらに好ましくは１〜３０秒間、そしてそれよりさらに好ましくは１〜１５秒間の期間が適当である。蛍光測定のために最も好ましい期間は７秒間である。
【００１８】
これらの値より基線傾斜（ＳＢ ）が算出される。ＳＢ は、（ＴＢ −ＴＥ ）で割った−（マイナス）（ＦＢ −ＦＥ ）により定義され、そして（ＴＭＥ−ＴＭＳ）で割った−（ＦＭＥ−ＦＭＳ）により定義される融解相傾斜（ＳＭ ）も算出される。
【００１９】
ＰＣＲ増幅が進行すると、標的アンプリコンの濃度が増加しそしてＦＭＳの値も増加する。量（ＳＭ −ＳＢ ）がゼロより大きい場合に、傾斜の正の変化が最初に出現する増幅サイクルの数（「閾サイクル数ＣＴ 」）は、標的アンプリコンの開始濃度（Ｃ）と相関する。
【００２０】
標的アンプリコンの標準曲線は、濃度が既知の標的アンプリコンの溶液の一連の希釈を用いて開始して確定される。同一のＰＣＲ条件下で連続希釈におけるそれぞれの濃度で上記の方法を反復して、ＣＴ が既知濃度のそれぞれについて決定される。与えられたＰＣＲ条件下での標的アンプリコンの標準曲線は、このようにしてＣＴ をＣに対してプロットして確定される。好ましくは、標準曲線は、標的アンプリコンの１〜１０９ コピーの間、好ましくは１０〜１０８ 、さらに好ましくは１０〜１０７ 、特に好ましくは１０〜１０６ コピーの範囲の濃度の適当な範囲をプロットする。
【００２１】
標的アンプリコンを含むと推測される試料内の標的アンプリコンの濃度を決定するために、ＰＣＲによる増幅のために適するような適当な方法で試料を調製する。次いで対応する標準曲線が確定されると同一の条件下で試料をＰＣＲ増幅させる。試料のためのＣＴ の値は上記のようにして決定されそして対応する濃度を確定するために標準曲線と比較する。
【００２２】
本発明に従う方法は、複数の標的アンプリコンを同時に検出するためにも使用できる（「多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ） 検出」）。図１１を参照すると、試料が１個を越える標的アンプリコンを含む場合に、それぞれのアンプリコンのそれぞれのＳＢ およびＳＭ 、ＴＥ におけるＦＥ およびＴＢ におけるＦＢ を決定しなければならない。従って、多重検出のために、標的アンプリコンは、区別が可能な融解曲線特性、例えばそれぞれのアンプリコンに対するＴＥ におけるＦＥ およびＴＢ におけるＦＢ が決定可能でなければならない。
【００２３】
試料が２個の標的アンプリコン（第一標的核酸分子および第二標的核酸分子と呼ぶ）を含む場合に、第一標的核酸分子の融解は、温度ＴＭＳ１ で開始しそしてＴＭＥ１ で完了すし、第二標的核酸分子の融解は、温度ＴＭＳ２ で開始しそしてＴＭＥ２ で完了する。本発明に従うと、ＴＭＳ２ はＴＭＥ１ より高い。通常の条件下で、ＴＭＥ１ は５５℃より低くはなく、一方ＴＭＳ２ は９５℃より高くはなく、そして多重増幅および定量のためには３〜５℃の温度差で通常は十分であることが認められる。多重ＰＣＲ反応において標的アンプリコンの開始濃度を定量するために、アンプリコン（内部標準対照、その他の標的アンプリコン、および非特異性産物、例えばプライマーダイマーを含む）は、反応内の他の可能な産物と重複しない融解温度を有するように設計または選定しなければならない。これは、産物が異なる温度で融解することを確実にし、そして種々の蛍光値が独立して区別されそして分析できることを確実にする。全蛍光は加法的でありそしてｄｓＤＮＡ産物の濃度への相関を保つ。すなわち、産物が分解または融解した後、これは全蛍光にもはや寄与しない。
【００２４】
しかし、鎖延伸温度（ＴＥ ）は、両方のアンプリコンで一致する。標的核酸分子それぞれの標準曲線は、上記のように適当な蛍光色素、既知の開始濃度（Ｃ１ およびＣ２ ）を有する標的核酸分子の存在中での同時ＰＣＲ増幅により確定される。具体的には、蛍光（Ｆ）を、それぞれの増幅サイクルの間に、温度がＴＥ から上昇を開始する直前の温度において（ＴＥ におけるＦＥ ）、ＴＥ とＴＭＳ１ との間のなんらかの温度点（ＴＢ１）において（ＴＢ１におけるＦＢ１）、ＴＭＳ１ において（ＴＭＳ１ におけるＦＭＳ１ ）およびＴＭＥ１ において（ＴＭＥ１ におけるＦＭＥ１ ）ＴＭＥ１ とＴＭＳ２ との間のなんらかの時点（ＴＢ２）において（ＴＢ２におけるＦＢ２）、ＴＭＳ２ において（ＴＭＳ２ におけるＦＭＳ２ ）、ＴＭＥ２ において（ＴＭＥ２ におけるＦＭＥ２ ）測定し；基線傾斜（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｌｏｐｅ）は、第一標的分子について、（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った−（ＦＢ１−ＦＥ ）により定義される（ＳＢ１）として算出され、そして第一アンプリコン融解相傾斜は、第一標的分子について（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った−（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）により定義される（ＳＭ１）として定義され；そして第二標的分子についての基線傾斜（ＳＢ２＝−（ＦＢ２−ＦＭＥ１ ）／（ＴＢ２−ＴＭＥ１ ））、および第一分子についての融解相傾斜（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｈａｓｅ ｓｌｏｐｅ）（ＳＭ２＝−（ＦＭＥ２ −ＦＭＳ２ ）／（ＴＭＥ２ −ＴＭＳ２ ））を同様に決定する。量（ＳＭ１−ＳＢ１）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ１ ）および量（ＳＭ２−ＳＢ２）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ２ ）を記録する。これらの段階を、２種の標的分子それぞれについての関係する濃度の適当な範囲内で反復し、そして、第一標的分子のための標準曲線を得るためにＣ１ をＮ１ に対してプロットし、そして第二標的分子のための標準曲線を得るためにＣ２ をＮ２ に対してプロットする。
【００２５】
次いで第一および第二標的核酸分子の未知濃度を含むと推測される試料に関して上記の段階を反復して、試料に関するＮ１ 値およびＮ２ 値を入手し、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定する。
【００２６】
蛍光強度は、本質的にサイクル毎に変動する。これは背景ノイズを構成する。かかるノイズを除去または少なくとも最小化するために、そして装置間の整合性を得るためにも閾値を任意に設定する。かかる閾値より低いあらゆる蛍光レベルは無視しそして有意または特異性増幅が起きていないと考えられる場合に測定を行う。閾値レベルより上の蛍光レベルのみを測定しそして検出および定量の目的に使用する。
【００２７】
典型的には、ＰＣＲの初期のサイクルの間には検出可能な産物はない。従って、最初の数サイクルは閾値を決定するために使用できる。本発明によると、初期蛍光値ＦＩ は、最初の数回のＰＣＲサイクルの平均蛍光値として定義される（図１６）。最も好ましい態様に従うと、初期サイクル＃４〜１２を用いる。閾蛍光ＦＢ は、閾背景シグナルとしてのＰＣＲの指数相の前のサイクルＮ−１０〜Ｎ−５の平均蛍光シグナルである。アンプリコンの検出可能レベルは、デルタ傾斜（ＳＭ −ＳＢ ）蛍光が基線上６７％であった場合のサイクルＮであると事前決定される。産物の指数増殖相では、Ｌｎ〔（Ｆｎ −ＦＢ ）／ＦＢ 〕の値がサイクル数の線型関数である。線型回帰の傾斜およびＲ２ は、１．０６ＦＢ 〜１．６７ＦＢ の範囲内のＦ値として決定される。回帰線と１．６７ＦＢ の閾蛍光（Ｌｎ＝−０．４）の交点が、増幅事象のサイクル閾値ＣＴ である。次いでＤＮＡ濃度の対数をＣＴ に対してプロットすると標準曲線が作製される。実施例１、２および６はこの態様を説明する。
【００２８】
本発明の別の態様によると、閾は初期１０サイクル（＃４〜１３）の蛍光の平均変化（ＳＭ −ＳＢ のデルタ傾斜）とこれらの値の標準偏差の１０倍との和でもあるであろう。初期蛍光ＦＩ は、初期サイクル＃４〜１３の平均蛍光として定義された。サイクルの数（Ｃｔ）は、試料の閾サイクル（Ｃｔ）である閾を越えた最初の出現とする。実施例３、４および５は、この方法を説明する。
【００２９】
他の好ましい態様では、本発明の多重検出方法は、別の標的核酸（標的Ｂ）を基準点として使用する標的核酸（標的Ａ）のゲノムあたりのコピー数を決定するために使用され、ここで標的Ｂのコピー数／ゲノムは既知である。標的Ａおよび標的Ｂは同一のゲノム内に存在し、そして標的Ｂのコピー数／ゲノムが既知なので、標的Ａおよび標的Ｂを本発明の多重検出法を用いて同時増幅おおび定量すると、標的Ａコピー数／ゲノムは、標的Ａの量と標的Ｂの量との間の比率から容易に算出でき、ゲノムの大きさの知識または決定の必要および開始試料に使用されたゲノムＤＮＡの量を定量する必要はない。この態様の例を実施例２に記載する。
【００３０】
本検出法は、あらゆる標的ｄｓＤＮＡを検出および定量するために使用ができ、これから標的生物体の存在およびレベルが決定できる。標的生物体の例には、真菌、細菌、感染性動物、ウイルスなどを含む病原性生物体が含まれる。特に、本方法は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｐｐ．， Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ） 、クリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コーリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ） 、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびＳＶ−４０ウイルスＤＮＡの検出に適用された。本方法は、その他の臨床および非臨床使用にも使用できる。例えば、本方法は食品または飼料内の遺伝子組換え生物体の存在を決定するために使用できる。例えば３５Ｓ ＣａＭＶプロモーター（ラウンドアップレディ（Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙ） （Ｒ） ダイズ中で発見された配列）、およびＣｒｙ９Ｃ遺伝子（スターリンク（ＳｔａｒＬｉｎｋ）トウモロコシ中で発見、Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６７：８７２−８７９）のような配列は、本発明を用いて検出および定量された。その他の通常の導入遺伝子には、これらに限定はされないが、グリリン酸（ｇｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）耐性遺伝子としてのＥＰＳＰＳ（５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸合成酵素）（５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｐｌａｎｔ Ｊ ２５：２６１−２７０）、ホスホエノールピリビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）プロモーター（ＢＴ１７６トウモロコシ中） 、Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）遺伝子のｈｓｐ７０プロモーター（Ｍｏｎ８０１００トウモロコシ中で発見）、Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）遺伝子（Ｍｏｎ８０９トウモロコシ）、ＮＯＳ遺伝子（Ｍｏｎ８１０トウモロコシ）、およびアクチンプロモーター遺伝子（ＧＡ２１トウモロコシ）が含まれる。内部陽性および／またはコピー数対照として、レクチン遺伝子、インベルターゼ遺伝子、およびアルドラーゼ遺伝子を適する場合にはすべて使用してもよい。
【００３１】
本方法は非常に特異性および高感度である。標的ｄｓＤＮＡの１０コピーでも検出される。
【００３２】
好ましい態様では、病原性生物体のＰＣＲタブレットは内部陽性対照を含む。ＰＣＲ反応内に含まれる内部陽性対照の利点は、以前に記載され（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／１１１９７号、１９９７年３月２７日付け公開、その内容は、引用することによって本明細書中に編入される）そして（ｉ）単一プライマーを用いて対照を増幅してもよく、（ｉｉ）対照増幅産物の量は、試料内に含まれるあらゆる標的ＤＮＡとは無関係であり、（ｉｉｉ）対照ＤＮＡは、手作業または自動化試験手順の両方において使用の容易さおよび高度の再現性のために他の増幅試薬を用いてタブレット化でき、（ｉｖ）対照は均質検出、すなわち反応物から産生ＤＮＡが分離しないで使用でき、そして（ｖ）内部対照は、反応中の他の産生される可能性がある酸性アンプリコンとは区別される融解プロフィールを有することを含む。対照ＤＮＡはプライマー指令増幅反応中の増幅を許容する適当な大きさおよび塩基組成である。対照ＤＮＡ配列は、標的細菌から、または他の起源から得てもよいが、しかし標的アンプリコンＤＮＡの増幅を許容すると同じ条件下で再現性をもって増幅されなければならない。好ましい態様では、対照ＤＮＡは検出されるべき標的ＤＮＡと類似した大きさおよび塩基配列を有する。例えば、対照核酸断片はサルモネラ属から単離され、そして検出されるべき標的と一致したが、これは単一プライマーを用いる増幅を可能とするように操作された場合を除く（ＷＯ９７／１１１９７号）。対照ＤＮＡは、増幅反応を確認するために有用である。対照ＤＮＡの増幅は、標的ＤＮＡを含む試験試料と同時に達成される。本発明の範囲内で、試料は、対照ＤＮＡを含む対照ならびに試料と平行して試験ＰＣＲ手順にかけられる。対照が増幅を示す場合には、平行試験で達成される陽性または陰性の結果にかかわらず、手順が有効であることの有利な徴候がある。増幅反応の有意な実現を達成するために、対照ＤＮＡのコピーの適当な数がそれぞれの増幅反応内に含まれていなければならない。食品を含む試料マトリックス成分はＰＣＲの抑制を起こすことができ、従って産物形成およびシグナルの低下をもたらすことは周知である。あるいは、ＰＣＲ反応内のある種の食品成分の存在は、蛍光色素検出を用いた場合に反対の結果、すなわちシグナルの増強をもたらすことも見いだされた。本明細書中に記載のような対照の使用は、このような偽りの陽性結果を排除する。さらに、対照内の応答のレベルを校正して、例えば多数の食品由来マトリックス中に見られる外因性物質により起きる試験における反応のあらゆる抑制または促進を評価および補償することが可能である。
【００３３】
ＰＣＲと関連して使用される他に、本方法は他の核酸増幅法、例えばストランド置換、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）および増幅に基づく核酸配列（ＮＡＳＢＡ）と共に使用してもよい（例えばＦｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ， １９９７， Ｍ．Ｅ．Ｄｏｙｌｅ， Ｌ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａ， ａｎｄ Ｔ．Ｊ． Ｍｏｎｄｖｉｌｌｅ， ＡＳＭ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， ７２３−７２４ ページ参照）。
【００３４】
好ましい態様に従うと、蛍光検出の能力を有する自動化熱サイクラー、例えばパーンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手できるパーキンエルマー７７００配列検出システムが使用される。蛍光データは、データ処理装置、例えばパーソナルコンピューターを用いて出力および処理され、必要なら種々の変換を行う。かかる自動化操作の方法および装置は熟練者には自明でありそして下記の実施例中で例示する。
実施例１
単一標的Ｑ−ＰＣＲアッセイ−３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーターを標的とすることによる遺伝子組換えＤＮＡの検出
遺伝子組換え（ＧＭ）作物の検出は、食品生産および消費者の関心、および付随する法的問題のためにますます重要となっている。我々は、迅速なＤＮＡ抽出法を開発しそしてこれをダイズ、メイズ穀粒、および種々の加工した試料における遺伝子組換え物質の同定および／または定量するための蛍光検出を使用する均質ＰＣＲベースアッセイと組み合わせた。ＧＭ ＤＮＡの存在は、３５Ｓウイルスプロモーターを指向する一対のプライマーを用いて決定した。プライマーのこの対はフランクら（Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．） により設計された。
【００３５】
これらのプライマーはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター配列の２０６ｂｐ断片を増幅し、これはほとんどすべての遺伝子組換え生物体内に存在し、従ってＧＭ産物に関して試料をスクリーニングするために使用される。殺虫剤として広く使用されているラウンドアップ（Ｒｏｕｎｄｕｐ） に対して耐性となるように遺伝子組換えされたダイズは、「ラウンドアップレディー」と呼ばれ、定義によりＧＭ物質を含むことを意味する。
【００３６】
以下に記載する閉管（ｃｌｏｓｅｄ ｔｕｂｅ） 均質ＰＣＲ法は、市販の検出系およびＤＮＡインターカレーション色素、ＳＹＢＲグリーン−Ｉを用いる。それぞれの熱サイクルの間に、伸長と変性段階の間の中間温度において蛍光データを採取した。特異性ＰＣＲ産物が生成すると、色素は産物中にインターカレーションしそして全蛍光シグナルは増加する。インターカレーション色素の蛍光値は、温度に逆比例する。我々は特異性アンプリコンの蛍光値の傾斜の変化をインターカレーション色素の基線傾斜と比較する。次いで、我々はアンプリコン傾斜が基線傾斜より大きい場合に、傾斜の正変化の最初の出現が起きた熱サイクルを記録する。
【００３７】
遺伝子組換え３５ＳプロモーターＤＮＡの既知レベルを有する標準（ＰＣＲあたりにゲノムの３５〜４３７５コピーの範囲）を増幅しそして蛍光シグナルをそれぞれのサイクルの後に記録した。閾曲線（ＣＴ ）の遺伝子組換え物質の割合の対数に対するプロットの線型回帰フィットに基づいて曲線を作製した。未知試料ＣＴ 値を標準曲線に対してプロットし、そして遺伝子組換え百分率を決定する。同様の技術を用いて、全ダイズＤＮＡの量が、ダイズＤＮＡのレクチンコーディング領域への増幅反応を標的することにより定量された。変性挿入物の量のダイズＤＮＡの全量に対する比が、遺伝子組換え物質の正確な百分率の算出を可能とする。
材料および方法
標準ＧＭＯキャリブレーターＤＮＡの伸長
材料（ＤＮＡ抽出）
・キアゲンＴＭ植物ＤＮイージーミニカラムキット（Ｑｉａｇｅｎ ＴＭ Ｐｌａｎｔ ＤＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｃｏｌｕｍｎ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）
・１００％エタノール
・ＤＮＡ溶出緩衝液Ａ：３０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３５・ＧＭ−ラウンドアップレディーＴＭ保証基準物質ＩＲＭＭ４１０（乾燥ダイズ粉末）（ＧＭ−ＲＲＴＭ）（Ｆｕｌｋａ， Ｒｅｔｉｅｓｅｗｅｇ， ベルギー）
・プロテイン テクノリジーズ インターナショナル（Ｐｒｅｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｕｉｎａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）からの未知試料
−Ｇ９Ｋ−ＢＱＡＰ９１（小麦粉）
−Ｇ９Ｋ−ＢＰＷ１４５（単離されたダイズタンパク質、レシチン）
−Ｅ９Ｊ−ＢＥ０１２２（単離されたダイズタンパク質）
方法
製造者の推奨を採用して、２％ＲＲＴＭダイズＧＭ−標準ＤＮＡ（未希釈、レベル１ＤＮＡキャリブレーターとして）の一つの大きいプールを抽出
・試料あたりに２％ＧＭ−ＲＲＴＭダイズタンパク質粉末の３０（±３）ｍｇ（または未知ＧＭＯ試料３０ｍｇ）を秤取し、そして１０個のミクロ遠心分離管に移す。それぞれの管に緩衝液ＡＰ１（キットと一緒に供給される）４００μｌおよびＲＮアーゼ原溶液４μｌを上記の試料に加えそして強く渦攪拌する。混合物を１０分間、６５℃、水浴中でインキュベーションする。インキュベーションの間に２−３回、管を倒立して混合させる。
・緩衝液ＡＰ２（供給）１３０μｌを混合物のそれぞれの管に添加し、混合し、そして５分間氷上でインキュベーションする。混合物を５分間、卓上型遠心分離機中、６０００ｘｇで遠心分離して凝集したタンパク質残留物をペレット化する。
・透明溶液の上層をタンパク質残留物ペレットを乱さないようにして新しい管の組に移す（試料あたりに上清約４００μｌ）。その目的は最も多くの上清体積を得ることである。一部の試料はペレット化が良くない。その場合には再び遠心分離する。
