CN102257163A - 在样品中检测目标核酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用荧光探针对在样品中检测目标核酸的方法,该荧光探针对包括可以用于杂交测定和核酸扩增反应,特别是聚合酶链式反应(PCR)的荧光报道分子以及猝灭剂分子。
Description
发明领域
概括说来本发明涉及在样品中检测目标核酸的方法。更具体地说,本发明涉及使用荧光探针对在样品中检测目标核酸的方法,该荧光探针对包括可以用于杂交测定和核酸扩增反应,特别是聚合酶链式反应(PCR)的荧光报道分子以及猝灭剂分子。
发明背景
使用荧光探针监测核酸扩增反应,例如聚合酶链式反应(PCR)的方法是本领域已知的。
荧光探针的一个实例是如图1中描述的荧光双标记探针。 这样的荧光双标记探针一般由两种不同染料,也就是报道分子和猝灭剂标记的寡核苷酸组成,能与特定的目标核酸序列杂交。报道分子是被光激发时能够发射荧光的分子,而猝灭剂是能够吸收报道分子发射的荧光的分子。有时候,报道分子位于寡核苷酸的5'末端而猝灭剂位于3'末端。对于这类荧光探针,当探针与目标核酸序列杂交或者它在PCR反应期间断裂时发射荧光。PCR反应的监测基于当PCR反应进行时监测荧光随时间的强度。更具体地说,当探针没有与目标核酸序列杂交时它呈无规卷曲构象而报道分子在空间上足够接近猝灭剂以致发生从报道分子到猝灭剂的Förster型共振能量转移(FRET)。在这种情况下,当报道分子被适当波长的光激发时,报道分子发射的荧光被猝灭剂"猝灭"而观察到相对低的荧光强度。当探针与目标核酸序列杂交时,探针不再自身折叠,这样报道分子和猝灭剂之间的距离增加。从而,FRET减少,报道分子发射的荧光较少地被猝灭剂猝灭而观察到相对较高的荧光强度。如果在PCR的延伸阶段期间探针被DNA聚合酶裂解,报道分子与探针隔断,这样在报道分子和猝灭剂之间没有FRET发生。 于是,荧光强度也相对较高。该过程在PCR反应的每一循环中重复。由此监测荧光强度的变化可以用来定量地监测PCR反应。
有一些与荧光双标记探针的使用相关的缺陷。特别是,当双标记探针用于使用非裂解DNA聚合酶的PCR过程时,荧光信号变化的大小仅仅由染料附着的DNA探针的长度和构象控制。因为在双标记探针的情况下,染料附着于相同的DNA片段,它们能够离开彼此的距离是有限的。荧光双标记探针的应用可能被该状况限制。
通过使用杂交探针对,其中荧光染料在不同的寡核苷酸上,染料能够彼此远离,因此增加了荧光变化并产生更大的信号动力学。如图2中示意地描述的,在荧光杂交探针对中,第一寡核苷酸用荧光供体染料标记而第二寡核苷酸用荧光受体染料标记。第一和第二寡核苷酸设计成能与一条目标核酸序列杂交以便当两种寡核苷酸都与目标核酸序列杂交时供体和受体相邻,或者接近。当供体染料被光激发时,它通过FRET将其全部或部分能量转移给受体。因此受体发射的光能够被检测。相对较高的荧光强度显示探针与目标核酸序列杂交。当在PCR反应的延伸阶段期间探针被DNA聚合酶裂解时,供体和/或受体与探针隔断并观察到相对较低的荧光强度。
荧光杂交探针对的缺陷是当监测受体染料的荧光时观察到荧光供体染料的高荧光背景。
由此需要使用荧光探针监测PCR反应的改进的方法,其中排除了高荧光背景并且甚至获得更大的信号动力学。
发明概述
本发明提供了一种满足该需要的使用荧光探针监测PCR反应的方法。
在第一方面中,本发明涉及一种在样品中检测目标核酸的方法,包括:
- 在第一和第二寡核苷酸探针与所述目标核酸选择性杂交的条件下把所述样品与基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶以及第一和第二寡核苷酸探针接触,其中第一寡核苷酸探针包括荧光报道分子而第二寡核苷酸探针包括猝灭剂以便当第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交时荧光报道分子的荧光被猝灭剂猝灭,以及当第一和第二寡核苷酸没有与目标核酸杂交时荧光报道分子的荧光不被猝灭剂猝灭,
- 用光源激发荧光报道分子,
- 在第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交的条件下监测荧光报道分子的荧光,并将该荧光与在第一和第二寡核苷酸探针没有与目标核酸杂交的条件下获得的荧光比较。
在另一个方面中,本发明涉及一种在样品中检测目标核酸的试剂盒,包括一对:
- 包括荧光报道分子的第一寡核苷酸探针,
- 包括猝灭剂的第二寡核苷酸探针,当第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交时该猝灭剂有效猝灭荧光报道分子的荧光,和
- 基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶。
在另一方面中,本发明涉及一种反应混合物,包括:
- 样品中的目标核酸,
- 基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶,
