CN109689889A - 用于进行多重pcr的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了使用标记的水解探针进行更高的多重PCR以检测和定量靶核酸的方法。

Description

用于进行多重PCR的方法
发明领域
本发明涉及聚合酶链式反应(PCR)的方法，特别涉及进行多重PCR的方法。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)已成为生物医学研究，疾病监测和诊断的普遍工具。通过PCR扩增核酸序列描述于美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188中。PCR现在是本领域众所周知的并且已在科学文献中广泛描述。参见PCR Applications, ((1999) Innis等人编辑，Academic Press, San Diego)；PCR Strategies, ((1995) Innis等人编辑，Academic Press, San Diego)；PCR Protocols, ((1990) Innis等人编辑，AcademicPress, San Diego)，和PCR Technology, ((1989) Erlich编辑，Stockton Press, NewYork)。
“实时”PCR测定能够同时扩增和检测并定量靶序列的起始量。典型实时PCR方案涉及使用对每种靶序列特异性的标记探针。探针优选用一个或多个荧光部分标记，所述荧光部分吸收并发射特定波长的光。在与靶序列或其扩增子杂交后，探针由于探针杂交或水解而表现出可检测的荧光发射变化。
然而，PCR测定的主要挑战仍然是分析单个管中的多种靶标的能力。在几乎每个医学和诊断领域，目标基因座数量迅速增加。例如，在法医DNA概况分析，病原微生物检测，多基因座遗传疾病筛查和多基因表达研究(仅举几例)中，必须分析多个基因座。
使用大多数现有方法，多重测定的能力受到检测仪器的限制。具体地，在相同反应中使用多个探针需要使用不同的荧光标记。为了同时检测多个探针，仪器必须能够区分每个探针发出的光信号。市场上的大多数现有技术不允许在同一反应容器中检测超过四到七个单独的波长。因此，每种靶标使用一个独特标记的探针，在同一个容器中可以检测到不超过四到七个单独的靶标。在实践中，至少一种靶标通常是对照核酸。因此，在实践中，在同一管中可以检测到不超过三到六个实验靶标。由于光谱宽度，荧光染料的使用也受到限制，其中在可见光谱内仅可容纳约六或七种染料而没有显著的重叠干涉。因此，除非进行扩增和检测策略的根本改变，否则多重测定的能力将不能跟上临床需要。
通过PCR后解链测定提供了使扩增反应多重化的额外能力。参见2006年6月23日提交的美国专利申请序列号11/474,071。在解链测定中，扩增的核酸通过其独特的解链曲线来鉴定。解链测定包括测定双链靶标或标记的探针和靶标之间的双链体的解链温度(解链点)。如美国专利号5,871,908中所述，为了使用荧光标记的探针确定解链温度，在温度受控程序中逐渐加热(或冷却)靶核酸和探针之间的双链体。双链体的解离改变了相互作用的荧光团之间或荧光团与猝灭剂之间的距离。相互作用的荧光团可以与分开的探针分子缀合，如美国专利号6,174,670中所述。或者，一个荧光团可以与探针缀合，而另一个荧光团可以插入核酸双链体中，如美国专利号5,871,908中所述。作为又另一种替代方案，荧光团可以与单个探针寡核苷酸缀合。在双链体解链后，荧光被猝灭，因为荧光团与猝灭剂在现在的单链探针中聚集在一起。
通过测量相关的荧光变化来监测核酸双链体的解链。荧光的变化可以在称为“解链曲线”的图上表示。因为不同的探针-靶标双链体可以设计成在不同温度下解链(或再退火)，每个探针将产生独特的解链曲线。正确设计的探针将具有与同一测定中其他探针的解链温度明显不同的解链温度。许多现有的软件工具使人们能够在考虑这些目标的情况下设计用于同管多重测定的探针。例如，Visual OMPTM软件(DNA Software, Inc., Ann Arbor,Mich)使人们能够确定核酸双链体在各种反应条件下的解链温度。
美国专利号6,472,156中描述了使用颜色检测和随后的扩增后解链测定的多重PCR方法。通过这种方法可检测的靶标的数量是可检测波长的数量和可区分的解链曲线的数量的乘积。因此，在颜色检测中添加解链测定是检测多种靶标的能力的一个进步。
扩增后解链测定最常用于定性目的，即鉴定靶核酸，参见美国专利号6,174,670、6,427,156和5,871,908。已知通过计算解链曲线函数的导数来获得解链峰。Ririe等人(“Product differentiation by analysis of DNA melting curves during thepolymerase chain reaction,”(1997) Anal. Biochem. 245:154-160)观察到计算导数有助于分辨由产物混合物产生的解链曲线。计算导数后，由混合物的每种组分产生的解链峰变得容易区分。此前还已知，扩增后的解链信号(即解链峰)，与样品中核酸的量成比例地更高。例如，美国专利号6,245,514教导了使用双链体-插入染料的扩增后解链测定，以产生导数解链峰，并且随后使用专用软件，计算峰的积分。积分提供了关于扩增效率和扩增核酸的相对量的信息。
在实践中，期望超越定性测定并且能够定量同一样品中的多种靶标。参见例如Sparano等人,“Development of the 21-gene assay and its application in clinicalpractice and clinical trials,” J. Clin. Oncol. (2008) 26(5):721-728。定量靶标量的能力在临床应用中是有用的，诸如测定患者血清中的病毒载量，测量响应药物疗法的基因表达水平或确定肿瘤的分子特征以预测其对疗法的反应。
许多用于检测靶核酸的方法是已知的。目前可用于核酸检测的均相测定包括TaqMan®，Ampliflour®，染料结合，等位基因选择性动力学PCR和Scorpion®引物测定。由于对每种待检测的靶核酸需要不同的染料，这些测定程序不容易多重化，并且因此在其改善潜力方面有限。为了克服这种局限性，几项近期研究已公开了含有可切割的“标签”部分的寡核苷酸探针的应用，所述可切割的“标签”部分可以被容易地分离和检测(例如参见Chenna等人，美国专利申请公开号2005/0053939；Van Den Boom，美国专利号8,133,701)。最近，美国专利申请公开号2014/0272955，U.S. 2015/0176075和U.S. 2015/0376681中已描述了通过使用基于结构的寡核苷酸探针切割进行多重核酸靶标鉴定的改进方法。Chun等人已经在美国专利号8,809,239中描述了通过在所谓的PTO切割和延伸测定中，使用“探测和标记寡核苷酸”(PTO)和“捕获和模板化寡核苷酸”(CTO)的组合，检测来自DNA或核酸混合物的靶核酸序列的其他方法。然而，仍然需要进行靶核酸的高通量多重检测的准确方法。在终点PCR测定中进行靶核酸的高通量多重检测，将是一个特别的优势，由此扩增产物的检测仅需要在PCR测定结束(或接近结束)时或在PCR测定完成后发生一次。
发明概述
本发明提供了用于核酸序列检测、特别是多种靶核酸的检测，其中运行PCR反应直到其达到超出扩增对数期的终点(例如，在平台期)。所述方法通过使用具有两个独特特征(即，非互补标签部分和猝灭分子)的新型寡核苷酸探针来进行。
因此，在一个方面，本发明提供了用于扩增和检测样品中的靶核酸的方法，其包括以下步骤：(a)使含有靶核酸的样品在单个反应容器中与以下接触：(i)一对寡核苷酸引物，每个寡核苷酸引物能够与靶核酸的子序列的相反链杂交；(ii)寡核苷酸探针，其包含退火部分和标签部分，其中所述标签部分包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列或非核苷酸分子，其中所述退火部分包含与靶核酸序列至少部分互补的核苷酸序列，并杂交至由所述对寡核苷酸引物界定的靶核酸的子序列的区域，其中所述探针还包含相互作用的双重标记，其包含位于标签部分上或退火部分上的报告子部分和位于退火部分上的第一猝灭剂部分，并且其中通过核酸酶敏感的切割位点将报告子部分与第一猝灭剂部分分离；且其中所述标签部分以温度依赖性方式可逆地结合至猝灭分子，所述猝灭分子包含一个或多个猝灭剂部分或与一个或多个猝灭剂部分结合，当猝灭分子与标签部分结合时，所述猝灭剂部分能够猝灭报告子部分；(b)使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶，通过PCR扩增靶核酸，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，聚合酶的核酸酶活性允许从探针的退火部分上的第一猝灭部分切割和分离报告子部分；(c)在猝灭分子与标签部分结合的第一温度下测量来自报告子部分的一个或多个信号；(d)在高于第一温度的第二温度下测量来自报告子部分的一个或多个信号，在所述第二温度下猝灭分子不与标签部分结合；(e)通过从在第二温度下检测到的一个或多个信号的中值或平均值减去在第一温度下检测到的一个或多个信号的中值或平均值，获得计算信号值；由此，高于阈信号值的计算信号值允许确定靶核酸的存在。在一个实施方式中，允许PCR扩增达到超出扩增对数期的终点(例如在平台期)。
