ES2893411T3

ES2893411T3 - Procedimientos para realizar PCR multiplexada

Info

Publication number: ES2893411T3
Application number: ES17768765T
Authority: ES
Inventors: Igor Kozlov; Amar Gupta; Randall Saiki; Alison Tsan
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2016-09-15
Filing date: 2017-09-15
Publication date: 2022-02-09
Anticipated expiration: 2037-09-15
Also published as: WO2018050824A1; US11034997B2; US20210269857A1; CA3033250A1; EP3512960A1; CN109689884A; CN109689889A; US20180073056A1; CA3036119A1; US11028433B2; DK3512959T3; AU2017328613B2; EP3512960B1; JP7063886B2; US11345958B2; EP3512959B1; ES2933176T3; AU2017328613A1; KR20190046880A; EP3512959A1

Abstract

Un procedimiento para la amplificación y detección de un ácido nucleico diana en una muestra que comprende las etapas de: (a) poner en contacto dicha muestra que contiene dicho ácido nucleico diana en un recipiente de reacción individual con (i) un par de cebadores oligonucleotídicos, cada cebador oligonucleotídico se puede hibridar a hebras opuestas de una subsecuencia de dicho ácido nucleico diana; (ii) una sonda oligonucleotídica que comprende una porción de hibridación y una porción de marca, en la que la porción de marca comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana o una molécula no nucleotídica, en la que la porción de hibridación comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida a una región de dicha subsecuencia de dicho ácido nucleico diana que se une por dicho par de cebadores oligonucleotídicos, en la que dicha sonda oligonucleotídica comprende además un marcador doble interactivo que comprende un resto indicador localizado en dicha porción de marca o en dicha porción de hibridación y un primer resto extintor localizado en dicha porción de hibridación y en la que dicho resto indicador se separa de dicho primer resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa; y en la que dicha porción de marca se une reversiblemente de una manera dependiente de la temperatura a una molécula de extinción que comprende o se asocia con uno o más restos extintores que pueden extinguir dicho resto indicador cuando dicha molécula de extinción se une a dicha porción de marca; (b) amplificar dicho ácido nucleico diana por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando una ácido nucleico polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3' de modo que durante una etapa de extensión de cada ciclo de PCR, la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa permite la escisión y separación de la porción de marca del primer resto extintor en la porción de hibridación de la sonda oligonucleotídica; (c) medir una o más señales del resto indicador a una primera temperatura a la que la molécula de extinción se une a la porción de marca; (d) medir una o más señales del resto indicador a una segunda temperatura, que es mayor que la primera temperatura, a la que la molécula de extinción no se une a la porción de marca; (e) obtener un valor de señal calculado restando una mediana o promedio de la una o más señales detectadas a la primera temperatura de una mediana o promedio de la una o más señales detectadas a la segunda temperatura; con lo que un valor de señal calculado que es mayor que un valor de señal umbral permite la determinación de la presencia del ácido nucleico diana.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimientos para realizar PCR multiplexada

Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en particular a procedimientos para realizar PCR multiplexada.

Antecedentes de la invención

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en una herramienta ubicua de investigación biomédica, seguimiento y diagnóstico de enfermedades. La amplificación de secuencias de ácido nucleico por PCR se describe en las patentes de EE. UU. n.os 4.683.195, 4.683.202 y 4.965.188. La PCR es ahora bien conocida en la técnica y se ha descrito ampliamente en la literatura científica. Véanse aplicaciones de PCR, ((1999) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego), estrategias de PCR, ((1995) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego); protocolos de PCR, ((1990) Innis et al, eds., Academic Press, San Diego) y tecnología de PCR, ((1989) Erlich, ed., Stockton Press, New York).

Un ensayo de PCR "ultrarrápida" puede amplificar y detectar y cuantificar simultáneamente la cantidad inicial de la secuencia diana. Un protocolo de PCR ultrarrápida típico implica el uso de una sonda marcada, específica para cada secuencia diana. La sonda se marca preferentemente con uno o más restos fluorescentes, que absorben y emiten luz en longitudes de onda específicas. T ras hibridarse a la secuencia diana o su amplicón, la sonda presenta un cambio detectable en la emisión fluorescente como resultado de hibridación o hidrólisis de sonda.

Sin embargo, el principal desafío de un ensayo de PCR sigue siendo la capacidad para analizar numerosas dianas en un tubo individual. Prácticamente en todos los campos de la medicina y el diagnóstico, el número de locus de interés se incrementa rápidamente. Por ejemplo, se deben analizar múltiples locus en la identificación de ADN forense, detección de microorganismos patógenos, cribado de enfermedades genéticas de múltiples locus y estudios de expresión de múltiples genes, por nombrar unos pocos.

Con la mayoría de los procedimientos actuales, la capacidad para multiplexar un ensayo se limita por los instrumentos de detección. Específicamente, el uso de múltiples sondas en la misma reacción requiere el uso de distintos marcadores fluorescentes. Para detectar simultáneamente múltiples sondas, un instrumento debe poder discriminar las señales lumínicas emitidas por cada sonda. La mayoría de las tecnologías actuales en el mercado no permiten la detección de más de cuatro a siete longitudes de onda separadas en el mismo recipiente de reacción. Por lo tanto, usando una sonda marcada de forma única por diana, se pueden detectar no más de cuatro a siete dianas separadas en el mismo recipiente. En la práctica, al menos una diana es normalmente un ácido nucleico de control. En consecuencia, en la práctica, se pueden detectar no más de tres a seis dianas experimentales en el mismo tubo. El uso de tintes fluorescentes también se limita debido al ancho espectral donde solo se pueden ajustar aproximadamente seis o siete tintes dentro del espectro visible sin una interferencia de superposición significativa. Por tanto, la capacidad para multiplexar un ensayo no se adaptará a las necesidades clínicas, a menos que se realicen cambios radicales en la estrategia de amplificación y detección.

Una capacidad adicional para multiplexar una reacción de amplificación se proporciona por un ensayo de fusión pos-PCR. Véase la solicitud de patente de EE. UU. con n.° serie 11/474.071, presentada el 23 de junio de 2006. En un ensayo de fusión, el ácido nucleico amplificado se identifica por su perfil de fusión único. Un ensayo de fusión implica determinar la temperatura de fusión (punto de fusión) de una diana bicatenaria, o un dúplex entre la sonda marcada y la diana. Como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.871.908, para determinar la temperatura de fusión usando una sonda marcada de forma fluorescente, se calienta (o se enfría) gradualmente un dúplex entre el ácido nucleico diana y la sonda en un programa de temperatura controlada. La disociación del dúplex cambia la distancia entre los fluoróforos que interactúan o entre un fluoróforo y un extintor. Los fluoróforos que interactúan se pueden conjugar para separar moléculas de sonda, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.174.670. De forma alternativa, un fluoróforo se puede conjugar a una sonda, mientras que el otro fluoróforo se puede intercalar en un dúplex de ácido nucleico, como se describe en la patente de EE. UU. n.° 5.871.908. Aún como otra alternativa, los fluoróforos se pueden conjugar a un oligonucleótido de sonda individual. Tras la fusión del dúplex, la fluorescencia se extingue a medida que el fluoróforo y el extintor se unen en la sonda ahora monocatenaria.

La fusión del dúplex de ácido nucleico se sigue midiendo el cambio asociado en la fluorescencia. El cambio en la fluorescencia se puede representar en un gráfico denominado "perfil de fusión". Debido a que se pueden diseñar diferentes dúplex sonda-diana para fundirse (o rehibridarse) a diferentes temperaturas, cada sonda generará un perfil de fusión único. Las sondas diseñadas apropiadamente tendrían temperaturas de fusión que se pueden distinguir claramente de las de las otras sondas en el mismo ensayo. Muchas herramientas informáticas existentes permiten diseñar sondas para un ensayo múltiple en el mismo tubo con estos objetivos en mente. Por ejemplo, el programa informático Visual OMP™ (DNA Software, Inc., Ann Arbor, Michigan) permite determinar las temperaturas de fusión de dúplex de ácido nucleico en diversas condiciones de reacción.

El procedimiento de PCR múltiple usando detección de color y posterior ensayo de fusión posamplificación se describe en la patente de EE. UU. n.° 6.472.156. El número de dianas detectables por un procedimiento de este tipo es un producto del número de longitudes de onda detectables y el número de perfiles de fusión distinguibles. Por lo tanto, añadir un ensayo de fusión a la detección de color fue un paso adelante en la capacidad para detectar múltiples dianas.

El ensayo de fusión posamplificación se usa más comúnmente con propósitos cualitativos, es decir, para identificar ácidos nucleicos diana, véanse las patentes de EE. UU. n.os 6.174.670, 6.427.156 y 5.871.908. Es conocido cómo obtener un pico de fusión diferenciando la función de la curva de fusión. Ririe et al. ("Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerase chain reaction", (1997) Anal. Biochem. 245:154-160) observó que la diferenciación ayuda a resolver las curvas de fusión generadas por mezclas de productos. Después de la diferenciación, los picos de fusión generados por cada componente de la mezcla se vuelven fácilmente distinguibles. También era conocido previamente que la señal de fusión posamplificación, es decir, el pico de fusión, es mayor en proporción a la cantidad de ácido nucleico en la muestra. Por ejemplo, la patente de Ee . UU. n.° 6.245.514 enseña un ensayo de fusión posamplificación usando un tinte de intercalación dúplex, para generar un pico de fusión derivado, y a continuación, usando un programa informático patentado, para integrar el pico. La integración proporciona información sobre la eficacia de amplificación y cantidad relativa del ácido nucleico amplificado.

En la práctica, sería deseable ir más allá de un ensayo cualitativo y poder cuantificar múltiples dianas en la misma muestra. Véase, por ejemplo, Sparano et al. "Development of the 21-gene assay and its application in clinical practice and clinical trials", J. Clin. Oncol. (2008) 26(5):721-728. La capacidad para cuantificar la cantidad de diana es útil en aplicaciones clínicas, tales como la determinación de carga vírica en el suero de un paciente, medición del nivel de expresión de un gen en respuesta a tratamiento farmacológico o determinación de la firma molecular de un tumor para predecir su respuesta al tratamiento.

Son conocidos muchos procedimientos para la detección de ácidos nucleicos diana. Los ensayos homogéneos disponibles actualmente para la detección de ácido nucleico incluyen los ensayos TaqMan®, Ampliflour®, de fijación de tinte, PCR cinética selectiva de alelos y de cebadores Scorpion®. Estos procedimientos de ensayo no se multiplexan fácilmente debido al requisito de detectar un tinte diferente para cada ácido nucleico diana, y por tanto están limitados en su potencial de mejora. Para superar dichas limitaciones, varios estudios recientes han divulgado el uso de sondas oligonucleotídicas que contienen una porción de "marca" escindible que se puede separar y detectar fácilmente (por ejemplo, véanse Chenna et al., publicación de solicitud de patente de e E. UU. n.° 2005/0053939, Van Den Boom, patente de EE. UU. n.° 8.133.701). Más recientemente, se han descrito procedimientos mejorados para realizar la identificación de diana de ácido nucleico multiplexada usando escisión de sonda oligonucleotídica basada en estructura en la publicación de solicitud de patente de EE. UU.

