CN110621783A - 多重核酸扩增测定 - Google Patents

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Abstract

本公开内容是单管多重测定，其能够使用多种用相同的荧光报道分子标记进行标记但各自具有不同的退火温度的杂交引物和探针同时检测多种核酸靶。可以使用多组杂交引物和探针进一步将所述测定多重化，各组用独立的荧光报道分子标记进行标记。

Description

多重核酸扩增测定
公开内容的领域
本公开内容大体上涉及核酸的体外扩增和检测。具体地，本公开内容涉及单管多重测定，其能够使用多组杂交引物和探针同时扩增和检测多种核酸靶，其中所述探针用相同的报道分子标记进行标记。可以使用几种报道分子进一步将所述测定多重化。
公开内容的背景
聚合酶链反应（PCR）已成为生物医学研究、疾病监控和诊断的普遍存在的工具。通过PCR扩增核酸序列描述于美国专利Nos. 4,683,195、4,683,202和4,965,188中。现在，PCR在本领域中是众所周知的，并且已经在科学文献中进行了广泛的描述。参见PCRApplications，（（1999）Innis等人，eds., Academic Press, San Diego），PCRStrategies，（（1995）Innis等人，eds., Academic Press, San Diego）；PCR Protocols，（（1990）Innis人，eds., Academic Press, San Diego），和PCR Technology，（（1989）Erlich，ed., Stockton Press, New York）。“实时”PCR测定能够同时扩增和检测和定量靶序列的起始量。Holland等人（1991）Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280和美国专利No. 5,210,015中描述了使用DNA聚合酶的核酸酶活性的基本TaqMan实时PCR测定。在2008年12月9日提交的美国申请序列No. 12/330,694中已描述了没有核酸酶活性的实时PCR（无核酸酶测定）。在美国专利No. 5,538,848中描述了在实时PCR中荧光探针的使用。
典型的实时PCR规程涉及对每种靶序列具有特异性的标记的探针的使用。探针优选用一种或多种荧光部分标记，所述荧光部分发射可检测波长的光。与靶序列或其扩增子杂交时，探针显示出可检测的荧光发射变化。
然而，实时测定的主要挑战仍然是在单个管中分析众多靶的能力。在实际上医学和诊断学的每个领域中，感兴趣的基因座的数目迅速增加。例如，仅举几个例子，必须在法医DNA分布、病原微生物检测、多基因座遗传病筛选和多基因表达研究中分析多个基因座。在当前方法的情况中，使测定多重化的能力受到检测仪器的限制。具体而言，在相同反应中多种探针的使用需要使用不同的荧光标记。为了同时检测多种探针，仪器必须能够区分由每种探针发射的光信号。当前的技术不允许在相同反应容器中检测多于四种的独立波长。例如，Bell等人（“Real-time quantitative PCR in parasitology,” Trends inParasitol. (2002) 18(8):337-342）最近调查了可用的实时定量PCR热循环仪，并报告没有一种具有多于四个的光学检测通道。因此，每种靶使用一种唯一标记的探针，在相同容器中可检测不多于四种独立的靶。实际上，至少一种靶通常是对照核酸。因此，实际上，在相同管中可检测不多于三种实验靶。因为光学硬件最多可能提供小的增量改进，所以除非在扩增和检测策略上进行了根本性改变，否则使测定多重化的能力将不能跟上临床需要。
公开内容概述
本文提供了一种用于检测单个样品容器中的多种靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：（a）使怀疑含有多种靶核酸的样品与（i）包括第一标记的探针和第一引物的第一引物/探针组和（ii）包括第二标记的探针和第二引物的第二引物/探针组接触，其中所述第一引物于第一温度与所述多种靶核酸中的靶核酸退火且所述第二引物于第二温度与所述多种靶核酸中的另外的核酸退火，并且所述第一温度高于所述第二温度；（b）在扩增反应中扩增所述样品中的所述多种靶核酸，所述扩增反应包括至少两步退火/延伸温度分布，其包括第一步骤和第二步骤，所述第一步骤包括第一温度，且所述第二步骤包括第二温度；（c）分别在至少一部分退火/延伸温度分布上顺序检测来自所述第一和第二标记的可检测信号；和（d）测量所述多种靶核酸中每种靶核酸的相对量。在一些实施方案中，所述第一和第二标记的探针各自用相同的报道分子部分标记。在某些实施方案中，所述报道分子部分是荧光的。在一些实施方案中，所述第一和第二标记的探针各自用报道分子部分和猝灭剂部分标记。在某些实施方案中，所述报道分子部分和所述猝灭剂部分是荧光团。在一些实施方案中，所述报道分子部分是荧光团，且所述猝灭剂部分是暗猝灭剂（dark quencher）。在一些实施方案中，所述检测步骤进一步包括（i）在所述第一步骤期间检测与由所述第一标记发射的信号相对应的第一信号，（ii）在所述第二步骤期间检测第二信号，以及（iii）从所述第二信号中减去所述第一信号以鉴定由所述第二标记发射的可检测信号。