在一个实施方案中，所述标签部分包含修饰，使得其不能被核酸聚合酶延伸。在一个实施方案中，所述报告子部分位于寡核苷酸探针的标签部分上。在另一个实施方案中，所述报告子部分位于寡核苷酸探针的退火部分上，并且能够以温度依赖性方式与包含第二猝灭剂部分的猝灭分子相互作用。在一个实施方案中，所述标签部分包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列，并且猝灭分子是包含与寡核苷酸探针的标签部分至少部分互补的核苷酸序列的寡核苷酸，并通过杂交与标签部分结合。在另一个实施方案中，寡核苷酸探针的标签部分或猝灭分子或所述标签部分和猝灭分子两者含有一种或多种核苷酸修饰。在又另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸修饰选自锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，桥连核酸(BNA)，2'-O烷基取代，L-对映体核苷酸，或其组合。在一个实施方案中，报告子部分是荧光染料，并且猝灭剂部分猝灭来自荧光染料的可检测信号。
另一方面，本发明提供了检测样品中的两种或更多种靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：(a)使怀疑含有两种或更多种靶核酸序列的样品在单个反应容器中与以下接触：(i)第一对寡核苷酸引物和第二对寡核苷酸引物，所述第一对寡核苷酸引物具有与第一靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列，且所述第二对寡核苷酸引物具有与第二靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列；(ii)第一寡核苷酸探针，其包含与第一靶核酸序列至少部分互补的核苷酸序列，并在由第一对寡核苷酸引物界定的第一靶核酸序列内退火，其中第一寡核苷酸探针包含能够产生可检测信号的荧光部分和能够猝灭由荧光部分产生的可检测信号的第一猝灭剂部分，其中通过核酸酶敏感的切割位点将荧光部分与第一猝灭剂部分分离；(iii)第二寡核苷酸探针，其包含两个不同部分：退火部分和标签部分，所述退火部分包含与第二靶核酸序列至少部分互补的核苷酸序列，并且在由第二对寡核苷酸引物界定的第二靶核酸序列内退火，其中退火部分包含第二猝灭剂部分；且所述标签部分连接到退火部分的5'末端或3'末端，或通过接头连接到退火部分的区域并包含与所述两种或更多种靶核酸序列不互补的核苷酸序列，其中标签部分包含与第一寡核苷酸探针上的荧光部分相同的荧光部分，并且其可检测信号能够被退火部分上的第二猝灭剂部分猝灭，其中通过核酸酶敏感的切割位点将荧光部分与第二猝灭部分分离；(iv)猝灭寡核苷酸，其包含与第二寡核苷酸探针的标签部分至少部分互补的核苷酸序列，并与标签部分杂交以形成双链体，其中猝灭寡核苷酸包含第三猝灭剂部分，当猝灭寡核苷酸与标签部分杂交时，所述第三猝灭剂部分猝灭由标签部分上的荧光部分产生的可检测信号；(b)使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增第一和第二靶核酸序列，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性允许从第一寡核苷酸探针上的第一猝灭部分切割并分离荧光部分，并且从第二寡核苷酸探针的退火部分上的第二猝灭部分切割并分离标签部分上的荧光部分，其中在延伸步骤，猝灭寡核苷酸保持与标签部分杂交；(c)在猝灭寡核苷酸与来自第二寡核苷酸探针的标签部分杂交的第一温度下测量一个或多个荧光信号；(d)在高于第一温度的第二温度下测量一个或多个荧光信号，在所述第二温度下猝灭寡核苷酸不与来自第二寡核苷酸探针的标签部分杂交；(e)通过从在第二温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值减去在第一温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值，获得计算信号值；由此，高于阈值的在第一温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值的值允许确定第一靶核酸序列的存在，并且高于阈信号值的计算信号值允许确定第二靶核酸的存在。在一个实施方式中，允许PCR扩增达到超出扩增对数期的终点(例如在平台期)。
在一个实施方案中，标签部分包含修饰，使得其不能被核酸聚合酶延伸。在另一个实施方案中，标签部分连接到退火部分的5'末端。在又另一个实施方案中，标签部分连接到退火部分的3'末端。在又另一个实施方案中，标签部分通过接头连接到退火部分的区域。在另一个实施方案中，第二寡核苷酸探针的标签部分或猝灭寡核苷酸或标签部分和猝灭寡核苷酸两者含有一种或多种核苷酸修饰。在又另一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸修饰选自锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，桥连核酸(BNA)，2'-O烷基取代，L-对映体核苷酸，或其组合。
在又另一个方面，本发明提供了用于检测样品中的两种或更多种靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：(a)使怀疑含有两种或更多种靶核酸序列的样品在单个反应容器中与以下接触：(i)第一对寡核苷酸引物和第二对寡核苷酸引物，所述第一对寡核苷酸引物具有与第一靶核酸序列的每条链互补的序列，且所述第二对寡核苷酸引物具有与第二靶核酸序列的每条链互补的序列；(ii)第一寡核苷酸探针，其包含两个不同部分：第一退火部分和第一标签部分，所述第一退火部分包含与第一靶核酸序列至少部分互补的序列，并在由第一对寡核苷酸引物界定的第一靶核酸序列内退火，其中第一退火部分包含第一猝灭剂部分；且所述第一标签部分连接到第一退火部分的5'末端或3'末端或通过接头连接到第一退火部分的区域，并且包含与所述两种或更多种靶核酸序列不互补的核苷酸序列，其中第一标签部分包含荧光部分，其可检测信号能够被第一退火部分上的第一猝灭剂部分猝灭，其中通过核酸酶敏感的切割位点将荧光部分与第一猝灭部分分离；(iii)第一猝灭寡核苷酸，其包含与第一寡核苷酸探针的第一标签部分至少部分互补的序列，并与第一标签部分杂交以形成双链体，其中第一猝灭寡核苷酸包含第二猝灭部分，当第一猝灭寡核苷酸与第一标签部分杂交时，所述第二猝灭部分猝灭由第一标签部分上的荧光部分产生的可检测信号；(iv)第二寡核苷酸探针，其包含两个不同部分：第二退火部分和第二标签部分，所述第二退火部分包含与第二靶核酸序列至少部分互补的序列，并在由第二对寡核苷酸引物界定的第二靶核酸序列内退火，其中第二退火部分包含第三猝灭剂部分；且所述第二标签部分连接到第二退火部分的5'末端或3'末端或通过接头连接到第二退火部分的区域，并且包含与所述两种或更多种靶核酸序列不互补的核苷酸序列，并且与第一寡核苷酸探针的第一标签部分的核苷酸序列相比具有不同的核酸序列或不同的核苷酸修饰，其中第二标签部分包含荧光部分，其与第一寡核苷酸探针上的荧光部分相同，并且其可检测信号能够被第二退火部分上的第三猝灭剂部分猝灭，其中通过核酸酶敏感的切割位点将荧光部分与第三猝灭部分分离；(v)第二猝灭寡核苷酸，其包含与第二寡核苷酸探针的第二标签部分至少部分互补的序列，并与第二标签部分杂交以形成双链体，其中第二猝灭寡核苷酸包含第四猝灭部分，当第二猝灭寡核苷酸与第二标签部分杂交时，所述第四猝灭部分猝灭由第二标签部分上的荧光部分产生的可检测信号；其中所述第二猝灭寡核苷酸和第二寡核苷酸探针的第二标签部分之间的双链体具有比第一猝灭寡核苷酸和第一寡核苷酸探针的第一标签部分之间的双链体更高的解链温度(Tm)值；(b)使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增第一和第二靶核酸序列，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性允许：(i)从第一寡核苷酸探针的第一退火部分上的第一猝灭部分切割并分离第一标签部分上的荧光部分，其中在延伸步骤，第一猝灭寡核苷酸保持与第一标签部分杂交；和(ii)从第二寡核苷酸探针的第二退火部分上的第三猝灭部分切割并分离第二标签部分上的荧光部分，其中在延伸步骤，第二猝灭寡核苷酸保持与第二标签部分杂交；(c)在第一温度下测量一个或多个荧光信号，在所述第一温度下，第一猝灭寡核苷酸不与来自第一寡核苷酸探针的第一标签部分杂交，并且第二猝灭寡核苷酸保持与来自第二寡核苷酸探针的第二标签部分杂交；(d)在高于第一温度的第二温度下测量一个或多个荧光信号，在所述第二温度下，第二猝灭寡核苷酸不与来自第二寡核苷酸探针的第二标签部分杂交；(e)通过从在第二温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值减去在第一温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值，获得计算信号值；由此，高于阈值的在第一温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值的值允许确定第一靶核酸序列的存在，并且高于阈信号值的计算信号值允许确定第二靶核酸的存在。在一个实施方式中，允许PCR扩增达到超出扩增对数期的终点(例如在平台期)。
在一个实施方案中，第一标签部分和第二标签部分都包含修饰，使得两个标签部分都不能被核酸聚合酶延伸。
在一个实施方案中，第一标签部分连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的3'末端，且第二标签部分连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的3'末端。在另一个实施方案中，第一标签部分连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的3'末端，且第二标签部分连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的5'末端。在另一个实施方案中，第一标签部分连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的3'末端，且第二标签部分通过接头连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的区域。