2014/0272955, documentos U.S. 2015/0176075 y U.S. 2015/0376681. Otros procedimientos para detectar la secuencia de ácido nucleico diana a partir de ADN o una mezcla de ácido nucleico por el uso de una combinación de "oligonucleótido de sondeo y marcaje" (PTO) y "oligonucleótido de captura y moldeo" (CTO) en un denominado ensayo de escisión y extensión con pTo se han descrito por Chun et al. en la patente de EE. UU. n.° 8.809.239. Sin embargo, todavía existe la necesidad de un procedimiento exacto para realizar la detección múltiple de alto rendimiento de ácidos nucleicos diana. En particular, sería una ventaja realizar la detección múltiple de alto rendimiento de ácidos nucleicos diana en un ensayo de PCR de punto final, con lo que se necesita que la detección de los productos amplificados se produzca solo una vez, al final (o casi al final) del ensayo de PCR o después de la finalización del ensayo de PCR.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona procedimientos novedosos para la detección de secuencias de ácido nucleico, en particular la detección de múltiples ácidos nucleicos diana en los que se realiza una reacción de PCR hasta que alcanza un punto final más allá de la fase logarítmica de amplificación (por ejemplo, en la fase de meseta). Los procedimientos se realizan por el uso de sondas oligonucleotídicas novedosas que tienen dos rasgos característicos únicos, una porción de marca no complementaria y una molécula de extinción.

Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un procedimiento para amplificación y detección de un ácido nucleico diana en una muestra que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra que contiene el ácido nucleico diana en un recipiente de reacción individual con (i) un par de cebadores oligonucleotídicos, cada cebador oligonucleotídico se puede hibridar a hebras opuestas de una subsecuencia del ácido nucleico diana; (ii) una sonda oligonucleotídica que comprende una porción de hibridación y una porción de marca, en la que la porción de marca comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana o una molécula no nucleotídica, en la que la porción de hibridación comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida a una región de la subsecuencia del ácido nucleico diana que se une por el par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la sonda comprende además un marcador doble interactivo que comprende un resto indicador localizado en la porción de marca o en la porción de hibridación y un primer resto extintor localizado en la porción de hibridación y en la que el resto indicador se separa del primer resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa; y en la que la porción de marca se une reversiblemente de manera dependiente de la temperatura a una molécula de extinción que comprende o se asocia con uno o más restos extintores que pueden extinguir el resto indicador cuando la molécula de extinción se une a la porción de marca; (b) amplificar el ácido nucleico diana por PCR usando una ácido nucleico polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3' de modo que durante una etapa de extensión de cada ciclo de PCR, la actividad nucleasa de la polimerasa permite la escisión y separación del resto indicador del primer resto de extinción en la porción de hibridación de la sonda; (c) medir una o más señales del resto indicador a una primera temperatura a la que la molécula de extinción se une a la porción de marca; (d) medir una o más señales del resto indicador a una segunda temperatura, que se mayor que la primera temperatura, a la que la molécula de extinción no se une a la porción de marca; (e) obtener un valor de señal calculado restando una mediana o promedio de la una o más señales detectadas a la primera temperatura de una mediana o promedio de la una o más señales detectadas a la segunda temperatura; con los que un valor de señal calculado que es mayor que un valor de señal umbral permite la determinación de la presencia del ácido nucleico diana. En un modo de realización, se permite que la amplificación por PCR alcance un punto final más allá de la fase logarítmica de amplificación (por ejemplo, en la fase de meseta).

En un modo de realización, la porción de marca comprende una modificación de modo que no se puede extender por una ácido nucleico polimerasa. En un modo de realización, el resto indicador está en la porción de marca de la sonda oligonucleotídica. En otro modo de realización, el resto indicador se localiza en la porción de hibridación de la sonda oligonucleotídica y puede interactuar de manera dependiente de la temperatura con la molécula de extinción que comprende el segundo resto inhibidor. En un modo de realización, la porción de marca comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y la molécula de extinción es un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la porción de marca de la sonda oligonucleotídica y se une a la porción de marca por hibridación. En otro modo de realización, la porción de marca de la sonda oligonucleotídica o la molécula de extinción o tanto la porción de marca como la molécula de extinción contienen una o más modificaciones de nucleótidos. Aún en otro modo de realización, la una o más modificaciones de nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido peptidonucleico (PNA), ácido nucleico con puente (BNA), sustitución de 2'-O-alquilo, nucleótido L-enantiomérico, o combinaciones de los mismos. En un modo de realización, el resto indicador es un tinte fluorescente y el resto extintor extingue una señal detectable del tinte fluorescente.

En otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar dos o más secuencias de ácido nucleico diana en una muestra que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra sospechosa de contener las dos o más secuencias de ácido nucleico diana en un recipiente de reacción individual con (i) un primer par de cebadores oligonucleotídicos con secuencias de nucleótidos que son complementarias a cada hebra de una primera secuencia de ácido nucleico diana, y un segundo par de cebadores oligonucleotídicos con secuencias de nucleótidos que son complementarias a cada hebra de una segunda secuencia de ácido nucleico diana; (ii) una primera sonda oligonucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la primera secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida dentro de la primera secuencia de ácido nucleico diana unida por el primer par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la primera sonda oligonucleotídica comprende un resto fluorescente que puede generar una señal detectable y un primer resto extintor que puede extinguir la señal detectable generada por el resto fluorescente, en la que el resto fluorescente se separa del primer resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa; (iii) una segunda sonda oligonucleotídica que comprende dos porciones distintas, una porción de hibridación que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida dentro de la segunda secuencia de ácido nucleico diana unida por el segundo par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la porción de hibridación comprende un segundo resto extintor; y una porción de marca unida al extremo 5' o al extremo 3' de la porción de hibridación o enlazada por medio de un conector a una región de la porción de hibridación y que comprende una secuencia de nucleótidos que es no complementaria a las dos o más secuencias de ácido nucleico diana, en la que la porción de marca comprende un resto fluorescente que es idéntico al resto fluorescente en la primera sonda oligonucleotídica y con una señal detectable que se puede extinguir por el segundo resto extintor en la porción de hibridación, en la que el resto fluorescente se separa del segundo resto de extinción por un sitio de escisión susceptible de nucleasa; (iv) un oligonucleótido de extinción que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica y se hibrida a la porción de marca para formar un dúplex, en la que el oligonucleótido de extinción comprende un tercer resto extintor que extingue la señal detectable generada por el resto fluorescente en la porción de marca cuando el oligonucleótido de extinción se hibrida a la porción de marca; (b) amplificar la primera y segunda secuencias de ácido nucleico diana por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando una ácido nucleico polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3' de modo que durante una etapa de extensión de cada ciclo de PCR, la actividad nucleasa 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa permite la escisión y separación del resto fluorescente del primer resto extintor en la primera sonda oligonucleotídica, y la escisión y separación del resto fluorescente en la porción de marca del segundo resto extintor en la porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica, en la que en la etapa de extensión el oligonucleótido extintor permanece hibridado a la porción de marca; (c) medir una o más señales fluorescentes a una primera temperatura a la que el oligonucleótido extintor se hibrida a la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica; (d) medir una o más señales fluorescentes a una segunda temperatura, que es mayor que la primera temperatura, a la que el oligonucleótido extintor no se híbrida a la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica; (e) obtener un valor de señal calculado restando una mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la primera temperatura de una mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la segunda temperatura; con lo que la mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la primera temperatura que es mayor que un valor umbral permite la determinación de la presencia de la primera secuencia de ácido nucleico diana y el valor de señal calculado que es mayor que el valor de señal umbral permite la determinación de la presencia del segundo ácido nucleico diana. En un modo de realización, se permite que la amplificación por PCR alcance un punto final más allá de la fase logarítmica de amplificación (por ejemplo, en la fase de meseta).

En un modo de realización, la porción de marca comprende una modificación de modo que no se puede extender por una ácido nucleico polimerasa. En otro modo de realización, la porción de marca se une al extremo 5' de la porción de hibridación. Aún en otro modo de realización, la porción de marca se une al extremo 3' de la porción de hibridación. Aún en otro modo de realización, la porción de marca se une por medio de un conector a una región de la porción de hibridación. En otro modo de realización, la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica o el oligonucleótido de extinción o tanto la porción de marca como el oligonucleótido de extinción contienen una o más modificaciones de nucleótidos. Aún en otro modo de realización, la una o más modificaciones de nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido peptidonucleico (PNA), ácido nucleico con puente (BNA), sustitución de 2'-O-alquilo, nucleótido L-enantiomérico, o combinaciones de los mismos.

Aún en otro aspecto, la invención proporciona un procedimiento para detectar dos o más secuencias de ácido nucleico diana en una muestra que comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra sospechosa de contener las dos o más secuencias de ácido nucleico diana en un recipiente de reacción individual con (i) un primer par de cebadores oligonucleotídicos con secuencias que son complementarias a cada hebra de una primera secuencia de ácido nucleico diana, y un segundo par de cebadores oligonucleotídicos con secuencias que son complementarias a cada hebra de una segunda secuencia de ácido nucleico diana; (ii) una primera sonda oligonucleotídica que comprende dos porciones distintas, una primera porción de hibridación que comprende una secuencia al menos parcialmente complementaria a la primera secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida dentro de la primera secuencia de ácido nucleico diana unida por el primer par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la primera porción de hibridación comprende un primer resto extintor; y una primera porción de marca unida al extremo 5' o al extremo 3' de la primera porción de hibridación o unida por medio de un conector a una región de la primera porción de hibridación y que comprende una secuencia de nucleótidos que es no complementaria a las dos o más secuencias de ácido nucleico diana, en la que la primera porción de marca comprende un resto fluorescente con una señal detectable que se puede extinguir por el primer resto extintor en la primera porción de hibridación, en la que el resto fluorescente se separa del primer resto de extinción por un sitio de escisión susceptible de nuclease; (iii) un primer oligonucleótido de extinción que comprende una secuencia al menos parcialmente complementaria a la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica y se hibrida a la primera porción de marca para formar un dúplex, en la que el primer oligonucleótido de extinción comprende un segundo resto de extinción que extingue la señal detectable generada por el resto fluorescente en la primera porción de marca cuando el primer oligonucleótido de extinción se hibrida a la primera porción de marca; (iv) una segunda sonda oligonucleotídica que comprende dos porciones distintas, una segunda porción de hibridación que comprende una secuencia al menos parcialmente complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida dentro de la segunda secuencia de ácido nucleico diana unida por el segundo par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la segunda porción de hibridación comprende un tercer resto extintor; y una segunda porción de marca unida al extremo 5'o al extremo 3' de la segunda porción de hibridación o unida por medio de un conector a una región de la segunda porción de hibridación y que comprende una secuencia de nucleótidos que es no complementaria a las dos o más secuencias de ácido nucleico diana, y tiene una secuencia de ácido nucleico diferente o modificaciones de nucleótidos diferentes en comparación con la secuencia de nucleótidos de la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica, en la que la segunda porción de marca comprende un resto fluorescente que es idéntico al resto fluorescente en la primera sonda oligonucleotídica y con una señal detectable que se puede extinguir por el tercer resto extintor en la segunda porción de hibridación, en la que el resto fluorescente se separa del tercer resto de extinción por un sitio de escisión susceptible de nucleasa; (v) un segundo oligonucleótido de extinción que comprende una secuencia al menos parcialmente complementaria a la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica y se hibrida a la segunda porción de marca para formar un dúplex, en la que el segundo oligonucleótido de extinción comprende un cuarto resto de extinción que extingue la señal detectable generada por el resto fluorescente en la segunda porción de marca cuando el segundo oligonucleótido de extinción se hibrida a la segunda porción de marca; en la que el dúplex entre el segundo oligonucleótido de extinción y la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica tiene un valor de temperatura de fusión (Tf) mayor que el dúplex entre el primer oligonucleótido de extinción y la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica; (b) amplificar la primera y segunda secuencias de ácido nucleico diana por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando una ácido nucleico polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3' de modo que durante una etapa de extensión de cada ciclo de PCR, la actividad nucleasa 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa permite (i) la escisión y separación del resto fluorescente en la primera porción de marca del primer resto de extinción en la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica, en la que en la etapa de extensión el primer oligonucleótido de extinción permanece hibridado a la primera porción de marca, y (ii) la escisión y separación del resto fluorescente en la segunda porción de marca del tercer resto de extinción en la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica, en la que en la etapa de extensión el segundo oligonucleótido de extinción permanece hibridado a la segunda porción de marca; (c) medir una o más señales fluorescentes a una primera temperatura a la que el primer oligonucleótido de extinción no se hibrida a la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica y el segundo oligonucleótido de extinción permaneces hibridado a la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica; (d) medir una o más señales fluorescentes a una segunda temperatura, que es mayor que la primera temperatura, a la que el segundo oligonucleótido de extinción no se hibrida a la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica; (e) obtener un valor de señal calculado restando una mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la primera temperatura de una mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la segunda temperatura; con lo que un valor de la mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la primera temperatura que es mayor que un valor umbral permite la determinación de la presencia de la primera secuencia de ácido nucleico diana y el valor de señal calculado que es mayor que el valor de señal umbral permite la determinación de la presencia del segundo ácido nucleico diana. En un modo de realización, se permite que la amplificación por PCR alcance un punto final más allá de la fase logarítmica de amplificación (por ejemplo, en la fase de meseta).