・緩衝液ＡＰ３（供給）２００μｌを上清のそれぞれの管に加える。１００％エタノール４００μｌを加えそしてピペット上下することによりおよびバイアルを渦攪拌することにより繰り返して混合させる。
・ＤＮイージーミニカラム（供給）を２ｍｌ捕集管内に入れる。混合物６５０μｌ管それぞれを適用する。１分間、６０００ｘｇ以上で遠心分離しそして流出物を廃棄する。残った試料について反復する。流出物および捕集管を廃棄する。
・ＤＮイージーカラムを新しい２ｍｌ捕集管内に入れ、緩衝液Ａｗ（供給）５００μｌをそれぞれのカラム内に加え、そして１分間、６０００ｘｇ以上で遠心分離する。流出物を廃棄し、そして捕集管を次の段階で再使用する。
・緩衝液ＡＷ５００μｌをそれぞれのカラムに加えそして２分間、最高層度で遠心分離してＤＮイージー膜を乾燥する。
・ＤＮイージーカラムを１．５ｍｌミクロ遠心分離管内に入れそして予熱（６０℃）した３０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３５溶出緩衝液２００μｌををそれぞれのカラム内に直接ピペットから入れる。５分間、室温でインキュベーションし次いで２分間、６０００ｘｇ以上で遠心分離してＤＮＡを溶出させる。
・溶出した参照標準ＤＮＡ試料の１０個すべてを一緒にプールする。ゲル濾過ＨＰＬＣを用いて精製されたダイズＤＮＡ濃度を定量する。
ＤＮＡ濃度を定量するためのＨＰＬＣ法
ゲル濾過ＨＰＬＣは、水性緩衝液（０．１Ｍリン酸塩／０．３Ｍ ＮａＣｌ、Ｐｈ７．０）を毎分１ｍｌの流量の移動層として行った。アッセイあたりに１０００塩基対の純粋ＤＮＡ（５〜５００ｎｇ）の既知量を注入してＤＮＡ断片濃度を定量し、次いでＤＮＡの量（ｎｇ）をＨＰＬＣピーク面積（ｍＡＵ）に対してプロットして校正曲線を作製する。この校正曲線を未知試料ＤＮＡ濃度を決定するために使用する。
・レベル１キャリブレーターとして全ＤＮＡ濃度を６ｎｇ／ｕｌに調整する。次いで、ＤＮＡ溶出緩衝液を用いて２％ＲＲＴＭＤＮＡ（Ｌ１）を連続希釈して、０．４％（１／５希釈、Ｌ２）、０．０８％（１／２５希釈、Ｌ３）、および０．０１６％ＧＭＯ（１／１２５希釈、Ｌ４）とする。
・それぞれＣａＭＶ（２、０．４、０．０８および０．０１６％）およびレクチン（１００、２０、４、および０．８％）の両方のＧＭＯ ＤＮＡ標準の同様の組を用いる。
・ダイズＤＮＡの平均的大きさが約１．１５Ｅ＋９塩基対であるというアルムガナサンら（Ａｒｕｍｕｇａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．）による記載の文献に基づく。ゲノムダイズＤＮＡの分子量は約７．４７５Ｅ１１ドルトンである。我々はＣａＭＶおよびレクチンのＰＣＲあたりのレベル１〜４のＤＮＡコピー数、ＣａＭＶについては４３７５、８７５、１７５、および３５、そしてレクチンダイズＤＮＡについては２１２，５００、４２，５００、８５００、および１７００とそれぞれ算出した。
ＰＣＲ試薬およびプロセス
物質（ＰＣＲ試薬）
リボプリンター（Ｒ） システム（ＲｉｂｏＰｒｉｎｔｅｒ（Ｒ） Ｓｙｓｔｅｍ） 脱イオン水（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）
２５ｍＭ ｍｇＣｌ２ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）
１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液＝１００ｍＭトリス／５００ｍＭ ＫＣｌ／０．０１％ゼラチン、ｐＨ８．３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
プライマー（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）
−ＣａＭＶプライマーＰ−９３：２５−マー ５’（ＣＧＡ ＡＧＧ ＡＴＡ ＧＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＴＧＣ ＧＴＣ Ａ）３’．ＣＡＭＶ１−２５−９３
−ＣａＭＶプライマーｒｃ−２９０：２５−マー５（ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＴＣ Ａ）３’．ＣａＭＶ１−２５−ｒｃ２９０
ＳＹＢＲグリーンＩインターカレーション色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）
ウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）
試薬タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）
１．２μＭ ＳＹＢＲグリーンＩ、４ｍｇ／タブレットＢＳＡ、４種すべてのｄ−ＮＴＰ、１．５単位ＴａｑＴＭポリメラーゼ
ハードウエア
ＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ， ＣＡ）
方法
ＰＣＲ緩衝液の２Ｘと１ｍＭ Ｍｇ＋２およびＣａＭＶプライマーの２Ｘを一緒にしてプレミックスして、２Ｘ作業濃度を得る（２０ｍＭトリス／１００ｍＭＫＣｌ／４ｍＭ ＭｇＣｌ２ ／３００ｎＭ ＣａＭＶプライマー）。この混合物２５μｌに、抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌを加える。
最終ＰＣＲ緩衝液濃度：
２５ｍＭトリス／５０ｍＭ ＫＣｌ／０．００１％ゼラチン／０．０５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
２ｍＭ Ｍｇ＋２（ＰＥ緩衝液からの寄与を含む全量）
それぞれのＣａＭＶプライマー１５０ｎＭ
定量ＰＣＲアッセイ
ＤＮＡ標準のそれぞれ５レベルの２５μｌ（３組）および未知試料抽出物をピペットで採取し、試薬タブレット１個を含むＰＣＲウエル（３組）内に入れた。抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌに、ＣａＭＶ／緩衝液混合物２５μｌを加える。
【００３８】
試料管を冷却ブロック（Ｑｕａｌｉｃｏｎ Ｉｎｃ）内に移しそして試料、試薬、およびタブレットを混合するためにＰＣＲ管を渦攪拌する。ＰＣＲ管の架台をＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）内に配置する。
ＰＣＲパラメーター構成
ＣａＭＶ ＤＮＡ配列のコピー数を定量するために（ＴＥ ）７２℃、（ＴＢ ）８２．５℃、（ＴＭＳ１ ）８３．５℃、（ＴＭＥ１ ）８７．６℃でステージＩＩから蛍光シグナルを採取した。
データ処理および分析
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する：伸長相の終わりの温度（ＴＥ ：７２℃におけるＦＥ ）、アンプリコン融解開始の前（ＴＢ１８２．５℃におけるＦＢ１）、増幅された３５Ｓ ＣａＭＶＰＣＲ産物の融解温度の開始（ＴＭＳ１ ８３．５℃におけるＦＭＳ１ ）および増幅されたＣａＭＶアンプリコンの融解温度の終において（ＴＭＥ１ ：８７．６℃におけるＦＭＥ１ ）。
【００３９】
（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った（ＦＢ１−ＦＥ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ１）から、（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）の負の値により定義されるアンプリコン３５Ｓ ＣａＭＶ融解相傾斜（ＳＭ１）への傾斜の変化を決定する。図１参照。（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。上記の段階を４０回反復して、標的開始濃度としてのＣａＭＶの３５から４３７５までのゲノムコピーの濃度範囲を決定して、標準曲線を作製する。上記の同じＤＮＡ抽出およびＰＣＲ操作を行って未知試料中のＧＭＯの開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始ＧＭＯ濃度を決定する。
結果
図１：ＣａＭＶアンプリコンの融解プロフィール、図２：ＣａＭＶに関する実時間定量ＰＣＲ、および図３：ＣａＭＶ標準校正曲線を参照。
【００４０】
試料＃ＣＯＣ−ＢＸＪ５３９（ＦＵＪＩタンパク質５４５）は、最初にサイクル３３．６５で現れ、そのＣａＭＶアンプリコン融解傾斜は基線傾斜より大きい。ＣａＭＶの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中に３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターＤＮＡの１８コピー（ｃｏｙ） を含む。
【００４１】
＃Ｍ３５−４９０（単離されたダイズタンパク質）はサイクル３０．７２で最初に現れ、そのＣａＭＶアンプリコン融解傾斜は基線傾斜および大きい。ＣａＭＶの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中に３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターＤＮＡの１２５コピーを含む。
【００４２】
＃ＮＡＨＸ−６１５０９（ダイズフレーク）はサイクル３３．３５で最初に現れ、そのＣａＭＶアンプリコン融解傾斜は基線傾斜および大きい。ＣａＭＶの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中に３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターＤＮＡの２１コピーを含む。
文献
Ｆｒａｎｃｋ Ａ， Ｇｕｉｌｌｅｙ， Ｈ．， Ｊｏｎａｒｄ， Ｇ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｋ．， ａｎｄ Ｈｉｒｔｈ， Ｌ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ， Ｃｅｌｌ ２１（１）：２８５−２９４（１９８０）。
【００４３】
Ａｒｕｍｕｇａｎａｔｈａｎ， Ｋ． ａｎｄ Ｅａｒｌｅ， ｅ．Ｄ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ９（３）：２１１−２１５． Ｔａｂｌｅｔ Ｉ 。
実施例２
単一標的Ｑ−ＰＣＲアッセイ−内因性植物遺伝子の検出およびゲノムコピー数基準としてのこれらの使用
我々は迅速なＤＮＡ抽出法を開発しそしてこれをダイズ、メイズ穀粒、および種々の加工試料内の遺伝子組換え物質を同定および／または定量するための蛍光検出を使用する均質ＰＣＲベースアッセイと組み合わせた。遺伝子組換え物質の百分率は、３５Ｓ ＣａＭＶ ＤＮＡの存在に依存するだけでなく、全ダイズＤＮＡの何個のコピーがそれぞれの試料内に抽出されたかの決定を必要とする。大部分の緑色植物で天然の標識物質であるレクチンを対照因子として選んだ。プライマーの対は、レクチン遺伝子の１８６ｂｐ断片を増幅するように、ボドキンら（Ｖｏｄｋｉｎ ｅｔ ａｌ．） により設計された。
材料および方法
ＧＭＯ標準キャリブレーターＤＮＡの抽出
実施例Ｉ記載と同様の手順。
ＰＣＲ試薬およびプロセス
材料（ＰＣＲ試薬）
リボプリンター（Ｒ） システム脱イオン水（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）
１０ＸＰＣＲ緩衝液＝１００ｍＭトリス／５００ｍＭ ＫＣｌ／０．０１％ゼラチン、ｐＨ８．３（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）
プライマー（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）
レクチンプライマーＰ−１４２３：５’（ＣＡＡ ＣＧＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ）３’
レクチン−２７−１４２３
レクチンプライマーｒｃ１５５５：５’（ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＡＡ）３’
レクチン−２７−ｒｃ１５５５
ＳＹＢＲグリーンＩインターカレーション色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）
ウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）
試薬タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）
１．２μＭ ＳＹＢＲグリーンＩ、４ｍｇ／タブレットＢＳＡ、４種すべてのｄ−ＮＴＰ、１．５単位ＴａｑＴＭポリメラーゼ
ハードウエア
ＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ， ＣＡ）
方法
ＰＣＲ緩衝液の２Ｘと１ｍＭ Ｍｇ＋２およびレクチンプライマーの２Ｘを一緒にしてプレミックスして、２Ｘ作業濃度を得る（２０ｍＭトリス／１００ｍＭＫＣｌ／４ｍＭ ＭｇＣｌ２ ／４００ｎＭ レクチンプライマー）。この混合物２５μｌに、抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌを加える。
最終ＰＣＲ緩衝液濃度：
２５ｍＭトリス／５０ｍＭ ＫＣｌ／０．００１％ゼラチン／０．０５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
２ｍＭ Ｍｇ＋２（ＰＥ緩衝液からの寄与を含む全量）
それぞれのレクチンプライマー２００ｎＭ
定量ＰＣＲアッセイ
ＤＮＡ標準のそれぞれ４レベル（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４）の２５μｌ（３組）および未知試料抽出物をピペットで採取し試薬タブレット１個を含むＰＣＲウエル（３組）内に入れた。抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌに、２Ｘレクチン／緩衝液混合物２５μｌを加える。
【００４４】
試料管を冷却ブロック（Ｑｕａｌｉｃｏｎ Ｉｎｃ）内に移しそして試料、試薬、およびタブレットを混合するためにＰＣＲ管を渦攪拌する。ＰＣＲ管の架台をＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）内に配置する。
ＰＣＲパラメーター構成
レクチンＤＮＡ配列のコピー数を定量するために（ＴＥ ）７２℃、（ＴＢ ）８１℃、（ＴＭＳ１ ）８１℃、（ＴＭＥ１ ）８３．５℃でステージＩＩから蛍光シグナルを採取した。
データ処理および分析
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する：伸長相の終わりの温度（ＴＥ ：７２℃におけるＦＥ ）、アンプリコン融解開始の前（ＴＢ１：８１℃におけるＦＢ１）、増幅されたレクチンＰＣＲ産物の融解温度の開始（ＴＭＳ１ ：８１℃におけるＦＭＳ１ ）および増幅されたレクチンＰＣＲ産物の融解温度の終（ＴＭＥ１ ：８３．５℃におけるＦＭＥ１ ）。図４参照
（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。上記の段階を４０回反復して、ＰＣＲごとにレクチンゲノムの１７００から２１２５００コピーまでの濃度範囲を決定して、標準曲線を作製する。上記の同じＤＮＡ抽出およびＰＣＲ操作を行って未知試料中のレクチンの開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始レクチンＤＮＡ濃度を決定する。
結果
図４：レクチンアンプリコンの融解プロフィール、および図５：レクチン標準校正曲線を参照。
【００４５】
試料＃ＣＯＣ−ＢＸＪ５３９（ＦＵＪＩタンパク質５４５）は、最初にサイクル２２．５５で現れ、そのレクチンアンプリコン融解傾斜は基線傾斜より大きい。レクチンの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中にレクチンＤＮＡの２９６８０コピーを含む。
【００４６】
実施例Ｉに基づいて、同じ試料中の３５Ｓ ＣａＭＶ含有量は２１コピーであった。ＧＭＯ含有％はＣａＭＶレベルとレクチンレベルとの比でありそしてこれは０．０７２％に等しい。
【００４７】
＃Ｍ３５−４９０（単離されたダイズタンパク質）はサイクル２２．０９で最初に現れ、そのレクチンアンプリコン融解傾斜は基線傾斜より大きい。レクチンの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中にレクチンＤＮＡの４０５１９を含む。実施例Ｉに基づいて、同じ試料中の３５Ｓ ＣａＭＶ含有量は１２５コピーであった。ＧＭＯ含有％はＣａＭＶレベルとレクチンレベルとの比でありそしてこれは０．３１％に等しい。
【００４８】
＃ＮＡＨＸ−６１５０９（ダイズフレーク）はサイクル２３．５７で最初に現れ、そのレクチンアンプリコン融解傾斜は基線傾斜より大きい。レクチンの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中にレクチンＤＮＡの１４８８０コピーを含む。
【００４９】
実施例Ｉに基づいて、同じ試料中の３５Ｓ ＣａＭＶ含有量は１８コピーであった。ＧＭＯ含有％はＣａＭＶレベルとレクチンレベルとの比でありそしてこれは０．１１７％に等しい。
文献
Ｖｏｄｋｉｎ， Ｌ．Ｏ．， Ｒｈｏｄｅｓ， Ｐ．Ｒ．， ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， Ｒ．Ｂ． Ｃａ ｌｅｃｔｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｈａｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ， Ｃｅｌｌ ３４： １０２３−１０３１ （１９８３）。
実施例３
単一標的Ｑ−ＰＣＲアッセイ−細菌ＤＮＡの検出
均質定量アッセイを細菌ＤＮＡについて開発した。このアッセイは、ＤＮＡインターカレーション色素であるＳＹＢＲグリーンＩの存在下でのＰＣＲを用いる。この方法は、病原性細菌、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） Ｏ１５７：Ｈ７の初期コピー数を反応中で定量できる。本方法は、ＰＣＲのそれぞれの熱サイクルの間のデータ採取を含む。蛍光データは、伸長および変性段階の間の中間温度で採取される。特定のＰＣＲ産物が産生されると、色素は産物内にインターカレーションし、そして全蛍光シグナルが増加する。インターカレーション色素の蛍光値は、温度に逆比例する。我々は特異性アンプリコンの蛍光値の傾斜の変化をインターカレーション色素の傾斜と比較する。次いで、我々は傾斜に正の変化が最初に現れた熱サイクルを記録し、ここでアンプリコン傾斜は基線傾斜よりも大きい。
【００５０】
蛍光がこのレベルより上に上昇したサイクルが閾サイクル（ＣＴ ）である。この値は開始標的コピー数に逆に関係する。既知濃度の標準（１．２５Ｅ＋５〜１．２５Ｅ＋１、大腸菌ゲノム／ＰＣＲ）を使用しそして濃度の対数を標準試料のＣＴ に対してプロットして標準曲線を作製する。次いで、未知試料の開始コピー数をこの標準曲線から決定する。本方法は、試験試料の開始コピー数を定量するための特異性で高感度のアッセイを提供する。
材料および方法
細胞培養
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７〔ＤＤ１９７７〕の株をＢＨＩブロス（脳心臓浸出液（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ） １０ｍｌ内に接種しそして３７℃で２４時間インキュベーションした。一夜培養物の細胞カウントは、スプレッドプレート計数（ｓｐｒｅａｄ ｐｌａｔｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）により推定した。これらの培養物は、典型的には、約１ｘ１０９ コロニー形成単位／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）の細胞密度を生成した。
試料希釈