在一个实施方案中，第一标签部分连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的5'末端，且第二标签部分连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的5'末端。在另一个实施方案中，第一标签部分连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的5'末端，且第二标签部分连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的3'末端。在另一个实施方案中，第一标签部分连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的5'末端，且第二标签部分通过接头连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的区域。
在一个实施方案中，第一标签部分通过接头连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的区域，且第二标签部分连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的5'末端。在另一个实施方案中，第一标签部分通过接头连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的区域，且第二标签部分连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的3'末端。在另一个实施方案中，第一标签部分通过接头连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的区域，且第二标签部分通过接头连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的区域。
在一个实施方案中，第一寡核苷酸探针的第一标签部分或第一猝灭寡核苷酸或第二寡核苷酸探针的第二标签部分或第二猝灭寡核苷酸中的任一个或其任意组合含有一种或多种核苷酸修饰。在一个实施方案中，所述一种或多种核苷酸修饰选自锁核酸(LNA)，肽核酸(PNA)，桥连核酸(BNA)，2'-O烷基取代，L-对映体核苷酸，或其组合。
附图简述
图1是用于实施本发明方法的寡核苷酸探针的图解描述。
图2是本发明方法的图示，其显示标签部分的分离和随后的猝灭寡核苷酸的解离。
图3是对本发明方法的一个实施方案的描述。
图4显示使用本发明方法的另一个实施方案的信号检测温度。
图5显示用于实施本发明方法的寡核苷酸探针的不同实施方案。
图6显示如实施例1中所述的，猝灭寡核苷酸和荧光标记的互补寡核苷酸之间在两个温度下杂交和解离的结果。
图7显示了如实施例2中所述，在增加HIV1-M靶标背景中检测IC靶标。
图8显示了如实施例2中所述，在增加IC靶标背景中检测HIV1-M gag靶标。
图9显示了如实施例2中所述，在增加IC靶标背景中检测HIV1-M ltr靶标。
图10显示了在如实施例3所述的实验中的IC样品的检测结果。在热通道1 (58℃，图10A)与热通道2 (83℃，图10B)中的IC单检测。使用基线减法，其中在热通道2中应用IC信号温度校正和减法。热通道1：阈值= 0.75，检测到84拷贝的IC，p = 0.58，λ = 0.88。热通道2：阈值= 1.00，检测到0拷贝的IC。p = 0，λ = 0。
图11显示了如实施例3所述的实验中的HIV1-M 1tr样品的检测结果。在热通道1(58℃，图11A)与应用基线减法的热通道2 (83℃，图11B)中的HIV-1单检测。热通道1：阈值=0.75，检测到0拷贝的HIV1-M ltr，p = 0，λ = 0。热通道2：阈值= 1.00，检测到48拷贝的HIV1-M ltr，p = 0.39，λ = 0.50。
图12显示了如实施例3所述的实验中的IC和HIV1-M ltr样品的双重靶标检测结果。在热通道1 (58℃，图12A)与热通道2 (83℃，图12B)中，检测IC和HIV1-M两者。在热通道2中应用基线减法，IC信号温度校正和减法。热通道1：阈值= 0.75，检测到82拷贝的IC，p =0.57，λ = 0.85。热通道2：阈值= 1.00，检测到47拷贝的HIV1-M ltr，p = 0.39，λ = 0.49。
发明详述
定义
如本文使用的术语“样品”包括包含核酸的样本或培养物(例如，微生物培养物)。术语“样品”还意图包括生物样品和环境样品。样品可以包括合成起源的样本。生物样品包括全血、血清、血浆、脐带血、绒毛膜绒毛、羊水、脑脊液、脊髓液、灌洗液(例如，支气管肺泡的、胃的、腹膜的、导管的、耳的、关节镜的灌洗液)、活检样品、尿、粪便、痰、唾液、鼻粘液、前列腺液、精液、淋巴液、胆汁、泪液、汗液、乳汁、乳房流体、胚胎细胞和胎儿细胞。在优选的实施方案中，所述生物样品是血液，并且更优选地是血浆。如本文使用的术语“血液”包括全血或任何血液级分，诸如，如常规地定义的血清和血浆。血液血浆是指由用抗凝剂处理过的血液的离心产生的全血级分。血液血清是指血液样品已经凝固后剩余的流体的水样部分。环境样品包括环境材料，诸如表面物质、土壤、水和工业样品，以及从食品和乳制品加工装置、仪器、设备、器具、一次性和非一次性物品获得的样品。这些实例不应解释为限制可应用于本发明的样品类型。
如本文使用的术语“靶标”或“靶核酸”意图指待检测或测量其存在、或者待研究其功能、相互作用或特性的任何分子。因此，靶标包括存在用于它的可检测探针(例如，寡核苷酸探针)或测定，或可以由本领域技术人员生产的基本上任何的分子。例如，靶标可以是生物分子，诸如核酸分子、多肽、脂质或碳水化合物，其能够与可检测探针(例如抗体)结合或以其他方式发生接触，其中所述可检测探针还包含能够通过本发明的方法检测的核酸。如本文使用的“可检测探针”是指能够与目标靶生物分子杂交或退火且允许如本文所述的靶生物分子的特异性检测的任何分子或试剂。在本发明的一个方面，所述靶标是核酸，且所述可检测探针是寡核苷酸。术语“核酸”和“核酸分子”可以在本公开全文互换使用。所述术语是指寡核苷酸、寡聚物、多核苷酸、脱氧核糖核苷酸(DNA)、基因组DNA、线粒体DNA (mtDNA)、互补DNA (cDNA)、细菌DNA、病毒DNA、病毒RNA、RNA、信使RNA (mRNA)、转移RNA (tRNA)、核糖体RNA (rRNA)、siRNA、催化性RNA、克隆、质粒、M13、P1、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)、扩增的核酸、扩增子、PCR产物及其他类型的扩增的核酸、RNA/DNA杂交体和聚酰胺核酸(PNA)，所有这些可以呈单链或双链形式，并且除非另有限制，否则将包括可以以与天然存在的核苷酸类似的方式起作用的天然核苷酸的已知类似物，及其组合和/或混合物。因此，术语“核苷酸”是指天然存在的和修饰的/非天然存在的核苷酸，包括三、二和单磷酸核苷，以及在聚核酸或寡核苷酸内存在的单磷酸单体。核苷酸也可以是核糖；2'-脱氧；2',3'-脱氧以及本领域众所周知的大量其他核苷酸模拟物。模拟物包括链终止核苷酸，诸如3'-O-甲基，卤代碱基或糖取代；替代糖结构，包括非糖，烷基环结构；替代碱基，包括肌苷；脱氮修饰的；chi和psi，接头修饰的；质量标记修饰的；磷酸二酯修饰或替代，包括硫代磷酸酯，甲基膦酸酯，硼代磷酸酯(boranophosphate)，酰胺，酯，醚；和基本或完全的核苷酸间替代，包括切割连接，诸如光可切割的硝基苯基部分。
可以定量地或定性地测量靶标的存在或不存在。靶标可以以多种不同形式出现，包括例如简单或复杂混合物，或基本上纯化的形式。例如，靶标可以是含有其他组分的样品的一部分，或可以是样品的唯一或主要组分。因此，靶标可以是全细胞或组织的组分、细胞或组织提取物、其分级分离的裂解物，或基本上纯化的分子。另外，靶标可以具有已知的或未知的序列或结构。
术语“扩增反应”是指用于扩增靶核酸序列的拷贝的任何体外方式。
“扩增”是指使溶液处于足以允许扩增的条件的步骤。扩增反应的组分可以包括但不限于例如引物、多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸、dNTP等。术语“扩增”通常是指靶核酸的“指数”增加。然而，如本文使用的“扩增”还可以是指选定的靶核酸序列的数目的线性增加，但不同于一次性的、单引物延伸步骤。
“聚合酶链式反应”或“PCR”是指用于以几何级数扩增靶双链DNA的特定区段或子序列的方法。PCR是本领域技术人员众所周知的；参见例如美国专利号4,683,195和4,683,202；和PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis等人编辑，1990。
如本文使用的“寡核苷酸”是指通过磷酸二酯键或其类似物连接的天然或修饰的核苷单体的线性寡聚体。寡核苷酸包括能够特异性地结合靶核酸的脱氧核糖核苷、核糖核苷、其端基异构形式、肽核酸(PNA)等。通常，单体通过磷酸二酯键或其类似物连接以形成寡核苷酸，所述寡核苷酸的大小范围从几个单体单元(例如3-4个)至几十个单体单元(例如40-60个)。每当寡核苷酸通过字母的序列(诸如"ATGCCTG")表示时，应该理解，除非另外指出，否则核苷酸从左到右是5'-3'顺序，并且"A"是指脱氧腺苷，"C"是指脱氧胞苷，"G"是指脱氧鸟苷，"T"是指脱氧胸苷，并且"U"是指核糖核苷，尿苷。通常寡核苷酸包含四种天然脱氧核苷酸；然而，它们也可包含核糖核苷或非天然核苷酸类似物。当酶对于活性具有特定寡核苷酸或多核苷酸底物要求(例如单链DNA、RNA/DNA双链体等)的情况下，则关于寡核苷酸或多核苷酸底物的适当组成的选择完全是在普通技术人员的知识之内。