En un modo de realización, la primera porción de marca y la segunda porción de marca comprenden ambas una modificación tal que ambas porciones de marca no se pueden extender por una ácido nucleico polimerasa.

En un modo de realización, la primera porción de marca se une al extremo 3' de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une al extremo 3' de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica. En otro modo de realización, la primera porción de marca se une al extremo 3' de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une al extremo 5' de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica. En otro modo de realización, la primera porción de marca se une al extremo 3' de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une por medio de un conector a una región de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica.

En un modo de realización, la primera porción de marca se une al extremo 5' de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une al extremo 5' de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica. En otro modo de realización, la primera porción de marca se une al extremo 5' de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une al extremo 3' de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica. En otro modo de realización, la primera porción de marca se une al extremo 5' de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une por medio de un conector a una región de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica.

En un modo de realización, la primera porción de marca se une por medio de un conector a una región de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une al extremo 5' de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica. En otro modo de realización, la primera porción de marca se une por medio de un conector a una región de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une al extremo 3' de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica. En otro modo de realización, la primera porción de marca se une por medio de un conector a una región de la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica y la segunda porción de marca se une por medio de un conector a una región de la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica.

En un modo de realización, cualquiera de la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica o el primer oligonucleótido de extinción o la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica o el segundo oligonucleótido de extinción o cualquier combinación de los mismos contiene una o más modificaciones de nucleótidos. En un modo de realización, la una o más modificaciones de nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido peptidonucleico (PNA), ácido nucleico con puente (BNA), sustitución de 2'-O-alquilo, nucleótido L-enantiomérico, o combinaciones de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

La FIG. 1 es una descripción gráfica de la sonda oligonucleotídica usada para realizar los procedimientos de la invención.

La FIG. 2 es una representación gráfica del procedimiento de la invención que muestra la separación de la porción de marca y posterior disociación del oligonucleótido de extinción.

La FIG. 3 es una descripción de un modo de realización de los procedimientos de la presente invención.

La FIG. 4 muestra las temperaturas de detección de señal usando otro modo de realización de los procedimientos de la presente invención.

La FIG. 5 muestra diferentes modos de realización de las sondas oligonucleotídicas usadas para practicar los procedimientos de la presente invención.

La FIG. 6 muestra los resultados de la hibridación y disociación a dos temperaturas entre un oligonucleótido de extinción y un oligonucleótido complementario marcado de forma fluorescente como se describe en el ejemplo 1.

La FIG. 7 muestra la detección de la diana CI en fondo creciente de la diana VIH1-M como se describe en el ejemplo 2.

La FIG. 8 muestra la detección de la diana VIH1-M gag en fondo creciente de la diana CI como se describe en el ejemplo 2.

La FIG. 9 muestra la detección de la diana VIH1-M ltr en fondo creciente de la diana CI como se describe en el ejemplo 2.

La FIG. 10 muestra los resultados de detección de la muestra de CI en el experimento como se describe en el ejemplo 3. Detección solo de CI en el canal térmico 1 (58 °C, FIG. 10A) frente al canal térmico 2 (83 °C, FIG. 10B). Se usó la resta del valor de referencia donde se aplicó la corrección y resta de la temperatura de señal de CI en el canal térmico 2. Canal térmico 1: umbral = 0,75, 84 copias de CI detectadas, p = 0,58, A = 0,88. Canal térmico 2: umbral = 1,00, 0 copias de CI detectadas, p = 0, A = 0.

La FIG. 11 muestra los resultados de detección de la muestra de VIH1-M ltr en el experimento como se describe en el ejemplo 3. Detección solo de VIH-1 en el canal térmico 1 (58°C, FIG. 11A) frente al canal térmico 2 (83°C, FIG. 11B) con la resta del valor de referencia aplicada. Canal térmico 1: umbral = 0,75, 0 copias de VIH1-M ltr detectadas, p = 0, A = 0. Canal térmico 2: umbral = 100, 48 copias de VIH1-M ltr detectadas, p = 0,39, A = 0,50.

La FIG. 12 muestra los resultados de detección de diana doble de muestras de CI y VIH1-M ltr en el experimento como se describe en el ejemplo 3. Tanto CI como VIH1-M se detectaron en el canal térmico 1 (58 °C, FIG. 12A) frente al canal térmico 2 (83 °C, FIG. 12B). La resta del valor de referencia, la corrección y resta de la temperatura de señal de CI se aplicaron en el canal térmico 2. Canal térmico 1: umbral = 0,75, 82 copias de CI detectadas, p = 0,57, A = 0,85. Canal térmico 2: umbral = 1,00, 47 copias de VIH1-M ltr detectadas, p = 0,39, A = 0,49.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

El término "muestra" como se usa en el presente documento incluye una muestra o cultivo (por ejemplo, cultivos microbiológicos) que incluye ácidos nucleicos. El término "muestra" también pretende incluir muestras tanto biológicas como ambientales. Una muestra puede incluir una muestra de origen sintético. Las muestras biológicas incluyen sangre completa, suero, plasma, sangre del cordón umbilical, vellosidades coriónicas, líquido amniótico, líquido cefalorraquídeo, líquido de lavado (por ejemplo, broncoalveolar, gástrico, peritoneal, ductal, ótico, artroscópico), muestra de biopsia, orina, heces, esputo, saliva, mucosa nasal, líquido prostático, semen, líquido linfático, bilis, lágrimas, sudor, leche materna, líquido mamario, células embrionarias y células fetales. En un modo de realización preferente, la muestra biológica es sangre, y más preferentemente plasma. Como se usa en el presente documento, el término "sangre" engloba sangre completa o cualquier fracción de sangre, tal como suero y plasma como se define convencionalmente. Plasma sanguíneo se refiere a la fracción de sangre total resultante de centrifugación de sangre tratada con anticoagulantes. Suero sanguíneo se refiere a la porción acuosa de líquido restante después de que se haya coagulado una muestra de sangre. Las muestras ambientales incluyen material ambiental tal como material de superficie, suelo, agua y muestras industriales, así como muestras obtenidas de instrumentos, aparatos, equipos, utensilios, artículos desechables y no desechables de procesamiento de alimentos y productos lácteos. Estos ejemplos no se deben interpretar como limitantes de los tipos de muestras aplicables a la presente invención.

Los términos "diana" o "ácido nucleico diana" como se usan en el presente documento pretenden querer decir cualquier molécula con una presencia que se va a detectar o medir o con una función, interacciones o propiedades que se van a estudiar. Por lo tanto, una diana incluye esencialmente cualquier molécula para la que existe una sonda detectable (por ejemplo, sonda oligonucleotídica) o ensayo, o que se puede producir por un experto en la técnica. Por ejemplo, una diana puede ser una biomolécula, tal como una molécula de ácido nucleico, un polipéptido, un lípido o un carbohidrato, que se puede unir con o entrar en contacto de otro modo con una sonda detectable (por ejemplo, un anticuerpo), en la que la sonda detectable también comprende ácidos nucleicos que se pueden detectar por procedimientos de la invención. Como se usa en el presente documento, "sonda detectable" se refiere a cualquier molécula o agente que se puede hibridar a una biomolécula diana de interés y permite la detección específica de la biomolécula diana como se describe en el presente documento. En un aspecto de la invención, la diana es un ácido nucleico y la sonda detectable es un oligonudeótido. Los términos "ácido nucleico" y "molécula de ácido nucleico" se pueden usar de manera intercambiable a lo largo de la divulgación. Los términos se refieren a oligonucleótidos, oligos, polinucleótidos, desoxirribonucleótidos (ADN), ADN genómico, ADN mitocondrial (ADNmt), ADN complementario (ADNc), ADN bacteriano, ADN vírico, ARN vírico, ARN, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia (ARNt), ARN ribosómico (ARNr), ARNip, ARN catalítico, clones, plásmidos, M13, P1, cósmido, cromosoma artificial de bacteria (BAC), cromosoma artificial de levadura (YAC), ácido nucleico amplificado, amplicón, producto de PCR y otros tipos de ácido nucleico amplificado, híbridos ARN/ADN y ácidos nucleicos de poliamida (PNA), de los que todos pueden estar en forma mono o bien bicatenaria y, a menos que se limite de otro modo, englobarían análogos conocidos de nucleótidos naturales que pueden funcionar de forma similar a los nucleótidos naturales y combinaciones y/o mezclas de los mismos. Por tanto, el término "nucleótidos" se refiere tanto a nucleótidos naturales como modificados/no naturales, incluyendo nucleósidos tri, di y monofosfato así como monómeros monofosfato presentes dentro del ácido polinucleico u oligonucleótido. Un nucleótido también puede ser un ribo; 2'-desoxi; 2',3'-desoxi, así como una amplia gama de otros miméticos nucleotídicos que son bien conocidos en la técnica. Los miméticos incluyen nucleótidos de terminación de cadena, tales como 3'-O-metilo, sustituciones glucídicas o de base halogenada; estructuras glucídicas alternativas incluyendo estructuras de anillo alquilo no glucídicas; bases alternativas incluyendo inosina; modificados con desaza; chi y psi, modificadas con conector; modificadas con marcador de masa; modificaciones o reemplazos de fosfodiéster incluyendo fosforotioato, metilfosfonato, boranofosfato, amida, éster, éter; y un reemplazo internucleotídico básico o completo, incluyendo enlaces de escisión tales como restos de nitrofenilo fotoescindibles.

La presencia o ausencia de una diana se puede medir cuantitativa o cualitativamente. Las dianas se pueden presentar en una variedad de formas diferentes, incluyendo, por ejemplo, mezclas simples o complejas, o en formas sustancialmente purificadas. Por ejemplo, una diana puede ser parte de una muestra que contiene otros componentes o puede ser el componente único o principal de la muestra. Por lo tanto, una diana puede ser un componente de una célula o tejido completo, un extracto de célula o tejido, un lisado fraccionado del mismo o una molécula sustancialmente purificada. Además, una diana puede tener una secuencia o estructura conocida o desconocida.

El término "reacción de amplificación" se refiere a cualquier medio in vitro para multiplicar las copias de una secuencia diana de ácido nucleico.

"Amplificación" se refiere a una etapa de someter una solución a condiciones suficientes para permitir la amplificación. Los componentes de una reacción de amplificación pueden incluir, pero no se limitan a, por ejemplo, cebadores, un molde polinucleotídico, polimerasa, nucleótidos, dNTP y similares. El término "amplificación" típicamente se refiere a un incremento "exponencial" en el ácido nucleico diana. Sin embargo, "amplificación" como se usa en el presente documento también se puede referir a incrementos lineales en los números de una secuencia diana seleccionada de ácido nucleico, pero es diferente de una etapa única de extensión de cebador individual.