- 包括荧光报道分子的第一寡核苷酸探针,和
- 包括猝灭剂的第二寡核苷酸探针,当第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交时该猝灭剂有效猝灭荧光报道分子的荧光。
附图简述
图1是根据现有技术的双标记探针的示意图。
图2是根据现有技术的包括包含荧光供体的第一寡核苷酸探针和包含受体的第二寡核苷酸探针的杂交探针对的示意图。
图3是根据本发明的方法的包括包含荧光报道分子的第一寡核苷酸探针和包含猝灭剂的第二寡核苷酸探针的杂交探针对的示意图。
图4(a-b)显示由来自根据现有技术包括荧光供体和受体的对照荧光探针的解链曲线(4-a)和解链峰(4-b)代表的荧光数据。
图5(a-b)显示由根据本发明的方法的包括包含荧光报道分子的第一寡核苷酸探针和包含猝灭剂的第二寡核苷酸探针的探针对激发的解链曲线(5-a)和解链峰(5-b)代表的荧光数据。
图6显示图4(b)和5(b)的荧光数据的叠加。
定义
对于便于本公开的理解,下列定义可能是有用的。
如本文使用的,"样品"指的是包含或推测包含核酸的任何物质。这包括从单个或复数个个体分离的组织或液体样品,包括但不限于,例如,皮肤、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、滑液、尿、泪液、血细胞、器官、肿瘤,以及体外细胞培养组分样品(包括但不限于由细胞培养基中的细胞生长的产生的条件培养基、重组细胞和细胞组分)。
如本文使用的,术语"核酸"、"多核苷酸"和"寡核苷酸"可互换地使用。这些术语仅仅涉及分子的一级结构。因此,这些术语包括双链和单链DNA,以及双链和单链RNA。寡核苷酸可以由与指定核苷酸序列的一个区域相应的至少大约6个核苷酸的序列组成,例如至少大约10-12个核苷酸,或至少大约15-20个核苷酸。"相应"表示与指定序列一致或互补。寡核苷酸不是必须实际上来源于任何存在的或天然的序列,而是可以以任何方式产生,包括化学合成、DNA复制、逆转录或其组合。
术语"引物"指的是一条或一条以上引物,并且指的是当置于催化与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时能够作为沿着互补链合成的起始点的寡核苷酸,无论天然存在的,如在纯化的限制酶切消化中,或合成产生的。
如本文使用的核酸序列的互补物指的是当与核酸序列对准以便一条序列的5 '末端与另一条的3 '末端配对时处于"反向平行结合"的寡核苷酸。互补不需要是完美的;稳定的双螺旋可以包含错配碱基对或不匹配碱基。 核酸技术领域的技术人员能够考虑若干变量包括,例如,寡核苷酸的长度,碱基组成和寡核苷酸的序列,离子强度,以及错配碱基对的发生率凭经验确定双螺旋稳定性。
如本文使用的,术语"目标序列"、"目标核酸"或""目标核酸序列"指的是要扩增、检测或它们两者的寡核苷酸区域。目标序列残基位于用于扩增的两引物序列之间。
如本文使用的,术语"探针"指的是由于探针中的至少一条序列与目标区域中的序列的互补,与目标核酸中的序列形成双链结构的标记的寡核苷酸。在某些实施方案中,探针不包含与用于起始聚合酶链式反应的序列互补的序列。术语"探针对"指的是如上文描述的一对探针。
如本文使用的术语"标记"指的是可用于提供可检测的(优选可定量的)信号,并且能够附着于核酸或蛋白质的任何原子或分子。 标记可以提供可被荧光、放射性、比色法、重量分析法、X射线衍射或吸收、磁性、酶活性等检测的信号。
术语"杂交的"和"杂交"指的是一条寡核苷酸与另一条寡核苷酸(一般是反向平行的多核苷酸)的碱基配对相互作用以致引起双螺旋或其它更高级结构,一般被称为杂交复合物的形成。 两条多核苷酸具有在它们全长上的100%互补不是实现杂交的必要条件。在一些方面中杂交复合物可以由分子间相互作用形成,或者可以由分子内相互作用形成。反之,表述"未杂交的"代表"杂交"没有或还没有发生的状态。
如本文使用的,术语"互补的"或"互补"与Watson-Crick和Hoogsteen型碱基配对规则涉及的反向平行多核苷酸链有关。例如,序列5'-AGTTC-3'与序列5'-GAACT-3'是互补的。术语"完全互补的"或"100%互补的"等指的是在反向平行链之间具有完美的Watson-Crick碱基配对(在多核苷酸双螺旋中没有错配)的互补序列。 然而,互补不需要是完美的;稳定的双螺旋,例如可以包含错配碱基对或不匹配碱基。术语"部分互补"、"部分互补的"、"非完全互补"或"非完全互补的"等指的是反向平行多核苷酸链之间的任何碱基比对小于100%完美的(例如,在多核苷酸双螺旋中存在至少一个错配或不匹配碱基)。例如,反向平行多核苷酸链之间的碱基比对可以是至少99%、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%或50%,或之间的任何值。