如本文使用的“寡核苷酸引物”或简称“引物”是指这样的多核苷酸序列：其与靶核酸模板上的序列杂交并且促进寡核苷酸探针的检测。在本发明的扩增实施方案中，寡核苷酸引物充当核酸合成的起始点。在非扩增实施方案中，寡核苷酸引物可以用于建立能够被切割试剂切割的结构。引物可以具有多种长度，并且通常长度小于50个核苷酸，例如12-25个核苷酸的长度。可以基于本领域技术人员已知的原则来设计用于PCR中的引物的长度和序列。
如本文使用的术语“寡核苷酸探针”是指这样的多核苷酸序列：其能够与目标靶核酸杂交或退火并且允许所述靶核酸的特异性检测。
“报告子部分”或“报告子分子”是赋予可检测信号的分子。例如，可检测的表型可以是比色的，荧光的或发光的。“猝灭剂部分”或“猝灭剂分子”是能够猝灭来自报告子部分的可检测信号的分子。
“错配核苷酸”或“错配”是指在该一个或多个位置处与靶序列不互补的核苷酸。寡核苷酸探针可以具有至少一个错配，但还可以具有2、3、4、5、6或7个或更多个错配核苷酸。
如本文使用的术语“多态性”是指等位基因变体。多态性可以包括单核苷酸多态性(SNP)以及简单序列长度多态性。多态性可以是由于与另一个等位基因相比在一个等位基因处的一个或多个核苷酸取代，或可以是由于插入或缺失、重复、倒置及本领域已知的其他改变。
如本文使用的术语“修饰”是指寡核苷酸探针在分子水平(例如，碱基部分、糖部分或磷酸酯骨架)的改变。核苷修饰包括但不限于：引入切割阻断剂或切割诱导物、引入小沟结合剂、同位素富集、同位素耗尽、引入氘，和卤素修饰。核苷修饰还可以包括增加杂交的严格性或增加寡核苷酸探针的解链温度的部分。例如，核苷酸分子可以用连接2'和4'碳的额外桥修饰，产生锁核酸(LNA)核苷酸，其对核酸酶的切割具有抗性(如Imanishi等人，美国专利号6,268,490和Wengel等人，美国专利号6,794,499中所述)。寡核苷酸探针的标签部分和猝灭寡核苷酸分子的组成仅受其形成稳定双链体的能力的限制。因此，这些寡核苷酸可包含DNA，L-DNA，RNA，L-RNA，LNA，L-LNA，PNA (肽核酸，如Nielsen等人，美国专利号5,539,082中所述)，BNA (桥接核酸，例如，2',4'-BNA(NC) [2'-O,4'-C-氨基亚甲基桥连核酸]，如Rahman等人，J.Am.Chem.Soc.2008; 130(14)：4886-96中所述)，L-BNA等(其中“L-XXX”是指核酸糖单元的L-对映体)，或对核苷酸碱基，糖或磷酸二酯骨架的任何其他已知变化和修饰。
核苷修饰的其他实例包括各种2'-取代，诸如在寡核苷酸的糖部分中引入的卤代、烷氧基和烯丙氧基基团。证据表明2'-取代-2'-脱氧腺苷多核苷酸类似于双链RNA而不是DNA。Ikehara等人(Nucleic Acids Res., 1978, 5, 3315)已经显示，在与其互补物形成双链体的多聚A，多聚I或多聚C中的2'-氟代取代基比核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸多聚双链体更稳定，如通过标准解链测定确定的。Inoue等人(Nucleic Acids Res., 1987, 15,6131)描述了在每个核酸核苷酸上含有2'-OMe (O-甲基)取代基的混合寡核苷酸序列的合成。混合的2'-OMe-取代的寡核苷酸以如RNA-RNA双链体一样的强度与其RNA互补物杂交，其显著强于相同序列的RNA-DNA杂双链体。因此，糖的2'位置的取代的实例包括F，CN，CF3，OCF3，OMe，OCN，O-烷基，S-烷基，SMe，SO2Me，ONO2，NO2，NH3，NH2，NH-烷基，OCH3=CH2和OCCH。
关于一种分子与另一种分子(诸如用于靶多核苷酸的探针)的结合的术语“特异性的”或“特异性”，是指两种分子之间的识别、接触和稳定复合物的形成，以及该分子与其他分子的大幅减少的识别、接触或复合物形成。如本文使用的术语“退火”是指两种分子之间的稳定复合物的形成。
如果探针的至少一个区域与核酸序列的互补物的至少一个区域共享实质序列同一性，则所述探针“能够退火”至所述核酸序列。“实质序列同一性”是至少约80%、优选地至少约85%、更优选地至少约90%、95%或99%、和最优选地100%的序列同一性。为了确定DNA序列和RNA序列的序列同一性的目的，U和T通常被视为相同核苷酸。例如，包含序列ATCAGC的探针能够与包含序列GCUGAU的靶RNA序列杂交。
如本文使用的术语“切割试剂”是指能够切割寡核苷酸探针以产生片段的任何工具，包括但不限于酶。对于其中不发生扩增的方法，切割试剂可以仅用于切割、降解或以其他方式分离寡核苷酸探针的第二部分或其片段。切割试剂可以是酶。切割试剂可以是天然的、合成的、未修饰的或修饰的。
对于其中发生扩增的方法，切割试剂优选地是具有合成(或聚合)活性和核酸酶活性的酶。这样的酶通常为核酸扩增酶。核酸扩增酶的实例是核酸聚合酶，诸如水生栖热菌(Thermus aquaticus) (Taq) DNA聚合酶(TaqMan®)或大肠杆菌(E. coli) DNA聚合酶I。所述酶可以是天然存在的，未修饰的或修饰的。
“核酸聚合酶”是指催化核苷酸并入核酸内的酶。示例性的核酸聚合酶包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、末端转移酶、逆转录酶、端粒酶等。
“热稳定的DNA聚合酶”是指这样的DNA聚合酶：当在选定的时间段经受高温时，其为稳定的(即抵抗分解或变性)且保留足够的催化活性。例如，当经受高温经过双链核酸变性所必需的时间时，热稳定DNA聚合酶保留足够的活性以实现随后的引物延伸反应。核酸变性所必需的加热条件是本领域众所周知的，并且例示在美国专利号4,683,202和4,683,195中。如本文使用的热稳定的聚合酶通常适用于温度循环反应诸如聚合酶链式反应("PCR")中。热稳定的核酸聚合酶的实例包括水生栖热菌Taq DNA聚合酶、栖热菌属种Z05聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavus)聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga maritima)聚合酶，诸如TMA-25和TMA-30聚合酶、Tth DNA聚合酶等。
“修饰的”聚合酶是指其中至少一个单体不同于参考序列的聚合酶，所述参考序列诸如所述聚合酶的天然或野生型形式或所述聚合酶的另一种修饰形式。示例性修饰包括单体插入、缺失和取代。修饰的聚合酶还包括嵌合聚合酶，其具有衍生自两个或更多个亲本的可鉴定的组分序列(例如，结构或功能结构域等)。修饰聚合酶的定义中还包括那些包含参考序列的化学修饰的聚合酶。修饰聚合酶的实例包括G46E E678G CS5 DNA聚合酶，G46EL329A E678G CS5 DNA聚合酶，G46E L329A D640G S671F CS5 DNA聚合酶，G46E L329AD640G S671F E678G CS5 DNA聚合酶，G46E E678G CS6 DNA聚合酶，Z05 DNA聚合酶，ΔZ05聚合酶，ΔZ05-Gold聚合酶，ΔZ05R聚合酶，E615G Taq DNA聚合酶，E678G TMA-25聚合酶，E678G TMA-30聚合酶等。
术语“5'至3'核酸酶活性”或“5'-3'核酸酶活性”是指核酸聚合酶的活性，通常与核酸链合成相关，由此从核酸链5'端移除核苷酸，例如，大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活性，而Klenow片段则没有。一些具有5'至3'核酸酶活性的酶是5'至3'外切核酸酶。这种5'至3'外切核酸酶的实例包括：来自枯草芽孢杆菌(B. subtilis)的外切核酸酶，来自脾的磷酸二酯酶，λ外切核酸酶，来自酵母的外切核酸酶II，来自酵母的外切核酸酶V和来自粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的外切核酸酶。
术语“丙二醇”或“丙二醇间隔物”是指1,3-丙二醇，并且与丙烷-1,3-二醇、1,3-二羟基丙烷和三亚甲基二醇同义。术语"HEG"或“HEG间隔物”是指六甘醇，其与3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1,17-二醇同义。
本发明的各个方面基于核酸聚合酶的特殊特性。核酸聚合酶可以具有几种活性，其中包括5'至3'核酸酶活性，由此核酸聚合酶可以从退火至其较大的互补多核苷酸的寡核苷酸切割单核苷酸或小寡核苷酸。为了使切割有效地发生，上游寡核苷酸也必须退火至相同的较大多核苷酸。
利用5'至3'核酸酶活性检测靶核酸可以通过“TaqMan®”或“5'-核酸酶测定”进行，如美国专利号5,210,015；5,487,972；和5,804,375；以及Holland等人，1988, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 88:7276-7280中所述。在TaqMan®测定中，在扩增区内杂交的标记的检测探针在扩增反应期间存在。探针经修饰，以阻止探针充当DNA合成的引物。所述扩增使用具有5'至3'外切核酸酶活性的DNA聚合酶进行。在扩增的每个合成步骤期间，通过DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性降解在所延伸的引物下游与靶核酸杂交的任何探针。因此，新靶链的合成也导致探针的降解，并且降解产物的积累提供靶序列合成的量度。
适合用于检测降解产物的任何方法均可用在5'核酸酶测定中。通常，检测探针用两种荧光染料进行标记，其中之一能够猝灭另一种染料的荧光。所述染料连接至探针，通常报告子或检测染料连接至5'末端，且猝灭染料连接至内部位点，使得当探针处于非杂交状态时，发生猝灭，并且使得通过DNA聚合酶的5'至3'外切核酸酶活性对探针的切割发生在两种染料之间。扩增导致染料之间的探针的切割，伴随猝灭的消除和来自最初猝灭的染料可观察到的荧光增加。通过测量反应荧光的增加，监测降解产物的积累。美国专利号5,491,063和5,571,673描述了用于检测伴随扩增发生的探针降解的替代方法。
