ES2589102T3 - Ensayo cuantitativo de amplificación y fusión multiplex de ácidos nucleicos - Google Patents

Abstract

Método para la amplificación por PCR en tiempo real, detección y cuantificación multiplex simultáneas de uno o más ácidos nucleicos diana en un único recipiente para muestras, que comprende las etapas siguientes: (a) poner en contacto una muestra, que se sospecha que contiene uno o más ácidos nucleicos diana, con por lo menos un juego de sondas oligonucleótidas, estando marcada cada sonda oligonucleótida en el juego con la misma o mismas fracciones informadoras, en el que cada una de dichas sondas oligonucleótidas marcadas i. es suficientemente complementaria respecto a por lo menos una subsecuencia de por lo menos un ácido nucleico diana, ii. es capaz de unirse al ácido nucleico diana correspondiente con una temperatura de fusión diferente de las temperaturas de fusión de las otras sondas oligonucleótidas marcadas en el mismo juego, (b) amplificar los ácidos nucleicos diana en la muestra en un ciclo de una reacción de amplificación que incluye un intervalo de cambios de temperatura, en el que dichas sondas oligonucleótidas marcadas se disocia de los híbridos con los ácidos nucleicos diana correspondientes, (c) detectar la emisión lumínica de dichas fracciones informadas en por lo menos una parte de dicho intervalo de cambio de temperatura, y (d) representar la primera derivada de dicha emisión lumínica detectada en la etapa (c) en por lo menos dicha parte del intervalo de cambio de temperatura, (e) determinar el valor del máximo de dicha derivada representada en la etapa (d), (f) repetir las etapas (b) a (e) múltiples veces, y (g) representar los valores de máximo de dicha derivada determinada en la etapa (e) frente al número de ciclos o el número de repeticiones de las etapas (b) a (e), y determinar el número de ciclos o el número de repeticiones a las que se alcanza un valor umbral predeterminado del valor determinado en la etapa (e), cuantificando de esta manera la cantidad relativa de dicho ácido nucleico diana, en el que dicha reacción de amplificación por PCR en tiempo real, detección y cuantificación multiplex simultáneas comprenden la detección de por lo menos dos secuencias diana diferentes, comprendiendo cualquier amplificación la utilización de parejas separadas de cebadores de amplificación para cada secuencia diana y la detección utilizando una sonda oligonucleótida separada para cada secuencia diana o la amplificación utilizando una pareja de cebadores de amplificación y la detección utilizando más de una sonda oligonucleótida para cada secuencia amplificada.

Description

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DESCRIPCION

Ensayo cuantitativo de amplificacion y fusion multiplex de acidos nucleicos CAMPO DE LA INVENCION

La invencion se refiere de manera general a la amplificacion in vitro, deteccion y cuantificacion de acidos nucleicos. Concretamente, la invencion se refiere a un ensayo multiplex en un unico tubo, capaz de amplificar, detectar y cuantificar simultaneamente multiples dianas de acidos nucleicos utilizando multiples sondas de hibridacion marcadas con el mismo marcaje informador fluorescente. El ensayo puede multiplexarse adicionalmente utilizando varios informadores fluorescentes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) se ha convertido en una herramienta ubicua de la investigacion biomedica, y el seguimiento y diagnostico de enfermedades. La amplificacion de las secuencias de acidos nucleicos mediante pCr se describe en las patentes US n° 4.683.195, n° 4.683.202 y n° 4.965.188. La PCR actualmente es bien conocida de la tecnica y ha sido extensamente descrita en la literatura cientffica (ver PCR Applications, Innis et al., editores, Academic press, San Diego, 1999; PCR Strategies, Innis et al., editores, Academic Press, San Diego, 1995; PCR Protocols, Innis et al., editores, Academic Press, San Diego, 1990, y PCR Technology, Erlich, ed., Stockton Press, New York, 1989). Un ensayo de PCR "en tiempo real" es capaz de amplificar, detectar y cuantificar simultaneamente la cantidad inicial de la secuencia diana. El ensayo de PCR en tiempo real TaqMan basico, que utiliza la actividad de nucleasa de la ADN polimerasa, se describe en Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280, 1991, y en la patente US n° 5.210.015. La PCR en tiempo real sin la actividad de nucleasa (un ensayo sin nucleasa) ha sido descrito en la solicitud de patente US n° de serie 12/330.694, presentado el 9 de diciembre de 2008 (numero de publicacion n° US2010/0143901). La utilizacion de sondas fluorescentes en la PCR en tiempo real se describe en la patente US n° 5.538.848.

Un protocolo de PCR en tiempo real tfpico implica la utilizacion de una sonda marcada espedfica para cada secuencia diana. La sonda preferentemente se marca con una o mas fracciones fluorescentes, que emiten luz de una longitud de onda detectable. Tras hibridarse con la secuencia diana o su amplicon, la sonda muestra un cambio detectable de la emision fluorescente.

Sin embargo, el reto principal del ensayo en tiempo real sigue siendo la capacidad de analizar numerosas dianas en un unico tubo. Practicamente en todos los campos de la medicina y el diagnostico se esta incrementando rapidamente el numero de loci de interes. Por ejemplo, deben analizarse multiples loci en el perfilado de ADN forense, en la deteccion de microorganismos patogenicos, en el cribado multi-locus de enfermedades geneticas y en los estudios de expresion multigenica, entre otros muchos.

Con los metodos actuales, la capacidad de multiplexar un ensayo se encuentra limitada por los instrumentos de deteccion. Concretamente, la utilizacion de multiples sondas en la misma reaccion requiere la utilizacion de diferentes marcajes fluorescentes. Para detectar simultaneamente multiples sondas, un instrumento debe poder discriminar las senales lummicas emitidas por cada sonda. La tecnologfa actual no permite la deteccion de mas de cuatro longitudes de ondas separadas en el mismo recipiente de reaccion. Por ejemplo, Bell et al. ("Real-time quantitative PCR in parasitology", Trends in Parasitol. 18(8):337-342, 2002) han estudiado recientemente los cicladores termicos de PCR cuantitativa en tiempo real disponibles y han informado de que ninguno presenta mas de cuatro canales de deteccion optica. Por lo tanto, utilizando una sonda con un unico marcaje por cada diana no pueden detectarse mas de cuatro dianas separadas en el mismo recipiente. En la practica por lo menos una diana es habitualmente un acido nucleico de control. De acuerdo con lo anterior, en la practica no pueden detectarse mas de tres dianas experimentales en el mismo tubo. Debido a que el hardware optico puede ofrecer como maximo una pequena mejora marginal, la capacidad de multiplexar un ensayo no mantendra el ritmo del crecimiento de las necesidades clmicas, a menos que se realicen cambios radicales en la estrategia de amplificacion y deteccion.