如本文使用的,术语"FRET"(荧光共振能量转移或Förster型共振能量转移)及相当的术语通常指的是两个染料分子的电子状态之间的动态距离依赖的相互作用,其中能量从供体染料分子转移到受体染料分子而没有来自供体分子的光子发射。FRET的效率取决于染料之间的分子间距的倒数,使得它在与生物大分子尺寸相当的距离上是有用的。通常,FRET提供成像、动力学分析和/或局部化分子的定量或单个分子中的构象变化,具有超过常规光学显微镜极限的空间分辨率。通常,FRET要求,(a)供体和受体分子必须紧密地接近(一般,例如10-100Å),(b)受体的吸收光谱必须与供体的荧光发射光谱重叠,以及(c)供体和受体跃迁偶极取向必须是大致并行的。
在大部分FRET应用中,供体和受体染料或报道分子和猝灭剂是不同的,在该情况下FRET可以通过受体敏化荧光的出现或供体荧光的猝灭来检测。在某些情况下,供体和受体或报道分子和猝灭剂是相同的,而FRET可以通过产生的荧光消偏振来检测。 例如,2004年5月20日公布的Packard和Komoriya的题为"COMPOSITIONS FOR THE DETECTION OF ENZYME ACTIVITY
IN BIOLOGICAL SAMPLES AND METHODS OF USE THEREOF"的公布的美国专利申请号2004/0096926描述了FRET系统中单一供体/受体或报道分子/猝灭剂分子的使用。
FRET已经成为研究以分子接近中的变化为特征的多种生命现象的重要技术。如今FRET技术在许多生物实验室中盛行,并且已经适合于在多种生物系统中使用,包括但不限于,核酸杂交的检测,实时PCR测定和SNP检测,蛋白质的结构和构象,蛋白质复合物的空间分布和装配,报道分子/配体相互作用,免疫测定,探测单个分子的相互作用,核酸的结构和构象,用于检测突变的引物延伸测定,自动化 DNA测序,脂类的分布和转运,膜融合测定(膜融合的脂类混合测定),膜电位传感,荧光探针蛋白酶底物,和环AMP和锌的指示物。
如本文使用的,术语"FRET报道分子"一般指的是产生可检测的辐射,例如荧光或发光辐射,的发射的部分,该发射可以被转移给足够接近的适当的FRET猝灭剂。 通常,这样的分子是染料。表述"FRET报道分子"可以与"报道分子"或"FRET标记"或"FRET标记部分"可互换地使用。
如本文使用的,术语"猝灭剂"通常指的是减少和/或能够减少可检测的辐射,例如但不限于荧光或发光辐射,的发射的部分,该辐射来自否则已经发射该辐射的来源。通常,猝灭剂指的是能够减少光发射的任何部分。猝灭的程度本身没有限制,除了猝灭效应最低限度应该是可通过任何使用的检测仪器检测的。在某些方面,猝灭剂减少来源发射的可检测的辐射至少50%,可选择地至少80%,并且可选择地和最优选至少90%。在一些实施方案中,猝灭剂导致来自报道分子的荧光发射减少,由此报道分子/猝灭剂形成FRET对,并且该猝灭剂被称为"FRET猝灭剂"而该报道分子为"FRET报道分子"。 这不意味着术语"猝灭剂"限于FRET猝灭剂。例如,猝灭可以包括任何类型的能量转移,包括但不限于光电子转移,质子偶合电子转移,紧密设置的荧光基团之间的二聚体形成,瞬时激发态相互作用,碰撞猝灭,或非荧光基态族的形成。在一些实施方案中,猝灭剂指的是能够减少光发射的分子。 荧光基团和猝灭剂之间不需要光谱的重叠。如本文使用的,"猝灭"包括任何类型的猝灭,包括动态(Förster-Dexter能量转移等)和静态的(基态复合物)。还可选择地,猝灭剂可以除光外的形式,例如热,散失从荧光染料中吸收的能量。 在一些实施方案中,某些猝灭剂能够以可同FRET报道分子发射区分的波长或信号类型,和以该猝灭剂特征的波长或信号类型重新发射从FRET报道分子吸收的能量,在这方面,猝灭剂也可以是"标记"。
对于荧光探针系统的使用的一般讨论,参见,例如Principles of Fluorescence Spectroscopy,
Joseph R. Lakowicz, Plenum Publishing Corporation, 第二版(1999年7月1日)和Handbook of
Fluorescent Probes and Research Chemicals, Richard P. Haugland, Molecular
Probes出版,第6版(1996年)。
已经开发了与其它试剂和检测/成像仪器一起用于FRET分析的多种染料、荧光染料、猝灭剂和荧光蛋白质,它们是市场上可以普遍地买到的。本领域技术人员知道用于任何特定分析的适当的FRET流程、试剂和仪器。
术语"监测"表示通过探针监测发射的荧光。这还可以包括检测和测定荧光强度,采集和记录荧光强度数据,例如在本领域已知的类型的电脑可读介质上。 进一步的步骤包括数据的数学处理,其使用或不适用电脑的分析和说明。
术语"基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶"或"5'-3'核酸酶缺陷的酶",或简单起见"核酸酶缺陷的酶"指的是具有天然Taq DNA聚合酶的50%或更少5'-3'活性的聚合酶。测定5'-3'核酸酶活性的方法和测定的条件已经描述于美国专利号5,466,591中。 缺少5'-3'核酸酶活性的聚合酶的实例包括Taq