在一些实施方案中，所述第一和第二步骤分别保持至少10秒。在某些实施方案中，所述第一和第二步骤分别保持5-10秒。在这里，退火步骤和/或延伸步骤中的每一个可以于恒定的温度保持指示的时间段。在某些实施方案中，退火步骤和/或延伸步骤中的每一个可以于恒定的温度保持至少10秒、至少15秒、至少20秒或5-10秒。在一些实施方案中，扩增所述样品中的所述多种靶核酸包括第一步骤，其包括将反应于恒定的第一温度保持至少5-10秒，和随后将反应于恒定的第二温度保持至少5-10秒。在某些实施方案中，将所述第一和/或第二温度中的每一个保持至少10秒、至少15秒、至少20秒或5-10秒。在一些实施方案中，所述第一和第二温度相隔至少15度，特别地相隔至少12度，并且相隔至少约10度。进一步地，在一些实施方案中，所述第一和第二标记的探针各自用相同的报道分子部分标记，并且所述检测步骤进一步包括（i）在所述第一步骤期间检测与由所述第一标记发射的信号相对应的第一信号，（ii）在所述第二步骤期间检测第二信号，以及（iii）从所述第二信号中减去所述第一信号以鉴定由所述第二标记发射的可检测信号。在一些实施方案中，所述扩增反应在有DNA聚合酶混合物的情况下进行。
还提供了用于检测单个样品容器中的多种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒在分开的容器、小瓶或区室中包括（i）包括第一标记的探针和第一引物的第一引物/探针组，以及（ii）包括第二标记的探针和第二引物的第二引物/探针组，其中所述第一引物于第一温度与所述多种靶核酸中的靶核酸退火且所述第二引物于第二温度与所述多种靶核酸中的另外的核酸退火，并且所述第一温度高于所述第二温度。试剂盒可进一步包括用于扩增靶核酸所必需的试剂，任选地包括已知浓度的对照核酸。在一些实施方案中，所述第一和第二标记的探针各自用相同的报道分子部分标记。在某些实施方案中，所述报道分子部分是荧光的。在一些实施方案中，所述第一和第二标记的探针各自用报道分子部分和猝灭剂部分标记。在某些实施方案中，所述报道分子部分和所述猝灭剂部分是荧光团。在某些实施方案中，所述报道分子部分是荧光团，且所述猝灭剂部分是暗猝灭剂。在一些实施方案中，试剂盒进一步包括已知浓度的对照核酸。在一些实施方案中，单个样品容器包括样品处理小管，所述样品处理小管包括限定流体流动通道的管和设置于其中的多个区段，其中所述管的至少一个区段包括所述第一和第二引物/探针组。在这里，所述管可以进一步包括一个或多个另外的区段，其包括用于扩增靶核酸所必需的试剂。在一些实施方案中，所述试剂包含DNA聚合酶的混合物。
附图简述
图1是使用两步引物退火/延伸温度分布的使用引物/探针A和引物/探针B的样品中两种靶序列的扩增分布的图解表示法。
图2显示了使用单独的两组引物和探针（引物/探针A和引物/探针B）扩增样品中两种靶序列所产生的相对荧光，其中扩增过程包括两步引物退火/延伸温度分布。
公开内容详述
定义
除非本文另有定义，否则与本公开内容共同使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。进一步地，除非上下文另外要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。冠词“一个（a）”和“一种（an）”在本文中用于指一个或多于一个（即，至少一个）冠词的语法对象。举例来说，“一个要素”是指一个要素或多于一个要素。
在本申请中使用术语“检测（detect）”、“检测（detecting）”、“检测（detection）”和类似术语来概括地指过程或发现或确定某事物的存在或不存在，以及程度、数量或水平，或发生的概率。例如，术语“检测”当关于靶核酸序列使用时，可以表示发现或确定所述序列的存在、不存在、水平或数量，以及存在或不存的概率或似然性。要理解的是，表述“检测存在或不存在”、“存在或不存在的检测”和相关表述包括定性和定量检测。例如，定量检测包括确定样品中HIV-有关的核酸序列的水平、数量或量。
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指核苷酸（例如，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸）的多聚体，并且包括天然存在的（腺苷、胍、胞嘧啶、尿嘧啶和胸苷）、非天然存在的和修饰的核酸。该术语不受多聚体长度（例如，单体数目）的限制。核酸可以是单链或双链的，并且将通常含有5'-3'磷酸二酯键，尽管在一些情况下，核苷酸类似物可能具有其他键。单体一般被称为核苷酸。术语“非天然核苷酸”或“修饰的核苷酸”是指含有修饰的含氮碱基、糖或磷酸基团，或在其结构中掺入非天然部分的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括双脱氧核苷酸，生物素化的，氨基化的，脱氨基的，烷基化的，苄化的和荧光团标记的核苷酸。
