CN101831496B - 多重定量核酸扩增及解链测定法 - Google Patents

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Abstract

多重定量核酸扩增及解链测定法。本发明涉及应用被标记相同荧光报告标记但各自具有不同解链温度的复数个杂交探针，能够同时扩增、检测并定量复数种核酸靶的单管多重测定法。所述测定法可应用多组杂交探针进一步多重化，每组探针被标记独立的荧光报告标记。

Description

多重定量核酸扩增及解链测定法
技术领域
本发明整体上涉及核酸的体外扩增、检测和定量。特别地，本发明涉及单管多重测定法(single-tube multiplex assay)，其能够应用复数个被标记相同荧光报告标记的杂交探针，同时扩增、检测和定量复数个靶核酸。所述测定法可应用多种荧光报告基团来进一步复杂化(multiplexed)。
背景技术
聚合酶链式反应(PCR)已经成为生物医学研究、疾病监测和诊断的一种普及的工具。美国专利4,683,195、4,683,202以及4,965,188中描述了通过PCR扩增核酸序列。PCR是现今本领域众所周知的技术，并广泛描述于科技文献中(参见PCR Applications，(1999)Innis等编辑，Academic Press，San Diego；PCRStrategies，(1995)Innis等编辑，AcademicPress，San Diego；PCR Protocols，(1990)Innis等编辑，Academic Press，San Diego以及PCR Technology，(1989)Erlich编辑，Stockton Press，New york)。“实时”PCR分析能够同时扩增和检测并且定量靶序列的起始量。应用DNA聚合酶的核酸酶活性的基础TaqMan实时PCR分析描述于Holland等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：7276-7280以及美国专利5,210,015。不需要核酸酶活性(无核酸酶分析)的实时PCR描述于2008年12月9日提交的美国申请系列号12/330,694。荧光探针在实时PCR的应用描述于美国专利5,538,848。
典型的实时PCR方案(protocol)涉及使用特异于每个靶序列的标记探针。优选地，探针被标记一个或更多个荧光基团(moiety)，所述的荧光基团发射可检测波长的光。在杂交至靶序列或其扩增子后，探针显示出在荧光发射上的可检测变化。
然而，在单管内分析多个靶的能力仍然是实时分析的主要挑战。几乎在医药以及诊断的每一个领域，被关注位点(loci)的数量迅速增长。例如，仅举几例，在法医DNA鉴定、病原微生物检测、多位点遗传疾病筛选以及多基因表达研究中必须分析多个位点。
利用目前的方法，多重分析的能力受限于检测仪器。特别地，相同反应中应用复数个探针要求采用不同的荧光标记。为同时检测复数个探针，仪器必须能够区分每个探针所发射的光信号。目前的技术不允许在相同反应容器中超过四个单独波长的检测。例如，Bell等(“Real-time quantitative PCR in parasitology”，Trends in Parasitol.(2002)18(8)：337-342.)最近已调查了可用的实时定量PCR热循环仪，并报道都不能具有超过四个光学检测通道。因此，每个靶应用一个独特标记的探针，在同一反应容器中可检测不超过四个单独的靶。在实践中，至少一个靶通常是对照核酸。因此，在实践中，同一管内可检测不超过三个实验靶。由于光学硬件最多允许做很小的增量改进，多重分析的能力将跟不上临床需要，除非扩增以及检测策略进行根本变革。
PCR后解链分析提供了额外的多重实时扩增反应能力(参见2006年6月23日提交的US2007-0072211)。在解链分析中，扩增的核酸通过其独特的解链曲线图(meltingprofile)来鉴定。解链分析涉及测定双链靶或者标记探针与靶的双链体的解链温度(解链点(melting point))。如美国专利5,871,908所描述的那样，为测定应用了荧光标记探针的解链温度，靶核酸和探针的双链体在受控温度程序下逐步加热(或冷却)。双链体的解离改变了相互作用的复数个荧光团或荧光团与淬灭剂之间的距离。相互作用的荧光团可缀合至单独的探针分子，如美国专利6,174,670所述的那样。备选地，一个荧光团可缀合至探针，而其它的荧光团可嵌入核酸双链体，如美国专利5,871,908所述的那样。作为另外一个备选，荧光团可缀合至单个探针寡核苷酸。在双链体解链后，由于此时在单链探针中荧光团与淬灭剂靠拢，因此荧光团被淬灭。
核酸双链体的解链通过测量荧光的相关变化而监测。荧光的变化可呈现在被称为“解链曲线”的图形上。由于不同的探针-靶双链体可被设计为在不同温度解链(或再退火)，每个探针将生成独特的解链曲线。恰当设计的探针将具有可与同一分析中其它探针可明确区别的解链温度。许多现有的软件工具可实现设计考虑了这些目标的用于同管多重分析的探针。例如，Visual OMPTM软件(DNASoftwatre，INC.，Ann Arbor，Mich.)可实现确定不同反应条件下核酸双链体的解链温度。