DNA聚合酶的Stoffel片段(美国专利号5,466,591),Thermus africanus DNA聚合酶的突变体(美国专利号5,968,799),海栖热袍菌(Thermotoga maritima) DNA聚合酶的突变体(美国专利号5,624,833和5,420,029),栖热菌属(Thermus)物种sps17和栖热菌属物种Z05 DNA聚合酶的突变体(美国专利号5,466,591和5,405,774)。 5'-3'核酸酶缺陷的酶还可以是由来源于一个以上物种的结构域组成并且具有消除5'-3'核酸酶活性的突变的嵌合体,即嵌合蛋白质(例如美国专利号5,795,762和6,228,628中描述的)。
如本文使用的,术语"Tm"用于指代"解链温度"。 解链温度是同源双链或异源双链中的双链多核苷酸或核苷碱基寡聚体(例如杂交复合物)群的一半解离成单链的温度。双链体多核苷酸的Tm的预测考虑了碱基序列以及其它因素,包括结构和序列特征以及寡聚物连锁的特性。预测和实验确定Tm的方法是本领域已知的。 例如,传统上通过解链曲线确定Tm,其中双链体核酸分子在控制温度程序中加热,监测该双链体中的两条单链的结合/解离状态并图示直到达到两条链完全解离的温度。Tm从该解链曲线中读出。可选择地,Tm可以通过退火曲线确定,其中双链体核酸分子被加热到两条链完全解离的温度。然后在控制温度程序中降低温度,监测该双链体中的两条单链的结合/解离状态并图示直到达到两条链完全退火的温度。Tm从该退火曲线中读出。
除非另有指示,本发明的实施可以使用化学、分子生物学、微生物学和重组DNA技术的常规技术,其在本领域技术的范围之内。这样的技术在文献中充分地解释。参见,例如Sambrook,
Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版(1989);Oligonucleotide
Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984);Nucleic
Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1984);A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, 1984);和Methods in Enzymology系列(Academic
Press, Inc.)。
发明详述
本发明提供了一种使用荧光探针监测PCR反应的方法。在第一方面中,本发明涉及一种在样品中检测目标核酸的方法,包括:在第一和第二寡核苷酸探针与所述目标核酸选择性杂交的条件下把所述样品与基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶和第一和第二寡核苷酸探针接触;其中第一寡核苷酸探针包括荧光报道分子而第二寡核苷酸探针包括猝灭剂以便当第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交时荧光报道分子的荧光被猝灭剂猝灭;以及当第一和第二寡核苷酸没有与目标核酸杂交时荧光报道分子的荧光不被猝灭剂猝灭;用光源激发荧光报道分子;在第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交的条件下监测荧光报道分子的荧光;和将在第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交的条件下获得的荧光与在第一和第二寡核苷酸探针没有与目标核酸杂交的条件下获得的荧光比较。
在本发明的方法中当用光激发时报道分子染料发射荧光,该荧光被直接监测。当猝灭剂在空间上足够接近报道分子时使报道分子的荧光衰减。这不同于现有技术使用具有供体和受体的荧光杂交对的方法,其中,当通过光激发时,供体通过FRET转移能量给依次发射荧光的受体。然后监测受体的荧光。根据本发明的方法通过监测报道分子直接发射的荧光,发明人发现在供体-受体探针对中供体的不希望的高荧光背景可以避免。这在存在具有一个供体的许多寡核苷酸探针的多路测定中是特别有益的。发明人还发现与能量转移相反从直接激发中获得更多的信号或更大的信号动力学。
通常在FRET中用作为报道分子或猝灭剂的分子包括,例如但不限于,荧光素染料(例如FAM、JOE和HEX),罗丹明染料(例如R6G、TAMRA、ROX),和花青染料(例如Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5和Cy7)。其它实例包括DABCYL和EDANS。荧光染料作为报道分子或猝灭剂是通过其激发和发射光谱,以及通过与其成对的荧光染料确定的。例如,FAM被488 nm波长的光最有效地激发,发射500至650 nm光谱的光,发射最大值为525 nm。FAM与作为猝灭剂的例如TAMRA一起使用是适当的报道分子标记,TAMRA的激发最大值在514