术语“引物”是指短核酸（寡核苷酸），其充当在合适条件下通过核酸聚合酶合成多核苷酸链的起始点。多核苷酸合成和扩增反应一般包括合适的缓冲剂、dNTPs和/或rNTPs以及一种或多种任选的辅因子，并且于合适的温度进行。引物一般包括至少一个与靶序列至少基本上互补的靶杂交区。这个区域的长度一般为约15至约40个核苷酸。“引物对”是指与靶序列的相反链互补并被设计用于扩增靶序列的正向引物和反向引物（有时称为5'和3'引物）。正向和反向引物在靶序列上彼此可扩增的距离内排列，例如，约10-5000个核苷酸或约25-500个核苷酸。
如本文所用的，“探针”意指能够选择性地结合具体预期的靶生物分子（例如，将被探针结合、捕获或杂交的感兴趣的核酸序列）的任何分子。
单词“互补的”或“互补性”是指多核苷酸中的核酸与第二多核苷酸中的另一核酸形成碱基对的能力。例如，序列5'-A-G-T-3'（对于RNA为5'-A-G-U-3'）与序列3'-T-C-A-5'（对于RNA为3'-U-C-A-5'）互补。互补可以是部分的，其中仅一些核酸根据碱基配对匹配，或者可以是完全的，其中所有的核酸都根据碱基配对匹配。如果探针或引物与靶序列至少部分互补，则认为所述探针或引物“对”靶序列“特异”。取决于条件，对于较短的核酸例如引物（例如，大于80％、90％、95％或更高），与对于较长序列相比，与靶序列的互补性程度一般更高。
术语“扩增条件”或类似表述是指核酸扩增反应（例如，PCR扩增）中的条件，其允许引物的杂交和模板依赖性延伸。术语“扩增子”是指包含靶核酸序列的全部或片段并且作为通过任何合适的扩增方法进行体外扩增的产物而形成的核酸分子。在PCR Strategies（Innis等人，1995，Academic Press, San Diego, CA）第14章；PCR Protocols: A Guideto Methods and Applications（Innis等人, Academic Press, NY, 1990）中描述了各种PCR条件。术语“热稳定的核酸聚合酶”或“热稳定的聚合酶”是指一种聚合酶，其当例如与来自大肠杆菌（E. coli）的聚合酶相比时在升高的稳定相对稳定。热稳定的聚合酶适合在作为聚合酶链反应（“PCR”）特征的温度循环条件下使用。示例性的热稳定的聚合酶包括来自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）、Thermus caldophilus、栖热菌属物种（Thermussp.）Z05（参见，例如，美国专利No. 5,674,738）和栖热菌属物种Z05聚合酶的突变体、水生栖热菌（Thermus aquaticus）、黄栖热菌（Thermus flavus）、丝状栖热菌（Thermusfiliformis）、栖热菌属物种sps17、耐放射异常球菌（Deinococcus radiodurans）、温泉家族B/克隆7、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、热坚芽孢杆菌（Bacilluscaldotenax）、海栖热袍菌（Thermotoga maritima）、那不勒斯栖热袍菌（Thermotoganeapolitana）和非洲栖热腔菌（Thermosipho africanus）的那些及其修饰形式。
术语“样品”或“生物样品”是指含有或推测含有来自个体的核酸的任何组合物。该术语包括细胞、组织或血液的纯化或分离的组分，例如，DNA、RNA、蛋白质、无细胞部分或细胞裂解物。在具体的实施方案中，对全血样品进行分析。如本文所用的，“全血样品”包括从身体中抽取的血液，尚未从所述血液去除诸如血浆或血小板的成分。通常，除抗凝剂的存在外，样品未经修饰。样品还可以指其他类型的生物样品，例如血浆、血清、血液组分（血沉棕黄层）和干血斑（dried blood spots）。样品还可以包括从个体获得的细胞的体外培养物的成分和组分，包括细胞系。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品（例如，包装或容器），其包括如本文所述的用于特异性扩增、捕获、标记/转化或检测如本文所述的靶核酸序列的固相支持体。试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
“荧光团”是例如与核酸附着的化合物或部分，当被合适波长的光激发时，其能够发射光辐射。典型的荧光染料包括罗丹明染料、花菁染料、荧光素染料和BODIPY®染料。荧光团是荧光发色团。
“FRET”或“荧光共振能量转移”或“Foerster共振能量转移”是至少两个发色团，供体发色团和接纳体发色团（称为猝灭剂）之间的能量转移。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体一般将能量转移至接纳体。接纳体一般以具有不同波长的光辐射的形式再发射所转移的能量。当接纳体是“暗”猝灭剂时，它以除光以外的形式耗散转移的能量。特定的荧光团是充当供体还是接纳体取决于FRET对中另一个成员的性质。常用的供体-接纳体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的暗猝灭剂是BlackHoleQuenchers™（BHQ）, Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Cal.)，Iowa Black™,Integrated DNA Tech., Inc. (Coralville, Iowa)，BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), Berry & Assoc., (Dexter, Mich.)。常用的供体-猝灭剂对包括FAM-BHQ对。