应用颜色检测和随后的扩增后解链分析的多重PCR方法描述于美国专利6,472,156。这样一种方法可检测的靶的数量，是可检测波长数量和可区别的解链曲线数量的乘积。因而在颜色检测中增加解链分析向检测复数个靶能力迈进了一步。
扩增后解链分析最通常用于定量的目的，即鉴定靶核酸数量，参见美国专利6,174,670、6,427,156和5,871,908。已知可通过微分(differentiate)解链曲线函数获得解链峰。Ririe等(“Product differentiation by analysis of DNA meltingcurves duringthe polymerase chain reaction”，(1997)Anal.Biochem.245：154-160)观察到微分可协助解析产物混合物生成的解链曲线。在微分之后，混合物中每个成分生成的解链峰变得容易区别。此前也已知扩增后解链信号，即解链峰与样品中核酸的量成比例。例如，美国专利6,245,514教导应用双链体嵌入染料的扩增后解链分析，以生成导数(derivative)解链峰，然后应用专有软件来整合峰。整合提供了有关扩增效率以及被扩增核酸相对量的信息。
实践中，将期望其超越定性分析并能够定量相同样品中的复数个靶(参见例如Sparano等，“Development of the 21-gene assay and its application inclinicalpratice and clinical trials”，J.Clin.Oncol.(2008)26(5)：721-728)。定量靶的量的能力在临床应用诸如测定病人血清中的病毒载量(viral load)、测量响应药物治疗的基因的表达水平、或测定肿瘤的分子标签(molecular signature)以预测其对治疗的响应中是有用的。
在实时PCR分析中，标记探针产生的信号与输入靶核酸的量成比例。输入得越多，荧光信号越早越过预设的阈值(Ct)。因而人们可以通过比较样品间或样品与具有已知量核酸的对照样品来确定靶核酸的相对或绝对量。然而，现有方法在同时定量复数个靶的能力上受到限制。对于复数个靶的定量检测，限制性因素是光学探测器。如上面所述，目前技术水平的光学技术不能在同一管中获得超过四个独立荧光标记探针的明显(distinct)信号。正在开发的技术承诺不超过六个独立探针的检测。因而需要从根本上不同的实验方法以容许在实时PCR期间扩增、检测并定量大量的核酸靶。
发明概述
本发明涉及在单个样品容器中扩增、检测以及定量一种或更多种靶核酸的方法，包括以下步骤：使怀疑含有一种或更多种靶核酸的样品与至少一组寡核苷酸接触，组内每个寡核苷酸被标记相同的一个或更多个报告基团(reportermoiety)，其中每个所述标记寡核苷酸(labeled oligonucleotide)充分互补于至少一种靶核酸的至少一个子序列，并且能以与同一组内其它标记寡核苷酸不同的解链温度结合至相应靶核酸；在包括温度改变区间的扩增反应中扩增样品中的靶核酸，其中所述一个或更多个标记寡核苷酸从与相应靶核酸的杂合子(hybrid)上解离；检测在所述温度变化区间的至少一部分上来自所述报告基团的光发射；并将在至少所述部分温度改变区间上的所述光发射的一阶导数进行作图；确定所述导数的最大值；重复上述提到的步骤复数次；将所述导数的最大值相对重复数目进行作图，并确定所述确定的最大导数值到达预设阈值时的重复数目，从而定量所述靶核酸的相对量。在该方法的一些实施方式中，使已知浓度的对照核酸与所述靶核酸同时进行之前描述的步骤，并且将确定的每个靶核酸的值与确定的对照核酸的值相比较，从而确定每个所述靶核酸的绝对值。在某些方面，每个所述寡核苷酸被标记单个报告基团，其中在某些特定方面，所述报告基团是荧光的。在其它一些实施方式中，每个所述寡核苷酸被标记报告基团和淬灭基团，其中所述报告基团和淬灭基团在特定方面中是荧光基团。在另一个实施方式中，所述报告基团是荧光团且所述淬灭基团是暗淬灭剂(darkquencher)。在另外一个实施方式中，报告基团和淬灭基团被核酸酶切割位点分隔。在另外一方面中，本发明的方法可应用数组寡核苷酸而进一步复杂化，其中每一组寡核苷酸被标记单独的报告基团，最高达到可被检测仪器清楚区分的基团数量。
在另一方面，本发明涉及在单个样品容器中扩增、检测以及定量一种或更多种靶核酸的反应混合物，其包括至少一组寡核苷酸，每个寡核苷酸被标记相同的一个或更多个报告基团，其中每个所述标记寡核苷酸充分互补于至少一种靶核酸的至少一个子序列，并且能以与同一组内其它标记寡核苷酸不同的解链温度结合至相应靶核酸，以及至少一种扩增靶核酸所需的试剂。在某些实施方式中，所述每一个寡核苷酸被标记单个报告基团。在另一个实施方式中，每个所述的寡核苷酸被标记报告基团和淬灭基团，其中在某些方面，所述报告基团是荧光基团而所述淬灭基团是暗淬灭剂。在另外一个实施方式中，所述反应混合物进一步包含浓度已知的对照核酸。
另一方面，本发明涉及在单个样品容器中扩增、检测以及定量一种或更多种靶核酸的试剂盒，其包括至少一组寡核苷酸，每个寡核苷酸被标记相同的一个或更多个报告基团标记，其中每个所述标记寡核苷酸充分互补于至少一种靶核酸的至少一个子序列，并且能以与同一组内其它标记寡核苷酸不同的解链温度结合至相应靶核酸，以及至少一种扩增靶核酸所需的试剂。在一些实施方式中，试剂盒进一步包含用于防止扩增反应后滞留(carryover)污染的试剂。在另外一个实施方式中，所述试剂盒进一步包含浓度已知的对照核酸。