nm。消散从荧光染料吸收的能量的非荧光或暗猝灭剂(dark quencher)的实例包括Biosearch Technologies, Inc. ( Novato, CA, USA)销售的Black Hole Quenchers™。Black
Hole Quenchers™是包括至少三个选自取代的或未取代的芳基或杂芳基化合物,或其组合的基团的结构,其中至少两个残基通过环外的重氮键连接(参见,例如Cook等的2001年11月15日公布的题为"DARK
QUENCHERS FOR DONOR-ACCEPTOR ENERGY TRANSFER"的国际公开号WO 01/86001)。其它暗猝灭剂包括Iowa
Black猝灭剂(例如Iowa Black FQTM和Iowa Black RQTM)和Eclipse®
Dark Quenchers ( Epoch Biosciences, Inc, Bothell, WA)。猝灭剂的实例还提供于,例如2002年10月15日颁发给Horn等的题为"OLIGONUCLEOTIDE PROBES BEARING QUENCHABLE
FLUORESCENT LABELS, AND METHODS OF USE THEREOF"的美国专利号6,465,175。
荧光染料包括例如罗丹明染料,例如R6G、R110、TAMRA、ROX等,参见美国专利号5,366,860、5,847,162、5,936,087、6,051,719、6,191,278,荧光素染料,例如JOE、VIC、TET、HEX、FAM等,6-羧基荧光素(carboxyfluorescein),2',4',1,4,-四氯荧光素(tetrachlorofluorescein),和2',4',5',7',1,4-六氯荧光素(hexachlorofluorescein),参见美国专利号5,188,934、6,008,379、6,020,481,苯并吩嗪(benzophenoxazines,美国专利号6,140,500),卤代荧光素(halofluorescein)染料,花青染料(例如CY3、CY3.5、CY5、CY5.5、CY7等,参见Kubista的公布的国际申请号WO 97/45539),BODIPY®染料(例如FL、530/550、TR、TMR等),ALEXA FLUOR®染料(例如488、532、546、568、594、555、653、647、660、680等),二氯罗丹明(dichlororhodamine)染料,能量转移染料(例如BigDye™ v 1染料、BigDye™ v 2染料、BigDye™ v 3染料等),Lucifer染料(例如,Lucifer yellow等),CASCADE
BLUE®,Oregon Green等等。 荧光染料另外的实例提供于,例如Haugland, Molecular Probes
Handbook of Fluorescent Probes and Research Products,第9版(2003)及其更新。荧光染料通常可以从多个商业供应商容易地获得,包括例如Molecular Probes, Inc. (Eugene,
OR)、Amersham Biosciences Corp. (Piscataway,
NJ)、Applied Biosystems (Foster City, CA)等。
FRET标记技术通常用于实时扩增子定量和监测核酸探针杂交。在一些实施方案中,FRET标记系统和本发明的探针一起使用。这不意味着本发明限于任何特定的FRET对系统。本领域技术人员知道可以与本发明的探针一起使用多种FRET标记。报道分子和猝灭剂荧光能量转移染料对包括,例如美国专利号5,863,727、5,800,996、5,945,526,以及能够产生可检测信号的任何其它荧光标记。
可以用作为报道分子和/或猝灭剂的其它标记包括,例如生物素,微弱的荧光标记(Yin
et al. (2003) Appl Environ Microbiol. 69(7):3938, Babendure et al.
(2003) Anal. Biochem. 317(1):1,和Jankowiak
et al. (2003) Chem Res Toxicol. 16(3):304),非荧光标记,比色标记,化学发光标记(Wilson
et al. (2003) Analyst. 128(5):480和Roda
et al. (2003) Luminescence 18(2):72),Raman标记,电化学标记,生物发光标记(Kitayama et al. (2003) Photochem
Photobiol. 77(3):333, Arakawa et al. (2003) Anal. Biochem.
314(2):206,和Maeda (2003) J. Pharm. Biomed. Anal.