“杂交”是两个通常单链或至少部分单链的核酸之间的相互作用。杂交是作为核碱基（nucleobases）之间的碱基配对的结果而发生的，并且涉及诸如氢键合、溶剂排斥（solvent exclusion）、碱基堆积等的物理化学过程。杂交可以发生在完全互补或部分互补的核酸链之间。核酸杂交的能力受温度和其他杂交条件的影响，可以对其进行控制以使得发生甚至部分互补的核酸的杂交。核酸的杂交是本领域众所周知的，并且已经在Ausubel（Eds.）Current Protocols in Molecular Biology, v. I, II和III (1997)中广泛描述。
“标记”是指（共价或非共价地）附着于分子的部分，该部分能够提供关于分子的信息。示例性标记包括荧光标记、放射性标记和质量修饰基团。
“退火温度”是指互补的单链核酸分子群体中的一半在同源双链体或异源双链体中杂交的温度。退火温度可以基于解链温度（Tm），即，双链核酸分子群体的一半解离的温度。退火温度受溶液的离子强度和pH值，以及浓度、碱基组成和二级结构的影响。一对互补的核酸在给定条件下的退火温度可以通过实验确定，或借助于诸如Visual OMP™（DNASoftware, Inc., Ann Arbor, Mich.）的商业软件来预测。
方法
本公开内容提供了同时多重检测核酸靶的方法。在一个实施方案中，该方法利用多种用相同报道分子部分标记的探针，连同各自具有与给定靶序列的独特退火温度的多种引物。因为可以通过它们各自的退火温度来鉴定引物，所以可以使用相同的荧光团为每种引物生成可检测的信号。所述测定可以进一步使用几组引物/探针多重化，每个组包括用单独的报道分子部分标记的探针，最多到检测仪器可区别的部分的数目。
本文所述的方法包括检测在引物退火和延伸的每个阶段期间由每个引物组产生的信号。所述方法例如在图1中举例说明。将包含多种靶核酸序列的样品与（i）包括第一标记的探针和第一引物（图1中的探针A和引物A）的第一引物/探针组以及（ii）包括第二标记的探针和第二引物（图1中的探针B和引物B）的第二引物/探针组混合，其中所述第一引物被设计为于第一温度与样品中的靶核酸（如果存在的话）退火，且所述第二引物被设计为于第二温度与样品中的另外的核酸（如果存在的话）退火，并且所述第一温度高于所述第二温度。混合物中的靶核酸序列例如于95℃变性（图A），并逐渐降低温度，例如至70℃，以允许探针与其各自的靶序列退火（图B）。在多步骤引物退火/延伸分布中，将混合物的温度逐渐降低至第一温度，例如，62℃（图C），以允许引物A与靶序列退火（图C（i））并延伸（图C（ii））。随着引物A延伸，它水解探针A，从而产生可检测的信号。在所述过程的此刻，因为仅引物A与靶退火，所以可检测信号只归因于引物A及其相应靶序列的退火/延伸。
然后将温度再次降低至引物退火/延伸分布的第二温度，例如，50℃（图D），此刻，引物B与靶序列退火（图D（i））并延伸（图D（ii）），最后杂交探针B并产生补充的可检测信号。当温度降低到第二温度时，来自引物A的退火/延伸的可检测信号不消除，且因此，于第二温度的累积可检测信号对应于与引物A和引物B的退火和延伸有关的信号。可以通过从在第一温度观察到的中减去在第二温度的可检测信号来计算与引物B有关的可检测信号。该方法还在图2中举例说明，其中温度相对于荧光作图。随着温度降低，相对荧光信号增加。
将理解的是，虽然所述方法使用两个引物/探针组在附图中举例说明并且在上文进行了描述，但是可以将多个引物/探针组与样品同时混合，以实现更高水平的多重化，只要在样品中扩增分布中每个引物和靶序列的退火温度与其他引物/靶序列的不同。在一个实施方案中，每个引物/靶序列的退火温度相隔至少15度，特别地相隔至少12度，并且相隔至少约10度。
探针可以用相同的报道分子部分标记。报道分子部分可以是发色团，例如，荧光团，并且如果使用两个发色团作为报道分子部分，则一个一般是报道分子发色团而另一个是猝灭剂。两个发色团都可以是荧光团，或者发色团之一可以是非荧光猝灭剂。合适的荧光团的例子包括荧光素家族（FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE）、罗丹明家族（得克萨斯红、ROX、R110、R6G和TAMRA）、花菁家族（Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7）香豆素家族、嗪家族、噻嗪家族、squaranine家族和其他适合标记和检测核酸的荧光染料家族的染料。第二发色团可掺入相同的探针寡核苷酸或分开的探针寡核苷酸中。常用的暗猝灭剂包括BlackHoleQuenchers™（BHQ），（Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.）、Iowa Black™，（Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa），和BlackBerry™ Quencher 650（BBQ-650），（Berry & Assoc., Dexter, Mich.）。