附图说明
图1是本发明所述方法的步骤的图解。
图2显示了本发明所述方法应用于靶核酸序列SENP1并描述于实施例1的结果。
图3显示了本发明所述方法应用于靶核酸序列PPP1CA并描述于实施例1的结果。
发明详述
定义
下述定义应用于本申请所使用的术语。
“非对称PCR”是两种扩增引物的量不相等的PCR。较高量存在的引物被称为“过量引物”而较少量存在的引物被称为“限制性引物”。过量引物延伸所产生的链过量聚集并被称为“过量片段”。限制性引物延伸产生的另一条链小量聚集并被称为“限制性片段”。
“生色团”是一种附着在例如核酸上的化合物或基团，其能够选择性地吸收光并导致着色(coloration)。当被激发时，生色团可以或可以不发射光辐射。
“荧光染料”或“荧光团”是一种附着在例如核酸上的化合物或基团，其被合适波长的光激发时能发射光辐射。典型的荧光染料包括罗丹明染料、菁染料、荧光素染料以及BODIPY染料。荧光团是一种荧光生色团。
“FRET”或“荧光共振能量转移”或“福斯特(Foerster)共振能量转移”是一种在至少两个生色团、供体生色团和受体生色团(被称为淬灭剂)之间的能量转移。当供体被合适波长的光激发后，供体通常转移能量至受体。受体通常以不同波长的光辐射形式重新发射转移的能量。当受体是“暗”淬灭剂时，其以不同于光的形式消散转移能量。特定荧光基团是作为供体还是作为受体取决于FRET对的其它成员的属性。通常应用的供-受体对包括FAM-TAMRA对。通常应用的淬灭剂是DABCYL以及TAMRA。通常应用的暗淬灭剂是BlackHoleQuenchersTM(BHQ)，Biosearch Technologies，Inc.(Novato，Cal.)，IowaBlackTM，Integrated DNA Tech.，Inc.(Coralville，Iowa)，BlackBerryTM Quencher 650(BBQ-650)，Berry&Assoc.，(Dexter，Mich.)。通常应用的供体-受体对包括FAM-BHQ对。
核酸扩增分析上下文中的“生长曲线”是一种函数图表，其中自变量是扩增循环数，而因变量是在每个扩增循环测量的扩增依赖可测参数。通常地，扩增依赖性可测参数是探针在杂交或被核酸聚合酶的核酸酶活性水解后而发射的荧光量，参见Holland等(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88：7276-7280以及美国专利5,210,015。在一个典型的聚合酶链式反应中，生长曲线包括后随平台期的指数增长段。生长曲线通常以“到阈值的循环”值或“Ct”值来表征，其为可测参数达到预定量时的循环数。较低的Ct值表示扩增的完成更迅速，而较高的Ct值表示扩增的完成较缓慢。当扩增效率相似时，较低的Ct值是较高起始量靶核酸的反映，而较高Ct值时较低起始量靶核酸的反映。当应用已知浓度的对照核酸时，通过比较靶核酸与对照核酸的Ct值来确定靶核酸的绝对量成为可能。
核酸扩增反应上下文中的“热启动”是这样一个方案，其中至少一个关键试剂被从反应混合物中保留(withheld)出来(或者，如果其存在于反应混合物中，则该试剂保持失活)直至温度被升高足以提供引物或复数引物必需的杂交特异性。“热启动酶”是这样一种酶，其通常是核酸聚合酶，能够作为热启动方案中的“提留(withheld)”或失活试剂。
“杂交”是两条通常的单链或至少部分单链核酸之间的相互作用。杂交作为核苷碱基之间碱基配对的结果而发生，并涉及诸如氢键合、溶剂排斥、碱基堆积等等物理化学过程。杂交可以发生在完全互补或部分互补的核酸链之间。核酸杂交能力受温度和其它杂交条件的影响，其可被操纵以使仅部分互补核酸间的杂交能发生。核酸杂交是本领域所熟知的并被深入地描述于Ausubel(编辑)的Current Protocols in Molecular Biology，v.I，II和III(1997)。
“标记”指附着(共价或非共价)至分子的基团，所述基团能提供关于该分子的信息。示例性的标记包括荧光标记、放射性标记以及质谱修饰基团(mass-modifyinggroups)。
术语“核酸”指核苷酸(例如，核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸，天然的以及非天然的)的诸如作为DNA、RNA及其子范畴诸如cDNA、mRNA的聚合物。核酸可以是单链或双链的并且通常含有5’-3’磷酸二酯键，尽管在某些情况下，核苷酸类似物可具有其它键。核酸可包括天然碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶和胸腺嘧啶)以及非天然碱基。非天然碱基的例子包括描述在例如Seela等的(1999)Helv.Chim.Acta 82：1640的那些。在核苷酸类似物中应用的某些碱基作为解链温度(Tm)修饰剂。例如，这些碱基的某些包括7-脱氮嘌呤(例如7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮腺嘌呤等)、吡唑并[3，4-d]嘧啶、丙炔-dN(例如丙炔-dU、丙炔-dC等)等等(参见例如美国专利5,990,303)。