"Reacción en cadena de la polimerasa" o "PCR" se refiere a un procedimiento por el que un segmento o subsecuencia específico de un ADN bicatenario diana se amplifica en una progresión geométrica. La PCR es bien conocida por los expertos en la técnica; véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.os 4.683.195 y 4.683.202; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., eds, 1990.

"Oligonucleótido" como se usa en el presente documento se refiere a oligómeros lineales de monómeros nucleosídicos naturales o modificados unidos por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos. Los oligonucleótidos incluyen desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, formas anoméricas de los mismos, ácidos peptidonucleicos (APN) y similares, que se pueden unir específicamente a un ácido nucleico diana. Normalmente, los monómeros se unen por enlaces fosfodiéster o análogos de los mismos para formar oligonucleótidos que varían en tamaño de unas pocas unidades monómeras, por ejemplo, 3-4, a varias decenas de unidades monómeras, por ejemplo, 40-60. Siempre que un oligonucleótido se representa por una secuencia de letras, tales como "

A T G C C T G " se entenderá que los nucleótidos están en orden 5'-3' de izquierda a derecha y que "A" indica desoxiadenosina, "C" indica desoxicitidina, "G" indica desoxiguanosina, "T" indica desoxitimidina, y "U" indica el ribonucleósido uridina, a menos que se indique de otro modo. Normalmente, los oligonucleótidos comprenden los cuatro desoxinucleótidos naturales; sin embargo, también pueden comprender ribonucleósidos o análogos nucleotídicos no naturales. Cuando una enzima tiene requisitos de sustratos oligonucleotídicos o polinucleotídicos específicos para la actividad, por ejemplo, ADN monocatenario, dúplex ARN/ADN o similar, entonces la selección de la composición apropiada para los sustratos oligonucleotídicos o polinucleotídicos está dentro del conocimiento de un experto en la técnica.

Como se usa en el presente documento, "cebador oligonucleotídico", o simplemente "cebador", se refiere a una secuencia polinucleotídica que se hibrida a una secuencia en un molde de ácido nucleico diana y facilita la detección de una sonda oligonucleotídica. En modos de realización de amplificación de la invención, un cebador oligonucleotídico sirve como punto de iniciación de la síntesis de ácido nucleico. En modos de realización distintos de amplificación, se puede usar un cebador oligonucleotídico para crear una estructura que se puede escindir por un agente de escisión. Los cebadores pueden ser de una variedad de longitudes y a menudo son de menos de 50 nucleótidos de longitud, por ejemplo 12-25 nucleótidos de longitud. La longitud y las secuencias de cebadores para su uso en PCR se pueden diseñar en base a principios conocidos por los expertos en la técnica.

El término "sonda oligonucleotídica" como se usa en el presente documento se refiere a una secuencia polinucleotídica que se puede hibridar a un ácido nucleico diana de interés y permite la detección específica del ácido nucleico diana.

Un "resto indicador" o "molécula indicadora" es una molécula que confiere una señal detectable. El fenotipo detectable puede ser colorimétrico, fluorescente o luminiscente, por ejemplo. Un "resto extintor" o "molécula extintora" es una molécula que puede extinguir la señal detectable del resto indicador.

"Nucleótido con emparejamiento erróneo" o "emparejamiento erróneo" se refiere a un nucleótido que no es complementario a la secuencia diana en esa posición o posiciones. Una sonda oligonucleotídica puede tener al menos un emparejamiento erróneo, pero también puede tener 2, 3, 4, 5, 6 o 7 o más nucleótidos con emparejamiento erróneo.

El término "polimorfismo" como se usa en el presente documento se refiere a una variante alélica. Los polimorfismos pueden incluir polimorfismos mononucleotídicos (SNP), así como polimorfismos de longitud de secuencia simple. Un polimorfismo se puede deber a una o más sustituciones nucleotídicas en un alelo en comparación con otro alelo o se puede deber a una inserción o deleción, duplicación, inversión y otras alteraciones conocidas en la técnica.

El término "modificación" como se usa en el presente documento se refiere a alteraciones de la sonda oligonucleotídica al nivel molecular (por ejemplo, resto de base, resto glucídico o cadena principal de fosfato). Las modificaciones de nucleósidos incluyen, pero no se limitan a, la introducción de bloqueantes de escisión o inductores de escisión, la introducción de ligandos del surco menor, enriquecimiento isotópico, disminución isotópica, la introducción de deuterio y modificaciones de halógeno. Las modificaciones nucleosídicas también pueden incluir restos que incrementan la restricción de hibridación o incrementan la temperatura de fusión de la sonda oligonucleotídica. Por ejemplo, una molécula de nucleótido se puede modificar con un puente adicional que conecta los carbonos 2' y 4' dando como resultado un nucleótido de ácido nucleico bloqueado (LNA) que es resistente a la escisión por una nucleasa (como se describe en Imanishi et al., patente de e E. UU. n.° 6.268.490 y en Wengel et al., patente de EE. UU. n.° 6.794.499). Las composiciones de la porción de marca de la sonda oligonucleotídica y de la molécula oligonucleotídica de extinción solo se restringen por su capacidad para formar dúplex estables. Por lo tanto, estos oligonucleótidos pueden comprender ADN, L-ADN, ARN, L-ARN, LNA, L-LNA, PNA (ácido peptidonucleico, como se describe en Nielsen et al., patente de EE. UU. n.° 5.539.082), BNA (ácido nucleico con puente, por ejemplo, 2',4'-BNA(NC) [ácido nucleico con puente 2'-O,4'-C-aminometileno] como se describe en Rahman et al., J. Am. Chem. Soc. 2008; 130(14):4886-96), L-BNA, etc. (donde "L-XXX" se refiere al enantiómero L de la unidad glucídica de los ácidos nucleicos) o cualquier otra variación y modificación conocida en las cadenas principales de fosfodiéster, glúcidos o bases de nucleótidos.

Otros ejemplos de modificaciones de nucleósidos incluyen diversas sustituciones en 2' tales como grupos halo, alcoxi y aliloxi que se introducen en el resto glucídico de los oligonucleótidos. Se han presentado pruebas de que los 2'-sustituido-2'-desoxiadenosina-polinucleótidos se parecen a ARN bicatenario más que a ADN. Ikehara et al., (Nucleic Acids Res., 1978, 5, 3315) han demostrado que un sustituyente 2'-fluoro en poli A, poli I o poli C duplicado a su complemento es significativamente más estable que el dúplex de ribonucleótido o desoxirribonucleótido y poli como se determina por ensayos de fusión estándar. Inoue et al., (Nucleic Acids Res., 1987, 15, 6131) han descrito la síntesis de secuencias oligonucleotídicas mixtas que contienen sustituyentes 2'-OMe (O-metil) en cada nucleótido nucleico. El oligonucleótido 2'-OMe-sustituido mixto se hibridó a su complemento de ARN tan fuertemente como el dúplex ARN-ARN que es significativamente más fuerte que el heterodúplex ARN-ADN de la misma secuencia. Por lo tanto, los ejemplos de sustituciones en la posición 2' del glúcido incluyen F, CN, CF³, OCF³, OMe, OCN, O-alquilo, S-alquilo, SMe, SO²Me, ONO², NO², NH³, NH², NH-alquilo, OCH3=CH2 y OCCH.

El término "específico" o "especificidad" en referencia a la unión de una molécula a otra molécula, tal como una sonda para un polinucleótido diana, se refiere al reconocimiento, contacto y formación de un complejo estable entre las dos moléculas, conjuntamente con reconocimiento, contacto o formación de complejo sustancialmente menores de esa molécula con otras moléculas. Como se usa en el presente documento, el término "hibridar" se refiere a la formación de un complejo estable entre dos moléculas.

Una sonda se "puede hibridar" a una secuencia de ácido nucleico si al menos una región de la sonda comparte una identidad de secuencia sustancial con al menos una región del complemento de la secuencia de ácido nucleico. "Identidad de secuencia sustancial" es una identidad de secuencia de al menos aproximadamente un 80 %, preferentemente al menos aproximadamente un 85 %, más preferentemente al menos aproximadamente un 90 %, 95 % o 99 %, y lo más preferentemente un 100 %. Con el propósito de determinar la identidad de secuencia de una secuencia de ADN y una secuencia de ARN, U y T a menudo se consideran el mismo nucleótido. Por ejemplo, una sonda que comprende la secuencia ATCAG C Se puede hibridar a una secuencia de ARN diana que comprende la secuencia GCUGAU.

El término "agente de escisión" como se usa en el presente documento se refiere a cualquier medio que pueda escindir una sonda oligonucleotídica para producir fragmentos, incluyendo pero sin limitarse a enzimas. Para los procedimientos en los que no se produce amplificación, el agente de escisión puede servir únicamente para escindir, degradar o separar de otro modo la segunda porción de la sonda oligonucleotídica o fragmentos de la misma. El agente de escisión puede ser una enzima. El agente de escisión puede ser natural, sintético, no modificado o modificado.

Para los procedimientos en los que se produce amplificación, el agente de escisión es preferentemente una enzima que posee actividad sintética (o de polimerización) y actividad nucleasa. Una enzima de este tipo a menudo es una enzima de amplificación de ácido nucleico. Un ejemplo de una enzima de amplificación de ácido nucleico es una enzima ácido nucleico polimerasa tal como a Dn polimerasa de Thermus aquaticus (Taq) (TaqMan®> o ADN polimerasa I de E. coli. La enzima puede ser natural, modificada o no modificada.

Una "ácido nucleico polimerasa" se refiere a una enzima que cataliza la incorporación de nucleótidos a un ácido nucleico. Las ácido nucleico polimerasas ejemplares incluyen ADN polimerasas, ARN polimerasas, transferasas terminales, retrotranscriptasas, telomerasas y similares.

Una "ADN polimerasa termoestable" se refiere a una ADN polimerasa que es estable (es decir, resiste la degradación o desnaturalización) y retiene actividad catalítica suficiente cuando se somete a temperaturas elevadas durante periodos de tiempo seleccionados. Por ejemplo, una ADN polimerasa termoestable retiene actividad suficiente para efectuar reacciones de extensión de cebadores posteriores, cuando se somete a temperaturas elevadas durante el tiempo necesario para desnaturalizar ácidos nucleicos bicatenarios. Las condiciones de calentamiento necesarias para la desnaturalización de ácido nucleico son bien conocidas en la técnica y se ejemplifican en las patentes de EE. UU. n.os 4.683.202 y 4.683.195. Como se usa en el presente documento, una polimerasa termoestable es típicamente adecuada para su uso en una reacción de termociclación tal como la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR"). Los ejemplos de ácido nucleico polimerasas termoestables incluyen ADN polimerasa de Thermus aquaticus Taq, polimerasa de Thermus sp. Z05, polimerasa de Thermus flavus, polimerasas de Thermotoga marítima, tales como polimerasas TMA-25 y TMA-30, ADN polimerasa Tth y similares.

Una polimerasa "modificada" se refiere a una polimerasa en la que al menos un monómero difiere de la secuencia de referencia, tal como una forma natural de la polimerasa u otra forma modificada de la polimerasa. Las modificaciones ejemplares incluyen inserciones, deleciones y sustituciones de monómeros. Las polimerasas modificadas también incluyen polimerasas quiméricas que tienen secuencias de componentes identificables (por ejemplo, dominios estructurales o funcionales, etc.) derivadas de dos o más originales. También se incluyen dentro de la definición de polimerasas modificadas las que comprenden modificaciones químicas de la secuencia de referencia. Los ejemplos de polimerasas modificadas incluyen ADN polimerasa G46E E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A E678G CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640g S671F CS5, ADN polimerasa G46E L329A D640G S671F E678G CS5, una ADN polimerasa G46E E678G CS6, ADN polimerasa Z05, polimerasa AZ05, polimerasa AZ05-Gold, polimerasa AZ05R, ADN polimerasa E615G Taq, polimerasa E678G TMA-25, polimerasa E678G TMA-30, y similares.