在一些实施方案中，每个探针用形成FRET对的两个发色团标记。在一些实施方案中，两个发色团均为荧光团。在其他实施方案中，一个发色团是非荧光猝灭剂。形成FRET对的发色团可以与相同或分开的探针分子缀合。在美国专利No. 6,174,670和De Silva等人，（1998）“Rapid genotyping and quantification on the LightCycler™ withhybridization probes,” Biochemica, 2:12-15中已描述了在解链测定中FRET探针的使用。在其他实施方案中，探针用单个发色团标记，所述单个发色团与或者与靶核酸缀合或者插入靶核酸中的第二发色团相互作用。参见美国专利No. 5,871,908。
另一方面，为了实现甚至更高程度的多重化，可以使用两种或更多种报道分子部分或报道分子部分组。例如，第一报道分子部分与前两种引物一起使用，每种引物具有不同的退火温度，但是以相同类型的可检测信号进行检测，且第二报道分子部分可以与另外的两种引物一起使用，每种引物具有与前两种引物相同的退火温度，但是因为它们用第二种类型的可检测信号标记，所以它们可以与前两种引物分开检测。例如，参考图1A-1D中描绘的实验的扩展，引物/探针组A和B中的每一个都使用相同的第一报道分子部分，并且引物/探针组的另外一对，例如，组C和D（未显示），包括第二报道分子部分，其中第一和第二报道分子部分各自产生不同的可检测信号。因此，可以使用退火温度和/或报道分子部分检测个别靶序列的每一个。在此实例中，A与B区别开，这是因为即使它们用相同的报道分子部分标记，它们也于不同温度与靶退火；但是至少因为A的扩增使用不同于在C和D的扩增期间观察到的报道分子部分进行检测，所以A与C和D区别开。在上文中所述且在附图中举例说明的实例中，使用了两组引物退火/延伸步骤，但是本领域技术人员将理解，如果使用另外的引物/探针组并且期望更高水平的多重化，则该方法中可以包括另外的引物/退火/延伸步骤。
用于引物退火/延伸步骤的合适温度的选择取决于所使用的所选热稳定的聚合酶。在本文提供的非限制性实例中，变性步骤于94-98℃的温度进行20-30秒，例如，于95℃；探针退火步骤于70-75℃进行至少10秒，例如70℃；第一引物退火/延伸步骤于62-67℃进行至少10秒，例如62℃；且第二引物退火/延伸步骤于50-55℃进行至少10秒，例如50℃。在备择实施方案中，变性步骤于94-98℃的温度进行20-30秒，例如，于95℃；探针退火步骤于70-75℃进行至少10秒，例如72℃；第一引物退火/延伸步骤于62-67℃进行至少10秒，例如67℃；且第二引物退火/延伸步骤于60-65℃进行至少10秒，例如62℃。退火/延伸步骤的每一个都可以于恒定温度保持至少20秒，例如，至少15秒，在5-10秒，并且在一个实施方案中，至少10秒。
可以选择用于本文所述方法的各种热稳定的核酸聚合酶是本领域已知的。在一个实施方案中，使用Z05聚合酶或其突变体。另一方面，使用rTth聚合酶或其突变体。有时使用缺乏5'-3'核酸酶活性的聚合酶是有利的。有时期望使用没有校正（3'-5'-外切核酸酶）活性的聚合酶。此外，可以使用聚合酶的混合物，例如，适合于扩增第一引物/探针组的第一聚合酶和适合于扩增第二引物/探针组的第二聚合酶。
通过本公开内容的方法检测的靶核酸序列可以具有任何长度。一般，靶核酸的长度为100至1,000个核苷酸。然而，在本公开内容的一些实施方案中，也可以使用更长（几千个核苷酸）和更短（50至100个核苷酸）的靶序列。靶核酸序列可以包含在从天然或实验室衍生的样品来源分离的更大的核酸分子中。
尽管本公开内容大体上涉及一种在样品中存在多种靶的方法，但是将理解的是，在一些实施方案中，样品中仅存在一种靶序列。在本公开内容的典型实施方案中，进行“多重”反应，其中检测到至少两种且最多到十二种或更多种不同的靶子序列（sub-sequences）或基因座。这些实施方案通常但并非总是涉及对于每种靶子序列或基因座使用单独的扩增引物和单独的探针。然而，在一些实施方案中，可以使用多于一种探针来检测使用相同引物扩增的相同核酸。当单个序列含有几个感兴趣的靶或基因座，例如，几个潜在突变位点时，这是有利的。每个引物/探针组将能够检测在每个位点的突变。
本公开内容的扩增引物是与靶序列的至少一种现有变体至少部分互补的寡核苷酸。引物的长度范围可以在6和100个核苷酸之间，尽管大多数引物一般范围在15和35个核苷酸之间。最优化用于核酸扩增的引物的方法已例如在PCR Protocols: A Guide toMethods and Applications, Innis等人, eds., (1990) Academic Press中描述。一般，引物是合成的寡核苷酸，由A、C、G和T核苷酸组成。然而，可以参入核酸的非常规碱基核苷酸也可以用于引物中。例如，已知某些修饰的碱基增加扩增的特异性，参见美国专利No. 6,001,011。
杂交探针的设计是本领域已知的。在本公开内容的一些实施方案中，在经受测定的反应混合物中可以存在多于一种探针。本领域技术人员将立即认识到适用于多重测定中有用的探针的设计标准。具体而言，应将能够在相同反应混合物中使用的探针设计为与其相应靶序列具有不同的杂交退火温度。