用于检测靶核酸的5'核酸酶测定可以采用具有5'至3'外切核酸酶活性的任何聚合酶。因此，在一些实施方案中，具有5'核酸酶活性的聚合酶是热稳定和热活性的核酸聚合酶。这种热稳定聚合酶包括但不限于来自真细菌属：栖热菌属(Thermus)、栖热袍菌属(Thermatoga)和栖热腔菌属(Thermosipho)的多种物种的天然和重组形式的聚合酶，以及其嵌合形式。例如，可用于本发明方法中的栖热菌属物种的聚合酶包括水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶，嗜热栖热菌(Tth) DNA聚合酶，栖热菌属种Z05 (Z05) DNA聚合酶，栖热菌属种sps17 (sps17)，以及栖热菌属种Z05 (例如，描述于美国专利号5,405,774; 5,352,600;5,079,352; 4,889,818; 5,466,591; 5,618,711; 5,674,738和5,795,762)。可以用于本发明方法中的栖热袍菌属聚合酶包括例如海栖热袍菌DNA聚合酶和新阿波罗栖热袍菌(Thermatoga neapolitana) DNA聚合酶，而可以使用的栖热腔菌属聚合酶的实例是非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus) DNA聚合酶。海栖热袍菌和非洲栖热腔菌DNA聚合酶的序列公开于国际专利申请号PCT/US91/07035，公开号为WO 92/06200。新阿波罗栖热袍菌的序列可见于国际专利公开号WO 97/09451中。
在5'核酸酶测定中，扩增检测通常与扩增同时发生(即，“实时”)。在一些实施方案中，扩增检测是定量的，并且扩增检测是实时的。在一些实施方案中，扩增检测是定性的(例如，靶核酸的存在或不存在的终点检测)。在一些实施方案中，扩增检测在扩增之后。在一些实施方案中，扩增检测是定性的，并且扩增检测在扩增之后，即当扩增达到超出扩增对数期的终点时。
在本发明中，可以在单个反应容器(例如管，孔)中进行两种或更多种靶核酸的PCR扩增和终点检测，其中使用标准TaqMan®寡核苷酸探针用于检测第一靶标的存在，且一种或更多种新型TaqMan®寡核苷酸探针用于检测第二，第三或更多靶标的存在，其中所有探针都含有相同的荧光标记。或者，新型TaqMan®寡核苷酸探针可用于检测所有靶核酸的存在。所述新型探针具有两个区别特征。
所述新型探针的第一个特征是它包含两个不同的部分。第一部分称为退火部分，并且包含与靶核酸序列至少部分互补的序列，使得其能够与靶序列杂交。退火部分还含有猝灭剂部分。在一个实施方案中，退火部分含有报告子部分，诸如荧光染料，其能够被猝灭剂部分猝灭，并通过核酸酶敏感的切割位点与猝灭剂部分分离。寡核苷酸探针的第二部分称为标签部分。在一个实施方案中，标签部分连接到退火部分的5'末端。在另一个实施方案中，标签部分连接到退火部分的3'末端。在另一个实施方案中，标签部分通过接头连接在退火部分的5'末端和3'末端之间的任何位置。标签部分可包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列，并形成不能与靶核酸结合的“鼓翼”区域(关于5'鼓翼探针的图示，参见图1)。标签部分也可以包含非核苷酸，诸如任何有机部分，或重复单元(例如(CH2-CH2-O)n等)，只要它可以连接到退火部分并且可以与猝灭分子相互作用(如下节所述)。在一个实施方案中，标签部分含有报告子部分，诸如荧光染料，其能够被退火部分上的猝灭剂部分猝灭。寡核苷酸探针的退火和标签部分可任选地被非核苷酸接头分开。这种接头可以包含碳、碳和氧、碳和氮、或这些的任意组合，且可以具有任意长度。此外，接头可以包含线性部分或环状部分。接头可以衍生自单个单元或衍生自由磷酸酯键分隔的多个相同或不同的单元。接头的目的是产生位于寡核苷酸探针的退火和标签部分的连接处的区域。当标签部分与退火部分分离时，接头还防止标签部分被核酸聚合酶延伸。或者，对分离的标签部分的另一种修饰使其不可被核酸聚合酶延伸。
所述新型探针的第二个特征是标签部分与猝灭分子结合。如果标签部分是核苷酸序列，则猝灭分子可以是与标签部分的核苷酸序列完全或部分互补并与标签部分杂交的寡核苷酸。猝灭分子也含有猝灭剂部分(即第二猝灭剂部分)或与其结合，所述猝灭剂部分(即第二猝灭剂部分)也能够猝灭来自标签部分上的报告子部分(例如荧光染料)的信号。在猝灭分子上或与其结合的猝灭剂部分(第二猝灭剂部分)可与退火部分上的猝灭剂部分(第一猝灭剂部分)相同或不同。因此，在进行PCR扩增之前，标签部分上的报告子部分被探针退火部分上的猝灭剂部分和猝灭分子上或与之结合的猝灭剂部分(例如，被如图1中所示的猝灭寡核苷酸)两者猝灭。
下面描述使用新型探针在5'核酸酶测定中进行靶核酸的PCR扩增和终点检测的一般原理。首先，提供怀疑含有靶核酸的样品。然后，使样品在单个反应容器(例如单个试管或多孔微孔板中的单个孔)内与PCR试剂接触，所述PCR试剂含有能够产生靶核酸的扩增子的寡核苷酸引物和新型寡核苷酸探针两者。通过使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶开始PCR扩增，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，聚合酶的核酸酶活性允许从探针的退火部分上的猝灭部分切割并分离标签部分。分离的标签部分可任选地含有修饰(诸如非核苷酸接头)，使得其不能被核酸聚合酶延伸。
当PCR测定已经达到已产生足够扩增子的水平(例如，超出扩增对数期或在平台期) 时或在PCR测定已经完成后，在第一温度下测量来自分离的标签部分上的报告子部分的信号，所述第一温度通常是退火和/或延伸温度，在该温度下，猝灭分子仍然与标签部分结合。由于在猝灭分子上或与之结合的猝灭剂部分的存在，来自标签部分上的报告子部分(例如荧光染料)的信号仍然被猝灭。在一些情况下，在第一温度下多于一次地测量来自报告子部分的信号并获得第一温度下的平均值或中值信号值是有利的。然后，在猝灭分子不再与标签部分结合的温度点进行第二信号读取。如果猝灭分子是具有与标签部分的核苷酸序列互补的序列的寡核苷酸，则该解离发生在猝灭寡核苷酸分子和标签部分之间形成的双链体的解链温度(Tm)。然后，在双链体的Tm温度或高于Tm温度的第二温度下测量来自报告子部分的信号，该信号不再被在猝灭寡核苷酸上或与之结合的猝灭剂部分猝灭。实际上更好的是，第二温度高于Tm温度，以确保接近100％的标签部分是单链形式。但是，也可以在低于Tm温度的温度下测量信号。在一些情况下，在第二温度下多于一次地测量来自报告子部分的信号并获得第二温度下的平均值或中值信号值是有利的。然后，通过从在第二温度(此时猝灭分子不与标签部分结合)检测到的信号(或平均值或中值信号值)减去在第一温度(此时猝灭分子仍然与标记部分结合)检测到的信号(或平均值或中值信号值)来确定计算信号值(参见图2和图3)。计算的信号值可以任选地归一化，以校正可能受温度影响的信号。例如，已知荧光信号在较高温度下降低，并且因此，可以使用标准品以将在不同温度下获得的信号值归一化。
这些信号测量和计算通常在PCR测定结束(或接近结束)时或PCR测定完成后进行，并且确定的信号值可用于确定靶核酸的存在或不存在。
终点PCR测定的一个实例是数字PCR (dPCR)。在dPCR中，将样品分区，以使样品内的各个核酸分子定位并浓缩在许多分开的区域内。各个核酸分子的猝灭或分离已在微孔板、毛细管、乳液的分散相和微型室的阵列中以及核酸结合表面上进行。通过假设分子群遵循泊松分布，样品的分区允许人们估计不同分子的数量。结果，每个部分将分别包含“0”或“1”个分子，或阴性或阳性反应。PCR扩增后，可以通过计数含有PCR终产物、阳性反应的区域来定量核酸。在常规PCR中，PCR扩增循环的数量与起始拷贝数成比例。然而，dPCR不依赖于扩增循环的数量来确定初始样品量，消除了对于用于量化靶核酸的不确定的指数数据的依赖，并因此提供了绝对定量。目前的数字PCR方法通过基于微流体的方法(其中反应被分区到阵列上的纳米孔中)或通过基于液滴的方法(其中反应被分到微滴中)实现。采用微流体方法的商业可得的系统包括来自Fluidigm Corporation (South San Francisco, CA)的Biomark HD系统和来自Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA)的QuantStudio 3DdPCR系统。商业数字PCR领域的其他竞争者包括RainDance Technologies (Billerica,MA)及其Raindrop系统和Bio-Rad (Hercules, CA)及其QX200基于液滴的系统。
通过设计寡核苷酸探针，仅使用一个报告子部分(例如一种荧光染料)的多重PCR测定是可能的，所述寡核苷酸探针具有在各种Tm温度下与它们各自的猝灭寡核苷酸分子杂交的标签部分。例如，通过使用全部用相同荧光团标记的三种寡核苷酸探针，可以实现在一个反应中扩增和检测三种靶核酸。标准TaqMan®寡核苷酸探针可用于通过在第一温度(通常是PCR循环的退火温度)下测量荧光信号来检测第一靶标。具有低Tm标签-猝灭寡核苷酸双链体的第一“标记的”探针可用于通过在其Tm温度或高于其Tm温度并且高于第一温度的第二温度下测量计算的荧光值，来检测第二靶标。具有高Tm标签-猝灭寡核苷酸双链体的第二“标记的”探针可用于通过测量在其Tm温度或高于其Tm温度并且高于第二温度的第三温度下测量计算的荧光值，来检测第三靶标。(参见图4)。理论上，可以使用一个TaqMan®探针和具有四到七种不同的报告子部分(例如荧光染料)的两个不同标记的探针，在一个反应中检测12至21种不同的靶核酸，或使用一个TaqMan®探针和3个不同的标记的探针，在一个反应中检测16至28种不同的靶核酸。