El término "actividad nucleasa 5' a 3'" o "actividad nucleasa 5'-3'" se refiere a una actividad de una ácido nucleico polimerasa, típicamente asociada con la síntesis de hebra de ácido nucleico, con lo que los nucleótidos se retiran del extremo 5' de la hebra de ácido nucleico, por ejemplo, la ADN polimerasa I de E. coli tiene esta actividad, mientras que el fragmento Klenow no. Algunas enzimas que tienen actividad nucleasa 5' a 3' son exonucleasas 5' a 3'. Los ejemplos de dichas exonucleasas 5' a 3' incluyen: exonucleasa de B. subtilis, fosfodiesterasa de bazo, exonucleasa lambda, exonucleasa II de levadura, exonucleasa V de levadura y exonucleasa de Neurospora crassa.

El término "propanodiol" o "espaciador de propanodiol" se refiere a 1,3-propanodiol y es sinónimo de propano-1,3-diol, 1,3-dihidroxipropano y trimetilenglicol. El término "HEG" o "espaciador de HEG" se refiere a hexaetilenglicol, que es sinónimo de 3,6,9,l2,15-pentaoxaheptadecano-1,17-diol.

Diversos aspectos de la presente invención se basan en una propiedad especial de las ácido nucleico polimerasas. Las ácido nucleico polimerasas pueden poseer varias actividades, entre ellas, una actividad nucleasa 5' a 3', con lo que la ácido nucleico polimerasa puede escindir mononucleótidos u oligonucleótidos pequeños de un oligonucleótido hibridado a su polinucleótido complementario más grande. Para que se produzca la escisión eficazmente, un oligonucleótido hacia 5' también se debe hibridar al mismo polinucleótido más grande.

La detección de un ácido nucleico diana utilizando la actividad nucleasa 5' a 3' se puede realizar por un "TaqMan®" o "ensayo de nucleasa 5'", como se describe en las patentes de EE. UU. n.os 5.210.015; 5.487.972; y 5.804.375; y Holland et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7276-7280. En el ensayo TaqMan®, las sondas de detección marcadas que se hibridan dentro de la región amplificada están presentes durante la reacción de amplificación. Las sondas se modifican para evitar que las sondas actúen como cebadores para la síntesis de ADN. La amplificación se realiza usando una ADN polimerasa que tiene actividad exonucleasa 5' a 3'. Durante cada etapa de síntesis de la amplificación, cualquier sonda que se hibrida al ácido nucleico diana hacia 3' del cebador que se está extendiendo se degrada por la actividad exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa. Por tanto, la síntesis de una nueva hebra diana también da como resultado la degradación de una sonda, y la acumulación de producto de degradación proporciona una medida de la síntesis de secuencias diana.

Se puede usar cualquier procedimiento adecuado para detectar el producto de degradación en un ensayo de nucleasa 5'. A menudo, la sonda de detección se marca con dos tintes fluorescentes, de los que uno puede extinguir la fluorescencia del otro tinte. Los tintes se unen a la sonda, típicamente con el tinte indicador o detector unido al extremo 5' y el tinte de extinción unido a un sitio interno, de modo que la extinción se produce cuando la sonda está en un estado no hibridado y de modo que la escisión de la sonda por la actividad exonucleasa 5' a 3' de la ADN polimerasa se produce entre los dos tintes. La amplificación da como resultado la escisión de la sonda entre los tintes con una eliminación concomitante de la extinción y un incremento en la fluorescencia observable del tinte inicialmente extinguido. Se sigue la acumulación del producto de degradación midiendo el incremento en la fluorescencia de reacción. Las patentes de EE. UU. n.os 5.491.063 y 5.571.673 describen procedimientos alternativos para detectar la degradación de sonda que se produce de manera concomitante con la amplificación.

Un ensayo de nucleasa 5' para la detección de un ácido nucleico diana puede emplear cualquier polimerasa que tenga una actividad exonucleasa 5' a 3'. Por tanto, en algunos modos de realización, las polimerasas con actividad nucleasa 5' son ácido nucleico polimerasas termoestables y termoactivas. Dichas polimerasas termoestables incluyen, pero no se limitan a, formas naturales y recombinantes de polimerasas de una variedad de especies de los géneros eubacterianos Thermus, Thermatogay Thermosipho, así como formas quiméricas de las mismas. Por ejemplo, las polimerasas de especie Thermus que se pueden usar en los procedimientos de la invención incluyen ADN polimerasa de Thermus aquaticus (Taq), ADN polimerasa de Thermus thermophilus (Tth), ADN polimerasa de especie Thermus Z05 (Z05), especie Thermus sps17 (sps17) y especie Thermus Z05 (por ejemplo, descritas en las patentes de EE. UU. n.os 5.405.774; 5.352.600; 5.079.352; 4.889.818; 5.466.591; 5.618.711; 5.674.738 y 5.795.762. Las polimerasas de Thermatoga que se pueden usar en los procedimientos de la invención incluyen, por ejemplo, a Dn polimerasa de Thermatoga marítima y ADN polimerasa de Thermatoga neapolitana, mientras que un ejemplo de una polimerasa de Thermosipho que se puede usar es ADN polimerasa de Thermosipho africanus. Las secuencias de ADN polimerasas de Thermatoga marítima y Thermosipho africanus se publican en la solicitud de patente internacional n.° PCT/US91/07035 con n.° de publicación WO 92/06200. La secuencia de Thermatoga neapolitana se puede encontrar en la publicación de patente internacional n.° WO 97/09451.

En el ensayo de nucleasa hacia 5', la detección de amplificación es típicamente concurrente con la amplificación (es decir, "ultrarrápida"). En algunos modos de realización, la detección de amplificación es cuantitativa, y la detección de amplificación es ultrarrápida. En algunos modos de realización, la detección de amplificación es cualitativa (por ejemplo, detección de punto final de la presencia o ausencia de un ácido nucleico diana). En algunos modos de realización, la detección de amplificación es posterior a la amplificación. En algunos modos de realización, la detección de amplificación es cualitativa y la detección de amplificación es posterior a la amplificación, es decir, cuando la amplificación alcanza un punto final más allá de la fase logarítmica de amplificación.

En la presente invención, la amplificación por PCR y la detección de punto final de dos o más ácidos nucleicos diana en un recipiente de reacción individual (por ejemplo, tubo, pocillo) se puede realizar usando una sonda oligonucleotídica TaqMan® estándar para detectar la presencia de la primera diana y una o más sondas oligonucleotídicas TaqMan® novedosas para detectar la presencia de la segunda, tercera o más dianas, conteniendo todas las sondas el mismo marcador fluorescente. De forma alternativa, las sondas oligonucleotídicas TaqMan® novedosas se pueden usar para detectar la presencia de todos los ácidos nucleicos diana. Las sondas novedosas tienen dos rasgos característicos distintivos.

El primer rasgo característico de la sonda novedosa es que comprende dos porciones distintas. La primera porción se denomina porción de hibridación y comprende una secuencia que es al menos parcialmente complementaria a una secuencia de ácido nucleico diana de modo que se puede hibridar con la secuencia diana. La porción de hibridación también contiene un resto extintor. En un modo de realización, la porción de hibridación contiene un resto indicador tal como un tinte fluorescente que se puede extinguir por el resto extintor y se separa del resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa. La segunda porción de la sonda oligonucleotídica se denomina porción de marca. En un modo de realización, la porción de marca se une al extremo 5' de la porción de hibridación. En otro modo de realización, la porción de marca se une al extremo 3' de la porción de hibridación. En otro modo de realización, la porción de marca se une en cualquier lugar entre el extremo 5' y el extremo 3' de la porción de hibridación por medio de un conector. La porción de marca puede comprender una secuencia de nucleótidos que no es complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y forma una región de "aleta" que no se puede unir al ácido nucleico diana (véase la FIG. 1 para una representación gráfica de una sonda de aleta 5'). La porción de marca también puede estar compuesta de no nucleótidos tales como cualquier resto orgánico, o unidades repetidas (por ejemplo, (CH²-CH²-O)n, etc.) siempre que se pueda unir a la porción de hibridación y pueda interactuar con una molécula de extinción (como se describe en la siguiente sección). En un modo de realización, la porción de marca contiene un resto indicador tal como un tinte fluorescente que se puede extinguir por el resto extintor en la porción de hibridación. Las porciones de hibridación y de marca de la sonda oligonucleotídica se pueden separar opcionalmente por un conector no nucleotídico. Este conector puede estar compuesto de carbono, carbono y oxígeno, carbono y nitrógeno o cualquier combinación de estos y puede ser de cualquier longitud. Además, el conector puede estar compuesto de un resto lineal o un resto cíclico. El conector se puede derivar de una unidad individual o de múltiples unidades idénticas o diferentes separadas por enlaces fosfato. El propósito del conector es crear una región en el punto de unión de las porciones de hibridación y de marca de la sonda oligonucleotídica. Cuando la porción de marca se separa de la porción de hibridación, el conector también evita que se extienda por una ácido nucleico polimerasa. De forma alternativa, otra modificación en la porción de marca separada la hace no extensible por la ácido nucleico polimerasa.

El segundo rasgo característico de la sonda novedosa es que la porción de marca se une a una molécula de extinción. Si la porción de marca es una secuencia de nucleótidos, la molécula de extinción puede ser un oligonucleótido que es total o parcialmente complementario a la secuencia de nucleótidos de la porción de marca y se hibrida a la porción de marca. La molécula de extinción también contiene o se asocia con un resto extintor, es decir, un segundo resto extintor, que también puede extinguir la señal del resto indicador (por ejemplo, tinte fluorescente) en la porción de marca. El resto extintor en o asociado con la molécula de extinción (el segundo resto extintor) puede ser el mismo o diferente del resto extintor en la porción de hibridación (el primer resto extintor). Por lo tanto, antes de realizar la amplificación por PCR, el resto indicador en la porción de marca se extingue tanto por el resto extintor en la porción de hibridación de la sonda como por el resto extintor en o asociado con la molécula de extinción (por ejemplo, por un oligonucleótido de extinción como se muestra en FIG. 1).

El principio general de uso de la sonda novedosa para realizar la amplificación por PCR y la detección de punto final del ácido nucleico diana en un ensayo de nucleasa 5' se describe a continuación. En primer lugar, se proporciona una muestra sospechosa de contener el ácido nucleico diana. A continuación, se pone en contacto la muestra dentro de un recipiente de reacción individual (por ejemplo, un tubo de ensayo individual o un pocillo individual en una microplaca de múltiples pocillos) con reactivos de PCR que contienen tanto los cebadores oligonucleotídicos que pueden generar amplicones del ácido nucleico diana como la sonda oligonucleotídica novedosa. La amplificación por PCR comienza usando una ácido nucleico polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3' de modo que durante la etapa de extensión de cada ciclo de PCR, la actividad nucleasa de la polimerasa permite la escisión y separación de la porción de marca del resto de extinción en la porción de hibridación de la sonda. La porción de marca separada puede contener opcionalmente una modificación (tal como el conector no nucleotídico) de modo que no se puede extender por una ácido nucleico polimerasa.