样品处理设备
本文描述的方法可以在被配置为执行核酸扩增技术的样品处理设备中执行。
在一个实施方案中，本文公开的方法在包括自携式微尺度到大尺度的通道、室、储存器、检测和处理区域的设备中执行。所述设备可以是药筒、设备、容器或袋，例如，如美国专利Nos. 6,440,725；6,783,934；6,818,185；6,979,424；8,580,559；和8,940,526中所描述的，以及诸如可从Cepheid Corp., Idaho Technology, Inc.和/或BiofireDiagnostics, Inc.获得的那些的设备。
例如，本文描述的方法可以在包括细胞裂解区、核酸制备区、第一阶段扩增区、第二阶段扩增区的自携式核酸分析袋中执行，如美国申请公开No. 201000056383的图1中所示的。所述袋包括各种尺寸的多种通道和泡型罩（blisters），并这样布置以使得样品流过系统和各个区并因此被处理。样品处理发生在位于袋内的各种泡型罩中。提供许多通道以在处理区域内和之间移动样品，而提供其他通道以将流体和试剂递送到样品或从样品除去这种流体和试剂。袋内的液体通过压力例如气动压力（pneumatic pressure）在泡型罩之间移动。
在备择的实例中，本文所述的方法可以在如美国专利No. 9,322,052的图3-5和9中所示的自携式核酸分析药筒中执行。所述药筒除了别的以外还包括多个室，所述多个室包括用于容纳通过入口引入的流体样品的样品室、用于容纳洗涤溶液的洗涤室、用于容纳裂解试剂的试剂室、裂解室、用于接收用过的样品和洗涤溶液的废物室、用于容纳中和剂的中和剂室和用于容纳主混合物（master mix）（例如，扩增试剂和荧光探针）且用于将试剂和探针与从流体样品分离的分析物混合的主混合物室，反应容器，和检测室。
在具体的实施方案中，本文所述的方法在样品处理设备中进行，例如在美国专利No. 7,718,421中所述那种。分区段的设备，例如在美国专利No. 7,718,421中描述的那些，提供了用于接收、贮藏、处理和/或分析生物样品的方便容器。在某些实施方案中，分区段的设备便于涉及多个处理步骤的样品处理规程。在某些实施方案中，可以将样品收集在样品设备中，且然后将所述设备放置在分析仪中，所述分析仪操纵所述设备及其内容物以处理样品。
特定的实施方案包括一种挠性设备，所述挠性设备已经通过易碎的密封装置分区段成区室。各个区段可以含有用于处理样品的各种试剂和缓冲剂。夹子和调节器可以以各种组合并以各种时间控制应用到设备，以引导流体的运动并引起易碎的密封装置破裂。易碎的密封装置的破裂可能会留下设备的内表面，其基本上没有对流体流动的阻碍。在一个实施方案中，随着处理进展，生物样品流可以被朝着设备的远端引导，而废物流可以被迫使以相反方向朝着最初输入样品的设备的开口移动。这个样品入口可以被具有锁定机构的盖密封，可能永久地，而废物室可以位于盖中以接收废物进行贮藏。这种方法的显著益处是，处理的样品不与已由未处理的样品接触过的表面接触。因此，未处理的样品中存在的可能涂布设备壁的痕量反应抑制剂不太可能污染处理的样品。
样品处理设备示于美国专利No. 7,718,421的图1中，并且可以包括透明的挠性设备，所述透明的挠性设备能够被配置成多个区段并且通过压缩而基本上变平。在实施方案中，设备可以具有至少两个区段。在实施方案中，设备可以具有至少三个区段。该挠性设备可提供约2-105℃的操作功能性（functionality），与样品、靶和试剂的相容性，低透气性，最小的荧光性质和/或在重复压缩和挠曲循环期间的回弹性。所述设备可以由多种材料制成，其实例包括但不限于：聚烯烃，例如聚丙烯或聚乙烯，聚氨基甲酸酯，聚烯烃共聚物和/或提供合适特征的其他材料。
在示例性实施方案中，一种或多种试剂可以作为干物质和/或作为液体溶液贮藏在设备区段中。在试剂可以以干燥形式贮藏的实施方案中，液体溶液可以贮藏在邻接的区段中以便于试剂溶液的重构。典型试剂的实例包括：裂解试剂、洗脱缓冲剂、洗涤缓冲剂、DNA酶抑制剂、RNA酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、螯合剂、中和试剂、离液盐溶液、去污剂、表面活性剂、抗凝剂、萌发剂溶液、异丙醇、乙醇溶液、抗体、核酸探针、肽核酸探针和硫代磷酸酯（phosphothioate）核酸探针。在其中一种试剂是离液盐溶液的实施方案中，优选的组分是异氰酸胍或盐酸胍或它们的组合。在一些实施方案中，试剂可以相对于输入样品所通过的开口在设备中贮藏的顺序反映了试剂可以在利用管的方法中使用的顺序。在优选的实施方案中，试剂包括能够与样品的预选组分特异性结合的物质。例如，物质可以特异性结合核酸，或者核酸探针可以特异性结合具有特定碱基序列的核酸。