Una capacidad adicional para multiplexar una reaccion de amplificacion en tiempo real es proporcionada por un ensayo de fusion post-PCR (ver el documento n° US2007-0072211, presentado el 23 de junio de 2006). En un ensayo de fusion se identifica el acido nucleico amplificado por su perfil de fusion unico. Un ensayo de fusion implica determinar la temperatura de fusion (punto de fusion) de una diana de doble cadena, o un duplex entre la sonda marcada y la diana. Tal como se indica en la patente US n° 5.871.908, para determinar la temperatura de fusion utilizando una sonda marcada fluorescentemente, un duplex entre el acido nucleico diana y la sonda se calienta (o se enfna) gradualmente en un programa de temperatura controlada. La disociacion del duplex cambia la distancia entre los fluoroforos interactuantes o entre fluoroforo e inhibidor. Los fluoroforos interactuantes pueden conjugarse a moleculas de sonda separadas, tal como se indica en la patente US n° 6.174.670. Alternativamente, un fluoroforo puede conjugarse con una sonda, mientras que el otro fluoroforo puede intercalarse en un duplex de acidos nucleicos, tal como se indica en la patente US n° 5.871.908. A modo de todavfa otra alternativa, los fluoroforos pueden conjugarse con un unico oligonucleotido sonda. Tras la fusion del duplex, la fluorescencia se inhibe al reunir el

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fluoroforo del inhibidor en la sonda que ahora es de cadena sencilla.

La fusion del duplex de acidos nucleicos se monitoriza mediante la medicion del cambio asociado de fluorescencia. El cambio de fluorescencia puede representarse en un grafico denominado "perfil de fusion". Debido a que pueden disenarse diferentes duplex de sonda-diana para fusionar (o rehibridar) a temperatures diferentes, cada sonda generara un perfil de fusion unico. Las sondas correctamente disenadas presentanan temperaturas de fusion que son claramente distinguibles de las de otras sondas en el mismo ensayo. Muchas herramientas de software actuales permiten disenar sondas para un ensayo multiplex en un unico tubo con estos objetivos en mente. Por ejemplo, el software Visual OMP'' (DNA Software, Inc., Ann Arbor, Mich.) permite determinar las temperaturas de fusion de los duplex de acidos nucleicos bajo diversas condiciones de reaccion.

El metodo de la PCR multiplex utilizando la deteccion de color y el posterior ensayo de fusion post-amplificacion se describen en la patente US n° 6.472.156. El numero de dianas detectables mediante dicho metodo es un producto del numero de longitudes de onda detectables y el numero de perfiles de fusion distinguibles. Por lo tanto, la adicion de un ensayo de fusion a la deteccion de color fue un avance en la capacidad de detectar multiples dianas.

El ensayo de fusion post-amplificacion es el utilizado mas comunmente con fines cualitativos, es decir para identificar los acidos nucleicos diana, ver las patentes US n° 6.174.670, n° 6.427.156 y n° 5.871.908. Es conocida la obtencion de un pico de fusion mediante la diferenciacion de la funcion de la curva de fusion. Ririe et al. ("Product differentiation by analysis of DNA melting curves during the polymerases chain reaction", Anal. Biochem. 245:154-160, 1997) observaron que la diferenciacion ayuda a resolver curvas de fusion generadas por mezclas de productos. Tras la diferenciacion, los picos de fusion generados por cada componente de la mezcla se tornan facilmente distinguibles. Tambien era conocido previamente que la senal de fusion post-amplificacion, es decir, el pico de fusion, era mas elevada en proporcion a la cantidad de acido nucleico en la muestra. Por ejemplo, la patente US n° 6.245.514 ensena un ensayo de fusion post-amplificacion que utiliza un pigmento intercalante de duplex para generar un pico de fusion de derivado, seguido de la integracion del pico utilizando software propietario. La integracion proporciona informacion sobre la eficiencia de la amplificacion y la cantidad relativa del acido nucleico amplificado.

El documento n° WO 00/18965 da a conocer metodos de genotipado multiplex utilizando juegos de sondas de hibridacion fluorescente (FRET), en los que cada juego de sondas se hibrida con diferentes loci geneticos y presenta una temperatura de fusion diferente y en el que los juegos de sondas se marcan con la misma pareja de resonancia fluorescente. Se llevo a cabo un analisis de las curvas de fusion para determinar cualitativamente el acido nucleico diana, mientras que no puede llevarse a cabo ninguna cuantificacion del acido nucleico diana. En el documento n° WO 2004/074447 se dan a conocer metodos para el analisis multiplex de muestras polinucleotidas que utilizan parejas de sondas inhibidoras de senal espedficas de secuencia que presentan temperaturas de fusion relativa diferentes que no requieren la utilizacion de diferentes marcajes distinguibles. Se llevo a cabo un analisis de las curvas de fusion para determinar cualitativamente el acido nucleico diana, mientras que no puede llevarse a cabo ninguna cuantificacion del acido nucleico diana. El documento n° US 2006/0177841 da a conocer un metodo no simetrico de amplificacion y deteccion (LATE-PCR) para el analisis de multiples amplicones, en el que en la reaccion se encuentran presentes una o mas sondas de deteccion de baja temperatura marcados con el mismo fluoroforo y que presentan temperaturas de fusion diferentes para cada diana. Se llevo a cabo un analisis de las curvas de fusion para determinar cualitativamente el acido nucleico diana, mientras que no puede llevarse a cabo ninguna cuantificacion de cada acido nucleico diana en el caso de que se encuentren presentes multiples dianas.

Zhang et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther. 311(1):373-81, 2004) dan a conocer un metodo para la medicion de la expresion e identificacion alelicas relativas que comprende llevar a cabo una srntesis de ADNc de primera cadena, una primera RT-PCR, una PCR anidada seguida de un analisis de curvas de fusion utilizando sondas marcadas fluorescentemente espedficas de alelo. Se calcula la proporcion de altura de picos de los dos alelos para obtener la proporcion de moldes basandose en curvas estandares. Sin embargo, el metodo no resulta adecuado para aplicaciones multiples y podna detectar unicamente la proporcion entre dos alelos de un acido nucleico diana.

En la practica resultana deseable avanzar mas alla de un ensayo cualitativo y poder cuantificar multiples dianas en la misma muestra (ver, por ejemplo, Sparano et al., "Development of the 21-gene assay and its application in clinical practice and clinical trials", J. Clin. Oncol. 26(5):721-728, 2008). La capacidad de cuantificar la cantidad de diana resulta util en aplicaciones clmicas, tales como la determinacion de la carga vmca en el suero del paciente, la medicion del nivel de expresion de un gen en respuesta a la terapia farmacologica o la determinacion de la firma molecular de un tumor para predecir su respuesta a la terapia.