Cuando el ensayo de PCR ha alcanzado un nivel con el que se han producido suficientes amplicones (por ejemplo, más allá de la fase logarítmica de amplificación o en la fase de meseta) o después de que se haya completado el ensayo de PCR, la señal del resto indicador en la porción de marca separada se mide en una primera temperatura, normalmente, la temperatura de hibridación y/o extensión, a la que la molécula de extinción todavía está unida a la porción de marca. Debido a la presencia del resto extintor en o asociado con la molécula de extinción, la señal del resto indicador (por ejemplo, un tinte fluorescente) en la porción de marca todavía se extingue. En algunos casos, puede ser ventajoso medir la señal del resto indicador más de una vez a la primera temperatura y obtener un promedio o mediana del valor de señal a la primera temperatura. A continuación, se realiza una segunda lectura de señal en un punto de temperatura en el que la molécula de extinción ya no está unida a la porción de marca. Si la molécula de extinción es un oligonucleótido que tiene secuencias complementarias a la secuencia de nucleótidos de la porción de marca, esta disociación se produce a la temperatura de fusión (Tf) de la formación de dúplex entre la molécula oligonucleotídica de extinción y la porción de marca. La señal del resto indicador que ya no se extingue por el resto extintor en o asociado con el oligonucleótido de extinción se mide a continuación a una segunda temperatura que está en o por encima de la temperatura Tf del dúplex. De hecho, puede ser mejor que la segunda temperatura esté por encima de la temperatura T f para garantizar que cerca de un 100 % de la porción de marca esté en forma monocatenaria. Sin embargo, también es posible medir la señal a una temperatura por debajo de la temperatura Tf. En algunos casos, puede ser ventajoso medir la señal del resto indicador más de una vez a la segunda temperatura y obtener un promedio o mediana del valor de señal a la segunda temperatura. A continuación, se determina un valor de señal calculado restando la señal (o el promedio o mediana del valor de señal) detectada a la primera temperatura cuando la molécula de extinción todavía está unida a la porción de marca de la señal (o el promedio o mediana del valor de señal) detectada a la segunda temperatura cuando la molécula de extinción no se une a la porción de marca (véanse las FIG. 2 y FIG. 3). El valor de señal calculado se puede normalizar opcionalmente para la corrección de señales que se pueden ver afectadas por la temperatura. Por ejemplo, es conocido que las señales fluorescentes disminuyen a temperaturas mayores y, por lo tanto, se pueden usar estándares para normalizar los valores de señal obtenidos a diferentes temperaturas.

Estas mediciones y cálculos de señal se realizan normalmente al final (o casi al final) del ensayo de PCR o después de la finalización del ensayo de PCR y los valores de señal determinados se pueden usar para determinar la presencia o ausencia del ácido nucleico diana.

Un ejemplo de un ensayo de PCR de punto final es la PCR digital (dPCR). En la dPCR, una muestra se divide de modo que las moléculas de ácido nucleico individuales dentro de la muestra se localizan y se concentran dentro de muchas regiones separadas. La extinción o aislamiento de moléculas de ácido nucleico individuales se ha realizado en placas de micropocillos, capilares, la fase dispersa de una emulsión y matrices de cámaras miniaturizadas, así como en superficies de unión a ácido nucleico. La división de la muestra permite estimar el número de moléculas diferentes asumiendo que la población de moléculas sigue la distribución de Poisson. Como resultado, cada parte contendrá "0" o "1" moléculas, o una reacción negativa o positiva, respectivamente. Después de la amplificación por PCR, los ácidos nucleicos se pueden cuantificar contando las regiones que contienen reacciones positivas de producto final de PCR. En la p Cr convencional, el número de ciclos de amplificación por PCR es proporcional al número de copias de partida. Sin embargo, la dPCR no depende del número de ciclos de amplificación para determinar la cantidad de muestra inicial, lo que elimina la dependencia de los datos exponenciales inciertos para cuantificar ácidos nucleicos diana y proporciona por lo tanto una cuantificación absoluta. Los enfoques de PCR digital actuales se logran por un enfoque basado en microfluidos donde una reacción se divide en nanopocillos en una matriz o bien por un enfoque basado en gotas donde la reacción se separa en microgotas.

Los sistemas disponibles comercialmente que emplean el enfoque de microfluidos incluyen el sistema Biomark HD de Fluidigm Corporation (South San Francisco, CA) y el sistema QuantStudio 3D dPCR de Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA). Otros competidores en el panorama comercial de PCR digital incluyen RainDance Technologies (Billerica, MA) con su sistema Raindrop y Bio-Rad (Hercules, CA) con sus sistemas basados en gotas QX200.

Son posibles ensayos de PCR múltiple que usan solo un resto indicador (por ejemplo, un tinte fluorescente) diseñando sondas oligonucleotídicas que tienen porciones de marca hibridadas a sus respectivas moléculas oligonucleotídicas de extinción a diversas temperaturas Tf. Por ejemplo, la amplificación y detección de tres ácidos nucleicos diana en una reacción se puede lograr usando tres sondas oligonucleotídicas todas marcadas con el mismo fluoróforo. Se puede usar una sonda oligonucleotídica TaqMan® estándar para detectar la primera diana midiendo la señal fluorescente a una primera temperatura (normalmente la temperatura de hibridación de un ciclo de PCR). Se puede usar una primera sonda "marcada" con un dúplex marca-oligonucleótido de extinción de Tf baja para detectar la segunda diana midiendo el valor fluorescente calculado a una segunda temperatura de o por encima de su temperatura T f y que es mayor que la primera temperatura. Se puede usar una segunda sonda "marcada" con un dúplex de marca-oligonucleótido de extinción de T f alta para detectar la tercera diana midiendo el valor fluorescente calculado a una tercera temperatura a o por encima de su temperatura T f y que es mayor que la segunda temperatura, (véase la FIG. 4). En teoría, sería posible usar una sonda TaqMan® y dos sondas marcadas diferentes con de cuatro a siete restos indicadores diferentes (por ejemplo, tintes fluorescentes) para detectar entre 12 y 21 ácidos nucleicos diana diferentes en una reacción o una sonda TaqMan® y 3 sondas marcadas diferentes para detectar entre 16 y 28 ácidos nucleicos diana diferentes en una reacción.

Adicionalmente, las sondas novedosas de la presente invención se pueden diseñar de modo que la porción de marca sea una secuencia de nucleótidos y se conecte a un oligonucleótido de extinción para formar una horquilla (es decir, una estructura de tallo-bucle). En esta estructura, la porción de "tallo" consistirá en las regiones complementarias entre la porción de marca y el oligonucleótido de extinción mientras que la porción de "bucle" puede estar compuesta de nucleótidos no complementarios o no nucleótidos tales como conectores como se describe previamente.

Aunque se ha descrito que las sondas novedosas de la presente invención tienen el resto indicador localizado en la porción de marca de las sondas, también es posible situar el resto indicador en la porción de hibridación y colocar el primer resto extintor en la porción de marca, siempre que el resto indicador pueda interactuar reversiblemente con el segundo resto extintor del oligonucleótido de extinción. En un sentido general, el resto indicador se diseña y se sitúa en el oligonucleótido de sonda de tal forma que se separa del primer resto de extinción en la porción de hibridación durante el ensayo de 5' nucleasa (TaqMan®> y se diseña además para interactuar reversiblemente con el segundo resto de extinción en la molécula de extinción. Algunos de estos diversos modos de realización de las sondas novedosas se pueden observar en la FIG. 5.

Para poner en práctica los procedimientos de la presente invención, son necesarios determinados rasgos característicos en el diseño de la porción de marca del oligonucleótido de sonda y de la molécula de extinción. En un modo de realización, tanto la porción de marca como la molécula de extinción están compuestas de secuencias de nucleótidos. En esta situación, tanto la porción de marca como el oligonucleótido de extinción no se deben hibridar específicamente a la secuencia de ácido nucleico diana, pero deben ser total o parcialmente complementarios entre sí para permitir la hibridación a las temperaturas deseadas. Ambos pueden incluir una modificación en sus extremos 3' para no extenderse por la ácido nucleico polimerasa durante la amplificación por PCR. Tanto el resto indicador (por ejemplo, tinte fluorescente) en la porción de marca como el resto extintor en el oligonucleótido de extinción se pueden localizar en el extremo 5', el extremo 3' o en cualquier posición entre los extremos 5' y 3' pero se deben localizar en proximidad entre sí cuando la porción de marca se hibrida al oligonucleótido de extinción para permitir que el resto de extinción extinga la señal detectable del resto indicador.

Con respecto a diferentes porciones de marca que se hibridan a sus respectivas moléculas oligonucleotídicas de extinción a diversas temperaturas Tf, se pueden introducir nucleótidos modificados en todas o algunas posiciones en cualquiera de las porciones de marca, en los oligonucleótidos de extinción o tanto en las porciones de marca como en los oligonucleótidos de extinción de modo que se pueda acortar la longitud de los oligonucleótidos. Los ejemplos de modificaciones de nucleótidos que sirven para incrementar la temperatura de fusión incluyen LNA, PNA, G-Clamp (9-(aminoetoxi)-fenoxacina-2'-desoxicitidina), propinildesoxiuridina (pdU), propinildesoxicitidina (pdC) y diversas modificaciones en 2' en el grupo glucídico, tales como modificaciones de 2'-O-metilo. Otro tipo de modificación que puede servir para prevenir la unión no deseada de la ácido nucleico polimerasa a la porción de marca o al oligonucleótido de extinción incluiría el uso de la forma L enantiomérica de un nucleótido, tal como L-ADN, L-ARN o L-LNA.

En otro modo de realización, la porción de marca de la sonda oligonucleotídica y la molécula de extinción están compuestas de moléculas no nucleotídicas que interactúan reversiblemente entre sí de manera dependiente de la temperatura. Los ejemplos de dichas interacciones no nucleotídicas incluyen, pero no se limitan a, interacciones proteína-proteína, interacciones proteína-péptido (por ejemplo, aptámeros peptídicos), interacciones proteínamolécula pequeña, interacciones péptido-molécula pequeña, interacciones molécula pequeña-molécula pequeña. En un ejemplo, la interacción bien conocida entre biotina y avidina (o estreptavidina) se puede aprovechar modificando el resto de biotina (por ejemplo, destiobiotina) o el resto de avidina (véase,Nordlund et al., J. Biol. Chem., 2003, 278 (4) 2479-2483) o ambos para hacer la interacción reversible y dependiente de la temperatura.

Aún en otro modo de realización, la interacción entre la porción de marca y la molécula de extinción puede implicar la interacción entre una secuencia de nucleótidos (o secuencias de nucleótidos) y una molécula no nucleotídica de manera específica de secuencia. Los ejemplos de estos tipos de interacciones incluyen pero no se limitan a aptámeros de ácido nucleico, proteínas o péptidos de unión a ADN y ligandos del surco menor de ADN. El diseño y la síntesis de moléculas de unión a ADN específicas de secuencia se han descrito en varios artículos (véanse, por ejemplo, Dervan, Science, 1986, 232, 464-471; White et al., Nature, 1998, 391,468-471) y estos procedimientos se pueden usar para generar interacciones entre la porción de marca y la molécula de extinción que son dependientes de la temperatura. De forma similar, las interacciones entre nucleótidos bicatenarios y extintores solubles también se pueden explorar de modo que el resto extintor no necesite estar contenido dentro de la propia molécula de extinción sino que puede estar en una forma soluble que interactuará con y extinguirá el resto indicador solo cuando la porción de marca se una a la molécula de extinción.

Los modos de realización de la presente invención se describirán además en los siguientes ejemplos, que no limitan el alcance de la invención descrita en las reivindicaciones.

Ejemplos

Ejemplo 1 Verificación de extinción por el oligonucleótido de extinción

Se realizó un experimento para verificar que un oligonucleótido de extinción que contiene un resto extintor se podría hibridar con la porción de marca liberada marcada de forma fluorescente de una sonda oligonucleotídica y extinguir la señal fluorescente a una temperatura por debajo de la temperatura de fusión del dúplex pero no a una temperatura por encima de la temperatura de fusión en la que se ha disociado el dúplex. La tabla 1 contiene las secuencias de nucleótidos de la porción de marca y el oligonucleótido de extinción. El oligonucleótido de extinción Q0 no contiene el extintor mientras que el oligonucleótido de extinción Q1 contiene un extintor BHQ-2 en su extremo 5'.