其它代表性杂环碱基包括例如次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤；2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤的8-氮衍生物；腺嘌呤、鸟嘌呤、2-氨基嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黄嘌呤、肌苷、黄嘌呤的7-脱氮-8氮衍生物；6-氮杂胞苷；5-氟胞苷；5-氯胞苷；5-碘胞苷；5-溴胞苷；5-甲基胞苷；5-丙炔胞苷；5-溴代烯基尿嘧啶(5-bromovinyluracil)；5-氟尿嘧啶；5-氯尿嘧啶；5-碘尿嘧啶；5-溴尿嘧啶；5-三氟甲基尿嘧啶；5-甲氧基甲基尿嘧啶；5-乙炔尿嘧啶；5-丙炔尿嘧啶等等。
术语“核酸聚合酶”或简单地“聚合酶”指的是例如催化核苷酸整合入核酸的DNA聚合酶的酶。示例性热稳定DNA聚合酶包括来自嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)、Thermuscaldophilus，栖热菌属(Thermus sp.)ZO5(参见例如美国专利5,674,738)，水生栖热菌(Thermus aquaticus)、Thermus flavus、丝状栖热菌(Thermus filiformis)、栖热菌属(Thermus sp.)sps17、Deinococcus radiodurans、温泉家族B/克隆7(Hot Spring familyB/clone 7)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、Bacillus caldotenax、大肠杆菌(Escherichia coli)、Thermotogamaritima、那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeapolitana)以及非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)中的那些。众多热稳定DNA聚合酶的全长核酸以及氨基酸序列可在公共数据库获得。
术语“5’至3’核酸酶活性”或者“5’-3’核酸酶活性”指核酸聚合酶的一种活性，其通常与核酸链合成相关，据此核苷酸被从核酸链的5’末端移除，例如，大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I具有这样的活性，而Klenow片段则没有。
术语“基本上缺乏5-3核酸酶活性的核酸聚合酶”或者“5’-3’核酸酶缺陷酶(5-3-nuclease-deficient enzyme)”或简单的“核酸酶缺陷酶”指的是具有Taq DNA聚合酶50％或更少的5-3活性的聚合酶。测量5-3核酸酶活性的方法以及测量条件描述于美国专利5,466,591。缺乏5-3核酸酶活性的聚合酶的例子包括Taq DNA聚合酶的Stoffel片段(美国专利5,466,591)、Thermus africanus DNA聚合酶突变体(美国专利5,968,799)、Thermotogamaritima DNA聚合酶突变体(美国专利5,624,833和5,420,029)、栖热菌属(Thermusspecies.)sps17以及栖热菌属(Thermus species.)ZO5 DNA聚合酶突变体(美国专利5,466,591以及5,405,774)。5-3核酸酶缺陷酶也可以是嵌合的，即由来源于一个以上物种的结构域组成并具有消除5-3核酸酶活性突变的嵌合蛋白(美国专利5,795,762以及6,228,628)。
“寡核苷酸”指一种短的核酸，长度通常为10个或更多个核苷酸。寡核苷酸由本领域已知的任意合适方法制备，例如，Narang等(1979)Meth.Enzymol.68：90-99；Brown等(1979)Meth.Enzymol.68：109-151；Beaucage等(1981)Tetrahedron Lett.22：1859-1862；Mattecci等(1981)J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191中描述的直接化学合成的方法，或本领域已知的任何其它方法。
“引物”是一种能作为沿模板核酸互补链延伸起始点的寡核苷酸。至少部分互补于模板核酸子序列的引物通常足以与模板核酸杂交并产生延伸。
“引物延伸”指一个或更多个核苷酸被添加至引物的化学反应。
“探针”指与靶序列中的序列形成双链体结构(由于探针和靶序列至少部分互补)的标记寡核苷酸。
“模板”或“靶”指的是待扩增、检测以及定量的核酸。靶或模板是引物或探针可杂交的序列。靶核酸基本上可来自任意来源，包括微生物、复杂的生物混合物、组织、体液、血清、保藏的生物样品、环境分离物、体外制备物等等。模板或靶可由核酸分子全长或一部分组成。
“热稳定核酸聚合酶”或“热稳定聚合酶”是与例如来源于大肠杆菌的聚合酶比较时，在高温下相对稳定的聚合酶。如本文中所使用的，热稳定聚合酶适合在聚合酶链式反应(PCR)典型的温度循环条件下使用。