En un ensayo de PCR en tiempo real, la senal generada por la sonda marcada es proporcional a la cantidad de acido nucleico diana de entrada. Cuanto mayor es la entrada, antes cruza la senal fluorescente un valor umbral (Ct) predeterminado. Por lo tanto, pueden determinarse cantidades relativas o absolutas del acido nucleico diana mediante la comparacion de las muestras entre sf o respecto a una muestra de control con una cantidad conocida de acido nucleico. Sin embargo, los metodos actuales son limitados en su capacidad de cuantificar simultaneamente multiples dianas. Al igual que con la deteccion cualitativa de multiples dianas, el factor limitantes es el detector optico. Tal como se ha explicado anteriormente, la tecnologfa optica del estado de la tecnica no puede obtener senales diferentes de

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mas de cuatro sondas marcadas fluorescentemente separadas en el mismo tubo. La tecnolog^a que ahora se desarrolla promete la deteccion de no mas de seis marcajes separados. Por lo tanto, se requiere un enfoque experimental radicalmente diferente que permita tanto la amplificacion, la deteccion y la cuantificacion de numerosas dianas de acidos nucleicos durante la PCR en tiempo real.

DESCRIPCION RESUMIDA DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a un metodo para la amplificacion mediante PCR en tiempo real multiplex, la deteccion y la cuantificacion simultaneas de uno o mas acidos nucleicos diana en un unico recipiente de muestra, que comprende las etapas de poner en contacto una muestra que se sospecha que contiene uno o mas acidos nucleicos diana, con por lo menos un juego de sondas oligonucleotidas, en el que cada sonda oligonucleotida dentro del juego esta marcada con la misma fraccion o fracciones informadoras, en el que cada una de dichas sondas oligonucleotidas marcadas es suficientemente complementaria respecto a por lo menos una subsecuencia de por lo menos un acido nucleico diana y es capaz de unirse al acido nucleico diana correspondiente con una temperatura de fusion diferente de las temperaturas de fusion de las otras sondas oligonucleotidas marcadas en el mismo juego; amplificar los acidos nucleicos diana en la muestra en un ciclo de reaccion de amplificacion que incluye un intervalo de cambio de temperatura, y representar en un grafico la primera derivada de dicha emision lummica a lo largo de por lo menos dicha porcion del intervalo de cambio de temperatura; determinar el valor maximo de dicha derivada; repetir las etapas anteriormente indicadas multiples veces y representar en un grafico los valores maximos de dicha derivada frente al numero de ciclos o el numero de repeticiones, y determinar el numero de ciclos o el numero de repeticiones en el que se alcanza un valor umbral predeterminado de dicho valor maximo determinado de la derivada, cuantificando de esta manera la cantidad relativa de dicho acido nucleico diana, en el que dicha reaccion de amplificacion mediante PCR en tiempo real multiplex, deteccion y cuantificacion simultaneas comprende la deteccion de por lo menos dos secuencias diana diferentes, comprendiendo la amplificacion con parejas separadas de cebadores de amplificacion para cada secuencia diana y la deteccion utilizando una sonda oligonucleotida separada para cada secuencia diana o la amplificacion utilizando una pareja de cebadores de amplificacion y la deteccion utilizando mas de una sonda oligonucleotida para cada secuencia amplificada. En determinadas realizaciones del metodo, un acido nucleico de control de concentracion conocida se somete a las etapas anteriormente indicadas simultaneamente con dichos acidos nucleicos diana y el valor determinado para cada acido nucleico diana se compara con el valor determinado para el acido nucleico de control, determinando de esta manera la cantidad absoluta de cada uno de dichos acidos nucleicos diana. En determinados aspectos, cada uno de dichos oligonucleotidos se marca con una unica fraccion informadora, en la que en aspectos particulares dicha fraccion informadora es fluorescente. En otras realizaciones, cada uno de dichos oligonucleotidos se marca con una fraccion informadora y una fraccion inhibidora, en el que dicha fraccion informadora y dicha fraccion inhibidora en aspectos particulares son fluoroforos. En otra realizacion, dicha fraccion informadora es un fluoroforo y dicha fraccion inhibidora es un inhibidor oscuro. En todavfa otra realizacion, la fraccion informadora y la inhibidora estan separadas por un sitio de corte de nucleasa. En otro aspecto, el metodo puede multiplexarse adicionalmente mediante la utilizacion de varios juegos de oligonucleotidos, estando marcado cada juego de oligonucleotidos con una fraccion informadora separada, hasta el numero de fracciones distinguibles por el instrumento de deteccion.

Se da a conocer ademas una mezcla de reaccion para la amplificacion, deteccion y cuantificacion de uno o mas acidos nucleicos diana en un unico recipiente para muestras que comprende por lo menos un juego de oligonucleotidos, estando marcado cada oligonucleotido con la misma o mismas fracciones informadoras, en el que cada uno de dichos oligonucleotidos marcados es suficientemente complementario a por lo menos una subsecuencia de por lo menos un acido nucleico diana y es capaz de unirse al acido nucleico diana correspondiente con una temperatura de fusion diferente de las temperaturas de fusion de los demas oligonucleotidos marcados en el mismo juego y por lo menos un reactivo necesario para la amplificacion de los acidos nucleicos diana. En determinados aspectos, cada uno de dichos oligonucleotidos se marca con una unica fraccion informadora. En otro aspecto, cada uno de dichos oligonucleotidos se marca con una fraccion informadora y una fraccion inhibidora, en el que en determinados aspectos dicha fraccion informadora es un fluoroforo y dicha fraccion inhibidora es un inhibidor oscuro. En todavfa otro aspecto, la mezcla de reaccion comprende ademas un acido nucleico de control de concentracion conocida.

Se da a conocer ademas un kit para la amplificacion, deteccion y cuantificacion de uno o mas acidos nucleicos diana en un unico recipiente para muestras que comprende por lo menos un juego de oligonucleotidos, estando marcado cada oligonucleotido con la misma o mismas fracciones informadoras, en el que cada uno de dichos oligonucleotidos marcados es suficientemente complementario a por lo menos una subsecuencia de por lo menos un acido nucleico diana y es capaz de unirse al acido nucleico diana correspondiente con una temperatura de fusion diferente de las temperaturas de fusion de los demas oligonucleotidos marcados en el mismo juego y por lo menos un reactivo necesario para la amplificacion de los acidos nucleicos diana. En determinados aspectos, el kit comprende ademas reactivos para la prevencion de la contaminacion cruzada de reacciones de amplificacion. En todavfa otro aspecto, el kit comprende ademas un acido nucleico de control de concentracion conocida.

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BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La figura 1 es un diagrama de etapas del metodo de la presente invencion.

La figura 2 muestra los resultados del metodo de la presente invencion tal como se aplica a la secuencia diana de acidos nucleicos SENP1 y descrita en el Ejemplo 1.

La figura 3 muestra los resultados del metodo de la presente invencion tal como se aplica a la secuencia diana de acidos nucleicos PPP1CA y descrita en el Ejemplo 1.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

Definiciones

Las definiciones siguientes se aplican a los terminos utilizados en toda la solicitud.