另外，可以设计本发明的新型探针，使得标签部分是核苷酸序列并连接到猝灭寡核苷酸以形成发夹(即茎环结构)。在该结构中，“茎”部分将由标签部分和猝灭寡核苷酸之间的互补区组成，而“环”部分可以包含非互补核苷酸或非核苷酸，诸如前述的接头。
尽管已经描述了本发明的新型探针具有位于探针标签部分上的报告子部分，但也可以将报告子部分定位在退火部分上并将第一猝灭剂部分置于标签部分上，只要报告子部分可以与猝灭寡核苷酸上的第二猝灭剂部分可逆地相互作用。在一般意义上，报告子部分以如下方式设计并定位在探针寡核苷酸中，使其在5'核酸酶(TaqMan®)测定期间与退火部分上的第一猝灭部分分离，并进一步设计为与猝灭分子上的第二猝灭部分可逆地相互作用。新型探针的这些各种替代实施方案中的一些可见于图5中。
为了实施本发明的方法，某些特征在探针寡核苷酸的标签部分和猝灭分子的设计中是必需的。在一个实施方案中，标签部分和猝灭分子均包含核苷酸序列。在这种情况下，标签部分和猝灭寡核苷酸都不应与靶核酸序列特异性杂交，但它们应彼此完全或部分互补，以允许在所需温度下杂交。两者都可以在它们的3'末端包括修饰，以便在PCR扩增期间不被核酸聚合酶延伸。标签部分上的报告子部分(例如荧光染料)和猝灭寡核苷酸上的猝灭剂部分都可以位于5'末端，3'末端或5'和3'末端之间的任何位置，但在标签部分与猝灭寡核苷酸杂交时，它们必须彼此接近地定位，以使猝灭部分猝灭来自报告子部分的可检测信号。
对于在各种Tm温度下与它们各自的猝灭寡核苷酸分子杂交的不同标签部分，可以在标签部分上，猝灭寡核苷酸上或标签部分和猝灭寡核苷酸两者上的所有或一些位置引入修饰的核苷酸，使得可以缩短寡核苷酸的长度。用于提高解链温度的核苷酸修饰的实例包括LNA，PNA，G-钳(9-(氨基乙氧基)-吩噁嗪-2'-脱氧胞苷)，丙炔基脱氧尿苷(pdU)，丙炔基脱氧胞苷(pdC)和在糖基团的各种2'修饰，诸如2'-O-甲基修饰。可用于防止核酸聚合酶与标签部分或与猝灭寡核苷酸的不希望的结合的另一类型的修饰可包括使用对映体L-形式的核苷酸，诸如L-DNA，L-RNA或L-LNA。
在另一个实施方案中，寡核苷酸探针的标签部分和猝灭分子包含以温度依赖性方式彼此可逆地相互作用的非核苷酸分子。此类非核苷酸相互作用的实例包括但不限于蛋白质-蛋白质相互作用，蛋白质-肽相互作用(例如肽适体)，蛋白质-小分子相互作用，肽-小分子相互作用，小分子-小分子相互作用。在一个实例中，可以利用生物素和抗生物素蛋白(或链霉抗生物素蛋白)之间的众所周知的相互作用，其中通过修饰生物素部分(例如脱硫生物素)或抗生物素蛋白部分(参见Nordlund等人，J. Biol. Chem., 2003., 278 (4) 2479-2483)或两者，以使所述相互作用具有可逆性和温度依赖性。
在又另一个实施方案中，标签部分和猝灭分子之间的相互作用可以涉及一个核苷酸序列(或多个核苷酸序列)与非核苷酸分子之间以序列特异性方式的相互作用。这些类型的相互作用的实例包括但不限于核酸适体，DNA结合蛋白或肽和DNA小沟结合物。序列特异性DNA结合分子的设计和合成已描述于多篇论文中(参见例如Dervan, Science, 1986,232, 464-471；White等人，Nature, 1998, 391, 468-471)，并且这些方法可用于产生标签部分和猝灭分子之间的温度依赖性相互作用。类似地，还可以利用双链核苷酸和可溶性猝灭剂之间的相互作用，使得猝灭部分不需要包含在猝灭分子本身之中，而可以是可溶形式，其仅在标签部分与猝灭分子结合时与报告子部分相互作用并将其猝灭。
在以下实施例中将进一步描述本发明的实施方案，所述实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1：通过猝灭寡核苷酸进行猝灭的验证
进行实验，以验证含有猝灭剂部分的猝灭寡核苷酸将能够与寡核苷酸探针的荧光标记的释放标签部分杂交，并在低于双链体的解链温度的温度下猝灭荧光信号，但在双链体已解离的高于解链温度的温度下不猝灭荧光信号。表1含有标签部分和猝灭寡核苷酸的核苷酸序列。猝灭寡核苷酸Q0不含猝灭剂，而猝灭寡核苷酸Q1在其5'末端含有BHQ-2猝灭剂。
表1
名称 序列 修饰 SEQ ID NO:
9FAM9TAG CGTCGCCAGTCAGCTCCGG9F9T 9=C9间隔物，F=FAM 1
Q0 CCGGAGCTGACTGGCGACGp P=磷酸酯 2
Q1 QCCGGAGCTGACTGGCGACGp p=磷酸酯，Q=BHQ-2 3
将9FAM9 TAG寡核苷酸在没有猝灭寡核苷酸(QX)的情况下温育，或与Q0或Q1猝灭寡核苷酸以1：5摩尔比温育。然后将混合物在50μL反应中循环，所述反应由60mM Tricine，120mM乙酸钾，5.4％DMSO，0.027％叠氮化钠，3％甘油，0.02％吐温20，43.9μM EDTA，0.2U/μL UNG，0.1μM 19TAGC9FAMC9，0.5μM Q0或Q1，400μM dATP，400μM 4CTP，400μM dGTP，800μMdUTP和3.3mM乙酸锰组成。类似于典型PCR扩增反应的循环条件显示在表2上。
表2
实验的结果显示在图6上。在58℃测量来自FAM染料的信号时，在没有猝灭寡核苷酸(QX)的情况下，或使用不带猝灭部分的猝灭寡核苷酸(Q0)，检测到荧光，但在存在Q1猝灭寡核苷酸的情况下，在任何循环均没有检测到信号。相反，在80℃测量荧光时，可以在所有循环中检测到信号，甚至在Q1猝灭寡核苷酸存在下也是如此，这证实在更高的温度下，Q1猝灭寡核苷酸不再与TAG杂交，并且没有观察到猝灭。
实施例2：使用标记探针和猝灭寡核苷酸的具有终点检测的PCR
进行矩阵实验，其中在0、10或100个拷贝的HIV1-M模板存在下，经50个PCR循环，扩增0、100或1,000个拷贝的内部对照(IC)模板。使用标记探针和它们各自的猝灭寡核苷酸，通过TaqMan®化学和热辅助信号生成(TAGS)的组合，实现在单个荧光通道中使用荧光素(FAM)对三个独特靶标的检测。在TaqMan® PCR后，在FAM荧光通道中测量所有三个靶标的终点荧光信号(最后四个循环的平均荧光信号)。表3显示了该实验中使用的探针和猝灭寡核苷酸的序列。
表3
每个50μL反应含有3％甘油，60mM Tricine，120mM乙酸钾，dATP，dCTP和dGTP各400μM，800μM dUTP，正向引物各0.3μM，反向引物各0.3μM，0.3μM的检测探针(序列1- 3)，Q-标签(序列4-5)各0.6μM，5.4％DMSO，0.02％吐温20，43.9μM EDTA，0.03％叠氮化钠，0.2 U/μL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)，0.67μM NTQ21-46A适体，0.9 U/μL Z05D聚合酶和3.3mM乙酸锰(pH6.3)。在Roche LightCycler® 480仪器上完成扩增，并使反应经历表2中所示的温度谱，除了进行50而不是55个循环，并且仅在最后四个循环期间进行数据采集(参见下文)。
实验结果见于图7-9中，其中终点绝对荧光在Y轴上绘制，且各种样品跨X轴绘制。由于常规TaqMan®探针(IC, SEQ ID NO: 4)在扩增的重复循环期间的切割，在IC靶标的存在下，在58℃观察到荧光信号(图7，热通道1)。此外，由于标记探针(HIV-1M gag，SEQ IDNO: 5)的切割和由探针切割片段从互补猝灭寡核苷酸(Q-标签gag，SEQ ID NO: 7)的解链而增加的荧光，当HIV1-M gag靶标存在时，在80℃观察到荧光信号(图8，热通道2)。此外，由于第二标记探针(HIV-1M ltr，SEQ ID NO: 6)的切割和由探针切割片段从第二互补猝灭寡核苷酸(Q-标签 ltr，SEQ ID NO: 8)的解链而增加的荧光，当HIV1-M ltr靶标存在时，在95℃观察到荧光信号(图9，热通道3)。任何具有低于限定的荧光阈值信号/热通道(虚线)的荧光信号的样品被认为是阴性的。
从热通道2 (80℃)荧光减去温度校正的热通道1 (58℃)荧光，以获得HIV1-M gag的特异性信号。类似地，从热通道3 (95℃)荧光减去温度校正的热通道2荧光，以获得HIV1-M ltr的特异性信号。因此，观察到，在58℃ (热通道1)特异性检测到IC靶标的扩增，在80℃(热通道2)特异性检测到HIV1-M gag靶标，和在95℃ (热通道3)特异性检测到HIV1-M ltr靶标。
实施例3：使用标记探针和猝灭寡核苷酸的具有终点检测的数字PCR
进行实验，其中在384孔板上的96孔中单独或一起扩增和检测大约47个拷贝的HIV1-MRNA或83个拷贝的内部对照RNA。每个反应中存在两个荧光素标记的TaqMan®探针。第一探针(表4，SEQ ID NO: 9)特异性地结合到内部对照靶标并且在58℃或低于58℃ (热通道1)检测扩增。具有5'非靶标结合标签序列的第二探针(表4，SEQ ID NO: 10)，特异性结合HIV-1-M ltr靶标并在限定于83℃的第二热通道中检测扩增。
表4
描述 序列 修饰 SEQ ID NO:
IC探针 FTGCGCGTCCCGTTTTGATACTTCGTAACGGTGCQP Q=BHQ-2，F=苏氨醇-Fam，P=磷酸酯 9
HIV1-M ltr探针 QTCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACF<u>CACACATTGGCACCGCCGTCT</u>P Q=BHQ-2，F=苏氨醇-Fam，P=磷酸酯，下划线= L-DNA修饰的碱基 10
Q-标签 <u>AGACGGCGGTGCCAATGTGTG</u>QP Q=BHQ-2，P=磷酸酯，下划线= L-DNA修饰的碱基 11