“解链温度”或“Tm”指一半量的同源双链体或异源双链体(heteroduplex)的双链核酸分子(双链体)解离为单链时的温度。双链核酸的Tm受离子强度和溶液pH值以及浓度、碱基组成以及核酸自身二级结构的影响。给定条件下双链体的Tm能在实验中确定或在商业软件诸如Visual OMPTM(DNA Software，Inc.，AnnArbor，Mich.)的帮助下预测。
“解链分析(melting assay)”、“解链分析(melt assay)”或简单的“解链”是一种确定解链温度(Tm)的测定法。在这种分析中，双链体核酸分子在受控温度程序中加热，通过测量某种参数诸如由于双链体解离而改变的荧光来监测双链体解离为单链。解链数据可表示为“解链曲线”，即作为温度函数的荧光图(F对比T)。解链数据也可以表示为“解链峰”，即荧光在温度区间的变化速率作为温度函数的图(dF/dT对比T)或(-dF/dT对比T)，其通常具有抛物线形状。双链体的Tm作为抛物线(dF/dT对比T)或(-dF/dT对比T)顶点上的温度值(T)表示在解链峰上。
“靶核酸扩增所需试剂”包括但不限于用于靶核酸扩增的物质，诸如至少一个引物核酸、缓冲溶液、核苷酸、盐、核酸聚合酶等等。每种这些试剂可分别存在于单瓶中或作为预混溶液或冻干物(lyophilisate)。
本发明是一种涉及同时多重扩增、检测并定量核酸靶的方法。在一个方面中，所述方法包含与解链分析组合的实时PCR。所述方法应用被标记相同报告基团的复数个探针，但每个探针具有独特的双链体解链温度。由于探针可通过其解链温度而不仅仅通过其荧光标记被鉴别，同一反应容器中的数个探针可以被标记相同标记基团。所述测定法可通过应用数组探针进一步用于多重分析，每组探针以独立的报告基团标记，最高达到至检测仪器可区分的基团数。
本发明的方法涉及由每个探针在扩增期间产生解链信号(解链曲线)的生成。解链曲线函数可微分成导函数或“解链峰”。对于每个解链峰，测量解链峰的最高值。解链峰最高值的大小与靶序列及其在反应混合物的扩增子的量成正比。当扩增循环期间记录的解链峰最高值相对于循环数作图时，一系列的解链峰最高值生成扩增曲线，外观上类似于传统实时PCR分析中生成的扩增曲线。每个标记探针能产生独特的明显区别于其它探针解链图形(melting profile)的解链图形。因此，每个探针提供了每个靶的独立定量数据。相对量化通过确定Cm值(给定解链峰到达预设阈值时的循环)来完成。较早(较低)的Cm表示加入的靶核酸浓度较高，而较迟(较高)的Cm表示加入的靶核酸浓度较低。预设阈值是针对每个靶核酸通过实验设定的。通常，阈值是解链峰首次可检测时的解链峰荧光水平。
当在相同分析中扩增并检测已知浓度的对照核酸时，就有可能通过比较靶核酸与对照核酸的Cm值来确定靶核酸的绝对输入量。
与应用荧光标记探针的传统多重实时PCR相比，本发明的方法具有更宽的多重功能。传统实时PCR分析受限于检测仪器不能区分更多个波长。在本发明中，在任意给定波长通过测量多个不同解链峰扩大了多重检测的能力。
在一个方面中，本发明采用了扩大定量实时PCR多重能力的解链测定法。特别地，本发明的测定法是实时PCR的应用复数个被标记相同荧光的探针，允许同时扩增、检测和定量同一管内复数个靶核酸序列的多重分析版本。所述探针在相同的波长通道内检测，但通过它们独特的解链温度而区分。
如图1所示，本发明的方法以数种靶核酸序列在同一反应容器中的扩增起始。每个管内包含有一组或更多组寡核苷酸探针，每一组寡核苷酸探针被标记相同荧光报告基团。然而，在每组寡核苷酸探针内，每一个寡核苷酸探针通过其与靶核酸的独特解链温度来表征。数组探针存在于同一反应容器中以获得最大多重分析能力。
在一轮扩增后，靶核酸可进行如下所述的解链步骤以生成每个探针-靶双链体的解链曲线。每个解链曲线(温度区间的荧光，或F对比T)被微分并转化为温度区间的解链峰曲线(dF/dT)，对其计算“解链峰最高值”(T＝Tm时的dF/dT)大小。在重复扩增以及解链循环后，累积每个靶-探针复合物的一组“解链最大峰值”。对所述解链最大峰值相对于循环数作图以生成每个靶核酸的生长曲线。获得类似于实时PCR分析中所获典型生长曲线的每个靶的生长曲线。
在一些实施方式中，一个或更多个探针可设计为具有低于扩增中所有退火温度的解链温度。这样的探针不会生成“传统的”实时PCR生长曲线。然而，这样的探针可用于生成依据本发明的生长曲线。
通过本发明方法扩增、检测并定量的靶核酸序列可以是任意长度的。通常地，靶核酸长度为100至1000个核苷酸。然而，更长(数千个核苷酸)以及更短(50至100个核苷酸之间)的靶序列也可用于本发明的一些实施方式。靶核酸序列可包含于较大的从天然或实验室来源样品分离的核酸分子。
尽管本公开通常讨论本发明如果样品中存在多个靶，但应当理解在具体实施方式中，样品中仅有一种靶序列。在本发明的一个典型实施方式中，当检测至少2种最高至16种或更多种不同靶序列时，实施“多重”反应。这些实施方式通常但不总是涉及用于每个靶序列的独立扩增引物对以及独立探针的使用。然而，但一些实施方式中，应用相同引物对扩增的相同核酸可采用一个以上探针来检测。这在单个序列中包含数个目的靶或位点例如数个潜在突变位点时是有利的。每个探针将能够检测和定量各个位点的突变。