Una "PCR asimetrica" es una PCR en la que las cantidades de los dos cebadores de amplificacion no son iguales. El cebador presente en una cantidad superior se denomina "cebador en exceso" y el cebador presente en una cantidad inferior se denomina "cebador limitante". La cadena resultante de la extension del cebador en exceso se acumula en exceso y se denomina "la cadena en exceso". La otra cadena, resultante de la extension del cebador limitante, se acumula en cantidades inferior y se denomina "la cadena limitante".

Un "cromoforo" es un compuesto o una fraccion unida, por ejemplo, a un acido nucleico, que es capaz de una absorcion selectiva de la luz, resultando en coloracion. Un cromoforo puede emitir o no radiacion lummica al ser excitado.

Un "pigmento fluorescente" o un "fluoroforo" es un compuesto o una fraccion unida, por ejemplo, a un acido nucleico, que es capaz de emitir radiacion lummica al excitarlo con una luz de una longitud de onda adecuada. Entre los pigmentos fluorescentes tfpicos se incluyen los pigmentos de rodamina, los pigmentos de cianina, los pigmentos de fluorescema y los pigmentos BODIPY®. Un fluoroforo es un cromoforo fluorescente.

El termino "FRET" o "transferencia de energfa de resonancia fluorescente" o "transferencia de energfa de resonancia de Foerster" se refiere a una transferencia de energfa entre por lo menos dos cromoforos, un cromoforo donante y un cromoforo aceptor (denominado inhibidor). El donante tfpicamente transfiere la energfa al aceptor cuando el donante es excitado por radiacion lummica de una longitud de onda adecuada. El aceptor tfpicamente reemite la energfa transferida en forma de radiacion lummica con una longitud de onda diferente. En el caso de que el aceptor sea un inhibidor "oscuro", disipa la energfa transferida en una forma que no es luz. Que un fluoroforo particular actue como donante o aceptor depende de las propiedades del otro elemento de la pareja FRET. Entre las parejas de donante-aceptor utilizadas comunmente se incluyen la pareja FAM-TAMRA. Son inhibidores utilizados comunmente, DABCILO y TAMRA. Entre los inhibidores oscuros utilizados comunmente se incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Cal.), Iowa Black™, Integrated DNA Tech., Inc. (Coralville, Iowa), BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650), Berry & Assoc. (Dexter, Mich.). Entre las parejas de donante-aceptor utilizadas comunmente se incluyen la pareja FAM-BHQ.

Una "curva de crecimiento" en el contexto de un ensayo de amplificacion de acidos nucleicos es un grafico de una funcion en el que una variable independiente es el numero de ciclos de amplificacion y una variable dependiente es un parametro medible dependiente de la amplificacion medido en cada ciclo de amplificacion. Tfpicamente, el parametro medible dependiente de la amplificacion es la cantidad de fluorescencia emitida por la sonda con la hibridacion, o con la hidrolisis de la sonda por la actividad de nucleasa de la acido nucleico polimerasa; ver Holland et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88:7276-7280, 1991, y la patente US n° 5.210.015. En una reaccion en cadena de la polimerasa tfpica, una curva de crecimiento comprende un segmento de crecimiento exponencial seguido de una meseta. Una curva de crecimiento tfpicamente se caracteriza por un valor de "ciclos hasta umbral" o valor "Ct", que es el numero de ciclos con los que se alcanza una magnitud predeterminada del parametro medible. Un valor de Ct mas bajo representa un completado mas rapido de la amplificacion, mientras que un valor de Ct mas alto representa un completado mas lento de la amplificacion. En el caso de que la eficiencia de amplificacion sea similar, el valor de Ct mas bajo refleja la cantidad inicial mas alta del acido nucleico diana, mientras que el valor de Ct mas alto refleja la cantidad inicial mas baja del acido nucleico diana. En el caso de que se utilice un acido nucleico de control de concentracion conocida, resulta posible determinar la cantidad absoluta del acido nucleico diana mediante la comparacion de los valores de Ct de los acidos nucleicos diana y de control.

Un "inicio en caliente" en el contexto de una reaccion de amplificacion de acidos nucleicos es un protocolo en el que se omite de la mezcla de reaccion por lo menos un reactivo cntico (o, en caso de hallarse presente en la mezcla de reaccion, el reactivo se mantiene inactivo) hasta que la temperatura se eleva suficientemente para proporcionar la especificidad de hibridacion necesaria del cebador o cebadores. Un "enzima de inicio en caliente" es un enzima, tfpicamente una polimerasa de acidos nucleicos, capaz de actuar como el reactivo "omitido" o inactivo en un protocolo de inicio en caliente.

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La "hibridacion" es una interaccion entre dos acidos nucleicos habitualmente de cadena sencilla o por lo menos parcialmente de cadena sencilla. La hibridacion se produce como resultado del apareamiento de bases entre nucleobases e implica procesos ffsicoqmmicos tales como la formacion de enlaces de hidrogeno, la exclusion de solvente, el apilamiento de bases y similares. La hibridacion puede producirse entre cadenas de acidos nucleicos totalmente complementarias o parcialmente complementarias. La capacidad de acidos nucleicos de hibridarse esta influida por la temperatura y otras condiciones de hibridacion, las cuales pueden manipularse con el fin de que se produzca la hibridacion de acidos nucleicos incluso parcialmente complementarios. La hibridacion de acidos nucleicos es bien conocida de la tecnica y ha sido extensamente descrita en Ausubel (editores) Current Protocols in Molecular Biology, v. I, II y III, 1997.

Un "marcaje" se refiere a una fraccion unida (covalente o no covalentemente) a una molecula, la cual es capaz de proporcionar informacion sobre la molecula. Entre los marcajes ejemplares se incluyen marcajes fluorescentes, marcajes radioactivos y grupos modificadores de la masa.

La expresion "acido nucleico" se refiere a polfmeros de nucleotidos (por ejemplo ribonucleotidos y desoxirribonucleotidos, tanto naturales como no naturales), siendo dichos polfmeros de ADN, ARN y sus subcategonas, tales como ADNc, ARNm, etc. Un acido nucleico puede ser de cadena sencilla o de doble cadena y generalmente contiene enlaces fosfodiester 5'-3', aunque en algunos casos, los analogos de nucleotido pueden presentar otros enlaces. Los acidos nucleicos pueden incluir bases naturales (adenosina, guanosina, citosina, uracilo y timidina), asf como bases no naturales. El ejemplo de bases no naturales incluye las indicadas en, por ejemplo, Seela et al. Helv. Chim. Acta 82:1640, 1999. Determinadas bases utilizadas en analogos de nucleotidos actuan como modificadores de la temperatura de fusion (Tf). Por ejemplo, entre algunas de ellas se incluyen las 7-deazapurinas (por ejemplo 7-deazaguanina, 7-deazaadenina, etc.), pirazolo[3,4-d]pirimidinas, propinil-dN (por ejemplo propinil-du, propinil-dC, etc.) y similares (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.990.303). Entre otras bases heterodclicas representativas se incluyen, por ejemplo, hipoxantina, inosina, xantina, derivados 8-aza de 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina, derivados 7-deaza-8-aza de adenina, guanina, 2-aminopurina, 2,6-diaminopurina, 2-amino-6-cloropurina, hipoxantina, inosina y xantina, 6-azacitidina, 5-fluorocitidina, 5-clorocitidina, 5-yodocitidina, 5-bromocitidina, 5-metilcitidina, 5-propinilcitidina, 5-bromoviniluracilo, 5-fluorouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, 5-bromouracilo, 5-trifluorometiluracilo, 5-metoximetiluracilo, 5-etiniluracilo, 5-propiniluracilo y similares.