新しい試料をＢＨＩブロスを用いて直ちに１０倍に希釈した。最終の標的大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の細胞カウントは、それぞれほぼ１０８ 、１０７ 、１０６ 、１０５ 、１０４ 、および０ＣＦＵ／ｍｌであった。それぞれ希釈した培養物の１個の５μｌ試料を採取しそしてＰＣＲ緩衝液〔３μＭ ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｒ） （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ） 、２００ｎｇ／μｌプロナーゼ−Ｅ（Ｐｒｏｎａｓｅ−Ｅ， ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、５０ｍＭトリスＨＣＬ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、２８ｍＭ ＫＣＬ、０．１％トライトンＸ１００、ｐＨ８．３〕の１９５μｌを含む溶解管に移した。すべての溶解管を３７℃に設定した加熱架台に２０分間置いた。次いで溶解した試料管を９５℃加熱ブロック内に１０分間置いてプロナーゼ−Ｅを不活性化した。最後に、すべての試料をＰＣＲ増幅し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内での蛍光検出により、それぞれのＰＣＲサイクルに対する大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の種々のレベルからのＰＣＲ産物の量を決定した。ＰＣＲ試薬は、スクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．）からなり、これはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの１６０ｍＭ、プライマー５’（ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＡＧ ＣＧＡ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＣ）３’．３３−２６−ｒｃ１０１２の７２ｎＭ、プライマー５’（ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＧＡ ＡＡ）３’．３３−２６−５３８の７２ｎＭおよびＴａｑＴＭポリメラーゼの１．５単位の保証された有効濃度を含んでいた。タブレット ロット９０２９大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を試験に使用した。
定量ＰＣＲプロセス
それぞれ溶解した試料の５０μｌの２組のアリコートを採取しそしてＢＡＸ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット１個を含むＰＣＲ管内に移し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で増幅した。
【００５１】
反応は、９４℃で２分間の初期保持期間、次いで９４℃／１５秒間および７０℃／２．５３分間、次いで（ＴＥ ）７０℃、（ＴＢ１）７６．５℃／７秒間、（ＴＭＳ１ ）８２．６℃、（ＴＭＥ１ ）および８９．５℃／７秒間の３８サイクルで進行した。我々はすべてのサイクルから最後の４事象（７０℃／７秒間でのＦＥ 、７６．５℃／７秒間でのＦＢ１、８２．６℃／７秒間でのＦＭＳ１ 、８９．４℃／７秒間でのＦＭＥ１ ）から蛍光シグナルを採取した。３８サイクルが完了した後、ＰＣＲ管を分析まで２５℃で保持した。
ＰＣＲ産物分析
選択されたプライマー対Ｐ−５３８およびｒｃ−１０１２は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を同定するために使用された４７５塩基対ＤＮＡ断片を増幅した。標的細胞を含まないものからの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の種々のレベルを含む区別試料のための閾サイクル値（ＣＴ ）の確定は、基線傾斜（ＳＢ１）からの標的ＰＣＲ産物融解相傾斜（ＳＭ１）の正の変化の最初の出現に基づいた。
【００５２】
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する：
伸長相の終わりの温度（ＴＥ ：７０℃におけるＦＥ ）、アンプリコン融解開始の前（ＴＢ１：７６．５℃におけるＦＢ１）、増幅された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ ＰＣＲ産物の融解温度の開始（ＴＭＳ１ ：８２．６℃におけるＦＭＳ１ ）および増幅された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ＰＣＲ増幅産物の融解温度の終（ＴＭＥ１ ：８９．４℃におけるＦＭＥ１ ）。
【００５３】
（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った（ＦＢ１−ＦＥ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ１）から、（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）の負の値により定義されるアンプリコン大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７融解相傾斜（ＳＭ１）への傾斜の変化を決定する。図６参照。（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。段階１）〜３）を３８回反復して、ＰＣＲごとに大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムの１．２５Ｅ＋１から１．２５Ｅ＋５までの濃度範囲を決定して標準曲線を作製する。上記のＰＣＲプロセスにおける溶解操作を行って未知試料中の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７濃度を決定する。
結果
図６：大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンの融解プロフィール、および図７：大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７標準校正曲線を参照。
実施例４
単一標的Ｑ−ＰＣＲアッセイ−ウイルスＤＮＡの検出
細菌ＤＮＡを定量するために使用した同じ基本的方法を本実施例ではウイルスＤＮＡに適用した。
材料および方法
ＳＶ４０ウイルスＤＮＡはＣＩＢＣＯ ＢＲＬ（Ｒ） Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）より購入した。これをＢＳＣ−１細胞中に増殖させたＣｓＣｌバンド付ＳＶ４０ウイルス（株７７６）から精製する。分子量は約３．５Ｅ６ドルトン（５２４３塩基対ｄｓＤＮＡ）スーパーコイル環状ＤＮＡである。ＳＶ４０ウイルスＤＮＡを本試験のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
【００５４】
原液ＳＶ４０ＤＮＡの濃度は５００ｎｇ／ｕｌであり、次いで蒸留、脱イオン水を用いて１０，０００倍に希釈して５０ｐｇ／ｕｌ作業原液とした。５０ｐｇ／ｕｌから２０、１０、４、０．８、および０．１６ｐｇ／ｕｌ（３．４４Ｅ＋６、１．７２Ｅ＋６、６．８８Ｅ＋５、１．３８Ｅ＋５および２．７５Ｅ＋４コピーＤＮＡに相当）の最終濃度へのＳＶ４０の連続希釈物をＰＣＲ反応に使用した。
【００５５】
最後に、すべての試料をＰＣＲ増幅、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で蛍光検出を行って、それぞれのＰＣＲサイクルでＳＶ４０の種々のレベルからのＰＣＲ産物の量を決定した。ＰＣＲ試薬は、スクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．）からなり、これはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの１６０ｍＭ、プライマー５’（ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＡＧ ＣＧＡ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＣ）３’．３３−２６−ｒｃ１０１２の７２ｎＭ、プライマー５’（ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＧＡ ＡＡ）３’．３３−２６−５３８の７２ｎＭおよびＴａｑＴＭポリメラーゼの１．５単位の保証された有効濃度を含んでいた。追加のＳＶ４０プライマーＰ−４１５８ ５’（ＴＴＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＡＡ ＡＧＧ ＴＡＣ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＡＧ ＣＡ）−３’の２００ｎＭおよびプライマーｒｃ−４２８９ ５’（ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＧＧ）−３’の２００ｎＭをそれぞれのＰＣＲ反応物に加えた。ロット９０２０タブレットを試験に使用した。
定量ＰＣＲプロセス
それぞれのＳＶ４０ＤＮＡ試料の５０μｌの２組のアリコートを採取しそしてスクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット１個を含むＰＣＲ管内に移し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で増幅した。反応は、９４℃で２分間最初に保持し、次いで９４℃／１５秒間および７０℃／２．５３分間、次いで（ＴＥ ）７０℃／７秒間、（ＴＢ１）７６．５℃／７秒間、（ＴＭＳ１ ）７７．５℃／７秒間、および（ＴＭＥ１ ）７９．５℃／７秒間の３８サイクルで進行した。それぞれおよびすべてのサイクルから最後の４事象（７０℃／７秒間でのＦＥ 、７６．５℃／７秒間でのＦＢ１、７７．５℃／７秒間でのＦＭＳ１ および７９．５℃／７秒間でのＦＭＥ１ ）から蛍光シグナルを採取した。３８サイクル後に完了した後、ＰＣＲ管を分析まで２５℃に保持した。
ＰＣＲ産物分析
選択されたプライマー対Ｐ−４１５８およびｒｃ−４２８９を、ＳＶ４０標的ＤＮＡを同定できるＤＮＡ断片の１３２ｂｐを増幅するために使用した。標的細胞を含まないものからのＳＶ４０の種々のレベルを含む区別試料に対する閾サイクル値（ＣＴ ）の確定は、基線傾斜（ＳＢ１）からの融解相傾斜（ＳＭ１）の正の変化の最初の出現に基づいた。
【００５６】
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する：
伸長相の終わりの温度（ＴＥ ：７０℃におけるＦＥ ）、増幅されたＳＶ４０ＰＣＲ産物の融解温度の前（ＴＢ１：７６．３℃におけるＦＢ１）、増幅されたＳＶ４０ＰＣＲ産物の融解温度の開始（ＴＭＳ１ ：７７．５℃におけるＦＭＳ１ ）および増幅されたＳＶ４０ＰＣＲ産物の融解温度の後（ＴＭＥ１ ７９．５℃におけるＦＭＥ１ ）。
【００５７】
（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った（ＦＢ１−ＦＥ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ１）から、（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）の負の値により定義されるアンプリコンＳＶ４０融解相傾斜（ＳＭ１）への傾斜の変化を決定する。図８参照。
【００５８】
（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。上記の段階を３８回反復して、ＰＣＲごとに２．７５Ｅ＋４から３．４４Ｅ＋６コピーまでの濃度範囲を決定して標準曲線を作製する。
【００５９】
未知試料中のＳＶ４０ＤＮＡ濃度におけるＳＶ４０の開始濃度を定量する。次いで、得られたサイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始ＳＶ４０ＤＮＡ濃度を決定する。
結果
図８：ＳＶ４０アンプリコンの融解プロフィール、および図９：ＳＶ４０標準校正曲線を参照。
実施例５
多重Ｑ−ＰＣＲアッセイ
本実施例は、以上に記載した２種のアッセイが両方の標的を試験するために単一反応内にどのように組合せてもよいかを示す。本方法は、実施例ＩＶのものと同様であるが、しかし本試験では試料は大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７およびＳＶ４０のための鋳型ＤＮＡを含み、従って両方の標的のためのアンプリコンが産生および測定される。
材料および方法
細胞培養大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７
それぞれのプロセスは実施例ＩＩＩと同様であり新しいカルチャーを調整およ希釈した。最終的な標的大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の細胞カウントは、それぞれほぼ１０８ 、１０７ 、１０６ 、１０５ 、１０４ 、および０ＣＦＵ／ｍｌであった。細胞溶解プロセスは、実施例ＩＩＩと同様であった。
【００６０】
ＳＶ４０ウイルスＤＮＡを大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細胞溶解物内にスパイクした。
【００６１】
実施例ＶＩと同様のＳＶ４０ ＤＮＡを本試験に使用した。５０ｐｇ／ｕｌから２０、１０、４、０．８、０．１６および０ｐｇ／５０ｕｌのＳＶ４０の連続希釈物をそれぞれ０、１０４ 、１０５ 、１０６ 、１０７ 、および１０８ ＣＦＵ／ｍｌのレベルの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７内にそれぞれスパイクした。最後に、すべての試料をＰＣＲ増幅し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で蛍光検出を行って、それぞれのＰＣＲサイクルでの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の種々のレベルからのＰＣＲ産物の量を決定した。ＰＣＲ反応あたりの最終の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７およびＳＶ４０ ＤＮＡ濃度は、それぞれ１．２５Ｅ＋５大腸菌ゲノム／０ＳＶ４０、１．２５Ｅ＋４大腸菌ゲノム／２．７５Ｅ＋４コピーＳＶ４０、１．２５Ｅ＋３大腸菌ゲノム／１．３８Ｅ＋５コピーＳＶ４０、１．２５Ｅ＋２大腸菌ゲノム／６．８８Ｅ＋５コピーＳＶ４０、１．２５Ｅ＋１大腸菌ゲノム／１．７２Ｅ＋６コピーＳＶ４０、およびスパイクしない大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノム／３．４４Ｅ＋６コピーＳＶ４０ＤＮＡであった。
ＰＣＲ試薬
ＰＣＲ試薬は、スクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．）からなり、これはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの１６０ｍＭ、プライマー５’（ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＡＧ ＣＧＡ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＣ）３’．３３−２６−ｒｃ１０１２の７２ｎＭ、プライマー５’（ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＧＡ ＡＡ）３’．３３−２６−５３８の７２ｎＭおよびＴａｑＴＭポリメラーゼの１．５単位の保証された有効濃度を含んでいた。追加のＳＶ４０プライマーＰ−４１５８ ５’（ＴＴＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＡＡ ＡＧＧ ＴＡＣ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＡＧ ＣＡ）−３’の２００ｎＭおよびプライマーｒｃ−４２８９ ５’（ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＧＧ）−３’の２００ｎＭをＰＣＲ反応物に加えた。ロット９０２９タブレットを本試験に使用した。これは実施例ＩＶで使用したＰＣＲ試薬組成と同様である。
定量ＰＣＲプロセス
それぞれ溶解したＳＶ４０スパイク試料の５０μｌの２組のアリコートを採取しそして１個のスクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレットを含むＰＣＲ管内に移し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で増幅した。反応は、９４℃で２分間の初期保持期、次いで９４℃／８秒間および７０℃／２．５３分間、次いで（ＴＥ ）７０℃／７秒間、（ＴＢ１）７３．５℃／７秒間、および（ＴＭＳ１ ）７７．５℃／７秒間、（ＴＭＥ１ ）７８．９℃／７秒間、（ＴＢ２）８３℃／７秒間、および（ＴＭＥ２ ）８９．４℃／７秒間の３８サイクルで進行した。我々はそれぞれおよびすべてのサイクルから最後の６事象（７０℃／７秒間でのＦＥ 、７３．５℃／７秒間でのＦＢ１、７７．５℃／７秒間でのＦＭＳ１ 、７８．９℃／７秒間でのＦＭＥ１ 、８３℃／７秒間でのＦＢ２／ＦＭＳ２ 、および８９．４℃／７秒間でのＦＭＥ２ ）から蛍光シグナルを採取した。この場合に、ＦＢ２はＦＭＳ２ と同様であった。３８サイクルが完了した後、ＰＣＲ管を分析まで２５℃に保持した。
ＰＣＲ産物分析
標的細胞を含まないものからのＳＶ４０の種々のレベルを含む区別試料に対する閾サイクル（ＣＴ ）値の確定は、基線傾斜（ＳＢ１）からのＳＶ４０アンプリコン融解相傾斜（ＳＭ１）の正の変化および基線傾斜（ＳＢ２）からの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコン融解相傾斜（ＳＭ２）の正の変化の最初の出現に基づいた。
【００６２】
別に、（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った（ＦＢ１−ＦＥ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ１）から、（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）の負の値により定義される融解相傾斜（ＳＭ１）へのＳＶ４０アンプリコンに対する傾斜の変化を決定する。図１０参照。
【００６３】
（ＴＢ２−ＴＭＥ１ ）で割った（ＦＢ２−ＦＭＥ１ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ２）から、（ＴＭＥ２ −ＴＭＳ２ ）で割った（ＦＭＥ２ −ＦＭＳ２ ）の負の値により定義されるアンプリコン融解相傾斜（ＳＭ２）への大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンに対する傾斜の変化を決定する。図１０参照。
【００６４】
別に、（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、ＳＶ４０アンプリコンに対する傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。濃度２．７５Ｅ＋４コピーから３．４４Ｅ＋６コピーＳＶ４０ ＤＮＡの範囲について段階１）〜３）を３８回反復して、標準曲線を作製する。
【００６５】
上記のＰＣＲプロセスにおける溶解を行って未知試料内のＳＶ４０の開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始ＳＶ４０コピー数を決定する。
【００６６】
（ＳＭ２−ＳＢ２）がゼロより大きくなる、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンに対する傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。
【００６７】
濃度１．２５Ｅ＋１コピーから１．２５Ｅ＋５大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノム／ＰＣＲの範囲について上記の段階を３８回反復して、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７標準曲線を作製する。
【００６８】
上記のＰＣＲプロセスにおける溶解を行って未知試料中の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７コピー数を決定する。
結果
図１０：ＳＶ４０／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンの融解プロフィール、および図１１：ＳＶ４０／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７標準校正曲線を参照。
実施例６
単一標的定量ＰＣＲアッセイ：追加閾決定
上記の実施例Ｉ〜ＩＶでは、インターカレーション色素の基線の傾斜に対する特異性アンプリコンの蛍光値の傾斜の変化を比較している。閾サイクルは、基線傾斜に対して、アンプリコン傾斜における最初の正の変化が検出されたサイクルとして定義される。ＰＣＲ反応における特異性アンプリコンの最初の出現の閾を決定するための他の方法もある。最初の１０回のＰＣＲサイクルにおいては標的アンプリコンの検出可能な産生がないと推定できる。従って、閾蛍光値は、最初の１０回の蛍光値を平均しそしてこの蛍光値の標準偏差の１５倍を加えてて算出できる。この方法には幾つかの欠点がある。第一に、多数のアンプリコンは類似した開始融解温度を有するので、標的ＤＮＡへの特異性が低い。これは単一標的ＰＣＲ定量にのみ適用できる。これは装置毎の変動、およびＰＣＲ性能におけるウエル毎の変動により影響を受けるので、実施例１〜４で使用した方法よりも再現性が低い。これは基線シグナルをシフトするアッセイにおける蛍光色素濃度にも依存する。