每个16μL反应含有3％甘油，60mM Tricine，120mM乙酸钾，dATP，dCTP和dGTP各400μM，800μM dUTP，正向引物各0.3μM，反向引物各0.3μM，0.3μM的检测探针(SEQ ID NO: 9 &10)，0.6μM的Q-标签(SEQ ID NO: 11)，5.4％DMSO，0.02％吐温20，43.9μM EDTA，0.03％叠氮化钠，0.2U/μL尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)，0.67μM NTQ21-46A适体，0.9U/μL Z05D聚合酶和3.3mM乙酸锰(pH6.3)。
在Roche LightCycler®480仪器上进行PCR扩增。使反应经历如实施例1中表2所述的温度谱。在PCR循环之前(以定义基线荧光)和PCR后，在每个热通道捕获荧光。绘制减去基线的荧光数据，并限定阈值以确定每个热通道处的阴性(无靶标存在)与阳性(存在一个或多个靶标)孔。当存在IC时，由于在扩增的重复循环期间常规IC探针的切割和报告子染料与猝灭剂的分离，在热通道1中观察到荧光信号(图10A)。当存在HIV1-M ltr时，由于标记的HIV1-M ltr探针切割以及由于报告子染料标记的探针切割片段从互补的Q-标签解链而导致的信号热活化，在热通道2中观察到荧光信号(图11B)。当两个靶标都存在时，在两个热通道中都观察到信号(图12A和12B)。因此，通过温度校正和荧光减法，从热通道2去除IC交叉信号，使得能够在热通道2中的单独HIV1-M检测(图12B)。
将每个96孔组的阴性反应比率应用于泊松计算，以确定遍及这些孔的每个靶标的总拷贝数。泊松方程基于λ= -ln(1-p)，其中λ是每孔计算的拷贝数，并且p是所有孔的正分数。通过将λ乘以96，计算遍及96孔的总拷贝数。结果显示在表5中，并且证明了在终点检测时，IC模板与HIV1-M ltr模板在单个荧光通道中和在两个热通道中的独特检测。
表5
样品 热通道1，58℃ 热通道2，83℃
仅IC 84个拷贝 未检测到
仅HIV1-M 未检测到 48个拷贝
IC + HIV1-M 82个拷贝 47个拷贝
非正式序列表
SEQ ID NO 1：9FAM9TAG寡核苷酸序列
CGTCGCCAGTCAGCTCCGGT
SEQ ID NO 2：Q0猝灭寡核苷酸序列(无猝灭剂)
CCGGAGCTGACTGGCGACG
SEQ ID NO 3：Q1猝灭寡核苷酸序列(5'末端上的BHQ-1猝灭剂)
CCGGAGCTGACTGGCGACG
SEQ ID NO 4：IC TaqMan探针寡核苷酸序列(FAM/BHQ/磷酸酯)
TGCGCGTCCCGTTTTGATACTTCGTAACGGTGC
SEQ ID NO 5：HIV1-M gag标记探针寡核苷酸序列(BHQ/FAM/磷酸酯)
TCTGCAGCTTCCTCATTGATGGTATCTTTTAACCACACATTGGCACCGCCGTCT
SEQ ID NO 6：HIV1-M ltr标记探针寡核苷酸序列(BHQ/FAM/磷酸酯)
TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCACGTCTCGGTGGTGGCGTTT
SEQ ID NO 7：HIV1-M gag猝灭寡核苷酸序列(3'末端上的BHQ-1猝灭剂)
AGACGGCGGTGCCAATGTGTG
SEQ ID NO 8：HIV1-M ltr猝灭寡核苷酸序列(3'末端上的BHQ-1猝灭剂)
AAACGCCACCACCGAGACGTG
SEQ ID NO 9：IC探针寡核苷酸序列(来自实施例3)
TGCGCGTCCCGTTTTGATACTTCGTAACGGTGC
SEQ ID NO 10：HIV1-M ltr探针寡核苷酸序列(来自实施例3)
TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCACACATTGGCACCGCCGTCT
SEQ ID NO 11：Q-标签寡核苷酸序列(来自实施例3)
AGACGGCGGTGCCAATGTGTG。
序列表
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F. Hoffmann-La Roche AG
Roche Molecular Systems, Inc.
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tctctagcag tggcgcccga acagggacca cacattggca ccgccgtct 49
<210> 6
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV1-M ltr标记探针寡核苷酸
<400> 6
tctctagcag tggcgcccga acagggacca cgtctcggtg gtggcgttt 49
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV1-M gag淬灭寡核苷酸
<400> 7
agacggcggt gccaatgtgt g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV1-M ltr淬灭寡核苷酸
<400> 8
aaacgccacc accgagacgt g 21
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IC探针寡核苷酸(来自实施例3)
<400> 9
tgcgcgtccc gttttgatac ttcgtaacgg tgc 33
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HIV1-M ltr探针寡核苷酸序列(来自实施例3)
<400> 10
tctctagcag tggcgcccga acagggacca cacattggca ccgccgtct 49
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Q-标签寡核苷酸序列(来自实施例3)
<400> 11
agacggcggt gccaatgtgt g 21

Claims (26)

1.用于扩增和检测样品中的靶核酸的方法，其包括以下步骤：
(a) 使含有所述靶核酸的所述样品在单个反应容器中与以下接触：
(i) 一对寡核苷酸引物，每个寡核苷酸引物能够与所述靶核酸的子序列的相反链杂交；
(ii) 寡核苷酸探针，其包含退火部分和标签部分，其中所述标签部分包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列或非核苷酸分子，其中所述退火部分包含与所述靶核酸序列至少部分互补的核苷酸序列，并杂交至由所述对寡核苷酸引物界定的所述靶核酸的所述子序列的部分，其中所述探针还包含相互作用的双重标记，其包含位于所述标签部分上或所述退火部分上的报告子部分和位于所述退火部分上的第一猝灭剂部分，并且其中通过核酸酶敏感的切割位点将所述报告子部分与所述第一猝灭剂部分分离；且其中所述标签部分以温度依赖性方式可逆地结合至猝灭分子，所述猝灭分子包含一个或多个猝灭剂部分或与一个或多个猝灭剂部分结合，当所述猝灭分子与所述标签部分结合时，所述一个或多个猝灭剂部分能够猝灭或在退火部分上的所述报告子部分；
(b) 使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶，通过PCR扩增所述靶核酸，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，聚合酶的核酸酶活性允许从探针的退火部分上的第一猝灭剂部分切割和分离标签部分；
(c) 在猝灭分子与标签部分结合的第一温度下测量来自报告子部分的一个或多个信号；
(d) 在高于第一温度的第二温度下测量来自报告子部分的一个或多个信号，在所述第二温度下猝灭分子不与标签部分结合；
(e) 通过从在第二温度下检测到的一个或多个信号的中值或平均值减去在第一温度下检测到的一个或多个信号的中值或平均值，获得计算信号值；由此，高于阈信号值的计算信号值允许确定靶核酸的存在。
2.权利要求1的方法，其中允许步骤(b)的PCR扩增达到超出扩增对数期的终点。
3.权利要求1的方法，其中所述报告子部分位于所述寡核苷酸探针的标签部分上或所述寡核苷酸探针的退火部分上。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述标签部分包含与靶核酸序列不互补的核苷酸序列，并且所述猝灭分子是包含与所述寡核苷酸探针的标签部分至少部分互补的核苷酸序列的寡核苷酸，并通过杂交与所述标签部分结合。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述标签部分包含修饰，使得其不能被核酸聚合酶延伸。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述寡核苷酸探针的标签部分或所述猝灭分子或所述标签部分和所述猝灭分子两者含有一种或多种核苷酸修饰。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述一种或多种核苷酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、桥连核酸(BNA)、2'-O烷基取代、L-对映体核苷酸，或其组合。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述报告子部分是荧光染料，并且所述猝灭剂部分猝灭来自所述荧光染料的可检测信号。
9.用于检测样品中的两种或更多种靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：
(a) 使怀疑含有所述两种或更多种靶核酸序列的所述样品在单个反应容器中与以下接触：