La expresion "polimerasas de acidos nucleicos" o simplemente "polimerasas" se refiere a enzimas, por ejemplo ADN polimerasas, que catalizan la incorporacion de nucleotidos en un acido nucleico. Entre las ADN polimerasas termoestables ejemplares se incluyen las propias de Thermus thermophilus, Thermus caldophilus, Thermus sp. Z05 (ver, por ejemplo, la patente US n° 5.674.738), Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Deinococcus radiodurans, Hot Spring family B/clone 7, Bacillus stearothermophilus, Bacillus caldotenax, Escheria coli, Thermotoga maritima, Thermotoga neapolitana y Thermosipho africanus. Se encuentran disponibles las secuencias de acidos nucleicos y de aminoacidos completas para numerosas ADN polimerasas termoestables en las bases de datos publicas.

La expresion "actividad de nucleasa 5' a 3'" o "actividad de nucleasa 5'-3'" se refiere a una actividad de una acido nucleico polimerasa, tipicamente asociada a la smtesis de cadenas de acidos nucleicos, en la que se extraen nucleotidos del extremo 5' de la cadena de acidos nucleicos, por ejemplo la ADN polimerasa I de E. coli presenta esta actividad, mientras que el fragmento Klenow no la presenta.

Las expresiones "acido nucleico polimerasa que no presenta sustancialmente la actividad de nucleasa 5'-3'" o el "enzima deficiente en nucleasa 5'-3'" o, en aras de la simplicidad, "enzima deficiente en nucleasa" se refieren a una polimerasa que presenta 50% o menos de la actividad 5'-3' de la ADN polimerasa Taq. Los metodos para medir la actividad de nucleasa 5'-3' y las condiciones para la medicion han sido descritas en la patente US n° 5.466.591. Entre los ejemplos de polimerasas que no presentan actividad de nucleasa 5'-3' se incluyen el fragmento Stoffel de la ADN polimerasa Taq (patente US n° 5.466.591), mutantes de ADN polimerasa de Thermus africanus (patente US n° 5.968.799), mutantes de la ADN polimerasa de Thermotoga maritima (patentes US n° 5.624.833 y n° 5.420.029), mutantes de las ADN polimerasas de Thermus especie sps17 y Thermus especie Z05 (patentes US n° 5.466.591 y 5.405.774). Los enzimas deficientes en nucleasa 5'-3' tambien pueden ser quimeras, es decir, protemas quimericas, compuestas de dominios derivados de mas de una especie y que presentan mutaciones que eliminan la actividad de nucleasa 5'-3' (patentes US n° 5.795.762 y 6.228.628).

Un "oligonucleotido" se refiere a un acido nucleico corto, tfpicamente de diez o mas nucleotidos de longitud. Los oligonucleotidos se preparan mediante cualquier metodo adecuado de la tecnica, por ejemplo, smtesis qrnmica directa tal como se indica en Narang et al., Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979; Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979; Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981; Matteucci et al., J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981, o cualquier otro metodo conocido de la tecnica.

Un "cebador" es un oligonucleotido que es capaz de actuar como punto de inicio de la extension conjuntamente con una cadena complementaria de un acido nucleico molde. Un cebador que es por lo menos parcialmente

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complementary a una subsecuencia de un acido nucleico molde tipicamente resulta suficiente para hibridarse con el acido nucleico molde para que pueda producirse la extension.

Una "extension de cebador" se refiere a una reaccion qmmica en la que se han anadido uno o mas nucleotidos al cebador.

Una "sonda" se refiere a un oligonucleotido marcado que forma una estructura duplex con una secuencia en la secuencia diana, debido a una complementariedad por lo menos parcial de la sonda y la secuencia diana.

Un "molde" o "diana" se refiere a un acido nucleico que debe amplificarse, detectarse y cuantificarse. La diana o molde es una secuencia con la que puede hibridarse un cebador o una sonda. Los acidos nucleicos diana pueden obtenerse de esencialmente cualquier fuente, incluyendo microorganismos, mezclas biologicas complejas, tejidos, lfquidos corporales, sueros, muestras biologicas conservadas, aislados ambientales, preparaciones in vitro o similares. El molde o diana puede constituir la totalidad o una parte de una molecula de acidos nucleicos.

Una "acido nucleico polimerasa termoestable" o "polimerasa termoestable" es un enzima polimerasa que es relativamente estable a temperaturas elevadas al compararse con, por ejemplo, enzimas de E. coli. Tal como se utiliza en la presente memoria, una polimerasa termoestable resulta adecuada para la utilizacion bajo condiciones de ciclado termico tfpicas de la reaccion en cadena de la polimerasa ("PCR").

Una "temperatura de fusion" o "Tf" se refiere a la temperatura a la que la mitad de uan poblacion de moleculas de acidos nucleicos de doble cadena (duplex), en homoduplex o heteroduplex, se disocia en cadenas sencillas. La Tf de un acido nucleico duplex resulta afectada por la fuerza ionica y el pH de la solucion, asf como la concentracion, composicion de bases y estructura secundaria del acido nucleico mismo. La Tf de un duplex bajo unas condiciones dadas puede determinarse experimentalmente o predecirse con ayuda de software comercial, tal como Visual OMP™ (DNA Software, Inc., Ann Arbor, Mich.). Un "ensayo de fusion" o simplemente "fusion" es un ensayo en el que puede determinarse la temperatura de fusion (Tf). En dicho ensayo, se calienta una molecula duplex de acidos nucleicos en un programa de temperatura controlada y se monitoriza la disociacion del duplex en cadenas sencillas mediante la medicion de un parametro, tal como la fluorescencia, que cambia con la disociacion del duplex. Los datos de fusion pueden representarse como una "curva de fusion", es decir, un grafico de la fluorescencia como funcion de la temperatura (F vs. T). Los datos de fusion tambien pueden representarse como un "pico de fusion", es decir, un grafico de la tasa de cambio de la fluorescencia en un intervalo de temperaturas como funcion de la temperatura (dF/dT vs. T) o (-dF/dT vs. T), que tfpicamente presenta una forma parabolica. La Tf del duplex se representa en un pico de fusion como el valor de temperatura (T) en el maximo de la parabola (dF/dT vs. T) o (-dF/dT vs. T).