【００６９】
ＣａＭＶウイルスプロモーターを用いる例で本方法を説明する。特異性アンプリコン蛍光シグナルは、すべてのサイクルの融解の前および完全変性の後に測定された。初期のＰＣＲサイクルの間には検出可能な増幅産物蛍光シグナルがないであろう。閾は最初の１０回のサイクルの蛍光値の平均変化に１０個の蛍光値の標準偏差の１５倍を加えて決定される（ＦＥ−１０ ａｖｅ ＋１５ＸＳＤ）。閾サイクルは、試料の蛍光がＦＥ−１０ ａｖｅ ＋１５ＸＳＤを越えるサイクルとして定義される。出発物質内の標的核酸の未知濃度の定量は、これらの閾サイクル（Ｃｔ）を既知濃度の対照から生成したＣｔの標準曲線と比較して外挿できる。
材料および方法
実施例Ｉと同様−既知濃度を有するＣａＭＶ ３５ＳウイルスＤＮＡ。
ＰＣＲ試薬およびプロセス
実施例Ｉと同様
定量ＰＣＲアッセイ
ＤＮＡ標準の５レベルのそれぞれ２５μｌ（３組）および未知試料抽出物をピペットで採取し試薬タブレット１個を含むＰＣＲウエル（３組）内に入れた。抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌに、ＣＡＭＶ／緩衝液混合物２５μｌを加えた。
【００７０】
試料管を冷却ブロック（Ｑｕａｌｉｃｏｎ Ｉｎｃ）内に置きそして試料，試薬、およびタブレットを混合するためにＰＣＲ管を渦攪拌した。ＰＣＲ管の架台をＰＥ／ＡＢＩ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）内に配置する。
ＰＣＲパラメーター構成
ＣＡＭＶ ＤＮＡ配列のコピー数を定量するために（ＴＭＳ）８２℃、（ＴＭＴ）９４℃でステージＩＩのそれぞれのサイクルから蛍光シグナルを採取する。
【００７１】
ＴＭＳ：すべてのｄｓＤＮＡについて全融解温度のＰＣＲ反応中の温度。
【００７２】
ＴＭＴ：アンプリコンについて融解温度の開始のＰＣＲ反応中の温度。
データ処理および分析
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する。
【００７３】
・増幅された３５Ｓ ＣａＭＶ ＰＣＲ産物が融解を開始する温度において（ＴＭＳ：８２℃におけるＦＭＳ）および
・増幅された３５Ｓ ＣａＭＶアンプリコンの全融解温度の後（ＴＭＴ：９４℃におけるＦＭ ）。
【００７４】
ＦＭＴをＦＭＳから差し引いて、それぞれのＰＣＲサイクルのＦＭＴからＦＭＳへの蛍光シグナルの変化を決定する。図１４参照。値が閾値より大きくなった正値の最初の出現の熱サイクルを記録する。３５Ｓ ＣａＭＶゲノム／ＰＣＲの３５〜４３７５コピーの濃度の範囲を決定する上記の段階を４０回反復して、標準曲線を作製する。図１５参照。
【００７５】
上記と同じＤＮＡ抽出およびＰＣＲプロセスを行って未知試料内のＣａＭＶ３５ＳプロモーターＤＮＡの開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始濃度を決定する。
結果
図１４：ＣａＭＶアンプリコンの融解プロフィールおよびシグナル決定、図１５：ＣａＭＶの実時間定量ＰＣＲ。
［配列表の簡単な説明］
配列番号１は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５ＳＣａＭＶ）のプロモーター領域の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号２に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号９に示す断片が産生される。
【００７６】
配列番号２は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５ＳＣａＭＶ）のプロモーター領域の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号１に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号９に示す断片が産生される。
【００７７】
配列番号３は、ダイズレクチン遺伝子Ｌｅ−１の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１０に示す断片が産生される。
【００７８】
配列番号４は、ダイズレクチン遺伝子Ｌｅ−１の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号３に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１０に示す断片が産生される。
【００７９】
配列番号５は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７にユニークなゲノムの一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号６に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１１に示す断片が産生される。
【００８０】
配列番号６は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７にユニークなゲノムの一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号５に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１１に示す断片が産生される。
【００８１】
配列番号７は、ＳＶ−４０からのラージ−Ｔ抗原の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号８に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１２に示す断片が産生される。
【００８２】
配列番号８は、ＳＶ−４０からのラージ−Ｔ抗原の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号７に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１２に示す断片が産生される。
【００８３】
配列番号９は、配列番号１および２で示されたプライマーにより増幅された３５−Ｓ ＣａＭＶプロモーター領域のヌクレオチド配列部分である。この断片は、８３〜８７．５℃の融解温度を有する。
【００８４】
配列番号１０は、配列番号３および４で示されたプライマーにより増幅されたダイズレクチン遺伝子ＬＥ−１のヌクレオチド配列部分である。この断片は、８１．５〜８３．５℃の融解温度を有する。
【００８５】
配列番号１１は、配列番号５および６で示されたプライマーにより増幅された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７からのユニークなゲノム座のヌクレオチド配列部分である。この断片は、８２．６〜８９℃の融解温度を有する。
【００８６】
配列番号１２は、配列番号７および８で示されたプライマーにより増幅されたＳＶ４０ラージ−Ｔ抗原のヌクレオチド配列部分である。この断片は、７７〜７９℃の融解温度を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＣａＭＶプロモーターの断片の融解プロフィールであって、温度と相対蛍光強度との関係、および基線傾斜（ＳＢ ）およびアンプリコン傾斜（ＳＭ ）を示す。
【図２】
図１中のアンプリコンの実時間定量ＰＣＲ増幅であって、温度と開始濃度との関係およびデルタ傾斜差（ＳＭ −ＳＢ ）との関係を示す。
【図３】
図１のアンプリコンの標準曲線であって、開始標的濃度の対数とＰＣＲ中の閾サイクル数との間の関係を示す。
【図４】
レクチンアンプリコンの融解プロフィールであって、温度と相対蛍光強度との関係および基線傾斜（ＳＢ ）およびアンプリコン傾斜（ＳＭ ）を示す。
【図５】
図３のアンプリコンの標準曲線であって、開始標的濃度の対数とＰＣＲ中の閾サイクル数との間の関係を示す。
【図６】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンの融解プロフィールであって、温度と相対蛍光強度との関係、および基線傾斜（ＳＢ ）およびアンプリコン傾斜（ＳＭ ）を示す。
【図７】
図６中のアンプリコンの実時間定量ＰＣＲ増幅であって、温度と開始濃度との関係およびデルタ傾斜差（ＳＭ −ＳＢ ）との関係を示す。
【図８】
図６のアンプリコンの標準曲線であって、開始標的濃度の対数とＰＣＲ中の閾サイクル数との間の関係を示す。
【図９】
ＳＶ４０アンプリコンの融解プロフィールであって、温度と相対蛍光強度との関係および基線傾斜（ＳＢ ）およびアンプリコン傾斜（ＳＭ ）を示す。
【図１０】
図９のアンプリコンの標準曲線であって、開始標的濃度の対数とＰＣＲ中の閾サイクル数との間の関係を示す。
【図１１】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７およびＳＶ４０アンプリコン両方の混合物の融解プロフィール。混合および傾斜決定。
【図１２】
多重Ｑ−ＰＣＲアッセイからのＳＶ４０アンプリコンの標準曲線。
【図１３】
多重Ｑ−ＰＣＲアッセイからの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンの標準曲線。
【図１４】
３５Ｓ ＣａＭＶ融解プロフィールおよびシグナル決定。本図は、温度と特異性ＣａＭＶ増幅産物の相対蛍光強度との関係を示し、そしてアンプリコンシグナルと背景蛍光との間の差も示す。
【図１５】
ＣａＭＶの実時間定量ＰＣＲ反応。本図は、閾値を設定するための平均基線の使用を示し、そしてＣａＭＶ試料のそれぞれの濃度の熱サイクルの数と蛍光シグナル差（特異性−背景）の間の関係を示す。
【図１６】
アンプリコンの閾サイクルの決定。初期蛍光（ＦＩ ）および背景閾蛍光（ＦＢ ）を定義するために使用したサイクルを示す。閾サイクル（ＣＴ ）は、アンプリコン産生およびＦＢ の関数として決定できる。
本出願は、２０００年３月７日付けの米国仮出願（ＵＳ）６０／１８７５３７号の利益を主張する。
発明の分野
本発明は分子生物学の分野そしてさらに特定するとＤＮＡに基づく診断プロトコールに関する。
発明の背景
多くの場合に、試料中の標的核酸のレベルを定量することが望ましい。例えば、食品または水試料中の病原性生物体の量、または作物中の遺伝子組換え生物体（ＧＭＯ）の量を決定することは重要であろう。
【０００２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、かかる検出のために感度が高くそして強力な方法である。ＰＣＲ技術の多数の特異性適用は、定性および定量検出の両方について当該技術分野では公知である。特に、増幅したＰＣＲ産物を検出および定量するために蛍光色素を用いることは公知である。均質（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ） ＰＣＲとしても知られるその場での増幅および検出もこれまでに記載されている。例えばヒグチら（Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｋｉｎｅｔｉｃｓ ＰＣＲ Ａｎａｌｙｓｉｓ： Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ， Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ．１１， １０２６−１０３０ページ（１９９３）） 、イシグロら（Ｉｓｈｉｇｕｒｏ ｅｔ ａｌ．， Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ａｓｓａｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｂｙ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｅｒ， Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２９， ２０−２１３ページ（１９９５）） 、およびヴィトヴァーら（Ｗｉｔｔｗｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ｏｆ Ｒａｐｉｄ ｃｙｃｌｅ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ， ｖｏｌ．２２， １３０−１３８ページ（１９９７）） 参照。
【０００３】
これらの方法において、蛍光シグナルは、ＰＣＲ反応のアニーリング／伸長相の間にサイクルあたりに１回得られる。しかし、このようにして測定された蛍光は、特異的に増幅された標的ＰＣＲ産物（標的アンプリコン）、ならびに単一プライマー産物、プライマー−ダイマー、およびその他の異常なアンプリコンを含む非特異性アンプリコンの混合物の全蛍光を表す。これらのこれまで開示された方法は、特異性および非特異性アンプリコン間の区別ができず、そして標的コピー数が少ない場合には特に問題がある。
【０００４】
さらに、これらの方法は、それぞれのＰＣＲ反応内の単一標的ＤＮＡを検出するために使用できるだけであるが、しかし一つのＰＣＲ反応内の複数の標的核酸を同時に検出することがしばしば望まれる。
【０００５】
さらに、試料ＤＮＡが同時に増幅される場合に、同じ反応内での陽性対照を入手することが必要である。このような「内部陽性対照」は、ＰＣＲ反応のための陽性制御として、および試験試料により導入される不純物のために増幅効率が変動するＰＣＲ反応を校正するための両方の場合に役立つであろう。
【０００６】
低いコピー数の試料中の標的核酸濃度を信頼できるように決定し、標的アンプリコンと非特異性アンプリコンとを区別でき、そして複数の標的核酸を同時に検出および定量するために使用できる定量ＰＣＲ方法を得るという要求がある。本出願で開示する本発明は、これらおよびその他の要求を満足する。
発明の要旨
標的核酸分子の融解が温度ＴＭＳで開始しそして温度ＴＭＥで完了する、試料内の標的核酸分子の量を実時間で検出するための方法であって、
Ａ．ｉ）適当な蛍光色素の存在下で、既知の開始濃度（Ｃ）を有し、変性、アニーリング、および連鎖伸長サイクルを介して標的核酸分子をＰＣＲ増幅し、ここで、色素が二本鎖核酸分子と結合すると蛍光が増加し、ここで連鎖伸長は連鎖伸長温度ＴＥ で起き；
ｉｉ）蛍光（Ｆ）を、それぞれの増幅サイクルの間に、温度がＴＥ から上昇を開始する直前の温度において（ＴＥ におけるＦＥ ）、ＴＥ とＴＭＳとの間のなんらかの温度点（ＴＢ ）において（ＴＢ におけるＦＢ ）、ＴＭＳにおいて（ＴＭＳにおけるＦＭＳ）およびＴＭＥにおいて（ＴＭＥにおけるＦＭＥ）測定し；
ｉｉｉ）（ＴＢ −ＴＥ ）で割った−（ＦＢ −ＦＥ ）により定義される基線傾斜（ＳＢ ）、および（ＴＭＥ−ＴＭＳ）で割った−（ＦＭＥ−ＦＭＳ）により定義されるアンプリコン融解相傾斜（ＳＭ ）を算出し；
ｉｖ）量（ＳＭ −ＳＢ ）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ）を記録し；
ｖ）関係する濃度の適当な範囲内で段階ｉ）からｖ）までを反復し、そして
ｖｉ）標的核酸配列のための標準曲線を得るためにＣをＣＴ に対してプロットする；
ことにより標準曲線を確定し、そして
Ｂ．標的核酸分子の未知濃度を含む試料について段階（Ａ）（ｉ）から（Ａ）（ｖ）までを反復して試料についてのＣＴ 値を入手し、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定する
ことを含んでなる方法。
【０００７】
上記の本発明の方法は、試料内の複数の標的を検出するために使用してもよい。特に、試料がｎ種の標的核酸分子を含む場合、ここでｎは３より大きい整数であり、ここで、第一標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ１ で開始しそして温度ＴＭＥ１ で完了し、第二標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ２ で開始しそして温度ＴＭＥ２ で完了し、第（ｎ−１）標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ（ｎ−１） で開始しそして温度ＴＭＥ（ｎ−１） で完了し、第ｎ標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳｎ で開始しそして温度ＴＭＥｎ で完了し、そしてここでＴＭＳｎ はＴＭＥ（ｎ−１） より高い。多重検出のための本方法は、
Ａ．単一標的検出の方法に従って標的核酸分子のそれぞれのための標準曲線を確定し；
Ｂ．標的核酸分子の未知濃度を含む試料を同時ＰＣＲ増幅して、試料についてのＮ１ 、Ｎ２ ．．．およびＮｎ 値を入手し、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定することを含んでなる。
【０００８】
好ましい態様に従うと、第一および第二標的核酸分子は生物体の同じゲノム上に存在し、そして第一標的核酸分子のゲノムあたりのコピー数は既知であり、これにより、第二標的核酸分子のゲノムあたりのコピー数を決定する。
【０００９】
本発明の他の態様に従うと、第一標的核酸はインベルターゼ遺伝子またはレクチン遺伝子であり、そしてここで、第二標的核酸は、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター、Ｃｒｙ９Ｃ遺伝子、ＧＡ２１遺伝子よりなる群より選ばれる。
【００１０】
特に好ましい態様に従うと、核酸分子は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９および配列番号１０よりなる群より選ばれる。
【００１１】
最も好ましい態様に従うと、標的核酸分子は、遺伝子組換え生物体内に含まれる導入遺伝子の部分である核酸断片である。
【００１２】
［発明の詳細な説明］
本発明のＰＣＲに基づく方法は、選定された時点でそれぞれの増幅サイクルの間に増幅した標的（「標的アンプリコン」）の蛍光を測定して二本鎖核酸分子（「ｄｓＤＮＡ」または「標的」）を検出および定量する。
【００１３】
専門家には周知のように、ｄｓＤＮＡの２本の鎖は、温度がその融解温度より高い場合には分離すなわち融解する。ｄｓＤＮＡ分子の融解は一つのプロセスであり、そしてある与えられた溶液条件下では、融解はある温度（本明細書中で以後ＴＭＳと呼ぶ）で開始し、そして別の温度（本明細書中で以後ＴＭＥと呼ぶ）で完了する。慣用の用語Ｔｍ は、融解が５０％完了する温度を示す。本発明の方法のために、標的アンプリコンの融解曲線特性があらかじめ決定される。
【００１４】
典型的なＰＣＲサイクルは、標的ｄｓＤＮＡが融解する変性相、プライマーが生成した一本鎖に結合するために温度が最適であるプライマーアニーリング相、およびＤＮＡポリメラーゼが機能するために温度が最適である連鎖延伸相（ＴＥ ）を含む。本発明に従うと、ＴＭＳはＴＥ より高くなければならず、そしてＴＭＥは、ＤＮＡポリメラーゼが熱で不活性化される温度より低く（しばしば本質的に低く）なければならない。当然ながら、融解曲線特性は、与えられたｄｓＤＮＡ分子の固有の特性である。望ましい融解曲線は、標的アンプリコンの長さおよび／またはＧＣ含有量を選定して通常は達成される。融解曲線特性は、これらを増幅するためにに使用されるＰＣＲプライマーを交換して変更してもよい。例えば、プライマーの５’末端にＧＣ−リッチオーバーハングを付加すると、増幅した標的のＴｍ が上昇する。
【００１５】
二本鎖核酸分子は、これらがある種の色素を結合すると紫外線下で蛍光を示し、そして蛍光の強度はｄｓＤＮＡの濃度に比例するであろう。ｄｓＤＮＡを検出および定量するためにかかる関係を利用する方法は、当該技術分野では公知である。多数の色素が公知でありそしてこれらの目的に当該技術分野で使用される。本方法もかかる関係を利用する。かかる色素の例には、インターカレーション色素が含まれる。かかる色素の例には、これらに限定はされないが、ＳＹＢＲ−グリーン−Ｉ（Ｒ） 、エチジウムブロミド、プロピジウムヨージド、ＴＯＴＯ（Ｒ） −１｛キノリニウム、１−１’−〔１，３−プロパンジイルビス〔（ジメチルイミニオ）−３，１−プロパンジイル〕〕ビス〔４−〔（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾチアゾリリデン）メチル〕〕−、テトラヨージド｝、およびＹｏＰｒｏ（Ｒ） ｛キノリニウム、４−〔（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンゾオキサゾリリデン）メチル〕−１−〔３−（トリメチルアンモニオ）プロピル〕−、テトラヨージド｝が含まれる。本発明にもっとも好ましい色素は、非不斉シアニド色素、例えばＭｏｌｅｄｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ． （Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）により製造されるＳＹＢＲ−グリーン−Ｉ（Ｒ） である。ＳＹＢＲ−グリーン（Ｒ） ／ＤＮＡ複合体、およびＳＹＢＲ−グリーン（Ｒ） 単独は、固有の温度依存性蛍光を有する。温度が上昇すると、ＳＹＢＲ−グリーン（Ｒ） ／ＤＮＡ複合体の蛍光は、ｄｓＤＮＡ鎖が分離しなくても自然に低下する。変化の割合は、ＤＮＡの濃度に比例して増加する。ｄｓＤＮＡ鎖分離による変化からこの温度依存性変化を区別するために、反応内のそれぞれのアンプリコンを取りまく測定の前およびその間に閾値を事前に確定する必要がある。