本发明的扩增引物是至少部分互补于靶序列的至少一个现有变体的寡核苷酸。引物的长度可在6到100个核苷酸间，尽管通常大多数引物在15到35个核苷酸之间变化。优化核酸扩增引物的方法已经描述在例如，PCR Protocols：AGuide to Methods andApplications，Innis等编辑(1990)Academic Press。通常地，引物是人工合成的寡核苷酸，由A、C、G以及T核苷酸组成。然而，能整合入核酸的非传统碱基核苷酸也可以用于引物中。例如，已知某些修饰碱基用于增加扩增特异性，参见美国专利6,001,011。
各种热稳定的核酸聚合酶是本领域已知的。任何热稳定核酸聚合酶可用于本发明的方法。有些时候，应用缺乏5-3核酸酶活性的聚合酶是有利的。有时候需要应用不具有校正活性(3’-5’外切酶活性)的聚合酶。有时候也需要具有“热启动”能力的酶，诸如描述于美国专利5,677,152以及5,773,528的可逆修饰酶。
杂交探针的设计是本领域已知的。同样的探针可作为杂交探针或解链探针使用或同时作为两者来使用。所述探针是否作为解链探针、单个杂交探针或杂交探针对中的成员，探针寡核苷酸的设计遵循本领域已知的以及本发明所描述的相同原则。这些原则可手动或在软件的帮助下应用。
在本发明的一些实施方式中，进行解链分析的反应混合物中可存在一个以上的探针。本领域技术人员能立即认识到可用于解链探针的设计标准可用于多重分析中。特别地，能用于相同反应混合物的探针应当设计为具有不相同的与其相应靶序列的杂交解链温度。
寡核苷酸探针可通过引入一个或更多个生色团而被标记。单个生色团，其为荧光团时，可如2008年12月9日提交的美国专利申请系列号12/330,694中所描述地那样应用。当应用两个生色团时，通常一个是报告生色团而另一个是淬灭剂。两个生色团可以都是荧光团或其中一个生色团可以是非荧光淬灭剂。合适的荧光团的例子包括荧光素家族(FAM、HEX、TET、JOE、NAN以及ZOE)、罗丹明家族(德克萨斯红(Texas Red)、ROX、R110、R6G以及TAMRA)、菁家族(Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5以及Cy7)、香豆素家族、噁嗪家族、噻嗪家族、squaranine家族以及适合用于标记和检测核酸的荧光染料中的其它家族中的染料。第二生色团可以被引入相同的探针寡核苷酸或独立的探针寡核苷酸。通常应用的暗淬灭剂包括BlackHole QuenchersTM(BHQ)，(Biosearch Technologies，Inc.，Novato，Cal.)，IowaBlackTM，(Integrated DNA Tech.，Inc.，Coralville，Iowa)，以及BlackBerryTM Quencher650(BBQ-650)，(Berry&Assoc.，Dexter，Mich.)。
本发明涉及在实时PCR分析中靶核酸的定量。如在传统实时PCR分析中，对每个靶生成扩增生长曲线。通过测量每个扩增循环期的可检测扩增依赖性信号生成曲线。本发明可以测量新的、非以前用于生成生长曲线的扩增依赖性信号。特别地，本发明的方法测量解链信号即解链分析中生成的信号以生成生长曲线。
在本发明方法的解链测定法中，在靶DNA和一个或更多个标记探针间形成杂合子。通常地，寡核苷酸探针或复数个探针被标记一个或更多个生色基团，其中至少一个生色团是荧光团。导致模板-探针杂合子解链或形成的温度变化，伴随着荧光的可测改变，所述荧光是在合适波长光激发寡核苷酸探针后发射的。
在一些实施方式中，探针被标记两个生色团而形成FRET对。在一些实施方式中，两个生色团均为荧光团。在另外的实施方式中，一个生色团是非荧光淬灭剂。形成FRET对的生色团可缀合至相同或不同探针分子。解链测定法中FRET探针的应用已描述于美国专利6,174,670以及De Sila等(1998)“Rapidgenotyping and quantification on theLightCycleTM with hybridization probes”，Biochemica，2：12-15。在另外的实施方式中，探针被标记单个生色团，所述生色团与缀合或嵌入靶核酸中的第二生色团相互作用(参见美国专利5,871,908)。
根据现有的方法，单一解链分析在扩增的所有循环完成之后施行的。这种技术通常被称为“扩增后解链”。然而，本发明教导了将解链分析整合至PCR循环中。这涉及添加解链步骤至PCR循环的温度特征(profile)。典型的解链步骤涉及在95℃温育(以变性双链扩增子)，接着降低温度至40℃(以允许解链探针的退火)，然后再次升温(以解链探针-模板双链体)。已观察到在扩增第一轮循环中解链信号微弱。这个现象很可能是由于扩增早期靶核酸的存在量不足引起的。因而实际上是在相当数量的扩增循环已经发生后将解链步骤整合入扩增循环的。
在应用荧光寡核苷酸探针的传统实时PCR测定法中，在每个循环的退火步骤检测荧光。在本发明中，在解链步骤的选定部分期间持续获得荧光数据。因此，探针-靶双链体的每一轮解链产生一个解链曲线和一个解链峰。微分解链曲线以获得解链峰描述在例如美国专利6,472,156中。对于每个解链峰，解链信号定义为当温度到达双链体的解链温度(T＝Tm)时解链峰的高度或“解链峰最大值”。解链峰的高度与解链探针和靶扩增子间形成的双链体的量成比例，并且其与样品中靶扩增子的量成比例。因此，给定解链峰首次到达预设阈值(Cm)时的循环是靶核酸起始量的反映。将每个循环测得的解链峰高度(解链峰最大值)相对于扩增循环作图。如图2和图3中能看到的那样，获得的图形类似于传统实时PCR生长曲线。如果已知所输入浓度的对照核酸与靶核酸一同扩增，可通过比较靶核酸和对照核酸测得的Cm值来确定所输入的靶核酸绝对量。