30(6):1725),和如例如2003年11月21日提出的美国专利申请序列号10/719,257描述的α-甲基-PEG标记的试剂。
寡核苷酸探针制品可以通过本领域已知的方法制造。 本领域技术人员能够确定寡核苷酸探针与目标核酸选择性杂交的条件。进一步地,激发和监测荧光报道分子的手段和方法也是本领域已知的。
在本发明的一些实施方案中,扩增包括聚合酶链式反应,即模板变性,寡核苷酸引物与模板的退火(杂交),和通过核苷酸掺入的生物催化剂的引物延伸的重复循环。在一些实施方案中,退火和延伸发生在相同的温度步骤。
在一些实施方案中,扩增反应包括热启动流程。在等位基因特异性扩增的背景中,可以通过利用热启动流程增加等位基因特异性引物对于错配目标的选择性。许多热启动流程是本领域已知的,例如使用蜡将关键的试剂从其余的反应混合物中隔离(美国专利号5,411,876),使用通过抗体可逆灭活的核酸聚合酶(美国专利号5,338,671),通过设计成能特异性结合其活性位点的寡核苷酸可逆灭活的核酸聚合酶(美国专利号5,840,867)或使用具有可逆的化学修饰的核酸聚合酶,如例如美国专利号5,677,152和5,773,528中描述的。
在本发明的一些实施方案中,扩增测定是实时PCR测定。在实时PCR测定中,扩增的测量是"阈值循环数"或Ct值。 较早的Ct值反映了阈值水平的迅速达到以及由此更有效率的扩增。 较迟的Ct值可以反映低效或抑制的扩增。在实时PCR测定的背景中,匹配和错配模板之间的Ct值差异是等位基因之间的区别或测定的选择性的度量。
RNA和DNA两种核酸序列的扩增描述于美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188。优选的方法,聚合酶链式反应(PCR),一般使用耐热DNA聚合酶执行,其能够承受在每个循环中用于使扩增产物变性的温度。如今PCR是本领域众所周知的并且已经在科学文献中广泛地描述。参见,例如PCR
Applications, ((1999) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego), PCR
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Protocols, ((1990) Innis et al., eds., Academic Press, San Diego), 和PCR Technology, ((1989) Erlich, ed., Stockton Press, New
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Opinion in Biotechnology 4:41-47)中提供。
本发明的方法利用基本上缺少5'-3'核酸酶活性的一种或更多种核酸聚合酶。许多这样的聚合酶,又称5'-3'核酸酶缺陷的酶,是本领域已知的。 一些实例包括G46E E678G CS5聚合酶,G46E E678G CS6聚合酶,TMA-25聚合酶,TMA-30聚合酶,delta-ZO5聚合酶,和美国专利号5,466,591中描述的被称为Stoffel片段的Taq DNA聚合酶的5'-3'核酸酶缺陷突变体。如果使用具有5'-3'核酸酶活性的酶,在PCR期间一部分探针被裂解。这有两个结果:已经裂解的探针不能参与后PCR解链,导致减少的信号产生,以及裂解的荧光DNA片段引起较高的和更有噪声的荧光基线。如果使用核酸酶缺陷的酶,探针不被裂解,产生具有增加的信号动力学和较小的噪声基线的测定,其产生更稳定和灵敏的测定。
在某个实施方案中,本发明的方法被用于多路测定以在一个样品中检测一种或更多种物种。在典型的多路测定中,使用两种或多种探针对检测两种或多种不同的目标核酸序列,每个探针对包括第一和第二寡核苷酸探针,其中每个第一寡核苷酸探针包括不同的荧光基团而每个第二寡核苷酸探针包括不同的猝灭剂,能够猝灭相应的荧光基团。
图1是根据现有技术使用在相同的寡核苷酸上包括报道分子和猝灭剂的双标记探针的方法的示意图。双标记探针与包含单核苷酸多态性(SNP)的目标杂交。如上面已经解释的,荧光双标记探针一般由两种不同染料,也就是报道分子和猝灭剂标记,能与特定的目标核酸序列杂交的寡核苷酸组成。报道分子是被光激发时能够发射荧光的分子,而猝灭剂是能够吸收报道分子发射的荧光的分子。对于这类荧光探针,当探针与目标核酸序列杂交或者它在PCR反应期间断裂时发射荧光。PCR反应的监测基于当PCR反应进行时监测荧光随时间的强度。更具体地说,当探针没有与目标核酸序列杂交时,探针呈无规卷曲构象而报道分子在空间上足够接近猝灭剂以致发生从报道分子到猝灭剂的Förster型共振能量转移(FRET)。在这种情况下,当被光激发时,报道分子发射的荧光被猝灭剂"猝灭"而观察到相对低的荧光强度。 当探针与目标核酸序列杂交时,探针不再具有无规卷曲构象而报道分子和猝灭剂之间的距离更大并且FRET因此减少。 报道分子发射的荧光较少地被猝灭剂猝灭而观察到相对较高的荧光强度。如果在PCR反应的延伸阶段期间探针被DNA聚合酶裂解,报道分子与探针隔断,这样在报道分子和猝灭剂之间没有FRET发生。于是,荧光强度也相对较高。该过程在PCR反应的每一循环中重复。由此监测荧光强度的变化可以用来定量地监测PCR反应。
图2是根据现有技术使用包括两条寡核苷酸(一条具有供体而另一条具有受体)的标记探针对的方法的示意图。探针对与包含单核苷酸多态性(SNP)的目标杂交。当能量转移杂交探针对与目标杂交时,供体被激发并转移其能量给受体,受体产生高的荧光。反之,当直接激发杂交探针对与目标杂交时,报道分子的荧光被猝灭剂猝灭而荧光相对降低。