【００１６】
本発明によると、それぞれのＰＣＲサイクルについて、ＰＣＲ反応混合物の蛍光（Ｆ）は、温度がＴＥ から上昇を開始する直前の温度において（ＴＥ におけるＦＥ ）、ＴＥ とＴＭＳとの間のなんらかの温度点（ＴＢ ）において（ＴＢ におけるＦＢ ）、溶融の開始温度の直下において（ＴＭＳにおけるＦＭＳ）および溶融の完了の直上において（ＴＭＥにおけるＦＭＥ）測定される。
【００１７】
ＰＣＲ反応中および種々の蛍光値の測定中に使用される装置に応じて、種々の蛍光測定を行う場合の期間内に温度を一定に保持する必要があるであろう。例えば、パーキンエルマー７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ７７００ ＳｅｑｕｅｎｃｅＤｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ） を用いる場合には、０．５〜６０秒間の間のいずれかの期間が適当である。好ましくは１〜４５秒間、さらに好ましくは１〜３０秒間、そしてそれよりさらに好ましくは１〜１５秒間の期間が適当である。蛍光測定のために最も好ましい期間は７秒間である。
【００１８】
これらの値より基線傾斜（ＳＢ ）が算出される。ＳＢ は、（ＴＢ −ＴＥ ）で割った−（マイナス）（ＦＢ −ＦＥ ）により定義され、そして（ＴＭＥ−ＴＭＳ）で割った−（ＦＭＥ−ＦＭＳ）により定義される融解相傾斜（ＳＭ ）も算出される。
【００１９】
ＰＣＲ増幅が進行すると、標的アンプリコンの濃度が増加しそしてＦＭＳの値も増加する。量（ＳＭ −ＳＢ ）がゼロより大きい場合に、傾斜の正の変化が最初に出現する増幅サイクルの数（「閾サイクル数ＣＴ 」）は、標的アンプリコンの開始濃度（Ｃ）と相関する。
【００２０】
標的アンプリコンの標準曲線は、濃度が既知の標的アンプリコンの溶液の一連の希釈を用いて開始して確定される。同一のＰＣＲ条件下で連続希釈におけるそれぞれの濃度で上記の方法を反復して、ＣＴ が既知濃度のそれぞれについて決定される。与えられたＰＣＲ条件下での標的アンプリコンの標準曲線は、このようにしてＣＴ をＣに対してプロットして確定される。好ましくは、標準曲線は、標的アンプリコンの１〜１０９ コピーの間、好ましくは１０〜１０８ 、さらに好ましくは１０〜１０７ 、特に好ましくは１０〜１０６ コピーの範囲の濃度の適当な範囲をプロットする。
【００２１】
標的アンプリコンを含むと推測される試料内の標的アンプリコンの濃度を決定するために、ＰＣＲによる増幅のために適するような適当な方法で試料を調製する。次いで対応する標準曲線が確定されると同一の条件下で試料をＰＣＲ増幅させる。試料のためのＣＴ の値は上記のようにして決定されそして対応する濃度を確定するために標準曲線と比較する。
【００２２】
本発明に従う方法は、複数の標的アンプリコンを同時に検出するためにも使用できる（「多重（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ） 検出」）。図１１を参照すると、試料が１個を越える標的アンプリコンを含む場合に、それぞれのアンプリコンのそれぞれのＳＢ およびＳＭ 、ＴＥ におけるＦＥ およびＴＢ におけるＦＢ を決定しなければならない。従って、多重検出のために、標的アンプリコンは、区別が可能な融解曲線特性、例えばそれぞれのアンプリコンに対するＴＥ におけるＦＥ およびＴＢ におけるＦＢ が決定可能でなければならない。
【００２３】
試料が２個の標的アンプリコン（第一標的核酸分子および第二標的核酸分子と呼ぶ）を含む場合に、第一標的核酸分子の融解は、温度ＴＭＳ１ で開始しそしてＴＭＥ１ で完了すし、第二標的核酸分子の融解は、温度ＴＭＳ２ で開始しそしてＴＭＥ２ で完了する。本発明に従うと、ＴＭＳ２ はＴＭＥ１ より高い。通常の条件下で、ＴＭＥ１ は５５℃より低くはなく、一方ＴＭＳ２ は９５℃より高くはなく、そして多重増幅および定量のためには３〜５℃の温度差で通常は十分であることが認められる。多重ＰＣＲ反応において標的アンプリコンの開始濃度を定量するために、アンプリコン（内部標準対照、その他の標的アンプリコン、および非特異性産物、例えばプライマーダイマーを含む）は、反応内の他の可能な産物と重複しない融解温度を有するように設計または選定しなければならない。これは、産物が異なる温度で融解することを確実にし、そして種々の蛍光値が独立して区別されそして分析できることを確実にする。全蛍光は加法的でありそしてｄｓＤＮＡ産物の濃度への相関を保つ。すなわち、産物が分解または融解した後、これは全蛍光にもはや寄与しない。
【００２４】
しかし、鎖延伸温度（ＴＥ ）は、両方のアンプリコンで一致する。標的核酸分子それぞれの標準曲線は、上記のように適当な蛍光色素、既知の開始濃度（Ｃ１ およびＣ２ ）を有する標的核酸分子の存在中での同時ＰＣＲ増幅により確定される。具体的には、蛍光（Ｆ）を、それぞれの増幅サイクルの間に、温度がＴＥ から上昇を開始する直前の温度において（ＴＥ におけるＦＥ ）、ＴＥ とＴＭＳ１ との間のなんらかの温度点（ＴＢ１）において（ＴＢ１におけるＦＢ１）、ＴＭＳ１ において（ＴＭＳ１ におけるＦＭＳ１ ）およびＴＭＥ１ において（ＴＭＥ１ におけるＦＭＥ１ ）ＴＭＥ１ とＴＭＳ２ との間のなんらかの時点（ＴＢ２）において（ＴＢ２におけるＦＢ２）、ＴＭＳ２ において（ＴＭＳ２ におけるＦＭＳ２ ）、ＴＭＥ２ において（ＴＭＥ２ におけるＦＭＥ２ ）測定し；基線傾斜（ｂａｓｅｌｉｎｅ ｓｌｏｐｅ）は、第一標的分子について、（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った−（ＦＢ１−ＦＥ ）により定義される（ＳＢ１）として算出され、そして第一アンプリコン融解相傾斜は、第一標的分子について（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った−（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）により定義される（ＳＭ１）として定義され；そして第二標的分子についての基線傾斜（ＳＢ２＝−（ＦＢ２−ＦＭＥ１ ）／（ＴＢ２−ＴＭＥ１ ））、および第一分子についての融解相傾斜（ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｈａｓｅ ｓｌｏｐｅ）（ＳＭ２＝−（ＦＭＥ２ −ＦＭＳ２ ）／（ＴＭＥ２ −ＴＭＳ２ ））を同様に決定する。量（ＳＭ１−ＳＢ１）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ１ ）および量（ＳＭ２−ＳＢ２）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ２ ）を記録する。これらの段階を、２種の標的分子それぞれについての関係する濃度の適当な範囲内で反復し、そして、第一標的分子のための標準曲線を得るためにＣ１ をＮ１ に対してプロットし、そして第二標的分子のための標準曲線を得るためにＣ２ をＮ２ に対してプロットする。
【００２５】
次いで第一および第二標的核酸分子の未知濃度を含むと推測される試料に関して上記の段階を反復して、試料に関するＮ１ 値およびＮ２ 値を入手し、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定する。
【００２６】
蛍光強度は、本質的にサイクル毎に変動する。これは背景ノイズを構成する。かかるノイズを除去または少なくとも最小化するために、そして装置間の整合性を得るためにも閾値を任意に設定する。かかる閾値より低いあらゆる蛍光レベルは無視しそして有意または特異性増幅が起きていないと考えられる場合に測定を行う。閾値レベルより上の蛍光レベルのみを測定しそして検出および定量の目的に使用する。
【００２７】
典型的には、ＰＣＲの初期のサイクルの間には検出可能な産物はない。従って、最初の数サイクルは閾値を決定するために使用できる。本発明によると、初期蛍光値ＦＩ は、最初の数回のＰＣＲサイクルの平均蛍光値として定義される（図１６）。最も好ましい態様に従うと、初期サイクル＃４〜１２を用いる。閾蛍光ＦＢ は、閾背景シグナルとしてのＰＣＲの指数相の前のサイクルＮ−１０〜Ｎ−５の平均蛍光シグナルである。アンプリコンの検出可能レベルは、デルタ傾斜（ＳＭ −ＳＢ ）蛍光が基線上６７％であった場合のサイクルＮであると事前決定される。産物の指数増殖相では、Ｌｎ〔（Ｆｎ −ＦＢ ）／ＦＢ 〕の値がサイクル数の線型関数である。線型回帰の傾斜およびＲ２ は、１．０６ＦＢ 〜１．６７ＦＢ の範囲内のＦ値として決定される。回帰線と１．６７ＦＢ の閾蛍光（Ｌｎ＝−０．４）の交点が、増幅事象のサイクル閾値ＣＴ である。次いでＤＮＡ濃度の対数をＣＴ に対してプロットすると標準曲線が作製される。実施例１、２および６はこの態様を説明する。
【００２８】
本発明の別の態様によると、閾は初期１０サイクル（＃４〜１３）の蛍光の平均変化（ＳＭ −ＳＢ のデルタ傾斜）とこれらの値の標準偏差の１０倍との和でもあるであろう。初期蛍光ＦＩ は、初期サイクル＃４〜１３の平均蛍光として定義された。サイクルの数（Ｃｔ）は、試料の閾サイクル（Ｃｔ）である閾を越えた最初の出現とする。実施例３、４および５は、この方法を説明する。
【００２９】
他の好ましい態様では、本発明の多重検出方法は、別の標的核酸（標的Ｂ）を基準点として使用する標的核酸（標的Ａ）のゲノムあたりのコピー数を決定するために使用され、ここで標的Ｂのコピー数／ゲノムは既知である。標的Ａおよび標的Ｂは同一のゲノム内に存在し、そして標的Ｂのコピー数／ゲノムが既知なので、標的Ａおよび標的Ｂを本発明の多重検出法を用いて同時増幅おおび定量すると、標的Ａコピー数／ゲノムは、標的Ａの量と標的Ｂの量との間の比率から容易に算出でき、ゲノムの大きさの知識または決定の必要および開始試料に使用されたゲノムＤＮＡの量を定量する必要はない。この態様の例を実施例２に記載する。
【００３０】
本検出法は、あらゆる標的ｄｓＤＮＡを検出および定量するために使用ができ、これから標的生物体の存在およびレベルが決定できる。標的生物体の例には、真菌、細菌、感染性動物、ウイルスなどを含む病原性生物体が含まれる。特に、本方法は、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｄｉｔｉｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｏ１５７：Ｈ７、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａｓｐｐ．， Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ） 、クリプトスポリジウム・パルブム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、カンピロバクター・コーリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅａｓ） 、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、およびＳＶ−４０ウイルスＤＮＡの検出に適用された。本方法は、その他の臨床および非臨床使用にも使用できる。例えば、本方法は食品または飼料内の遺伝子組換え生物体の存在を決定するために使用できる。例えば３５Ｓ ＣａＭＶプロモーター（ラウンドアップレディ（Ｒｏｕｎｄｕｐ Ｒｅａｄｙ） （Ｒ） ダイズ中で発見された配列）、およびＣｒｙ９Ｃ遺伝子（スターリンク（ＳｔａｒＬｉｎｋ）トウモロコシ中で発見、Ｈｕａ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ６７：８７２−８７９）のような配列は、本発明を用いて検出および定量された。その他の通常の導入遺伝子には、これらに限定はされないが、グリリン酸（ｇｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）耐性遺伝子としてのＥＰＳＰＳ（５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸合成酵素）（５−ｅｎｏｌｐｙｒｕｖｙｌｓｈｉｋｉｍａｔｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（Ｙｅ ｅｔ ａｌ．（２００１） Ｐｌａｎｔ Ｊ ２５：２６１−２７０）、ホスホエノールピリビン酸カルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）プロモーター（ＢＴ１７６トウモロコシ中） 、Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）遺伝子のｈｓｐ７０プロモーター（Ｍｏｎ８０１００トウモロコシ中で発見）、Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）遺伝子（Ｍｏｎ８０９トウモロコシ）、ＮＯＳ遺伝子（Ｍｏｎ８１０トウモロコシ）、およびアクチンプロモーター遺伝子（ＧＡ２１トウモロコシ）が含まれる。内部陽性および／またはコピー数対照として、レクチン遺伝子、インベルターゼ遺伝子、およびアルドラーゼ遺伝子を適する場合にはすべて使用してもよい。
【００３１】
本方法は非常に特異性および高感度である。標的ｄｓＤＮＡの１０コピーでも検出される。
【００３２】
好ましい態様では、病原性生物体のＰＣＲタブレットは内部陽性対照を含む。ＰＣＲ反応内に含まれる内部陽性対照の利点は、以前に記載され（ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／１１１９７号、１９９７年３月２７日付け公開、その内容は、引用することによって本明細書中に編入される）そして（ｉ）単一プライマーを用いて対照を増幅してもよく、（ｉｉ）対照増幅産物の量は、試料内に含まれるあらゆる標的ＤＮＡとは無関係であり、（ｉｉｉ）対照ＤＮＡは、手作業または自動化試験手順の両方において使用の容易さおよび高度の再現性のために他の増幅試薬を用いてタブレット化でき、（ｉｖ）対照は均質検出、すなわち反応物から産生ＤＮＡが分離しないで使用でき、そして（ｖ）内部対照は、反応中の他の産生される可能性がある酸性アンプリコンとは区別される融解プロフィールを有することを含む。対照ＤＮＡはプライマー指令増幅反応中の増幅を許容する適当な大きさおよび塩基組成である。対照ＤＮＡ配列は、標的細菌から、または他の起源から得てもよいが、しかし標的アンプリコンＤＮＡの増幅を許容すると同じ条件下で再現性をもって増幅されなければならない。好ましい態様では、対照ＤＮＡは検出されるべき標的ＤＮＡと類似した大きさおよび塩基配列を有する。例えば、対照核酸断片はサルモネラ属から単離され、そして検出されるべき標的と一致したが、これは単一プライマーを用いる増幅を可能とするように操作された場合を除く（ＷＯ９７／１１１９７号）。対照ＤＮＡは、増幅反応を確認するために有用である。対照ＤＮＡの増幅は、標的ＤＮＡを含む試験試料と同時に達成される。本発明の範囲内で、試料は、対照ＤＮＡを含む対照ならびに試料と平行して試験ＰＣＲ手順にかけられる。対照が増幅を示す場合には、平行試験で達成される陽性または陰性の結果にかかわらず、手順が有効であることの有利な徴候がある。増幅反応の有意な実現を達成するために、対照ＤＮＡのコピーの適当な数がそれぞれの増幅反応内に含まれていなければならない。食品を含む試料マトリックス成分はＰＣＲの抑制を起こすことができ、従って産物形成およびシグナルの低下をもたらすことは周知である。あるいは、ＰＣＲ反応内のある種の食品成分の存在は、蛍光色素検出を用いた場合に反対の結果、すなわちシグナルの増強をもたらすことも見いだされた。本明細書中に記載のような対照の使用は、このような偽りの陽性結果を排除する。さらに、対照内の応答のレベルを校正して、例えば多数の食品由来マトリックス中に見られる外因性物質により起きる試験における反応のあらゆる抑制または促進を評価および補償することが可能である。
【００３３】
ＰＣＲと関連して使用される他に、本方法は他の核酸増幅法、例えばストランド置換、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）および増幅に基づく核酸配列（ＮＡＳＢＡ）と共に使用してもよい（例えばＦｏｏｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ， １９９７， Ｍ．Ｅ．Ｄｏｙｌｅ， Ｌ．Ｒ．Ｂｅｕｃｈａ， ａｎｄ Ｔ．Ｊ． Ｍｏｎｄｖｉｌｌｅ， ＡＳＭ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ， ７２３−７２４ ページ参照）。
【００３４】
好ましい態様に従うと、蛍光検出の能力を有する自動化熱サイクラー、例えばパーンエルマー社（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手できるパーキンエルマー７７００配列検出システムが使用される。蛍光データは、データ処理装置、例えばパーソナルコンピューターを用いて出力および処理され、必要なら種々の変換を行う。かかる自動化操作の方法および装置は熟練者には自明でありそして下記の実施例中で例示する。
実施例１
単一標的Ｑ−ＰＣＲアッセイ−３５Ｓ−ＣａＭＶプロモーターを標的とすることによる遺伝子組換えＤＮＡの検出
遺伝子組換え（ＧＭ）作物の検出は、食品生産および消費者の関心、および付随する法的問題のためにますます重要となっている。我々は、迅速なＤＮＡ抽出法を開発しそしてこれをダイズ、メイズ穀粒、および種々の加工した試料における遺伝子組換え物質の同定および／または定量するための蛍光検出を使用する均質ＰＣＲベースアッセイと組み合わせた。ＧＭ ＤＮＡの存在は、３５Ｓウイルスプロモーターを指向する一対のプライマーを用いて決定した。プライマーのこの対はフランクら（Ｆｒａｎｃｋ ｅｔ ａｌ．） により設計された。
【００３５】
これらのプライマーはＣａＭＶ ３５Ｓプロモーター配列の２０６ｂｐ断片を増幅し、これはほとんどすべての遺伝子組換え生物体内に存在し、従ってＧＭ産物に関して試料をスクリーニングするために使用される。殺虫剤として広く使用されているラウンドアップ（Ｒｏｕｎｄｕｐ） に対して耐性となるように遺伝子組換えされたダイズは、「ラウンドアップレディー」と呼ばれ、定義によりＧＭ物質を含むことを意味する。
【００３６】
以下に記載する閉管（ｃｌｏｓｅｄ ｔｕｂｅ） 均質ＰＣＲ法は、市販の検出系およびＤＮＡインターカレーション色素、ＳＹＢＲグリーン−Ｉを用いる。それぞれの熱サイクルの間に、伸長と変性段階の間の中間温度において蛍光データを採取した。特異性ＰＣＲ産物が生成すると、色素は産物中にインターカレーションしそして全蛍光シグナルは増加する。インターカレーション色素の蛍光値は、温度に逆比例する。我々は特異性アンプリコンの蛍光値の傾斜の変化をインターカレーション色素の基線傾斜と比較する。次いで、我々はアンプリコン傾斜が基線傾斜より大きい場合に、傾斜の正変化の最初の出現が起きた熱サイクルを記録する。
【００３７】
遺伝子組換え３５ＳプロモーターＤＮＡの既知レベルを有する標準（ＰＣＲあたりにゲノムの３５〜４３７５コピーの範囲）を増幅しそして蛍光シグナルをそれぞれのサイクルの後に記録した。閾曲線（ＣＴ ）の遺伝子組換え物質の割合の対数に対するプロットの線型回帰フィットに基づいて曲線を作製した。未知試料ＣＴ 値を標準曲線に対してプロットし、そして遺伝子組換え百分率を決定する。同様の技術を用いて、全ダイズＤＮＡの量が、ダイズＤＮＡのレクチンコーディング領域への増幅反応を標的することにより定量された。変性挿入物の量のダイズＤＮＡの全量に対する比が、遺伝子組換え物質の正確な百分率の算出を可能とする。
材料および方法
標準ＧＭＯキャリブレーターＤＮＡの伸長
材料（ＤＮＡ抽出）
・キアゲンＴＭ植物ＤＮイージーミニカラムキット（Ｑｉａｇｅｎ ＴＭ Ｐｌａｎｔ ＤＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｃｏｌｕｍｎ ｋｉｔ， Ｑｉａｇｅｎ Ｉｎｃ．， Ｖａｌｅｎｃｉａ， ＣＡ）
・１００％エタノール
・ＤＮＡ溶出緩衝液Ａ：３０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３５・ＧＭ−ラウンドアップレディーＴＭ保証基準物質ＩＲＭＭ４１０（乾燥ダイズ粉末）（ＧＭ−ＲＲＴＭ）（Ｆｕｌｋａ， Ｒｅｔｉｅｓｅｗｅｇ， ベルギー）