在一些具体实施方式中，本发明涉及非对称PCR。在非对称PCR混合物中，其中一个扩增引物的存在量比另一个的大。所述引物分别被称为“过量引物”和“限制性引物”。这些引物延伸所生成的核酸链分别被称为“过量链”和“限制性链”。过量引物与限制性引物的比例可以被选择性调节并且在200∶1和2∶1之间，但通常约为9∶1至5∶1。由于引物的过量，过量链以单链形式线性积聚。在本发明中，解链探针被设计为与“过量链”杂交，即过量引物延伸所生成并以单链形式积聚的扩增子链。所述过量单链在随后的PCR循环中是有益的。在传统非对称PCR分析的后期循环期间，扩增子链积聚并有效地与用于形成双链体的杂交探针竞争。非对称PCR被设计为使得过量链与探针杂交，因而消除了PCR后期循环的动力学劣势并容许解链峰的检测。
在一些实施方式中，应用包含5-3核酸酶活性的酶是有益的。为防止杂交探针被这样的酶清除掉，选择探针浓度以确保足够量的探针用于解链测定法。
具体实施方式
实施例
仅作为示例而不限制本发明的范围，所述方法被用于检测同一样品中人类基因PPP1CA和SENP1的mRNA的存在和量。PPP1CA是编码蛋白质磷酸酶1-α催化亚单元的基因，且具有抗致癌特性(参见Castro等“PPP1CA contributesto the senescence programinduced by oncogenic Ras，”，Carcinogenesis(2008)29(3)：491-499)。SENP1是一种sentrin/SUMO特异性蛋白酶，其属于SmallUbiquitin样(Ubl)修饰剂(Modiffers)(SUMO)，在Muller等的“SUMO，ubiquitin’smysterious cousin”，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.(2001)2(3)：202-10以及Yeh等的“Ubiquitin-like proteins：new wines in new bottle，”Gene(2000)248(1-2)：1-14)中有过论述。
实施例1
应用基于解链的生长曲线，定量扩增同管内不同量的靶SENP1和PPP1CA。
在该实施例中，所述方法被用来检测和定量组织样品中不同量的SENP1和PPP1CA。
以过量引物比限制性引物过量7倍的量进行非对称PCR。采用被标记荧光素染料和BlackHoleTM淬灭剂的单个杂交探针施行检测。引物和探针序列见于表1。探针被设计来杂交过量链。
表1
实施例中所用引物和探针
序列ID 功能 序列5’-3’
SEQ IDNO：1 SENP1的正向引物 CAGCTTCAAATACACAATCTGAAGGATCA
SEQ IDNO：2 SENP1的反向引物 TGCCTGGAAGAAAGTAGAACTGGGA
SEQ IDNO：3 SENP1的探针 FGACTCTGTGATTTTACTGAAAGTGAAAGATTCCCAGACTCCQp
SEQ IDNO：4 PPP1CA的正向引物 AACCGCATATATGGTTTCTACGATGE
SEQ IDNO：5 PPP1CA的反向引物 CGATGAGTGCAAGAGACGCTACAE
SEQ IDNO：6 PPP1CA的探针 FACTGTGGAAAACCTTQp
F-cx-FAM报告染料
Q-BHQ-2淬灭剂染料
E-叔丁基苄基dA
p-3’-磷酸基团
每100μl反应物中含有标明量的人胚胎脾脏RNA(在0.2与2000纳克之间，如图2和图3所标明的)，50mM Tricine，pH8.3；120mM醋酸钾；8％的甘油；dATP、dGTP和dCTP各33.3mM，100mM的dUTP；40U ZO5 DNA聚合酶；100nM适体(Aptamer)46A；5U尿嘧啶N-糖苷酶(UNG)；3mM醋酸锰；100nM正向(限制性)引物(SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：4)；700nM反向(过量)引物(SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5)；以及200nM探针(SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：6)。
应用Roche LightCycleTMLC480仪器实施扩增和检测。以下述温度特征进行反应：50℃2分钟(UNG步骤)；95℃1分钟(UNG灭活)；60℃30分钟(反转录)；随后是44个以下扩增循环：90℃15秒(变性)以及61℃60秒(退火和延伸)。
在起始15个扩增循环后引入解链步骤。对于循环16-27，每两个循环后实施解链。对于循环28-39，每个循环后实施解链。对于循环40-44，每两个循环后实施解链。解链步骤在61℃退火和延伸步骤完成之后开始，并且由以下构成：以每秒1.2℃的升温速率(ramprate)升高至90℃并保持5秒；以每秒1.8℃的速率冷却至40℃；以1.8℃每秒的速率加热至90℃，同时以每℃两次的速率从三个通道读取，连续获得荧光数据。