在具体的实施方案中，所述设备还可以包括基质，例如颗粒或多个颗粒，以便于核酸的选择性吸附。颗粒例如是二氧化硅颗粒、磁颗粒、二氧化硅磁颗粒、玻璃颗粒、硝化纤维素胶体颗粒和磁化的硝化纤维素胶体颗粒。在颗粒可以是顺磁性的一些实施方案中，颗粒可以被磁场捕获。可以允许核酸分子选择性吸附到涂布有官能团的表面的试剂的实例例如描述于美国专利Nos. 5,705,628；5,898,071；和6,534,262中。可以通过控制溶液的离子强度和聚(亚烷基)二醇浓度以选择性地使核酸沉淀并可逆地吸附至固相表面来完成分离。当这些固相表面是顺磁性微粒时，可以在保留核酸而不保留其他分子的条件下洗涤已吸附有靶核酸分子的磁颗粒。几家公司提供基于磁性的纯化系统，例如QIAGEN的MagAttract™、Cortex Biochem的MagaZorb™和Roche Life Science的MagNA Pure LC™。这些产品使用带阴电的颗粒并控制缓冲剂条件，以将多种核酸选择性结合到颗粒，洗涤颗粒并在水性缓冲剂中洗脱颗粒。这些公司使用的许多产品都使用离液盐来帮助核酸沉淀到磁颗粒上。实例在美国专利Nos. 4,427,580；4,483,920；和5,234,809中描述。
优选的示例性实施方案可以包括两个或更多个设备区段的线性布置（美国专利No. 7,718,421的图1）。线性布置便于以受控的方式使样品以及作为结果而产生的废物和靶通过管移动。可以通过设备的第一区段中的第一开口输入样品，例如，样品。此后，来自处理的样品的废物可以朝着第一开口向后移动，而靶被朝着相反末端推动，从而将可能已附着至设备壁的反应抑制剂对靶的污染减至最小，并将靶限制在设备的干净区段，其可以含有用于靶的进一步操作的合适试剂。一些实施方案可以使用各自含有至少一种试剂的多个区段。在一些实施方案中，这些区段可以按以下顺序含有试剂：第二区段可以包括包含固定化结合试剂和稀释缓冲剂的表面；第三区段可划分为两个分段（subsections），第一分段包括蛋白酶K，且第二分段包括二氧化硅磁珠或其他合适的颗粒；第四区段中的试剂可以都是裂解试剂；第五区段中的试剂可以是洗涤缓冲剂；第六-第八区段中的试剂可以是洗涤缓冲剂、中和试剂、悬浮缓冲剂、洗脱试剂或核酸扩增检测试剂。在一些实施方案中，所述区段可以连续地布置，而在其他实施方案中，这些区段可以由它们之间的另一个区段或多个区段隔开。
在某些实施方案中，这种试验中的事件顺序可以包括：1）用收集工具收集的生物样品，2）挠性设备，其可以包括多个区段，所述多个区段可以含有试验期间所需的试剂，且可以使用设备中的第一开口将收集的样品放置在其中，3）至少一个可以设置在受控温度和/或其他条件的基质，以在设定的温育时间段期间捕获靶生物或核酸，4）未处理的样品中的生物或分子，其可能不与基质结合，且因而可以通过将液体转移到废物储存器中而被去除，5）将废物贮藏在废物储存器中，其可以通过倚着设备压缩的夹子和/或调节器与靶分开，6）从设备另一区段释放的洗涤缓冲剂，其可以去除反应抑制剂，7）来自另一区段的洗脱试剂，其于受控温度温育后可以释放与基质结合的靶，和8）可通过本领域技术人员熟知的技术检测或通过设备中的第二开口收集的核酸。在示例性实施方案中，随着试验进展，样品流可以从设备的第一开口朝着远端，而废物流可以朝着设备的闭合的样品输入开口，在那里，设备的盖中的废物室接收废物进行贮藏。因此，避免了处理的样品和已由未处理的样品接触过的反应容器中表面之间不期望的接触，从而防止了由于未处理的样品中存在的且可能涂布反应容器壁的痕量反应抑制剂的反应抑制。
一些实施方案可以包括使用挠性设备，所述挠性设备被分成多个区段，其可以横截所述设备的纵轴并且可以含有试剂；以及分析仪，其可以具有多个压缩构件，例如调节器和/或夹子，以及与调节器和夹子相对的块，以处理样品。这些调节器、夹子和/或块的各种组合可用于有效地将设备夹持闭合，从而分开流体。在示例性实施方案中，调节器或块中的至少一个可具有热控制元件，以控制用于样品处理的设备区段的温度。样品处理装置可以进一步具有至少一个能够将磁场应用到区段的磁场来源。样品处理装置可以进一步具有检测设备，例如光度计或CCD，以监控在设备内发生或完成的反应。
可以通过用放置于中心的调节器以及其侧面的夹子（如果有的话）压缩设备以形成通过每个区段的具有约1至约500 um，优选约5至约500 um间隙的流动通道，可以驱动流体通过流动通道。相邻的调节器温和地压缩与流动通道液体连通的相邻区段，以产生补偿的内部压力，以确保流动通道基本均匀的间隙。然后，两个侧面的调节器可以在设备上在其各自区段上交替地压缩和释放压力，以产生处于受控的流速的流。可以包含任选的流、压力和/或力传感器，以允许流状态的闭环控制。流动通道方法可用于洗涤、提高基质结合效率和检测。
颗粒固定和重悬浮方法可用于从样品液体分离颗粒。可以将由磁源产生的磁场应用到含有磁颗粒悬浮液的区段，以捕获颗粒并将其固定于管壁。在捕获过程期间可以使用搅拌方法。在另一个实施方案中，可以在具有所应用的磁场的区段中形成流动通道，并且可以将磁颗粒捕获在流中以提高捕获效率。为了重悬浮固定的颗粒，可以关闭或去除磁场，并且可以将搅拌或流动通道方法用于重悬浮。
可以通过使用连接到块的传感器（例如光度计、分光计、CCD）来实现对来自设备区段的信号的实时检测。在示例性实施方案中，可以通过调节器将压力应用于设备区段以适当地限定设备区段的形状。信号的格式可以是一定波长的光的强度，例如荧光，光谱和/或图像，例如测定池（cell）或人造元素（例如量子点（quantum dots））的图像。对于荧光检测，可以使用来自光学系统的光激发来照射反应，并且可以通过光度计检测发射光。为了检测具有特定波长的多个信号，可以通过专用检测通道或分光计来串联或并联地检测不同的波长信号。