・プロテイン テクノリジーズ インターナショナル（Ｐｒｅｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｔｅｒｎａｔｕｉｎａｌ， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）からの未知試料
−Ｇ９Ｋ−ＢＱＡＰ９１（小麦粉）
−Ｇ９Ｋ−ＢＰＷ１４５（単離されたダイズタンパク質、レシチン）
−Ｅ９Ｊ−ＢＥ０１２２（単離されたダイズタンパク質）
方法
製造者の推奨を採用して、２％ＲＲＴＭダイズＧＭ−標準ＤＮＡ（未希釈、レベル１ＤＮＡキャリブレーターとして）の一つの大きいプールを抽出
・試料あたりに２％ＧＭ−ＲＲＴＭダイズタンパク質粉末の３０（±３）ｍｇ（または未知ＧＭＯ試料３０ｍｇ）を秤取し、そして１０個のミクロ遠心分離管に移す。それぞれの管に緩衝液ＡＰ１（キットと一緒に供給される）４００μｌおよびＲＮアーゼ原溶液４μｌを上記の試料に加えそして強く渦攪拌する。混合物を１０分間、６５℃、水浴中でインキュベーションする。インキュベーションの間に２−３回、管を倒立して混合させる。
・緩衝液ＡＰ２（供給）１３０μｌを混合物のそれぞれの管に添加し、混合し、そして５分間氷上でインキュベーションする。混合物を５分間、卓上型遠心分離機中、６０００ｘｇで遠心分離して凝集したタンパク質残留物をペレット化する。
・透明溶液の上層をタンパク質残留物ペレットを乱さないようにして新しい管の組に移す（試料あたりに上清約４００μｌ）。その目的は最も多くの上清体積を得ることである。一部の試料はペレット化が良くない。その場合には再び遠心分離する。
・緩衝液ＡＰ３（供給）２００μｌを上清のそれぞれの管に加える。１００％エタノール４００μｌを加えそしてピペット上下することによりおよびバイアルを渦攪拌することにより繰り返して混合させる。
・ＤＮイージーミニカラム（供給）を２ｍｌ捕集管内に入れる。混合物６５０μｌ管それぞれを適用する。１分間、６０００ｘｇ以上で遠心分離しそして流出物を廃棄する。残った試料について反復する。流出物および捕集管を廃棄する。
・ＤＮイージーカラムを新しい２ｍｌ捕集管内に入れ、緩衝液Ａｗ（供給）５００μｌをそれぞれのカラム内に加え、そして１分間、６０００ｘｇ以上で遠心分離する。流出物を廃棄し、そして捕集管を次の段階で再使用する。
・緩衝液ＡＷ５００μｌをそれぞれのカラムに加えそして２分間、最高層度で遠心分離してＤＮイージー膜を乾燥する。
・ＤＮイージーカラムを１．５ｍｌミクロ遠心分離管内に入れそして予熱（６０℃）した３０ｍＭトリス／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．３５溶出緩衝液２００μｌををそれぞれのカラム内に直接ピペットから入れる。５分間、室温でインキュベーションし次いで２分間、６０００ｘｇ以上で遠心分離してＤＮＡを溶出させる。
・溶出した参照標準ＤＮＡ試料の１０個すべてを一緒にプールする。ゲル濾過ＨＰＬＣを用いて精製されたダイズＤＮＡ濃度を定量する。
ＤＮＡ濃度を定量するためのＨＰＬＣ法
ゲル濾過ＨＰＬＣは、水性緩衝液（０．１Ｍリン酸塩／０．３Ｍ ＮａＣｌ、Ｐｈ７．０）を毎分１ｍｌの流量の移動層として行った。アッセイあたりに１０００塩基対の純粋ＤＮＡ（５〜５００ｎｇ）の既知量を注入してＤＮＡ断片濃度を定量し、次いでＤＮＡの量（ｎｇ）をＨＰＬＣピーク面積（ｍＡＵ）に対してプロットして校正曲線を作製する。この校正曲線を未知試料ＤＮＡ濃度を決定するために使用する。
・レベル１キャリブレーターとして全ＤＮＡ濃度を６ｎｇ／ｕｌに調整する。次いで、ＤＮＡ溶出緩衝液を用いて２％ＲＲＴＭＤＮＡ（Ｌ１）を連続希釈して、０．４％（１／５希釈、Ｌ２）、０．０８％（１／２５希釈、Ｌ３）、および０．０１６％ＧＭＯ（１／１２５希釈、Ｌ４）とする。
・それぞれＣａＭＶ（２、０．４、０．０８および０．０１６％）およびレクチン（１００、２０、４、および０．８％）の両方のＧＭＯ ＤＮＡ標準の同様の組を用いる。
・ダイズＤＮＡの平均的大きさが約１．１５Ｅ＋９塩基対であるというアルムガナサンら（Ａｒｕｍｕｇａｎａｔｈａｎ ｅｔ ａｌ．）による記載の文献に基づく。ゲノムダイズＤＮＡの分子量は約７．４７５Ｅ１１ドルトンである。我々はＣａＭＶおよびレクチンのＰＣＲあたりのレベル１〜４のＤＮＡコピー数、ＣａＭＶについては４３７５、８７５、１７５、および３５、そしてレクチンダイズＤＮＡについては２１２，５００、４２，５００、８５００、および１７００とそれぞれ算出した。
ＰＣＲ試薬およびプロセス
物質（ＰＣＲ試薬）
リボプリンター（Ｒ） システム（ＲｉｂｏＰｒｉｎｔｅｒ（Ｒ） Ｓｙｓｔｅｍ） 脱イオン水（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）
２５ｍＭ ｍｇＣｌ２ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）
１０Ｘ ＰＣＲ緩衝液＝１００ｍＭトリス／５００ｍＭ ＫＣｌ／０．０１％ゼラチン、ｐＨ８．３（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）
プライマー（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）
−ＣａＭＶプライマーＰ−９３：２５−マー ５’（ＣＧＡ ＡＧＧ ＡＴＡ ＧＴＧ ＧＧＡ ＴＴＧ ＴＧＣ ＧＴＣ Ａ）３’．ＣＡＭＶ１−２５−９３
−ＣａＭＶプライマーｒｃ−２９０：２５−マー５（ＡＡＧ ＧＴＧ ＧＣＴ ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＧＣＣ ＡＴＣ Ａ）３’．ＣａＭＶ１−２５−ｒｃ２９０
ＳＹＢＲグリーンＩインターカレーション色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）
ウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）
試薬タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）
１．２μＭ ＳＹＢＲグリーンＩ、４ｍｇ／タブレットＢＳＡ、４種すべてのｄ−ＮＴＰ、１．５単位ＴａｑＴＭポリメラーゼ
ハードウエア
ＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ， ＣＡ）
方法
ＰＣＲ緩衝液の２Ｘと１ｍＭ Ｍｇ＋２およびＣａＭＶプライマーの２Ｘを一緒にしてプレミックスして、２Ｘ作業濃度を得る（２０ｍＭトリス／１００ｍＭＫＣｌ／４ｍＭ ＭｇＣｌ２ ／３００ｎＭ ＣａＭＶプライマー）。この混合物２５μｌに、抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌを加える。
最終ＰＣＲ緩衝液濃度：
２５ｍＭトリス／５０ｍＭ ＫＣｌ／０．００１％ゼラチン／０．０５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
２ｍＭ Ｍｇ＋２（ＰＥ緩衝液からの寄与を含む全量）
それぞれのＣａＭＶプライマー１５０ｎＭ
定量ＰＣＲアッセイ
ＤＮＡ標準のそれぞれ５レベルの２５μｌ（３組）および未知試料抽出物をピペットで採取し、試薬タブレット１個を含むＰＣＲウエル（３組）内に入れた。抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌに、ＣａＭＶ／緩衝液混合物２５μｌを加える。
【００３８】
試料管を冷却ブロック（Ｑｕａｌｉｃｏｎ Ｉｎｃ）内に移しそして試料、試薬、およびタブレットを混合するためにＰＣＲ管を渦攪拌する。ＰＣＲ管の架台をＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）内に配置する。
ＰＣＲパラメーター構成
データ処理および分析
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する：伸長相の終わりの温度（ＴＥ ：７２℃におけるＦＥ ）、アンプリコン融解開始の前（ＴＢ１８２．５℃におけるＦＢ１）、増幅された３５Ｓ ＣａＭＶＰＣＲ産物の融解温度の開始（ＴＭＳ１ ８３．５℃におけるＦＭＳ１ ）および増幅されたＣａＭＶアンプリコンの融解温度の終において（ＴＭＥ１ ：８７．６℃におけるＦＭＥ１ ）。
【００３９】
（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った（ＦＢ１−ＦＥ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ１）から、（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）の負の値により定義されるアンプリコン３５Ｓ ＣａＭＶ融解相傾斜（ＳＭ１）への傾斜の変化を決定する。図１参照。（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。上記の段階を４０回反復して、標的開始濃度としてのＣａＭＶの３５から４３７５までのゲノムコピーの濃度範囲を決定して、標準曲線を作製する。上記の同じＤＮＡ抽出およびＰＣＲ操作を行って未知試料中のＧＭＯの開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始ＧＭＯ濃度を決定する。
結果
図１：ＣａＭＶアンプリコンの融解プロフィール、図２：ＣａＭＶに関する実時間定量ＰＣＲ、および図３：ＣａＭＶ標準校正曲線を参照。
【００４０】
試料＃ＣＯＣ−ＢＸＪ５３９（ＦＵＪＩタンパク質５４５）は、最初にサイクル３３．６５で現れ、そのＣａＭＶアンプリコン融解傾斜は基線傾斜より大きい。ＣａＭＶの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中に３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターＤＮＡの１８コピー（ｃｏｙ） を含む。
【００４１】
＃Ｍ３５−４９０（単離されたダイズタンパク質）はサイクル３０．７２で最初に現れ、そのＣａＭＶアンプリコン融解傾斜は基線傾斜および大きい。ＣａＭＶの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中に３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターＤＮＡの１２５コピーを含む。
【００４２】
＃ＮＡＨＸ−６１５０９（ダイズフレーク）はサイクル３３．３５で最初に現れ、そのＣａＭＶアンプリコン融解傾斜は基線傾斜および大きい。ＣａＭＶの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中に３５Ｓ ＣａＭＶプロモーターＤＮＡの２１コピーを含む。
文献
Ｆｒａｎｃｋ Ａ， Ｇｕｉｌｌｅｙ， Ｈ．， Ｊｏｎａｒｄ， Ｇ．， Ｒｉｃｈａｒｄｓ， Ｋ．， ａｎｄ Ｈｉｒｔｈ， Ｌ． Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ， Ｃｅｌｌ ２１（１）：２８５−２９４（１９８０）。
【００４３】
Ａｒｕｍｕｇａｎａｔｈａｎ， Ｋ． ａｎｄ Ｅａｒｌｅ， ｅ．Ｄ． （１９９１） Ｎｕｃｌｅａｒ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｓｏｍｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ， Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ ９（３）：２１１−２１５． Ｔａｂｌｅｔ Ｉ 。
実施例２
単一標的Ｑ−ＰＣＲアッセイ−内因性植物遺伝子の検出およびゲノムコピー数基準としてのこれらの使用
我々は迅速なＤＮＡ抽出法を開発しそしてこれをダイズ、メイズ穀粒、および種々の加工試料内の遺伝子組換え物質を同定および／または定量するための蛍光検出を使用する均質ＰＣＲベースアッセイと組み合わせた。遺伝子組換え物質の百分率は、３５Ｓ ＣａＭＶ ＤＮＡの存在に依存するだけでなく、全ダイズＤＮＡの何個のコピーがそれぞれの試料内に抽出されたかの決定を必要とする。大部分の緑色植物で天然の標識物質であるレクチンを対照因子として選んだ。プライマーの対は、レクチン遺伝子の１８６ｂｐ断片を増幅するように、ボドキンら（Ｖｏｄｋｉｎ ｅｔ ａｌ．） により設計された。
材料および方法
ＧＭＯ標準キャリブレーターＤＮＡの抽出
実施例Ｉ記載と同様の手順。
ＰＣＲ試薬およびプロセス
材料（ＰＣＲ試薬）
リボプリンター（Ｒ） システム脱イオン水（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）
２５ｍＭ ＭｇＣｌ２ （Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ， ＮＪ）
１０ＸＰＣＲ緩衝液＝１００ｍＭトリス／５００ｍＭ ＫＣｌ／０．０１％ゼラチン、ｐＨ８．３（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）
プライマー（Ｔｒｉｌｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）
レクチンプライマーＰ−１４２３：５’（ＣＡＡ ＣＧＡ ＡＡＡ ＣＧＡ ＧＴＣ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＣＧ ＡＧＴ）３’
レクチン−２７−１４２３
レクチンプライマーｒｃ１５５５：５’（ＴＧＧ ＴＧＧ ＡＧＧ ＣＡＴ ＣＡＴ ＡＧＧ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＡＡ）３’
レクチン−２７−ｒｃ１５５５
ＳＹＢＲグリーンＩインターカレーション色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｅｕｇｅｎｅ， ＯＲ）
ウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ， ＩＮ）
試薬タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， ＤＥ）
１．２μＭ ＳＹＢＲグリーンＩ、４ｍｇ／タブレットＢＳＡ、４種すべてのｄ−ＮＴＰ、１．５単位ＴａｑＴＭポリメラーゼ
ハードウエア
ＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ， ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ， ＣＡ）
方法
ＰＣＲ緩衝液の２Ｘと１ｍＭ Ｍｇ＋２およびレクチンプライマーの２Ｘを一緒にしてプレミックスして、２Ｘ作業濃度を得る（２０ｍＭトリス／１００ｍＭＫＣｌ／４ｍＭ ＭｇＣｌ２ ／４００ｎＭ レクチンプライマー）。この混合物２５μｌに、抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌを加える。
最終ＰＣＲ緩衝液濃度：
２５ｍＭトリス／５０ｍＭ ＫＣｌ／０．００１％ゼラチン／０．０５ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．３
２ｍＭ Ｍｇ＋２（ＰＥ緩衝液からの寄与を含む全量）
それぞれのレクチンプライマー２００ｎＭ
定量ＰＣＲアッセイ
ＤＮＡ標準のそれぞれ４レベル（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４）の２５μｌ（３組）および未知試料抽出物をピペットで採取し試薬タブレット１個を含むＰＣＲウエル（３組）内に入れた。抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌに、２Ｘレクチン／緩衝液混合物２５μｌを加える。
【００４４】
試料管を冷却ブロック（Ｑｕａｌｉｃｏｎ Ｉｎｃ）内に移しそして試料、試薬、およびタブレットを混合するためにＰＣＲ管を渦攪拌する。ＰＣＲ管の架台をＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）内に配置する。
ＰＣＲパラメーター構成
データ処理および分析
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する：伸長相の終わりの温度（ＴＥ ：７２℃におけるＦＥ ）、アンプリコン融解開始の前（ＴＢ１：８１℃におけるＦＢ１）、増幅されたレクチンＰＣＲ産物の融解温度の開始（ＴＭＳ１ ：８１℃におけるＦＭＳ１ ）および増幅されたレクチンＰＣＲ産物の融解温度の終（ＴＭＥ１ ：８３．５℃におけるＦＭＥ１ ）。図４参照
（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。上記の段階を４０回反復して、ＰＣＲごとにレクチンゲノムの１７００から２１２５００コピーまでの濃度範囲を決定して、標準曲線を作製する。上記の同じＤＮＡ抽出およびＰＣＲ操作を行って未知試料中のレクチンの開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始レクチンＤＮＡ濃度を決定する。
結果
図４：レクチンアンプリコンの融解プロフィール、および図５：レクチン標準校正曲線を参照。
【００４５】
試料＃ＣＯＣ−ＢＸＪ５３９（ＦＵＪＩタンパク質５４５）は、最初にサイクル２２．５５で現れ、そのレクチンアンプリコン融解傾斜は基線傾斜より大きい。レクチンの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中にレクチンＤＮＡの２９６８０コピーを含む。
【００４６】
実施例Ｉに基づいて、同じ試料中の３５Ｓ ＣａＭＶ含有量は２１コピーであった。ＧＭＯ含有％はＣａＭＶレベルとレクチンレベルとの比でありそしてこれは０．０７２％に等しい。
【００４７】
＃Ｍ３５−４９０（単離されたダイズタンパク質）はサイクル２２．０９で最初に現れ、そのレクチンアンプリコン融解傾斜は基線傾斜より大きい。レクチンの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中にレクチンＤＮＡの４０５１９を含む。実施例Ｉに基づいて、同じ試料中の３５Ｓ ＣａＭＶ含有量は１２５コピーであった。ＧＭＯ含有％はＣａＭＶレベルとレクチンレベルとの比でありそしてこれは０．３１％に等しい。
【００４８】
＃ＮＡＨＸ−６１５０９（ダイズフレーク）はサイクル２３．５７で最初に現れ、そのレクチンアンプリコン融解傾斜は基線傾斜より大きい。レクチンの校正曲線からの線型回帰に基づいて、試料は、その中にレクチンＤＮＡの１４８８０コピーを含む。
【００４９】
実施例Ｉに基づいて、同じ試料中の３５Ｓ ＣａＭＶ含有量は１８コピーであった。ＧＭＯ含有％はＣａＭＶレベルとレクチンレベルとの比でありそしてこれは０．１１７％に等しい。
文献
Ｖｏｄｋｉｎ， Ｌ．Ｏ．， Ｒｈｏｄｅｓ， Ｐ．Ｒ．， ａｎｄ Ｇｏｌｄｂｅｒｇ， Ｒ．Ｂ． Ｃａ ｌｅｃｔｉｎ ｇｅｎｅ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｈａｓ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ａ ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ ｅｌｅｍｅｎｔ， Ｃｅｌｌ ３４： １０２３−１０３１ （１９８３）。
実施例３
単一標的Ｑ−ＰＣＲアッセイ−細菌ＤＮＡの検出
均質定量アッセイを細菌ＤＮＡについて開発した。このアッセイは、ＤＮＡインターカレーション色素であるＳＹＢＲグリーンＩの存在下でのＰＣＲを用いる。この方法は、病原性細菌、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ） Ｏ１５７：Ｈ７の初期コピー数を反応中で定量できる。本方法は、ＰＣＲのそれぞれの熱サイクルの間のデータ採取を含む。蛍光データは、伸長および変性段階の間の中間温度で採取される。特定のＰＣＲ産物が産生されると、色素は産物内にインターカレーションし、そして全蛍光シグナルが増加する。インターカレーション色素の蛍光値は、温度に逆比例する。我々は特異性アンプリコンの蛍光値の傾斜の変化をインターカレーション色素の傾斜と比較する。次いで、我々は傾斜に正の変化が最初に現れた熱サイクルを記録し、ここでアンプリコン傾斜は基線傾斜よりも大きい。
【００５０】
蛍光がこのレベルより上に上昇したサイクルが閾サイクル（ＣＴ ）である。この値は開始標的コピー数に逆に関係する。既知濃度の標準（１．２５Ｅ＋５〜１．２５Ｅ＋１、大腸菌ゲノム／ＰＣＲ）を使用しそして濃度の対数を標準試料のＣＴ に対してプロットして標準曲線を作製する。次いで、未知試料の開始コピー数をこの標準曲線から決定する。本方法は、試験試料の開始コピー数を定量するための特異性で高感度のアッセイを提供する。
材料および方法
細胞培養