Entre los "reactivos necesarios para la amplificacion de los acidos nucleicos diana" se incluyen, aunque sin limitacion, los materiales para la amplificacion del acido nucleico diana, tales como por lo menos un acido nucleico cebador, una solucion tamponadora, nucleotidos, sales, acido nucleico polimerasas, etc. Cada uno de dichos reactivos puede encontrarse presente separadamente en un unico vial o como solucion madre premezclada o liofilizado.

La presente invencion es un metodo de amplificacion, deteccion y cuantificacion multiplex simultaneas de acidos nucleicos diana. El metodo comprende PCR en tiempo real, en combinacion con analisis de fusion. El metodo utiliza multiples sondas marcadas con la misma fraccion informadora, aunque cada una presenta una unica temperatura de fusion de duplex. Debido a que pueden identificarse las sondas por su temperatura de fusion y no solo por su marcaje fluorescente, pueden marcarse varias sondas en el mismo recipiente de reaccion con la misma fraccion de marcaje. El ensayo puede multiplexarse adicionalmente mediante la utilizacion de varios juegos de sondas, estando marcado cada juego con una fraccion informadora separada, hasta el numero de fracciones distinguibles por el instrumento de deteccion.

El metodo de la presente invencion implica la generacion de senales de fusion (curvas de fusion) producidas por cada sonda durante la amplificacion. Las funciones de curva de fusion pueden diferenciarse en funciones derivadas o "picos de fusion". Para cada pico de fusion se mide el valor del maximo del pico de fusion. La magnitud del maximo del pico de fusion es proporcional a la cantidad de la secuencia diana y su amplicon en la mezcla de reaccion. Al registrar los maximos de los picos de fusion durante los ciclos de la amplificacion representados frente al numero de ciclos, la serie de los valores de maximo de pico de fusion generan una curva de amplificacion de apariencia similar a las curvas de amplificacion generadas en los ensayos de PCR de tiempo real tradicionales. Cada sonda marcada es capaz de generar un perfil de fusion unico distinguible de los perfiles de fusion de otras sondas. De esta manera, cada sonda proporciona datos cuantitativos independientes para cada diana. La cuantificacion relativa se lleva a cabo mediante la determinacion de Cm, el ciclo en el que un pico de fusion dado alcanza un umbral predeterminado. Una Cm anterior (inferior) indica una concentracion de entrada superior del acido nucleico diana, mientras que una Cm posterior (superior) indica una concentracion de entrada mas baja del acido nucleico diana. El umbral predeterminado se fijo experimentalmente para cada acido nucleico diana. Tfpicamente el umbral es el nivel fluorescente de un pico de fusion en el momento en que se hace detectable.

Al amplificar y detectar en el mismo ensayo un acido nucleico de control de concentracion conocida, resulta posible

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determinar la cantidad de entrada absoluta del acido nucleico diana mediante la comparacion de los valores de Cm de los acidos nucleicos diana y de control.

En comparacion con la PCR en tiempo real multiplex tradicional que utiliza sondas marcadas fluorescentemente, el metodo de la presente invencion presenta capacidades multiplex mas amplias. Un ensayo de PCR en tiempo real tradicional se encuentra limitado por la incapacidad del detector de separar mas de unas cuantas longitudes de onda. En la presente invencion, la capacidad de multiplexar se expande mediante la medicion de multiples picos de fusion diferentes a cualquier longitud de onda dada.

En un aspecto, la presente invencion utiliza un ensayo de fusion para expandir la capacidad de multiplexado de la PCR en tiempo real cuantitativa. Concretamente, el ensayo de la presente invencion es una version multiplex de la PCR en tiempo real que permite la amplificacion, deteccion y cuantificacion simultaneas de multiples secuencias de acidos nucleicos diana en el mismo tubo, utilizando multiples sondas, marcadas con el mismo marcaje fluorescente. Las sondas se detectan dentro del mismo canal de longitud de onda pero se distinguen por su temperatura de fusion unica.

Tal como se muestra en la figura 1, el metodo de la presente invencion se inicia con la amplificacion de varias secuencias diana de acidos nucleicos en el mismo recipiente de reaccion. Cada tubo contiene uno o mas juegos de sondas oligonucleotidas, estando marcado cada juego de sondas oligonucleotidas con el mismo informador fluorescente. Sin embargo, dentro del juego de sondas oligonucleotidas, cada sonda oligonucleotida se caracteriza por una temperatura de fusion unica con su acido nucleico diana. Para la capacidad multiplex maxima, se encuentran presentes varios juegos de sondas en el mismo recipiente de reaccion.

Tras una ronda de amplificacion, el acido nucleico diana puede someterse a la etapa d efusion tal como se indica posteriormente con el fin de generar una curva de fusion para cada duplex de sonda-diana. Cada curva de fusion (fluorescencia en el intervalo de temperatura, o F vs. T) se diferencia y se convierte en una curva de pico de fusion en el intervalo de temperaturas (dF/dT), para el que se calcula un valor de "maximo de pico de fusion" (dF/dT en T=Tf). Tras ciclos repetidos de amplificacion y fusion, se acumula un conjunto de valores de "max. de pico de fusion" para cada complejo de diana-sonda. Los valores de max. de pico de fusion se representan frente al numero de ciclos para generar una curva de crecimiento para cada acido nucleico diana. Se obtiene para cada diana una curva de crecimiento similar a las curvas de crecimiento tfpicas obtenidas en los ensayos de PCR en tiempo real.

En algunas realizaciones, pueden disenarse una o mas sondas para que presenten una temperatura de fusion inferior a la temperatura de hibridacion utilizada en la amplificacion. Dicha sonda no generana una curva de crecimiento de PCR en tiempo real "tradicional". Sin embargo, dicha sonda resultana util para generar una curva de crecimiento segun la presente invencion.

La secuencia de acidos nucleicos diana amplificada, detectada y cuantificada mediante el metodo de la presente invencion puede presentar cualquier longitud. Tfpicamente, el acido nucleico diana presenta una longitud de entre 100 y 1.000 nucleotidos. Sin embargo, tambien pueden utilizarse secuencias diana mas largas (varios miles de nucleotidos) o mas cortas (entre 50 y 100 nucleotidos) en algunas realizaciones de la presente invencion. Una secuencia de acidos nucleicos diana puede estar contenida dentro de una molecula de acidos nucleicos de mayor tamano, asilada a partir de una fuente de muestras natural o derivada de laboratorio.