(i) 第一对寡核苷酸引物和第二对寡核苷酸引物，所述第一对寡核苷酸引物具有与第一靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列，且所述第二对寡核苷酸引物具有与第二靶核酸序列的每条链互补的核苷酸序列；
(ii) 第一寡核苷酸探针，其包含与第一靶核酸序列至少部分互补的核苷酸序列，并在由第一对寡核苷酸引物界定的第一靶核酸序列内退火，其中所述第一寡核苷酸探针包含能够产生可检测信号的荧光部分和能够猝灭由荧光部分产生的可检测信号的第一猝灭剂部分，其中通过核酸酶敏感的切割位点将荧光部分与第一猝灭剂部分分离；
(iii) 第二寡核苷酸探针，其包含两个不同部分：退火部分和标签部分，所述退火部分包含与第二靶核酸序列至少部分互补的核苷酸序列，并且在由第二对寡核苷酸引物界定的第二靶核酸序列内退火，其中退火部分包含第二猝灭剂部分；且所述标签部分连接到退火部分的5'末端或3'末端，或通过接头连接到退火部分的区域并包含与所述两种或更多种靶核酸序列不互补的核苷酸序列，其中标签部分包含与第一寡核苷酸探针上的荧光部分相同的荧光部分，并且其可检测信号能够被退火部分上的第二猝灭剂部分猝灭，其中通过核酸酶敏感的切割位点将所述荧光部分与第二猝灭部分分离；
(iv) 猝灭寡核苷酸，其包含与第二寡核苷酸探针的标签部分至少部分互补的核苷酸序列，并与标签部分杂交以形成双链体，其中所述猝灭寡核苷酸包含第三猝灭剂部分，当猝灭寡核苷酸与标签部分杂交时，所述第三猝灭剂部分猝灭由标签部分上的荧光部分产生的可检测信号；
(b) 使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增第一和第二靶核酸序列，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性允许从第一寡核苷酸探针上的第一猝灭部分切割并分离荧光部分，并且从第二寡核苷酸探针的退火部分上的第二猝灭部分切割并分离标签部分上的荧光部分，其中在延伸步骤，猝灭寡核苷酸保持与标签部分杂交；
(c) 在猝灭寡核苷酸与来自第二寡核苷酸探针的标签部分杂交的第一温度下测量一个或多个荧光信号；
(d) 在高于第一温度的第二温度下测量一个或多个荧光信号，在所述第二温度下猝灭寡核苷酸不与来自第二寡核苷酸探针的标签部分杂交；
(e) 通过从在第二温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值减去在第一温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值，获得计算信号值；由此，高于阈值的在第一温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值的值允许确定第一靶核酸序列的存在，并且高于阈信号值的计算信号值允许确定第二靶核酸的存在。
10.权利要求9的方法，其中允许步骤(b)的PCR扩增达到超出扩增对数期的终点。
11.权利要求10的方法，其中所述标签部分连接到所述退火部分的5'末端或所述退火部分的3'末端。
12.权利要求9-11中任一项的方法，其中所述标签部分包含修饰，使得其不能被核酸聚合酶延伸。
13.权利要求9-12中任一项的方法，其中所述猝灭寡核苷酸通过茎-环结构与第二寡核苷酸探针的标签部分连接。
14.权利要求9-13中任一项的方法，其中所述第二寡核苷酸探针的标签部分或所述猝灭寡核苷酸或所述标签部分和所述猝灭寡核苷酸两者含有一种或多种核苷酸修饰。
15.权利要求9-14中任一项的方法，其中所述一种或多种核苷酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、桥连核酸(BNA)、2'-O烷基取代、L-对映体核苷酸，或其组合。
16.用于检测样品中的两种或更多种靶核酸序列的方法，其包括以下步骤：
(a) 使怀疑含有所述两种或更多种靶核酸序列的所述样品在单个反应容器中与以下接触：
(i) 第一对寡核苷酸引物和第二对寡核苷酸引物，所述第一对寡核苷酸引物具有与第一靶核酸序列的每条链互补的序列，且所述第二对寡核苷酸引物具有与第二靶核酸序列的每条链互补的序列；
(ii) 第一寡核苷酸探针，其包含两个不同部分：第一退火部分和第一标签部分，所述第一退火部分包含与第一靶核酸序列至少部分互补的序列，并在由第一对寡核苷酸引物界定的第一靶核酸序列内退火，其中第一退火部分包含第一猝灭剂部分并在3'末端被阻断以阻止通过核酸聚合酶的延伸；且所述第一标签部分连接到第一退火部分的5'末端或3'末端，并且包含与所述两种或更多种靶核酸序列不互补的核苷酸序列，其中第一标签部分包含荧光部分，其可检测信号能够被第一退火部分上的第一猝灭剂部分猝灭，其中通过核酸酶敏感的切割位点将所述荧光部分与第一猝灭部分分离；
(iii) 第一猝灭寡核苷酸，其包含与第一寡核苷酸探针的第一标签部分至少部分互补的序列，并与第一标签部分杂交以形成双链体，其中所述第一猝灭寡核苷酸包含第二猝灭部分，当第一猝灭寡核苷酸与第一标签部分杂交时，所述第二猝灭部分猝灭由第一标签部分上的荧光部分产生的可检测信号；
(iv) 第二寡核苷酸探针，其包含两个不同部分：第二退火部分和第二标签部分，所述第二退火部分包含与第二靶核酸序列至少部分互补的序列，并在由第二对寡核苷酸引物界定的第二靶核酸序列内退火，其中第二退火部分包含第三猝灭剂部分并在3'末端被阻断以阻止通过核酸聚合酶的延伸；且所述第二标签部分连接到第二退火部分的5'末端或3'末端并且包含与所述两种或更多种靶核酸序列不互补的核苷酸序列，并且与第一寡核苷酸探针的第一标签部分的核苷酸序列相比具有不同的核酸序列或不同的核苷酸修饰，其中第二标签部分包含荧光部分，其与第一寡核苷酸探针上的荧光部分相同，并且其可检测信号能够被第二退火部分上的第三猝灭剂部分猝灭，其中通过核酸酶敏感的切割位点将所述荧光部分与第三猝灭部分分离；
(v) 第二猝灭寡核苷酸，其包含与第二寡核苷酸探针的第二标签部分至少部分互补的序列，并与第二标签部分杂交以形成双链体，其中所述第二猝灭寡核苷酸包含第四猝灭部分，当第二猝灭寡核苷酸与第二标签部分杂交时，所述第四猝灭部分猝灭由第二标签部分上的荧光部分产生的可检测信号；
其中第二猝灭寡核苷酸和第二寡核苷酸探针的第二标签部分之间的双链体具有比第一猝灭寡核苷酸和第一寡核苷酸探针的第一标签部分之间的双链体更高的解链温度(Tm)；
(b) 使用具有5'至3'核酸酶活性的核酸聚合酶，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增第一和第二靶核酸序列，使得在每个PCR循环的延伸步骤期间，核酸聚合酶的5'至3'核酸酶活性允许：
(i) 从第一寡核苷酸探针的第一退火部分上的第一猝灭部分切割并分离第一标签部分上的荧光部分，其中在延伸步骤，第一猝灭寡核苷酸保持与第一标签部分杂交；和
(ii) 从第二寡核苷酸探针的第二退火部分上的第三猝灭部分切割并分离第二标签部分上的荧光部分，其中在延伸步骤，第二猝灭寡核苷酸保持与第二标签部分杂交；
(c) 在第一温度下测量一个或多个荧光信号，在所述第一温度下，第一猝灭寡核苷酸不与来自第一寡核苷酸探针的第一标签部分杂交，并且第二猝灭寡核苷酸保持与来自第二寡核苷酸探针的第二标签部分杂交；
(d) 在高于第一温度的第二温度下测量一个或多个荧光信号，在所述第二温度下，在所述第二温度下，第二猝灭寡核苷酸不与来自第二寡核苷酸探针的第二标签部分杂交；
(e) 通过从在第二温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值减去在第一温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值，获得计算信号值；由此，高于阈值的在第一温度下检测到的一个或多个荧光信号的中值或平均值的值允许确定第一靶核酸序列的存在，并且高于阈信号值的计算信号值允许确定第二靶核酸的存在。
17.权利要求16的方法，其中允许步骤(b)的PCR扩增达到超出扩增对数期的终点。
18.权利要求16或17的方法，其中第一标签部分连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的3'末端，并且第二标签部分连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的3'末端，或者，第一标签部分连接到第一寡核苷酸探针的第一退火部分的5'末端，并且第二标签部分连接到第二寡核苷酸探针的第二退火部分的5'末端。
19.权利要求16-18中任一项的方法，其中第一猝灭寡核苷酸通过茎-环结构与第一寡核苷酸探针的第一标签部分连接。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中第二猝灭寡核苷酸通过茎-环结构与第二寡核苷酸探针的第二标签部分连接。
21.权利要求16-20中任一项的方法，其中释放的第一标签部分和释放的第二标签部分都包含修饰，使得两个释放的标签部分都不能被核酸聚合酶延伸。
22.权利要求16-21中任一项的方法，由此通过数字PCR进行靶核酸的扩增和检测。
23.权利要求16-22中任一项的方法，由此通过数字PCR进行两种或更多种靶核酸序列的检测。
24.权利要求16-23中任一项的方法，由此通过数字PCR进行两种或更多种靶核酸序列的检测。
25.权利要求16-24中任一项的方法，其中第一寡核苷酸探针的第一标签部分或第一猝灭寡核苷酸或第二寡核苷酸探针的第二标签部分或第二猝灭寡核苷酸的任一种或其任意组合含有一种或多种核苷酸修饰。
26.权利要求16-25中任一项的方法，其中所述一种或多种核苷酸修饰选自锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、桥连核酸(BNA)、2'-O烷基取代、L-对映体核苷酸，或其组合。
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