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７〔ＤＤ１９７７〕の株をＢＨＩブロス（脳心臓浸出液（Ｂｒａｉｎ ｈｅａｒｔ ｉｎｆｕｓｉｏｎ）、Ｄｉｆｃｏ， Ｄｅｔｒｏｉｔ， ＭＩ） １０ｍｌ内に接種しそして３７℃で２４時間インキュベーションした。一夜培養物の細胞カウントは、スプレッドプレート計数（ｓｐｒｅａｄ ｐｌａｔｅ ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎ）により推定した。これらの培養物は、典型的には、約１ｘ１０９ コロニー形成単位／ｍｌ（ＣＦＵ／ｍｌ）の細胞密度を生成した。
試料希釈
新しい試料をＢＨＩブロスを用いて直ちに１０倍に希釈した。最終の標的大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の細胞カウントは、それぞれほぼ１０８ 、１０７ 、１０６ 、１０５ 、１０４ 、および０ＣＦＵ／ｍｌであった。それぞれ希釈した培養物の１個の５μｌ試料を採取しそしてＰＣＲ緩衝液〔３μＭ ＳＹＢＲグリーンＩ（Ｒ） （Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｉｎｃ） 、２００ｎｇ／μｌプロナーゼ−Ｅ（Ｐｒｏｎａｓｅ−Ｅ， ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ）、５０ｍＭトリスＨＣＬ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、２８ｍＭ ＫＣＬ、０．１％トライトンＸ１００、ｐＨ８．３〕の１９５μｌを含む溶解管に移した。すべての溶解管を３７℃に設定した加熱架台に２０分間置いた。次いで溶解した試料管を９５℃加熱ブロック内に１０分間置いてプロナーゼ−Ｅを不活性化した。最後に、すべての試料をＰＣＲ増幅し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内での蛍光検出により、それぞれのＰＣＲサイクルに対する大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の種々のレベルからのＰＣＲ産物の量を決定した。ＰＣＲ試薬は、スクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．）からなり、これはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの１６０ｍＭ、プライマー５’（ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＡＧ ＣＧＡ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＣ）３’．３３−２６−ｒｃ１０１２の７２ｎＭ、プライマー５’（ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＧＡ ＡＡ）３’．３３−２６−５３８の７２ｎＭおよびＴａｑＴＭポリメラーゼの１．５単位の保証された有効濃度を含んでいた。タブレット ロット９０２９大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を試験に使用した。
定量ＰＣＲプロセス
それぞれ溶解した試料の５０μｌの２組のアリコートを採取しそしてＢＡＸ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット１個を含むＰＣＲ管内に移し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で増幅した。
【００５１】
反応は、９４℃で２分間の初期保持期間、次いで９４℃／１５秒間および７０℃／２．５３分間、次いで（ＴＥ ）７０℃、（ＴＢ１）７６．５℃／７秒間、（ＴＭＳ１ ）８２．６℃、（ＴＭＥ１ ）および８９．５℃／７秒間の３８サイクルで進行した。我々はすべてのサイクルから最後の４事象（７０℃／７秒間でのＦＥ 、７６．５℃／７秒間でのＦＢ１、８２．６℃／７秒間でのＦＭＳ１ 、８９．４℃／７秒間でのＦＭＥ１ ）から蛍光シグナルを採取した。３８サイクルが完了した後、ＰＣＲ管を分析まで２５℃で保持した。
ＰＣＲ産物分析
選択されたプライマー対Ｐ−５３８およびｒｃ−１０１２は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７を同定するために使用された４７５塩基対ＤＮＡ断片を増幅した。標的細胞を含まないものからの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の種々のレベルを含む区別試料のための閾サイクル値（ＣＴ ）の確定は、基線傾斜（ＳＢ１）からの標的ＰＣＲ産物融解相傾斜（ＳＭ１）の正の変化の最初の出現に基づいた。
【００５２】
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する：
伸長相の終わりの温度（ＴＥ ：７０℃におけるＦＥ ）、アンプリコン融解開始の前（ＴＢ１：７６．５℃におけるＦＢ１）、増幅された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ ＰＣＲ産物の融解温度の開始（ＴＭＳ１ ：８２．６℃におけるＦＭＳ１ ）および増幅された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ＰＣＲ増幅産物の融解温度の終（ＴＭＥ１ ：８９．４℃におけるＦＭＥ１ ）。
【００５３】
（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った（ＦＢ１−ＦＥ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ１）から、（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）の負の値により定義されるアンプリコン大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７融解相傾斜（ＳＭ１）への傾斜の変化を決定する。図６参照。（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。段階１）〜３）を３８回反復して、ＰＣＲごとに大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノムの１．２５Ｅ＋１から１．２５Ｅ＋５までの濃度範囲を決定して標準曲線を作製する。上記のＰＣＲプロセスにおける溶解操作を行って未知試料中の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７濃度を決定する。
結果
図６：大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンの融解プロフィール、および図７：大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７標準校正曲線を参照。
実施例４
単一標的Ｑ−ＰＣＲアッセイ−ウイルスＤＮＡの検出
細菌ＤＮＡを定量するために使用した同じ基本的方法を本実施例ではウイルスＤＮＡに適用した。
材料および方法
ＳＶ４０ウイルスＤＮＡはＣＩＢＣＯ ＢＲＬ（Ｒ） Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， ＭＤ）より購入した。これをＢＳＣ−１細胞中に増殖させたＣｓＣｌバンド付ＳＶ４０ウイルス（株７７６）から精製する。分子量は約３．５Ｅ６ドルトン（５２４３塩基対ｄｓＤＮＡ）スーパーコイル環状ＤＮＡである。ＳＶ４０ウイルスＤＮＡを本試験のＰＣＲ増幅のための鋳型として使用した。
【００５４】
原液ＳＶ４０ＤＮＡの濃度は５００ｎｇ／ｕｌであり、次いで蒸留、脱イオン水を用いて１０，０００倍に希釈して５０ｐｇ／ｕｌ作業原液とした。５０ｐｇ／ｕｌから２０、１０、４、０．８、および０．１６ｐｇ／ｕｌ（３．４４Ｅ＋６、１．７２Ｅ＋６、６．８８Ｅ＋５、１．３８Ｅ＋５および２．７５Ｅ＋４コピーＤＮＡに相当）の最終濃度へのＳＶ４０の連続希釈物をＰＣＲ反応に使用した。
【００５５】
最後に、すべての試料をＰＣＲ増幅、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で蛍光検出を行って、それぞれのＰＣＲサイクルでＳＶ４０の種々のレベルからのＰＣＲ産物の量を決定した。ＰＣＲ試薬は、スクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．）からなり、これはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの１６０ｍＭ、プライマー５’（ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＡＧ ＣＧＡ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＣ）３’．３３−２６−ｒｃ１０１２の７２ｎＭ、プライマー５’（ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＧＡ ＡＡ）３’．３３−２６−５３８の７２ｎＭおよびＴａｑＴＭポリメラーゼの１．５単位の保証された有効濃度を含んでいた。追加のＳＶ４０プライマーＰ−４１５８ ５’（ＴＴＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＡＡ ＡＧＧ ＴＡＣ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＡＧ ＣＡ）−３’の２００ｎＭおよびプライマーｒｃ−４２８９ ５’（ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＧＧ）−３’の２００ｎＭをそれぞれのＰＣＲ反応物に加えた。ロット９０２０タブレットを試験に使用した。
定量ＰＣＲプロセス
それぞれのＳＶ４０ＤＮＡ試料の５０μｌの２組のアリコートを採取しそしてスクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット１個を含むＰＣＲ管内に移し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で増幅した。反応は、９４℃で２分間最初に保持し、次いで９４℃／１５秒間および７０℃／２．５３分間、次いで（ＴＥ ）７０℃／７秒間、（ＴＢ１）７６．５℃／７秒間、（ＴＭＳ１ ）７７．５℃／７秒間、および（ＴＭＥ１ ）７９．５℃／７秒間の３８サイクルで進行した。それぞれおよびすべてのサイクルから最後の４事象（７０℃／７秒間でのＦＥ 、７６．５℃／７秒間でのＦＢ１、７７．５℃／７秒間でのＦＭＳ１ および７９．５℃／７秒間でのＦＭＥ１ ）から蛍光シグナルを採取した。３８サイクル後に完了した後、ＰＣＲ管を分析まで２５℃に保持した。
ＰＣＲ産物分析
選択されたプライマー対Ｐ−４１５８およびｒｃ−４２８９を、ＳＶ４０標的ＤＮＡを同定できるＤＮＡ断片の１３２ｂｐを増幅するために使用した。標的細胞を含まないものからのＳＶ４０の種々のレベルを含む区別試料に対する閾サイクル値（ＣＴ ）の確定は、基線傾斜（ＳＢ１）からの融解相傾斜（ＳＭ１）の正の変化の最初の出現に基づいた。
【００５６】
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する：
伸長相の終わりの温度（ＴＥ ：７０℃におけるＦＥ ）、増幅されたＳＶ４０ＰＣＲ産物の融解温度の前（ＴＢ１：７６．３℃におけるＦＢ１）、増幅されたＳＶ４０ＰＣＲ産物の融解温度の開始（ＴＭＳ１ ：７７．５℃におけるＦＭＳ１ ）および増幅されたＳＶ４０ＰＣＲ産物の融解温度の後（ＴＭＥ１ ７９．５℃におけるＦＭＥ１ ）。
【００５７】
（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った（ＦＢ１−ＦＥ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ１）から、（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）の負の値により定義されるアンプリコンＳＶ４０融解相傾斜（ＳＭ１）への傾斜の変化を決定する。図８参照。
【００５８】
（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。上記の段階を３８回反復して、ＰＣＲごとに２．７５Ｅ＋４から３．４４Ｅ＋６コピーまでの濃度範囲を決定して標準曲線を作製する。
【００５９】
未知試料中のＳＶ４０ＤＮＡ濃度におけるＳＶ４０の開始濃度を定量する。次いで、得られたサイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始ＳＶ４０ＤＮＡ濃度を決定する。
結果
図８：ＳＶ４０アンプリコンの融解プロフィール、および図９：ＳＶ４０標準校正曲線を参照。
実施例５
多重Ｑ−ＰＣＲアッセイ
本実施例は、以上に記載した２種のアッセイが両方の標的を試験するために単一反応内にどのように組合せてもよいかを示す。本方法は、実施例ＩＶのものと同様であるが、しかし本試験では試料は大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７およびＳＶ４０のための鋳型ＤＮＡを含み、従って両方の標的のためのアンプリコンが産生および測定される。
材料および方法
細胞培養大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７
それぞれのプロセスは実施例ＩＩＩと同様であり新しいカルチャーを調整およ希釈した。最終的な標的大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の細胞カウントは、それぞれほぼ１０８ 、１０７ 、１０６ 、１０５ 、１０４ 、および０ＣＦＵ／ｍｌであった。細胞溶解プロセスは、実施例ＩＩＩと同様であった。
【００６０】
ＳＶ４０ウイルスＤＮＡを大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７細胞溶解物内にスパイクした。
【００６１】
実施例ＶＩと同様のＳＶ４０ ＤＮＡを本試験に使用した。５０ｐｇ／ｕｌから２０、１０、４、０．８、０．１６および０ｐｇ／５０ｕｌのＳＶ４０の連続希釈物をそれぞれ０、１０４ 、１０５ 、１０６ 、１０７ 、および１０８ ＣＦＵ／ｍｌのレベルの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７内にそれぞれスパイクした。最後に、すべての試料をＰＣＲ増幅し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で蛍光検出を行って、それぞれのＰＣＲサイクルでの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の種々のレベルからのＰＣＲ産物の量を決定した。ＰＣＲ反応あたりの最終の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７およびＳＶ４０ ＤＮＡ濃度は、それぞれ１．２５Ｅ＋５大腸菌ゲノム／０ＳＶ４０、１．２５Ｅ＋４大腸菌ゲノム／２．７５Ｅ＋４コピーＳＶ４０、１．２５Ｅ＋３大腸菌ゲノム／１．３８Ｅ＋５コピーＳＶ４０、１．２５Ｅ＋２大腸菌ゲノム／６．８８Ｅ＋５コピーＳＶ４０、１．２５Ｅ＋１大腸菌ゲノム／１．７２Ｅ＋６コピーＳＶ４０、およびスパイクしない大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノム／３．４４Ｅ＋６コピーＳＶ４０ＤＮＡであった。
ＰＣＲ試薬
ＰＣＲ試薬は、スクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレット（Ｑｕａｌｉｃｏｎ， Ｉｎｃ．）からなり、これはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの１６０ｍＭ、プライマー５’（ＴＡＣ ＣＴＧ ＡＧＧ ＣＡＧ ＴＡＧ ＣＧＡ ＴＡＡ ＴＧＡ ＧＣ）３’．３３−２６−ｒｃ１０１２の７２ｎＭ、プライマー５’（ＡＴＧ ＣＡＧ ＡＣＣ ＣＧＣ ＴＧＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＧＡ ＡＡ）３’．３３−２６−５３８の７２ｎＭおよびＴａｑＴＭポリメラーゼの１．５単位の保証された有効濃度を含んでいた。追加のＳＶ４０プライマーＰ−４１５８ ５’（ＴＴＡ ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＡＡ ＡＧＧ ＴＡＣ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＴＴ ＧＡＧ ＣＡ）−３’の２００ｎＭおよびプライマーｒｃ−４２８９ ５’（ＡＡＡ ＡＧＣ ＴＧＣ ＡＣＴ ＧＣＴ ＡＴＡ ＣＡＡ ＧＡＡ ＡＡＴ ＴＡＴ ＧＧ）−３’の２００ｎＭをＰＣＲ反応物に加えた。ロット９０２９タブレットを本試験に使用した。これは実施例ＩＶで使用したＰＣＲ試薬組成と同様である。
定量ＰＣＲプロセス
それぞれ溶解したＳＶ４０スパイク試料の５０μｌの２組のアリコートを採取しそして１個のスクリーニングのためのＢＡＸ（Ｒ） ／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７タブレットを含むＰＣＲ管内に移し、次いでＰＥ／ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７７００配列検出システム内で増幅した。反応は、９４℃で２分間の初期保持期、次いで９４℃／８秒間および７０℃／２．５３分間、次いで（ＴＥ ）７０℃／７秒間、（ＴＢ１）７３．５℃／７秒間、および（ＴＭＳ１ ）７７．５℃／７秒間、（ＴＭＥ１ ）７８．９℃／７秒間、（ＴＢ２）８３℃／７秒間、および（ＴＭＥ２ ）８９．４℃／７秒間の３８サイクルで進行した。我々はそれぞれおよびすべてのサイクルから最後の６事象（７０℃／７秒間でのＦＥ 、７３．５℃／７秒間でのＦＢ１、７７．５℃／７秒間でのＦＭＳ１ 、７８．９℃／７秒間でのＦＭＥ１ 、８３℃／７秒間でのＦＢ２／ＦＭＳ２ 、および８９．４℃／７秒間でのＦＭＥ２ ）から蛍光シグナルを採取した。この場合に、ＦＢ２はＦＭＳ２ と同様であった。３８サイクルが完了した後、ＰＣＲ管を分析まで２５℃に保持した。
ＰＣＲ産物分析
標的細胞を含まないものからのＳＶ４０の種々のレベルを含む区別試料に対する閾サイクル（ＣＴ ）値の確定は、基線傾斜（ＳＢ１）からのＳＶ４０アンプリコン融解相傾斜（ＳＭ１）の正の変化および基線傾斜（ＳＢ２）からの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコン融解相傾斜（ＳＭ２）の正の変化の最初の出現に基づいた。
【００６２】
別に、（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った（ＦＢ１−ＦＥ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ１）から、（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）の負の値により定義される融解相傾斜（ＳＭ１）へのＳＶ４０アンプリコンに対する傾斜の変化を決定する。図１０参照。
【００６３】
（ＴＢ２−ＴＭＥ１ ）で割った（ＦＢ２−ＦＭＥ１ ）の負の値により定義される基線傾斜（ＳＢ２）から、（ＴＭＥ２ −ＴＭＳ２ ）で割った（ＦＭＥ２ −ＦＭＳ２ ）の負の値により定義されるアンプリコン融解相傾斜（ＳＭ２）への大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンに対する傾斜の変化を決定する。図１０参照。
【００６４】
別に、（ＳＭ１−ＳＢ１）がゼロより大きくなる、ＳＶ４０アンプリコンに対する傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。濃度２．７５Ｅ＋４コピーから３．４４Ｅ＋６コピーＳＶ４０ ＤＮＡの範囲について段階１）〜３）を３８回反復して、標準曲線を作製する。
【００６５】
上記のＰＣＲプロセスにおける溶解を行って未知試料内のＳＶ４０の開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始ＳＶ４０コピー数を決定する。
【００６６】
（ＳＭ２−ＳＢ２）がゼロより大きくなる、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンに対する傾斜の正変化が最初に現れる熱サイクルを記録する。
【００６７】
濃度１．２５Ｅ＋１コピーから１．２５Ｅ＋５大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７ゲノム／ＰＣＲの範囲について上記の段階を３８回反復して、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７標準曲線を作製する。
【００６８】