Tabla 1

Se incubó el oligonucleótido 9FAM9 TAG sin un oligonucleótido de extinción (QX) o con el oligonucleótido de extinción Q0 o Q1 en una proporción molar 1:5. A continuación, se ciclaron las mezclas en reacciones de 50 |jl que consistieron en tricina 60 mM, acetato de potasio 120 mM, DMSO al 5,4 %, acida de sodio al 0,027 %, glicerol al 3 %, Tween 20 al 0,02 %, EDTA 43,9 uM, UNG 0,2 U/ul, 19TAGC9FAMC90,1 uM, Q0 o Q1 0,5 uM, dATP 400 jM , 4CTP 400 jM , dGTP 400 jM , dUTP 800 jM y acetato de manganeso 3,3 mM. Las condiciones de ciclo que se asemejan a una reacción de amplificación por PCR típica se muestran en la tabla 2.

Tabla 2

Los resultados del experimento se muestran en la FIG. 6. Cuando se midió la señal del tinte FAM a 58 °C, se detectó fluorescencia sin oligonucleótido de extinción (QX) o con un oligonucleótido de extinción sin resto de extinción (Q0) pero no se detectó señal en ninguno de los ciclos en presencia del oligonucleótido de extinción Q1. Por el contrario, cuando se midió la fluorescencia a 80 °C, se pudieron detectar señales en todos los ciclos incluso en presencia del oligonucleótido de extinción Q1, lo que demuestra que a la temperatura mayor, el oligonucleótido de extinción Q1 ya no se hibridó con TAG, y no se observó extinción.

Ejemplo 2 PCR con sonda marcada y oligonucleótido de extinción con detección de punto final

Se realizó un experimento de matriz en el que se amplificaron 0, 100 o 1000 copias de un molde de control interno (CI) en presencia de 0, 10 o 100 copias de molde de VIH1-M durante 50 ciclos de PCR. Se logró la detección de tres dianas únicas en un solo canal de fluorescencia usando fluoresceína (FAM) a través de una combinación de química TaqMan® y generación termoasistida de señal (TAGS) usando sondas marcadas y sus respectivos oligonucleótidos de extinción. Se midió la señal de fluorescencia de punto final (promedio de señal de fluorescencia para últimos cuatro ciclos) en el canal de fluorescencia FAM para las tres dianas pos-PCR TaqMan®. La tabla 3 muestra las secuencias de las sondas y oligonucleótidos de extinción usados en este experimento.

Tabla 3

Cada reacción de 50 |jl contenía glicerol al 3 %, tricina 60 mM, acetato de potasio 120 mM, cada dATP, dCTP y dGTP 400 jM , dUTP 800 jM , 0,3 jM de cada cebador directo, 0,3 jM de cada cebador inverso, 0,3 jM de sonda de detección (secuencia 1-3), 0,6 uM de cada marca Q (secuencia 4-5) DMSO al 5,4 %, Tween 20 al 0,02 %, EDTA 43,9 uM, acida de sodio al 0,03 %, uracil-N-glicosilasa (UNG) 0,2 U/jl, aptámero NTQ21-46A 0,67 jM , Z05D polimerasa 0,9 U /jl y acetato de manganeso 3,3 mM (pH 6,3). Se realizó la amplificación en un instrumento Roche LightCycler® 480 y las reacciones se sometieron al perfil de temperatura como se muestra en la tabla 2 excepto que se realizaron 50 en lugar de 55 ciclos y se realizó la adquisición de datos solo durante los últimos cuatro ciclos (véase a continuación).

Los resultados del experimento se observan en las FIGs. 7-9 con la fluorescencia absoluta de punto final representada en el eje Y con diversas muestras a lo largo del eje X. Se observó la señal de fluorescencia a 58 °C (FIG. 7, canal térmico 1) en presencia de la diana CI debido a la escisión de la sonda TaqMan® convencional (CI, SEQ ID NO: 4) durante ciclos repetidos de amplificación. Adicionalmente, se observó una señal de fluorescencia a 80 °C (FIG. 8, canal térmico 2) cuando la diana VIH1-M gag estaba presente debido a la escisión de la sonda marcada (VIH-1M gag, SEQ ID NO: 5) y un incremento en la fluorescencia de fusión del fragmento de escisión de sonda del oligonucleótido de extinción complementario (marca-Q gag, SEQ ID NO: 7). Además, se observó la señal de fluorescencia a 95 °C (FIG. 9, canal térmico 3) cuando la diana VIH1-M ltr estaba presente debido a la escisión de la segunda sonda marcada (VIH-1M ltr, SEQ ID NO: 6) y un incremento en la fluorescencia de fusión del fragmento de escisión de sonda del segundo oligonucleótido de extinción complementario (marca-Q ltr, SEQ ID NO: 8). Cualquier muestra con señales de fluorescencia por debajo de la señal umbral de fluorescencia definida por canal térmico (líneas discontinuas) se consideró negativa.

Se restó la fluorescencia de canal térmico 1 (58 °C) con temperatura corregida de la fluorescencia de canal térmico 2 (80 °C) para lograr una señal específica para VIH1-M gag. De forma similar, se restó la fluorescencia de canal térmico 2 con temperatura corregida de la fluorescencia de canal térmico 3 (95 °C) para lograr una señal específica para VIH1-M ltr. Por lo tanto, se observó que la amplificación de la diana CI se detectó específicamente a 58 °C (canal térmico 1), la diana VIH1-M gag se detectó específicamente a 80 °C (canal térmico 2) y la diana VIH1-M ltr se detectó específicamente detectado a 95 °C (canal térmico 3).

Ejemplo 3 PCR digital con sonda marcada y oligonucleótido de extinción con detección de punto final

Se realizó un experimento en el que aproximadamente 47 copias de ARN de VIH1-M u 83 copias de ARN de control interno se amplificaron y se detectaron individualmente o juntas en 96 pocillos en una placa de 384 pocillos. Dos sondas TaqMan® marcadas con fluoresceína estuvieron presentes en cada reacción. Una primera sonda (TABLA 4, SEQ Id NO: 9) se une específicamente a la diana de control interno y detecta la amplificación a o por debajo de 58 °C (canal térmico 1). Una segunda sonda (TABLA 4, SEQ ID NO: 10), con una secuencia de marca de unión distinta de diana 5', se une específicamente a la diana VIH1-M ltr y detecta la amplificación en un segundo canal térmico definido a 83 °C.

Tabla 4

Cada reacción de 16 |jl contenía glicerol al 3 %, tricina 60 mM, acetato de potasio 120 mM, cada dATP, dCTP y dGTP 400 jM , dUTP 800 jM , 0,3 jM de cada cebador directo, 0,3 jM de cada cebador inverso, 0,3 jM de sonda de detección (SEQ ID NO: 9 y 10), 0,6 jM de marca Q (SEQ ID NO: 11) DMSO al 5,4 %, Tween 20 al 0,02 %, EDTA 43,9 uM, acida de sodio al 0,03 %, uracil-N-glicosilasa (UNG) 0,2 U/jl, aptámero NTQ21-46A 0,67 jM , Z05D polimerasa 0,9 U /jl y acetato de manganeso 3,3 mM (pH 6,3).

Se realizó la amplificación por PCR en un instrumento Roche LightCycler® 480. Las reacciones se sometieron al perfil de temperatura como se describe en la TABLA 2 en el ejemplo 1. Se capturó la fluorescencia en cada canal térmico antes del ciclo de PCR (para definir la fluorescencia de referencia) y después pos-PCR. Se representaron los datos de fluorescencia con valor de referencia restado y se definió un valor umbral para determinar pocillos negativos (sin diana presente) frente a positivos (una o más dianas presentes) en cada canal térmico. Cuando CI estuvo presente, se observó señal de fluorescencia en el canal térmico 1 debido a la escisión de la sonda CI convencional y la separación del tinte indicador del extintor durante ciclos repetidos de amplificación (FIG. 10A).

Cuando VIH1-M Itr estuvo presente, se observó señal de fluorescencia en el canal térmico 2 (FIG. 11B) debido a la escisión de la sonda VIH1-M ltr marcada y la activación térmica de la señal debido a la fusión del fragmento de escisión de sonda marcada con tinte indicador de marca-Q complementaria. Cuando ambos dianas estaban presentes, se observó señal en ambos canales térmicos (FIG. 12A y 12B). En consecuencia, se retiró la señal cruzada de CI del canal térmico 2 por medio de corrección de temperatura y resta de fluorescencia, permitiendo la detección solo de VIH1-M en el canal térmico 2 (Figura 12B).

Se aplicó la proporción de reacciones negativas para cada conjunto de 96 pocillos a un cálculo de Poisson para determinar las copias totales de cada diana en esos pocillos. La ecuación de Poisson se basa en A = -ln(1 -p), donde A son las copias calculadas por pocillo y p es la fracción positiva de todos los pocillos. Las copias totales en 96 pocillos se calculan multiplicando A por 96. Los resultados se muestran en la TABLA 5 y demuestran la detección única del molde CI frente al molde VIH1-M ltr en un solo canal de fluorescencia y dos canales térmicos en la detección de punto final.

Tabla 5

Listado de secuencias informal

SEQ ID NO 1: secuencia oligonucleotídica de 9FAM9TAG

CGT CGCCAGT CAGCTCCGGT

SEQ ID NO 2: secuencia oligonucleotídica de extinción Q0 (sin extintor)

CCG G AG CTG ACTG G CG ACG

SEQ ID NO 3: secuencia oligonucleotídica de extinción Q1 (extintor BHQ-1 en extremo 5')

CCGGAGCTGACTGGCGACG

SEQ ID NO 4: secuencia oligonucleotídica de sonda TaqMan CI (FAM/BHQ/fosfato)

SEQ ID NO 5: secuencia oligonucleotídica de sonda marcada VIH1-M gag (BHQ/FAM/fosfato)

TCTG C AG CTT CCT C ATT G ATG G TAT CTTTT AACC AC AC ATT GGCACCGCCGTCT

SEQ ID NO 6: secuencia oligonucleotídica de sonda marcada VIH1-M ltr (BHQ/FAM/fosfato)

TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCACGTCTCGGTGGTGGCGTTT

SEQ ID NO 7: secuencia oligonucleotídica de extinción VIH1-M gag (extintor BHQ-1 en extremo 3')

AG ACGGCGGT G CC A A T GT GT G

SEQ ID NO 8: secuencia oligonucleotídica de extinción VIH1-M ltr (extintor BHQ-1 en extremo 3')

AAAC G C C ACCACCG AG ACG TG

SEQ ID NO 9: secuencia oligonucleotídica de sonda CI (del ejemplo 3)

TG C G C G TC C C G TTTTG ATAC TTC G TAAC G G TG C

SEQ ID NO 10: secuencia oligonucleotídica de sonda VIH1-M Itr (del ejemplo 3) TCTCTAGCAGTGGCGCCCGAACAGGGACCACACATTGGCACCGCCGTCT SEQ ID NO 11: secuencia oligonucleotídica marca-Q (del ejemplo 3)

AG AC G G C G G TG C C AATG TG TG

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para la amplificación y detección de un ácido nucleico diana en una muestra que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicha muestra que contiene dicho ácido nucleico diana en un recipiente de reacción individual con

(i) un par de cebadores oligonucleotídicos, cada cebador oligonucleotídico se puede hibridar a hebras opuestas de una subsecuencia de dicho ácido nucleico diana;

(ii) una sonda oligonucleotídica que comprende una porción de hibridación y una porción de marca, en la que la porción de marca comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana o una molécula no nucleotídica, en la que la porción de hibridación comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y se hibrida a una región de dicha subsecuencia de dicho ácido nucleico diana que se une por dicho par de cebadores oligonucleotídicos, en la que dicha sonda oligonucleotídica comprende además un marcador doble interactivo que comprende un resto indicador localizado en dicha porción de marca o en dicha porción de hibridación y un primer resto extintor localizado en dicha porción de hibridación y en la que dicho resto indicador se separa de dicho primer resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa; y en la que dicha porción de marca se une reversiblemente de una manera dependiente de la temperatura a una molécula de extinción que comprende o se asocia con uno o más restos extintores que pueden extinguir dicho resto indicador cuando dicha molécula de extinción se une a dicha porción de marca;