Aunque la presente exposicion generalmente comenta la invencion como si hubiera multiples dianas presentes en la muestra, se apreciara que en algunas realizaciones solo se encuentra presente una secuencia diana en una muestra. En una realizacion tfpica de la presente invencion, se lleva a cabo una reaccion "multiplex" en la que se detectan por lo menos dos y hasta dieciseis o mas secuencias diana diferentes. Estas realizaciones generalmente, aunque no siempre, implican la utilizacion de una pareja separada de cebadores de amplificacion y una sonda separada para cada secuencia diana. Sin embargo, en algunas realizaciones, el mismo acido nucleico, que se amplifica utilizando la misma pareja de cebadores, puede detectarse con mas de una sonda. Lo anterior resulta ventajoso en el caso de que una unica secuencia contenga varias dianas o loci de interes, por ejemplo varios sitios de mutacion potenciales. Cada sonda podra detectar y cuantificar la mutacion en cada sitio.

Los cebadores de amplificacion de la presente invencion son oligonucleotidos por lo menos parcialmente complementarios a por lo menos una de las variantes existentes de la secuencia diana. La longitud del cebador puede estar comprendida entre 6 y 100 nucleotidos, aunque la mayona de cebadores tfpicamente presenta entre 15 y 35 nucleotidos. Los metodos para optimizar los cebadores para la amplificacion de acidos nucleicos se han descrito en, por ejemplo, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et al., editores, 1990, Academic Press. Tfpicamente, los cebadores son oligonucleotidos sinteticos, compuestos de los nucleotidos A, C, G y T. Sin embargo, tambien pueden utilizarse en los cebadores nucleotidos bases no convencionales que pueden incorporarse en los acidos nucleicos. Por ejemplo, es conocido que determinadas bases modificadas incrementan la especificidad de la amplificacion; ver la patente US n° 6.001.011.

Se conocen de la tecnica diversas acido nucleico polimerasas termoestables. Puede utilizarse cualquier acido nucleico polimerasa termoestable en el metodo de la presente invencion. En ocasiones resulta ventajoso utilizar una polimerasa

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que no presente actividad de nucleasa 5'-3'. En ocasiones resulta deseable utilizar una polimerasa sin actividad correctora de errores (exonucleasa 3'-5'). En ocasiones tambien puede resultar deseable disponer de un enzima con una capacidad de "inicio en caliente", tal como los enzimas reversiblemente modificados que se indican en las patentes US n° 5.677.152 y n° 5.773.528. El diseno de sondas de hibridacion es conocido de la tecnica. La misma sonda puede servir de sonda de hibridacion o sonda de fusion, o ambas. Este la sonda destinada a ser una sonda de fusion, una unica sonda de hibridacion o un miembro de una pareja de sondas de hibridacion, el diseno de la sonda oligonucleotido esta guiado por los mismos principios, conocidos de la tecnica y descritos en la presente memoria. Estos principios pueden aplicarse manualmente o con ayuda de software.

En la presente invencion, se encuentra presente mas de una sonda en la mezcla de reaccion sometida a un ensayo de fusion. El experto en la materia reconocera inmediatamente los criterios de diseno aplicables a las sondas de fusion utiles en los ensayos multiplex. Concretamente, las sondas capaces de ser utilizadas en la misma mezcla de reaccion debenan disenarse para que presenten una temperatura de fusion tubrida diferente con sus secuencias diana correspondientes.

Las sondas oligonucleotidas pueden marcarse mediante la incorporacion de uno o mas cromoforos. Puede utilizarse un unico cromoforo, que es un fluoroforo, tal como se indica en la solicitud de patente US n° de serie 12/330.694, presentada el 9 de diciembre de 2008. En el caso de que se utilicen dos cromoforos, uno tipicamente es un cromoforo informador y el otro es un inhibidor. Ambos cromoforos pueden ser fluoroforos o uno de los cromoforos puede ser un inhibidor no fluorescente. Entre los ejemplos de fluoroforos adecuados se incluyen pigmentos de la familia de la fluorescema (FAM, HEX, TET, JOE, NaNa y ZOE), de la familia de la rodamina (rojo Texas, ROX, R110, R6G y TAMRA), de la familia de la cianina (Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7), de la familia de la coumarina, de la familia de la oxazina, de la familia de la tiazina, de la familia de la escuarama y de otras familias de pigmentos fluorescentes adecuados para el marcaje y deteccion de acidos nucleicos. El segundo cromoforo puede incorporarse en la misma sonda oligonucleotido o en una sonda oligonucleotida separada. Entre los inhibidores oscuros utilizados comunmente se incluyen BlackHole Quenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™ (Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa) y BlackBerry™ Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.).

La presente invencion implica la cuantificacion del acido nucleico diana en un ensayo de PCR en tiempo real. Tal como en el ensayo de PCR en tiempo real tradicional, se genera una curva de crecimiento de amplificacion para cada diana. La curva se genera mediante la medicion de una senal dependiente de la amplificacion detectable durante cada ciclo de la amplificacion. La presente invencion puede medir una nueva senal dependiente de la amplificacion, no utilizada previamente para generar curvas de crecimiento. Concretamente, el metodo de la presente invencion mide una senal de fusion, es decir, una senal generada en un ensayo de fusion con el fin de generar curvas de crecimiento.

En el ensayo de fusion del metodo de la presente invencion, se forma un tubrido entre el ADN diana y una o mas sondas marcadas. Tfpicamente, la sonda o sondas oligonucleotidas se marcan con una o mas fracciones de cromoforo, de entre las que por lo menos un cromoforo es un fluoroforo. El cambio de temperatura que resulta en la fusion o en la formacion del tubrido de molde-sonda se ve acompanado de un cambio medible de fluorescencia emitida por la sonda oligonucleotida al ser excitada por luz de longitud de onda apropiada.

En algunas realizaciones, la sonda se marca con dos cromoforos, formando una pareja FRET. En algunas realizaciones ambos cromoforos son fluoroforos. En otras realizaciones, un cromoforo es un inhibidor no fluorescente. Los cromoforos que forman la pareja FRET pueden conjugarse con las mismas moleculas de sonda o moleculas separadas. La utilizacion de sondas FRET en un ensayo de fusion ha sido descrita en la patente US n° 6.174.670 y en De Silva et al., "Rapid genotyping and quantification on the LightCycler™ with hybridization probes," Biochemica, 2:12-15, 1998. En otras realizaciones, la sonda esta marcada con un unico cromoforo que interactua con un segundo cromoforo conjugado o intercalado en el acido nucleico diana (ver la patente US n° 5.871.908).

Segun los metodos existentes, se lleva a cabo un unico ensayo de fusion tras completar todos los ciclos de amplificacion. Esta tecnologfa se denomina comunmente "fusion post-amplificacion". Sin embargo, la presente invencion ensena la incorporacion de un ensayo de fusion en los ciclos de la PCR. Lo anterior implica anadir una etapa de fusion al perfil de temperaturas de un ciclo de PCR. Una etapa de fusion tfpica implica una incubacion a 95°C (para desnaturalizar los amplicones de doble cadena), seguido de la reduccion de la temperatura a 40°C (para permitir la hibridacion de la sonda de fusion) e incrementar seguidamente la temperatura nuevamente (para la fusion del duplex de sonda-molde). Se observo que la senal de fusion era pobre en las primeras rondas de amplificacion. Este fenomeno probablemente se debe a las cantidades insuficientes de acido nucleico diana presente en las etapas tempranas de la amplificacion. Por lo tanto, resulta practico incorporar etapas de fusion en los ciclos de amplificacion una vez ha tenido lugar un numero sustancial de ciclos de amplificacion.