试剂盒
在一些实施方案中，用于执行本文公开的方法的试剂、材料和设备包括在试剂盒中。在一些实施方案中，所述试剂盒在分开的容器、小瓶或区室中包括组分，其包括（i）包括第一标记的探针和第一引物的第一引物/探针组，以及（ii）包括第二标记的探针和第二引物的第二引物/探针组，其中所述第一引物于第一温度与所述多种靶核酸中的靶核酸退火且所述第二引物于第二温度与多种所述靶核酸中的另外的核酸退火，并且所述第一温度高于所述第二温度。试剂盒可进一步在一个或多个分开的容器、小瓶或区室中包括用于扩增靶核酸所必需的试剂，包括但不限于DNA聚合酶，dNTPs，裂解和/或洗涤缓冲剂，包含固定化结合试剂的表面，例如颗粒，稀释缓冲剂，蛋白酶K，二氧化硅磁珠或其他合适颗粒，裂解试剂（S），中和试剂，悬浮缓冲剂，洗脱试剂等，以及用于获得、贮藏和/或准备样品进行分析的试剂。
此外，试剂盒包括诸如上述的那些的测定处理设备，并且在具体的实施方案中，测定处理设备包括贮藏在设备的一个或多个区段中的，执行本文公开的方法所需的各种试剂。
试剂盒可进一步包括对照，例如，在待检测的序列为野生型的多核苷酸或包括待检测的序列的多核苷酸。
试剂盒还可以包括另外的设备，例如样品管或小瓶；反应容器（例如，管、多孔板、微观流体芯片或室等），以及使用说明或网站参考。

Claims (20)

1.一种用于检测单个样品容器中的多种靶核酸的方法，所述方法包括以下步骤：
（a）使怀疑含有多种靶核酸的样品与（i）包括第一标记的探针和第一引物的第一引物/探针组和（ii）包括第二标记的探针和第二引物的第二引物/探针组接触，其中所述第一引物于第一温度与所述多种靶核酸中的靶核酸退火且所述第二引物于第二温度与所述多种所述靶核酸中的另外的核酸退火，并且所述第一温度高于所述第二温度；
（b）在扩增反应中扩增所述样品中的所述多种靶核酸，所述扩增反应包括至少两步退火/延伸温度分布，其包括第一步骤和第二步骤，所述第一步骤包括所述第一温度，且所述第二步骤包括所述第二温度；
（c）分别在至少一部分所述退火/延伸温度分布上顺序检测来自所述第一和第二标记的可检测信号；和
（d）测量所述多种靶核酸中每种靶核酸的相对量。
2.权利要求1的方法，其中所述第一和第二标记的探针各自用相同的报道分子部分标记。
3.权利要求2的方法，其中所述报道分子部分是荧光的。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述第一和第二标记的探针各自用报道分子部分和猝灭剂部分标记。
5.权利要求4的方法，其中所述报道分子部分和所述猝灭剂部分是荧光团。
6.权利要求4-5中任一项的方法，其中所述报道分子部分是荧光团，且所述猝灭剂部分是暗猝灭剂。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述检测步骤进一步包括（i）在所述第一步骤期间检测与由所述第一标记发射的信号相对应的第一信号，（ii）在所述第二步骤期间检测第二信号，以及（iii）从所述第二信号中减去所述第一信号以鉴定由所述第二标记发射的可检测信号。
8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述第一和第二步骤分别保持至少10秒。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述扩增反应在有DNA聚合酶混合物的情况下进行。
10.用于检测单个样品容器中的多种靶核酸的试剂盒，所述试剂盒在分开的容器、小瓶或区室中包括（i）包括第一标记的探针和第一引物的第一引物/探针组，以及（ii）包括第二标记的探针和第二引物的第二引物/探针组，其中所述第一引物于第一温度与所述多种靶核酸中的靶核酸退火且所述第二引物于第二温度与所述多种所述靶核酸中的另外的核酸退火，并且所述第一温度高于所述第二温度。
11.权利要求10的试剂盒，其进一步包括用于扩增靶核酸所必需的试剂。
12.权利要求10-11中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二标记的探针各自用相同的报道分子部分标记。
13.权利要求12的试剂盒，其中所述报道分子部分是荧光的。
14.权利要求10-13中任一项的试剂盒，其中所述第一和第二标记的探针各自用报道分子部分和猝灭剂部分标记。
15.权利要求14的试剂盒，其中所述报道分子部分和所述猝灭剂部分是荧光团。
16.权利要求14-15中任一项的试剂盒，其中所述报道分子部分是荧光团，且所述猝灭剂部分是暗猝灭剂。
17.权利要求10-16中任一项的试剂盒，其进一步包括已知浓度的对照核酸。
18.权利要求10-17中任一项的试剂盒，其中所述单个样品容器包括样品处理小管，所述样品处理小管包括限定流体流动通道的管和设置于其中的多个区段，其中所述管的至少一个区段包括所述第一和第二引物/探针组。
19.权利要求18的试剂盒，其中所述管进一步包括一个或多个另外的区段，其包括用于扩增靶核酸所必需的试剂。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述试剂包含DNA聚合酶的混合物。
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