(b) amplificar dicho ácido nucleico diana por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando una ácido nucleico polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3' de modo que durante una etapa de extensión de cada ciclo de PCR, la actividad nucleasa 5' a 3' de la polimerasa permite la escisión y separación de la porción de marca del primer resto extintor en la porción de hibridación de la sonda oligonucleotídica;

(c) medir una o más señales del resto indicador a una primera temperatura a la que la molécula de extinción se une a la porción de marca;

(d) medir una o más señales del resto indicador a una segunda temperatura, que es mayor que la primera temperatura, a la que la molécula de extinción no se une a la porción de marca;

(e) obtener un valor de señal calculado restando una mediana o promedio de la una o más señales detectadas a la primera temperatura de una mediana o promedio de la una o más señales detectadas a la segunda temperatura; con lo que un valor de señal calculado que es mayor que un valor de señal umbral permite la determinación de la presencia del ácido nucleico diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se permite que la amplificación por PCR de la etapa (b) alcance un punto final más allá de la fase logarítmica de amplificación.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el resto indicador está en la porción de marca de la sonda oligonucleotídica.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la porción de marca comprende una secuencia de nucleótidos no complementaria a la secuencia de ácido nucleico diana y la molécula de extinción es un oligonucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la porción de marca de la sonda oligonucleotídica y se une a la porción de marca por hibridación.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que la porción de marca comprende una modificación tal que no se puede extender por una ácido nucleico polimerasa.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que la porción de marca de la sonda oligonucleotídica o la molécula de extinción o tanto la porción de marca como la molécula de extinción contienen una o más modificaciones de nucleótidos y en el que una o más modificaciones de nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido peptidonucleico (PNA), ácido nucleico con puente (BNA), sustitución de 2'-O-alquilo, nucleótido L-enantiomérico, o combinaciones de los mismos.

7. Un procedimiento para detectar dos o más secuencias de ácido nucleico diana en una muestra que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto dicha muestra sospechosa de contener dichas dos o más secuencias de ácido nucleico diana en un recipiente de reacción individual con

(i) un primer par de cebadores oligonucleotídicos con secuencias de nucleótidos que son complementarias a cada hebra de una primera secuencia de ácido nucleico diana, y un segundo par de cebadores oligonucleotídicos con secuencias de nucleótidos que son complementarias a cada hebra de una segunda secuencia de ácido nucleico diana;

(ii) una primera sonda oligonucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la primera secuencia de ácido nucleico diana y que se hibrida dentro de una región de la primera secuencia de ácido nucleico diana que se une por el primer par de cebadores oligonucleotídicos, en la que dicha primera sonda oligonucleotídica comprende un resto fluorescente que puede generar una señal detectable y un primer resto extintor que puede extinguir la señal detectable generada por el resto fluorescente, en la que dicho resto fluorescente se separa del primer resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa;

(iii) una segunda sonda oligonucleotídica que comprende dos porciones distintas:

- una porción de hibridación que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico diana y que se hibrida dentro de una región de la segunda secuencia de ácido nucleico diana que se une por el segundo par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la porción de hibridación comprende un segundo resto extintor; y

- una porción de marca unida al extremo 5' o al extremo 3' de la porción de hibridación o unida por medio de un conector a una región de la porción de hibridación que comprende una secuencia de nucleótidos que no es complementaria a las dos o más secuencias de ácido nucleico diana, en la que la porción de marca comprende un resto fluorescente que es idéntico al resto fluorescente en la primera sonda oligonucleotídica y con una señal detectable que se puede extinguir por el segundo resto extintor en la porción de hibridación, en la que dicho resto fluorescente se separa del segundo resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa;

(iv) un oligonucleótido de extinción que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica y que se hibrida a la porción de marca para formar un dúplex, en la que dicho oligonucleótido de extinción comprende un tercer resto extintor que extingue la señal detectable generada por la fracción fluorescente en la porción de marca cuando el oligonucleótido de extinción se hibrida a la porción de marca;

(b) amplificar la primera y segunda secuencias de ácido nucleico diana por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando una ácido nucleico polimerasa que tiene actividad nucleasa 5' a 3' de modo que durante una etapa de extensión de cada ciclo de PCR, la actividad nucleasa 5' a 3' de la ácido nucleico polimerasa permite

(i) la escisión y separación del resto fluorescente del primer resto extintor en la primera sonda oligonucleotídica, y

(ii) la escisión y separación del resto fluorescente en la porción de marca del segundo resto extintor en la porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica, en la que en la etapa de extensión el oligonucleótido de extinción permanece hibridado a la porción de marca;

(c) medir una o más señales fluorescentes a una primera temperatura a la que el oligonucleótido de extinción se hibrida a la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica;

(d) medir una o más señales fluorescentes a una segunda temperatura, que es mayor que la primera temperatura, a la que el oligonucleótido de extinción no se hibrida a la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica;

(e) obtener un valor de señal calculado restando una mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la primera temperatura de una mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la segunda temperatura; con lo que un valor de la mediana o promedio de la una o más señales fluorescentes detectadas a la primera temperatura que es mayor que un valor umbral permite la determinación de la presencia de la primera secuencia de ácido nucleico diana y el valor de señal calculado que es mayor que el valor de señal umbral permite la determinación de la presencia del segundo ácido nucleico diana.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que se permite que la amplificación por PCR de la etapa (b) alcance un punto final más allá de la fase logarítmica de amplificación.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que la porción de marca se une al extremo 5' de la porción de hibridación.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7 - 9, en el que la porción de marca comprende una modificación tal que no se puede extender por una ácido nucleico polimerasa.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7 - 10, en el que el oligonucleótido de extinción se conecta a la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica por medio de una estructura de tallo-bucle.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 7 - 11, en el que la porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica o el oligonucleótido de extinción o tanto la porción de marca como el oligonucleótido de extinción contienen una o más modificaciones de nucleótidos y en el que una o más modificaciones de nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido peptidonucleico (PNA), ácido nucleico con puente (BNA), sustitución de 2'-O-alquilo, nucleótido L-enantiomérico, o combinaciones de los mismos.

13. Un procedimiento para detectar dos o más secuencias de ácido nucleico diana en una muestra que comprende las etapas de:

(ii) una primera sonda oligonucleotídica que comprende dos porciones distintas:

- una primera porción de hibridación que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la primera secuencia de ácido nucleico diana y que se hibrida dentro de una región de la primera secuencia de ácido nucleico diana que se une por el primer par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la primera porción de hibridación comprende un primer resto extintor y se bloquea en el extremo 3' para prohibir la extensión por una ácido nucleico polimerasa; y

- una primera porción de marca unida al extremo 5' o al extremo 3' de la primera porción de hibridación o unida por medio de un conector a una región de la porción de hibridación que comprende una secuencia de nucleótidos que no es complementaria a las dos o más secuencias de ácido nucleico diana, en la que la primera porción de marca comprende un resto fluorescente con una señal detectable que se puede extinguir por el primer resto extintor en la primera porción de hibridación, en la que dicho resto fluorescente se separa del primer resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa;

(iii) un primer oligonucleótido de extinción que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica y que se hibrida a la primera porción de marca para formar un dúplex, en la que dicho primer oligonucleótido de extinción comprende un segundo resto extintor que extingue la señal detectable generada por el resto fluorescente en la primera porción de marca cuando el primer oligonucleótido de extinción se hibrida a la primera porción de marca;

(iv) una segunda sonda oligonucleotídica que comprende dos porciones distintas:

- una segunda porción de hibridación que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la segunda secuencia de ácido nucleico diana y que se hibrida dentro de una región de la segunda secuencia de ácido nucleico diana que se une por el segundo par de cebadores oligonucleotídicos, en la que la segunda porción de hibridación comprende un tercer resto extintor y se bloquea en el extremo 3' para prohibir la extensión por una ácido nucleico polimerasa; y

- una segunda porción de marca unida al extremo 5' o al extremo 3' de la segunda porción de hibridación o unida por medio de un conector a una región de la porción de hibridación que comprende una secuencia de nucleótidos que no es complementaria a las dos o más secuencias de ácido nucleico diana y que tiene una secuencia de ácido nucleico diferente o modificaciones de nucleótidos diferentes en comparación con la secuencia de nucleótidos de la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica, en la que la segunda porción de marca comprende un resto fluorescente que es idéntico al resto fluorescente en la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica y con una señal detectable que se puede extinguir por el tercer resto extintor en la segunda porción de hibridación, en la que dicho resto fluorescente se separa del tercer resto extintor por un sitio de escisión susceptible de nucleasa;

(v) un segundo oligonucleótido de extinción que comprende una secuencia de nucleótidos al menos parcialmente complementaria a la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica y que se hibrida a la segunda porción de marca para formar un dúplex, en la que dicho segundo oligonucleótido de extinción comprende un cuarto resto extintor que extingue la señal detectable generada por el resto fluorescente en la segunda porción de marca cuando el segundo oligonucleótido de extinción se hibrida a la segunda porción de marca;

en la que el dúplex entre el segundo oligonucleótido de extinción y la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica tiene un valor de temperatura de fusión (T/) mayor que el dúplex entre el primer oligonucleótido de extinción y la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica;

(i) la escisión y separación del resto fluorescente en la primera porción de marca del primer resto extintor en la primera porción de hibridación de la primera sonda oligonucleotídica, en la que en la etapa de extensión el primer oligonucleótido de extinción permanece hibridado a la primera porción de marca, y

(ii) la escisión y separación del resto fluorescente en la segunda porción de marca del tercer resto extintor en la segunda porción de hibridación de la segunda sonda oligonucleotídica, en la que en la etapa de extensión el segundo oligonucleótido de extinción permanece hibridado a la segunda porción de marca;

(c) medir una o más señales fluorescentes a una primera temperatura a la que el primer oligonucleótido de extinción no se hibrida a la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica y el segundo oligonucleótido de extinción permanece hibridado a la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica;

(d) medir una o más señales fluorescentes a una segunda temperatura, que es mayor que la primera temperatura, a la que el segundo oligonucleótido de extinción no se hibrida a la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica;

14. El procedimiento de la reivindicación 13, en el que se permite que la amplificación por PCR de la etapa (b) alcance un punto final más allá de la fase logarítmica de amplificación.

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 - 14, en el que el primer oligonucleótido de extinción se conecta a la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica por medio de una estructura de tallo-bucle y/o en el que el segundo oligonucleótido de extinción se conecta a la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica por medio de una estructura de tallo-bucle.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 - 15, en el que la primera porción de marca liberada y la segunda porción de marca liberada comprenden ambas una modificación tal que ambas porciones de marca liberadas no se pueden extender por una ácido nucleico polimerasa.

17. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13 - 16, en el que la detección de dos o más secuencias de ácido nucleico diana se realiza por PCR digital.

18. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 13-17, en el que cualquiera de la primera porción de marca de la primera sonda oligonucleotídica o el primer oligonucleótido de extinción o la segunda porción de marca de la segunda sonda oligonucleotídica o el segundo oligonucleótido de extinción o cualquier combinación de los mismos contiene una o más modificaciones de nucleótidos y en el que la una o más modificaciones de nucleótidos se seleccionan del grupo que consiste en ácido nucleico bloqueado (LNA), ácido peptidonucleico (PNA), ácido nucleico con puente (BNA), sustitución de 2'-O-alquilo, nucleótido L-enantiomérico, o combinaciones de los mismos.