上記のＰＣＲプロセスにおける溶解を行って未知試料中の大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７コピー数を決定する。
結果
図１０：ＳＶ４０／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンの融解プロフィール、および図１１：ＳＶ４０／大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７標準校正曲線を参照。
実施例６
単一標的定量ＰＣＲアッセイ：追加閾決定
上記の実施例Ｉ〜ＩＶでは、インターカレーション色素の基線の傾斜に対する特異性アンプリコンの蛍光値の傾斜の変化を比較している。閾サイクルは、基線傾斜に対して、アンプリコン傾斜における最初の正の変化が検出されたサイクルとして定義される。ＰＣＲ反応における特異性アンプリコンの最初の出現の閾を決定するための他の方法もある。最初の１０回のＰＣＲサイクルにおいては標的アンプリコンの検出可能な産生がないと推定できる。従って、閾蛍光値は、最初の１０回の蛍光値を平均しそしてこの蛍光値の標準偏差の１５倍を加えてて算出できる。この方法には幾つかの欠点がある。第一に、多数のアンプリコンは類似した開始融解温度を有するので、標的ＤＮＡへの特異性が低い。これは単一標的ＰＣＲ定量にのみ適用できる。これは装置毎の変動、およびＰＣＲ性能におけるウエル毎の変動により影響を受けるので、実施例１〜４で使用した方法よりも再現性が低い。これは基線シグナルをシフトするアッセイにおける蛍光色素濃度にも依存する。
【００６９】
ＣａＭＶウイルスプロモーターを用いる例で本方法を説明する。特異性アンプリコン蛍光シグナルは、すべてのサイクルの融解の前および完全変性の後に測定された。初期のＰＣＲサイクルの間には検出可能な増幅産物蛍光シグナルがないであろう。閾は最初の１０回のサイクルの蛍光値の平均変化に１０個の蛍光値の標準偏差の１５倍を加えて決定される（ＦＥ−１０ ａｖｅ ＋１５ＸＳＤ）。閾サイクルは、試料の蛍光がＦＥ−１０ ａｖｅ ＋１５ＸＳＤを越えるサイクルとして定義される。出発物質内の標的核酸の未知濃度の定量は、これらの閾サイクル（Ｃｔ）を既知濃度の対照から生成したＣｔの標準曲線と比較して外挿できる。
材料および方法
実施例Ｉと同様−既知濃度を有するＣａＭＶ ３５ＳウイルスＤＮＡ。
ＰＣＲ試薬およびプロセス
実施例Ｉと同様
定量ＰＣＲアッセイ
ＤＮＡ標準の５レベルのそれぞれ２５μｌ（３組）および未知試料抽出物をピペットで採取し試薬タブレット１個を含むＰＣＲウエル（３組）内に入れた。抽出したＤＮＡのそれぞれの試料２５μｌに、ＣＡＭＶ／緩衝液混合物２５μｌを加えた。
【００７０】
試料管を冷却ブロック（Ｑｕａｌｉｃｏｎ Ｉｎｃ）内に置きそして試料，試薬、およびタブレットを混合するためにＰＣＲ管を渦攪拌した。ＰＣＲ管の架台をＰＥ／ＡＢＩ７７００配列検出システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）内に配置する。
ＰＣＲパラメーター構成
【００７１】
ＴＭＳ：すべてのｄｓＤＮＡについて全融解温度のＰＣＲ反応中の温度。
【００７２】
ＴＭＴ：アンプリコンについて融解温度の開始のＰＣＲ反応中の温度。
データ処理および分析
それぞれの増幅サイクルの間にビームにより励起された蛍光を測定する。
【００７３】
・増幅された３５Ｓ ＣａＭＶ ＰＣＲ産物が融解を開始する温度において（ＴＭＳ：８２℃におけるＦＭＳ）および
・増幅された３５Ｓ ＣａＭＶアンプリコンの全融解温度の後（ＴＭＴ：９４℃におけるＦＭ ）。
【００７４】
ＦＭＴをＦＭＳから差し引いて、それぞれのＰＣＲサイクルのＦＭＴからＦＭＳへの蛍光シグナルの変化を決定する。図１４参照。値が閾値より大きくなった正値の最初の出現の熱サイクルを記録する。３５Ｓ ＣａＭＶゲノム／ＰＣＲの３５〜４３７５コピーの濃度の範囲を決定する上記の段階を４０回反復して、標準曲線を作製する。図１５参照。
【００７５】
上記と同じＤＮＡ抽出およびＰＣＲプロセスを行って未知試料内のＣａＭＶ３５ＳプロモーターＤＮＡの開始濃度を定量する。次いで、得られた熱サイクル数を標準曲線と比較して未知試料中の開始濃度を決定する。
結果
図１４：ＣａＭＶアンプリコンの融解プロフィールおよびシグナル決定、図１５：ＣａＭＶの実時間定量ＰＣＲ。
［配列表の簡単な説明］
配列番号１は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５ＳＣａＭＶ）のプロモーター領域の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号２に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号９に示す断片が産生される。
【００７６】
配列番号２は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（３５ＳＣａＭＶ）のプロモーター領域の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号１に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号９に示す断片が産生される。
【００７７】
配列番号３は、ダイズレクチン遺伝子Ｌｅ−１の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号４に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１０に示す断片が産生される。
【００７８】
配列番号４は、ダイズレクチン遺伝子Ｌｅ−１の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号３に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１０に示す断片が産生される。
【００７９】
配列番号５は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７にユニークなゲノムの一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号６に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１１に示す断片が産生される。
【００８０】
配列番号６は、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７にユニークなゲノムの一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号５に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１１に示す断片が産生される。
【００８１】
配列番号７は、ＳＶ−４０からのラージ−Ｔ抗原の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号８に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１２に示す断片が産生される。
【００８２】
配列番号８は、ＳＶ−４０からのラージ−Ｔ抗原の一部分をコードする合成オリゴヌクレオチドの配列である。配列番号７に示すオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ反応に使用すると、配列番号１２に示す断片が産生される。
【００８３】
配列番号９は、配列番号１および２で示されたプライマーにより増幅された３５−Ｓ ＣａＭＶプロモーター領域のヌクレオチド配列部分である。この断片は、８３〜８７．５℃の融解温度を有する。
【００８４】
配列番号１０は、配列番号３および４で示されたプライマーにより増幅されたダイズレクチン遺伝子ＬＥ−１のヌクレオチド配列部分である。この断片は、８１．５〜８３．５℃の融解温度を有する。
【００８５】
配列番号１１は、配列番号５および６で示されたプライマーにより増幅された大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７からのユニークなゲノム座のヌクレオチド配列部分である。この断片は、８２．６〜８９℃の融解温度を有する。
【００８６】
配列番号１２は、配列番号７および８で示されたプライマーにより増幅されたＳＶ４０ラージ−Ｔ抗原のヌクレオチド配列部分である。この断片は、７７〜７９℃の融解温度を有する。
【図面の簡単な説明】
【図１】
ＣａＭＶプロモーターの断片の融解プロフィールであって、温度と相対蛍光強度との関係、および基線傾斜（ＳＢ ）およびアンプリコン傾斜（ＳＭ ）を示す。
【図２】
図１中のアンプリコンの実時間定量ＰＣＲ増幅であって、温度と開始濃度との関係およびデルタ傾斜差（ＳＭ −ＳＢ ）との関係を示す。
【図３】
図１のアンプリコンの標準曲線であって、開始標的濃度の対数とＰＣＲ中の閾サイクル数との間の関係を示す。
【図４】
レクチンアンプリコンの融解プロフィールであって、温度と相対蛍光強度との関係および基線傾斜（ＳＢ ）およびアンプリコン傾斜（ＳＭ ）を示す。
【図５】
図３のアンプリコンの標準曲線であって、開始標的濃度の対数とＰＣＲ中の閾サイクル数との間の関係を示す。
【図６】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンの融解プロフィールであって、温度と相対蛍光強度との関係、および基線傾斜（ＳＢ ）およびアンプリコン傾斜（ＳＭ ）を示す。
【図７】
図６中のアンプリコンの実時間定量ＰＣＲ増幅であって、温度と開始濃度との関係およびデルタ傾斜差（ＳＭ −ＳＢ ）との関係を示す。
【図８】
図６のアンプリコンの標準曲線であって、開始標的濃度の対数とＰＣＲ中の閾サイクル数との間の関係を示す。
【図９】
ＳＶ４０アンプリコンの融解プロフィールであって、温度と相対蛍光強度との関係および基線傾斜（ＳＢ ）およびアンプリコン傾斜（ＳＭ ）を示す。
【図１０】
図９のアンプリコンの標準曲線であって、開始標的濃度の対数とＰＣＲ中の閾サイクル数との間の関係を示す。
【図１１】
大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７およびＳＶ４０アンプリコン両方の混合物の融解プロフィール。混合および傾斜決定。
【図１２】
多重Ｑ−ＰＣＲアッセイからのＳＶ４０アンプリコンの標準曲線。
【図１３】
多重Ｑ−ＰＣＲアッセイからの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７アンプリコンの標準曲線。
【図１４】
３５Ｓ ＣａＭＶ融解プロフィールおよびシグナル決定。本図は、温度と特異性ＣａＭＶ増幅産物の相対蛍光強度との関係を示し、そしてアンプリコンシグナルと背景蛍光との間の差も示す。
【図１５】
ＣａＭＶの実時間定量ＰＣＲ反応。本図は、閾値を設定するための平均基線の使用を示し、そしてＣａＭＶ試料のそれぞれの濃度の熱サイクルの数と蛍光シグナル差（特異性−背景）の間の関係を示す。
【図１６】
アンプリコンの閾サイクルの決定。初期蛍光（ＦＩ ）および背景閾蛍光（ＦＢ ）を定義するために使用したサイクルを示す。閾サイクル（ＣＴ ）は、アンプリコン産生およびＦＢ の関数として決定できる。
Claims (10)
- 標的核酸分子の融解が温度ＴＭＳで開始しそして温度ＴＭＥで完了する、試料内の標的核酸分子の量を実時間で検出するための方法であって、
Ａ．ｉ）適当な蛍光色素の存在下で、既知の開始濃度（Ｃ）で、変性、アニーリング、および連鎖伸長サイクルを介して標的核酸分子をＰＣＲ増幅し、ここで、色素が二本鎖核酸分子と結合すると蛍光が増加し、ここで連鎖伸長は連鎖伸長温度ＴＥ で起き；
ｉｉ）蛍光（Ｆ）を、それぞれの増幅サイクルの間に、温度がＴＥ から上昇を開始する直前の温度において（ＴＥ におけるＦＥ ）、ＴＥ とＴＭＳとの間のいずれかの温度点（ＴＢ ）において（ＴＢ におけるＦＢ ）、ＴＭＳにおいて（ＴＭＳにおけるＦＭＳ）およびＴＭＥにおいて（ＴＭＥにおけるＦＭＥ）測定し；
ｉｉｉ）（ＴＢ −ＴＥ ）で割った−（ＦＢ −ＦＥ ）により定義される基線傾斜（ＳＢ ）、および（ＴＭＥ−ＴＭＳ）で割った−（ＦＭＥ−ＦＭＳ）により定義されるアンプリコン融解相傾斜（ＳＭ ）を算出し；
ｉｖ）量（ＳＭ −ＳＢ ）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ）を記録し；
ｖ）関係する濃度の適当な範囲内で段階ｉ）からｖ）までを反復し、そして
ｖｉ）標的核酸配列のための標準曲線を得るためにＣをＣＴ に対してプロットする；
ことにより標準曲線を確定し、そして
Ｂ．標的核酸分子の未知濃度を含む試料について段階（Ａ）（ｉ）から（Ａ）（ｖ）までを反復して試料についてのＣＴ 値を得て、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定する
ことを含んでなる方法。 - 試料が第一標的核酸分子および第二標的核酸分子を含み、ここで第一標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ１ で開始しそしてＴＭＥ１ で完了し、第二標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ２ で開始しそしてＴＭＥ２ で完了し、そしてここでＴＭＳ２ はＴＭＥ１ より高く、
Ａ．ｉ）適当な蛍光色素の存在下で、既知の開始濃度（Ｃ１ およびＣ２ ）で、変性、アニーリング、および連鎖伸長サイクルを介して標的核酸分子を同時ＰＣＲ増幅し、ここで、色素が二本鎖核酸分子と結合すると蛍光が増加し、ここで連鎖伸長は連鎖伸長温度ＴＥ で起き；
ｉｉ）蛍光（Ｆ）を、それぞれの増幅サイクルの間に、温度がＴＥ から上昇を開始する直前の温度において（ＴＥ におけるＦＥ ）、ＴＥ とＴＭＳ１ との間のなんらかの温度点（ＴＢ１）において（ＴＢ１におけるＦＢ１）、ＴＭＳ１ において（ＴＭＳ１ におけるＦＭＳ１ ）、ＴＭＥ１ において（ＴＭＥ１ におけるＦＭＥ１ ）、ＴＭＥ１ とＴＭＳ２ との間のいずれかの時点（ＴＢ２）において（ＴＢ２におけるＦＢ２）、ＴＭＳ２ において（ＴＭＳ２ におけるＦＭＳ２ ）ＴＭＥ２ において（ＴＭＥ２ におけるＦＭＥ２ ）測定し；
ｉｉｉ）（ＴＢ１−ＴＥ ）で割った−（ＦＢ１−ＦＥ ）により定義される第一標的分子の基線傾斜（ＳＢ１）、および（ＴＭＥ１ −ＴＭＳ１ ）で割った−（ＦＭＥ１ −ＦＭＳ１ ）により定義される第一分子の第一アンプリコン融解相傾斜（ＳＭ１）を算出し；そして（ＴＢ２−ＴＭＥ１ ）で割った−（ＦＢ２−ＦＭＥ１ ）により定義される第二標的分子の基線傾斜（ＳＢ２）、および（ＴＭＥ２ −ＴＭＳ２ ）で割った−（ＦＭＥ２ −ＦＭＳ２ ）により定義される第一分子の融解相傾斜（ＳＭ２）を算出し；
ｉｖ）量（ＳＭ１−ＳＢ１）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ１ ）を記録し；そして量（ＳＭ２−ＳＢ２）が最初に０より大きくなるために必要なＰＣＲサイクルの数（Ｎ２ ）を記録し；
ｖ）２種の標的分子それぞれについての関係する濃度の適当な範囲内で段階ｉ）からｖ）までを反復し、そして
ｖｉ）第一標的分子のための標準曲線を得るためにＣ１ をＮ１ に対してプロットし；そして第二標的分子のための標準曲線を得るためにＣ２ をＮ２ に対してプロットする；
ことにより標的核酸分子のそれぞれのための標準曲線を確定し、そして
Ｂ．第一および第二標的核酸分子の未知濃度を含む試料について段階（Ａ）（ｉ）から（Ａ）（ｖ）までを反復して試料についてのＮ１ 値およびＮ２ 値を入手し、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定する
ことを含んでなる、請求項１記載の方法。 - 試料が、第一標的核酸分子、第二標的核酸分子および第三標的核酸分子を含み、ここで第一標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ１ で開始しそして温度ＴＭＥ１ で完了し、第二標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ２ で開始しそして温度ＴＭＥ２ で完了しそして第三標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ３ で開始しそして温度ＴＭＥ３ で完了し、そしてここでＴＭＳ３ はＴＭＥ２ より高く、
Ａ．請求項１記載の方法に従って標的核酸分子のそれぞれのための標準曲線を確定し；
Ｂ．標的核酸分子の未知濃度を含む試料を同時ＰＣＲ増幅して、試料についてのＮ１ 、Ｎ２ およびＮ３ 値を得て、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定することを含んでなる、請求項１記載の方法。 - 試料がｎ種の標的核酸分子を含み、ここでｎは３より大きい整数であり、ここで、第一標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ１ で開始しそして温度ＴＭＥ１ で完了し、第二標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ２ で開始しそして温度ＴＭＥ２ で完了し、第（ｎ−１）標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳ（ｎ−１） で開始しそして温度ＴＭＥ（ｎ−１） で完了し、第ｎ標的核酸分子の融解は温度ＴＭＳｎ で開始しそして温度ＴＭＥｎ で完了し、そしてここでＴＭＳｎ はＴＭＥ（ｎ−１） より高く、
Ａ．請求項１記載の方法に従って標的核酸分子のそれぞれのための標準曲線を確定し；
Ｂ．標的核酸分子の未知濃度を含む試料を同時ＰＣＲ増幅して、試料についてのＮ１ 、Ｎ２ ．．．およびＮｎ 値を得て、そして標準曲線を介して標的核酸分子濃度を決定することを含んでなる、請求項１記載の方法。 - 第一および第二標的核酸分子が生物体の同じゲノム上に存在し、そしてここで第一標的核酸分子のゲノムあたりのコピー数が既知であり、それにより第二標的核酸分子のゲノムあたりのコピー数を決定する、請求項２記載の方法。
- 標的核酸分子が病原性生物体由来である、請求項１記載の方法。
- 第一標的核酸がインベルターゼ遺伝子、アルドラーゼ遺伝子またはレクチン遺伝子であり、そしてここで第二標的核酸が、３５Ｓ ＣａＭＶプロモーター、Ｃｒｙ９Ｃ遺伝子、ＧＡ２１遺伝子、ＥＰＳＰＳ（５−エノールピルビルシキマート−３−リン酸合成酵素遺伝子、ＰＥＰＣプロモーター；Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）遺伝子のｈｓｐ７０プロモーター、Ｃｒｙ１Ａ（ｂ）遺伝子；ＮＯＳ遺伝子、およびアクチンプロモーター遺伝子よりなる群より選ばれる、請求項２記載の方法。
- 標的核酸分子が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号９、および配列番号１０よりなる群より選ばれる、請求項１記載の方法。
- 標的核酸分子が、遺伝子組換え生物体内に含まれる導入遺伝子の部分である核酸断片である請求項１記載の方法。標的核酸分子が導入遺伝子のプロモーターを含んでなる、請求項９記載の方法。
- プロモーターがカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターである、請求項１０記載の方法。
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Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| WO2009064717A2 (en) * | 2007-11-14 | 2009-05-22 | Talecris Biotherapeutics, Inc. | Method for adjusting results of a polymerase chain reaction (pcr) instrument |
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Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10227649B2 (en) | 2003-01-24 | 2019-03-12 | University Of Utah Research Foundation | Methods of predicting mortality risk by determining telomere length |
| US11193169B2 (en) | 2003-01-24 | 2021-12-07 | University Of Utah Research Foundation | Methods of predicting mortality risk by determining telomere length |
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