图3是根据本发明使用标记探针对的方法的示意图。探针对包括包含荧光报道分子的第一寡核苷酸探针和包含猝灭剂的第二寡核苷酸探针。探针对与包含单核苷酸多态性(SNP)的目标杂交。当探针对用光激发时,报道分子在空间上与猝灭剂接近并且发生通过FRET从激发的报道分子到猝灭剂的能量转移。报道分子的发射是相对弱的。当探针对不杂交时报道分子和猝灭剂之间的距离比当探针对与目标核酸杂交时更重要。结果,报道分子的发射增加。监测报道分子的发射及其强度变化可用于在样品上实施分析。例如,探针对可以被设计成检测某个目标核酸序列。监测报道分子发射的荧光可以表明样品中目标核酸的存在。这可以引出诊断领域中的若干应用,其中目标核酸可以例如是疾病或状况的指示。
图4代表来自图1中显示的现有技术类型的探针的数据,其中报道分子和猝灭剂在相同的寡核苷酸上。当寡核苷酸与目标杂交时,报道分子和猝灭剂最大限度地分离并且荧光信号是高的。因为当温度升高时探针从目标解链,探针采取无规卷曲构象,报道分子和猝灭剂移动靠近在一起并且荧光下降。这可以在图4的第一个画面(a)中观察到,其是在因子V的在后PCR解链测定中荧光对温度的原始数据。该数据又称"解链曲线"数据。第二画面(b)显示原始数据的负一阶导数,或"解链峰"数据,其对于实验中的3个目标在探针的解链温度(Tm)出现顶点,在本例中与探针完美匹配并产生最高的Tm的野生型目标,与探针有单一碱基不匹配并产生较低的Tm的突变体目标,和等量地包含野生型和突变体目标两者并产生2个顶点的杂合子目标。
图5(a-b)显示来自图3中显示的根据本发明的探针对的数据。在本例中,报道分子和猝灭剂是在不同的寡核苷酸上,当报道分子被激发并被监测其荧光时,荧光变化与前面的例子是相反方向的。当寡核苷酸被杂交时,报道分子和猝灭剂靠近在一起而荧光是低的。当寡核苷酸从目标解链时,染料被最大限度地分离而荧光上升。这可以在第一个画面(a)中看到,其显示在前面的例子中相同的因子V的后PCR解链测定中的原始数据。第二画面(b)显示原始数据的负一阶导数并显示Tm值的负峰。比较图4和5的Y轴,能够看出探针对(图5)的信号大小显著地比单一探针(图4)高。如果负导数曲线绘制在相同的图表(图6)上,这可以更清楚地看出。
图6显示共同来自图4(b)和5(b)的数据。能够看出来自杂交探针对(负曲线)的信号大小高于来自双标记对照探针(正曲线)大约50%,其意味着获得了更大的信号动力学。
如上面已经解释的,本发明的方法克服了现有技术的检测方法的许多缺陷。获得了更大的信号动力学和因此更好的准确度。
本发明还提供了用于实施本发明的方法的试剂盒。在某个实施方案中,试剂盒包括包含荧光报道分子的第一寡核苷酸探针,包含猝灭剂的第二寡核苷酸探针,以便当第一和第二寡核苷酸与目标核酸杂交时荧光报道分子的荧光被猝灭剂猝灭。任选地,试剂盒可以包含纸制的或电子的说明书以及包括用于操纵荧光监测的软件的电脑可读的介质。电脑可读的介质可以是能够通过电脑或包含例如微处理器的其它仪器读出或解码的类型。
本发明还提供了用于实施本发明的方法的反应混合物。在某个实施方案中,反应混合物包括样品中的目标核酸,包含荧光报道分子的的第一寡核苷酸探针,包含猝灭剂的第二寡核苷酸探针,以便当第一和第二寡核苷酸与目标核酸杂交时荧光报道分子的荧光被猝灭剂猝灭。典型的反应混合物可以包括用于核酸扩增的组分。
下列实施例举例说明本发明而不限制其范围于其中描述的实施方案。
实施例
在这些实施例中,本发明的方法用来扩增包含Leiden突变位点的人因子V基因区域,克隆进入质粒载体。在当前的实施例中,不对称PCR样品母液混合物(100uL)由下列成分组成:5%甘油;50 mM Tricine,pH 8.3;25 mM 醋酸钾;200μM dATP,200μM dGTP,200μM dCTP,400μM dUTP;0.7μM上游(过量)引物;0.1μM下游(限制)引物;0.4μM各个探针;0.04U/μL 尿嘧啶-N -糖基化酶;0.4 U/μL ΔZO5 DNA聚合酶;和4 mM 醋酸镁。
母液混合物用于扩增因子V野生型、突变体和混合质粒DNA目标。过量引物以7倍于限制引物浓度存在以确保与杂交探针结合的过量的单链扩增子。扩增和解链是在Roche
LightCycler 480上实施的。
用于本实施例的热循环谱为:50℃ 5分钟(UNG步骤);94℃ 15秒然后59℃ 40秒,2个循环;后面是91℃ 15秒然后59℃ 40秒,48个循环,在每个59℃步骤期间采集数据;以及后面是解链步骤,在40℃和95℃之间每度采集3个数据。
上游引物的序列为SEQ ID NO: 1,下游引物的序列为SEQ ID
NO: 2,双标记解链探针(对照)的序列为SEQ ID NO: 3,锚定探针的序列为SEQ ID NO: 4,而受体探针的序列为SEQ
ID NO: 5。这些序列显示于表1。实验结果显示于图4-6。
图4显示从包括供体和受体的荧光探针获得的解链曲线(4a)和解链峰(4b)。图5显示从包括具有报道分子的寡核苷酸和具有猝灭剂的寡核苷酸的荧光探针对获得的解链曲线(5a)和解链峰(5b)。在两张图上都标明突变体、野生型和混合目标的不同曲线。图6显示图4(b)和5(b)的荧光数据的叠加。
表
1
引物和探针序列
E = t-丁基苯甲基dA
F = cx-FAM
Q = BHQ2
P= 3’- 磷酸
序列表
<110> F. Hoffmann-La Roche AG
Roche Diagnostics GmbH
<120> 在样品中检测目标核酸的方法
<130> 25746 WO
<140> 未知
<141> 未知
<150> 12/341,130
<151> 22.12.2008
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成引物
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (24)..(24)
<223> t-丁基苯甲基 dA
<400> 1