对于解链步骤获得的每个荧光读数，获得解链曲线(F/T函数)。对于每个解链曲线，获得导函数或“解链峰”(dF/dT)以及依据本发明所述方法确定解链峰最大值(图1)。将获得的解链峰最大值相对于循环数作图以生成如图2(SENP1)和图3(PPP1CA)所示的生长曲线。
定量结果如表2所示。表中显示了到达预设“解链阈值”(Cm)的循环数。对于SENP1，阈值设定在0.181。对于PPP1CA，阈值设定在0.055。对于每一个靶，起始核酸输入得越多就越早到达阈值。
表2
定量数据(到达解链阈值(Cm)时的循环数)
输入的RNA(ng) 0 0.2 2 20 200 2000
SENP1 NC 35.3 32.1 31.1 30.3 29.4
PPP1CA NC 32.3 31.2 30.8 30.1 29.8
NC：未计算
如图2和3所示，对各种量的靶核酸，实验一式两份地进行。对于每个靶，所有12个反应(包括两个无模板对照反应)都采用相同荧光标记的探针。
尽管本发明参照具体实施例进行了详细描述，但对本领域技术人员来说，可在本发明范围内作各种修改是很明显的。因此本发明的范围不应当受限于所描述的实施例，而应当依据下述的权利要求。
<110>F.Hoffmann-La Roche AG
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<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>1
cagcttcaaa tacacaatct gaaggatca 29
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<400>2
tgcctggaag aaagtagaac tggga 25
<210>3
<211>41
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成探针
<400>3
gactctgtga ttttactgaa agtgaaagat tcccagactc c 41
<210>4
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(26)..(26)
<223>叔丁基苄基-dA
<400>4
aaccgcatat atggtttcta cgatga 26
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成引物
<220>
<221>修饰的碱基
<222>(24)..(24)
<223>叔丁基苄基-dA
<400>5
cgatgagtgc aagagacgct acaa 24
<210>6
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：合成探针
<400>6
actgtggaaa acctt 15

Claims (9)

1.在单个样品容器中同时多重实时PCR扩增、检测并定量一种或更多种靶核酸的方法，其包括步骤：
(a)使怀疑含有一种或更多种靶核酸的样品与至少一组寡核苷酸探针相接触，其中所述组内每个寡核苷酸探针被标记相同的一个或更多个报告基团，其中每个所述标记寡核苷酸探针
i.充分互补于至少一种靶核酸的至少一个子序列；
ii.能够以不同于同组内其它标记寡核苷酸探针解链温度的解链温度与相应靶核酸结合；
(b)在包括温度变化区间的扩增反应循环中扩增样品中的靶核酸，其中所述标记寡核苷酸探针从与相应靶核酸的杂合子解离；
(c)检测在至少部分所述温度变化区间上来自所述报告基团的光发射；以及
(d)对步骤(c)中在温度变化区间的至少所述部分上检测的光发射的一阶导数进行作图；
(e)确定步骤(d)中作图的所述导数的最大值；
(f)重复步骤(b)至(e)复数次；以及
(g)将步骤(e)确定的所述导数最大值相对于步骤(b)至(e)的循环数或重复数目进行作图，并确定步骤(e)中确定的数值到达预设阈值时的循环数或重复数目，从而定量所述靶核酸的相对量。
2.权利要求1所述的方法，其中对浓度已知的对照核酸与所述靶核酸同时进行步骤(a)-(f)，并且将步骤(g)中确定的每个靶核酸的值与步骤(g)中确定的对照核酸的值进行比较，从而确定每个所述靶核酸的绝对量。
3.权利要求1和2任一项的方法，其中步骤(a)中每个所述寡核苷酸探针被标记单个报告基团。
4.权利要求3所述的方法，其中所述报告基团是荧光的。
5.权利要求1和2任一项的方法，其中步骤(a)中的每个所述寡核苷酸探针被标记报告基团和淬灭基团。
6.权利要求5所述的方法，其中所述报告基团和所述淬灭基团是荧光团。
7.权利要求5所述的方法，其中所述报告基团是荧光团而所述淬灭基团是暗淬灭剂。
8.权利要求5所述的方法，其中所述报告和淬灭基团被核酸酶切割位点分隔。
9.权利要求1、2、4和6-8任一项所述的方法，其进一步包含至少一个用于在步骤(b)之前扩增样品中的靶核酸的扩增循环。
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