tgaacccaca gaaaatgatg
ccca
24
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成引物
<220>
<221> 修饰的碱基
<222> (26)..(26)
<223> t-丁基苯甲基 dA
<400> 2
ggaaatgccc cattatttag
ccagga
26
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成探针
<400> 3
ctgtattcct cgcctgtcca g
21
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成探针
<400> 4
gaaattctca gaatttctga aaggttactt
caaggacaa
39
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列描述: 合成探针
<400> 5
ctgtattcct cgcctgtcca
g
21
Claims (16)
1.一种在样品中检测目标核酸的方法,包括:
a) 在第一和第二寡核苷酸探针与所述目标核酸选择性杂交的条件下把所述样品与基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶以及第一和第二寡核苷酸探针接触,其中第一寡核苷酸探针包括荧光报道分子而第二寡核苷酸探针包括猝灭剂以便当第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交时荧光报道分子的荧光被猝灭剂猝灭以及当第一和第二寡核苷酸没有与目标核酸杂交时荧光报道分子的荧光不被猝灭剂猝灭,
b) 用光源激发荧光报道分子,
c) 在第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交的条件下监测荧光报道分子的荧光,和
d) 将步骤c)的荧光与在第一和第二寡核苷酸探针不与目标核酸杂交的条件下获得的荧光比较。
2.根据权利要求1的方法,其中至少2对寡核苷酸探针被用于多路测定。
3.根据权利要求1的方法,其中报道分子选自荧光素染料、罗丹明染料、花青染料、FAM、JOE、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和EDANS。
4.根据权利要求1的方法,其中猝灭剂选自荧光素染料、罗丹明染料、花青染料、FAM、JOE、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和EDANS。
5.根据权利要求1的方法,其中猝灭剂是暗猝灭剂。
6.根据权利要求1的方法,其中基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶来源于选自水生栖热菌、栖热菌属物种 sps17、栖热菌属物种 Z05、海栖热袍菌和Thermus africanus的一种或更多种物种。
7.一种在样品中检测目标核酸的试剂盒,包括:
- 包括荧光报道分子的第一寡核苷酸探针,
- 包括猝灭剂的第二寡核苷酸探针,当第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交时该猝灭剂有效猝灭荧光报道分子的荧光,和
- 基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶。
8.根据权利要求7的试剂盒,其中报道分子选自荧光素染料、罗丹明染料、花青染料、FAM、JOE、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和EDANS。
9.根据权利要求7的试剂盒,其中猝灭剂选自荧光素染料、罗丹明染料、花青染料、FAM、JOE、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和EDANS。
10.根据权利要求7的试剂盒,其中猝灭剂是暗猝灭剂。
11.根据权利要求7的试剂盒,其中基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶来源于选自水生栖热菌、栖热菌属物种 sps17、栖热菌属物种 Z05、海栖热袍菌和Thermus africanus的一种或更多种物种。
12.一种反应混合物,包括:
- 样品中的目标核酸,
- 基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶,
- 包括荧光报道分子的第一寡核苷酸探针,和
- 包括猝灭剂的第二寡核苷酸探针,当第一和第二寡核苷酸探针与目标核酸杂交时该猝灭剂有效猝灭荧光报道分子的荧光。
13.根据权利要求12的反应混合物,其中报道分子选自荧光素染料、罗丹明染料、花青染料、FAM、JOE、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和EDANS。
14.根据权利要求12的反应混合物,其中猝灭剂选自荧光素染料、罗丹明染料、花青染料、FAM、JOE、R6G、TAMRA、ROX、DABCYL、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7和EDANS。
15.根据权利要求12的反应混合物,其中猝灭剂是暗猝灭剂。
16.根据权利要求12的反应混合物,其中基本上缺少5'-3'核酸酶活性的核酸聚合酶来源于选自水生栖热菌、栖热菌属物种 sps17、栖热菌属物种 Z05、海栖热袍菌和Thermus africanus的一种或更多种物种。
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