En un ensayo de PCR en tiempo real tradicional con sondas oligonucleotidas fluorescentes, se detecta la fluorescencia en la etapa de hibridacion de cada ciclo. En la presente invencion, los datos fluorescentes se adquieren continuamente durante una parte seleccionada de la etapa de fusion. De esta manera, cada ronda de fusion del duplex de sonda-diana rinde una curva de fusion y un pico de fusion. La diferenciacion de las curvas de fusion para obtener picos de fusion ha sido descrita en, por ejemplo, la patente US n° 6.472.156. Para cada pico de fusion, la senal de fusion se

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define como la altura del pico de fusion o "max. de pico de fusion", cuando la temperatura alcanza la temperature de fusion del duplex (T=Tf). La altura del pico de fusion es proporcional a la cantidad del duplex formada entre la sonda de fusion y el amplicon diana y esta es proporcional a la cantidad del amplicon diana en la muestra. Por lo tanto, el ciclo en el que un pico de fusion dado alcanza un umbral predeterminado (Cm) refleja la cantidad inicial de acido nucleico diana. Las alturas de los picos de fusion (valores de max. de pico de fusion) medidos en cada ciclo se representan frente a los ciclos de amplificacion. Tal como puede observarse en las figuras 2 y 3, el grafico resultante es similar a la curva de crecimiento de PCR en tiempo real tradicional. En el caso de que se coamplifique un acido nucleico de control de concentracion de entrada conocida con el acido nucleico diana, puede determinarse una cantidad de entrada absoluta del acido nucleico diana mediante la comparacion de los valores de Cm medidos para los acidos nucleicos diana y de control.

En algunas realizaciones, la presente invencion implica una PCR asimetrica. En una mezcla de PCR asimetrica, uno de los cebadores de amplificacion se encuentra presente en mayor cantidad que el otro cebador. Los cebadores se denominan "cebador en exceso" y "cebador limitante", respectivamente. Las cadenas de acidos nucleicos que resultan de la extension de dichos cebadores se denominan "cadena de exceso" y "cadena limitante", respectivamente. La proporcion entre el cebador en exceso y el cebador limitante puede manipularse selectivamente y ser de entre 200:1 y 2:1, aunque tfpicamente es de entre aproximadamente 9:1 y 5:1. Debido al exceso del cebador, la cadena en exceso se acumula de manera lineal en forma de cadena sencilla. En la presente invencion, las sondas de fusion estan disenadas para hibridarse con la "cadena en exceso", es decir, la cadena de amplicon que resulta de la extension del cebador en exceso, y se acumula en forma de cadena sencilla. La cadena sencilla en exceso resulta ventajosa en los ciclos posteriores de la PCR. En un ensayo de PCR no simetrica tradicional durante los ciclos posteriores, las cadenas del amplicon se acumulan y compiten eficazmente con la sonda de hibridacion para la formacion de un duplex. Una PCR asimetrica esta disenada de manera que la cadena en exceso se hibrida con la sonda, eliminando de esta manera la desventaja cinetica en ciclos posteriores de la PCR y permitiendo la deteccion de un pico de fusion.

En algunas realizaciones, puede resultar ventajoso utilizar un enzima que contenga actividad de nucleasa 5'-3'. Para evitar el agotamiento de la sonda de hibridacion por dicho enzima, se selecciona una concentracion de sonda que garantice una cantidad suficiente de sonda para el ensayo de fusion.

EJEMPLOS

A tftulo meramente ilustrativo y no limitativo del alcance de la invencion, se aplico el metodo a la deteccion de la presencia y cantidad de ARNm de los genes humanos PPP1CA y SENP1 en la misma muestra. PPP1CA es un gen codificante de una subunidad catalttica de la protema fosfatasa 1-alfa y que presenta propiedades antioncogenicas (ver Castro et al., "PPP1CA contributes to the senescence program induced by oncogenic Ras", Carcinogenesis 29(3):491-499, 2008. SENP1 es una proteasa sentrina/sUlVIO-espedfica que pertenece a la familia de los modificadores pequenos similares a ubiquitina (SUMO, por sus siglas en ingles), revisado en Muller et al., "SUMO, ubiquitin's mysterious cousin", Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2(3):202-10, 2001, y Yeh et al., "Ubiquitin-like proteins: new wines in new bottles", Gene 248(1-2):1-14, 2000).

Ejemplo 1

Amplificacion cuantitativa de diversas cantidades de las dianas SENP1 y PPP1CA en el mismo tubo utilizando curvas de crecimiento basadas en la fusion.

En el presente ejemplo se aplica el metodo a la deteccion y cuantificacion de diversas cantidades de ARN de SENP1 y PPP1CA en una muestra de tejido.

Se llevo a cabo la PCR asimetrica con un exceso de siete veces del cebador en exceso sobre el cebador limitante. La deteccion se llevo a cabo con una unica sonda de hibridacion marcada con un pigmento de fluorescerna y un inhibidor BlackHole™. Las secuencias del cebador y de la sonda se muestran en la Tabla 1. Las sondas se disenaron para hibridarse con la cadena en exceso.

Tabla 1

Cebadores y sondas utilizados en los ejemplos

ID de secuencia

Funcion Secuencia 5'-3'

SEC ID n° 1

Cebador directo para SENP1 CAGCTTCAAATACACAATCTGAAGGATCA

SEC ID n° 2

Cebador inverso para SENP1 TGCCTGGAAGAAAGTAGAACTGGGA

SEC ID n° 3

Sonda para SENP1 FGACTCTGTGATTTTACTGAAAGTGAAAGATTCCCAGACTCCQp

SEC ID n° 4

Cebador directo para PPP1CA AACCGCATATATGGTTTCTACGATGE

SEC ID n° 5

Cebador inverso para CGATGAGTGCAAGAGACGCTACAE

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PPP1CA

SEC ID n° 6

Sonda para PPP1CA FACTGTGGAAAACCTTQp

F - pigmento informador cx-FAM Q - pigmento inhibidor BHQ-2 E - terc-butil-bencil dA

p - grupo de 3'

-fosfato

Cada reaccion de 100 |jl contema una cantidad indicada de ARN de bazo fetal humano (entre 0,2 y 2.000 nanogramos, tal como se indica en las figuras 2 y 3), tricina 50 mM, pH 8,3; acetato potasico 120 mM, glicerol al 8%, 33,3 mM de cada uno de dATP, dGTP y dCTP, 100 mM de dUTP, 40 U de ADN polimerasa ZO5, 100 nM de aptamero 46A, 5 U de uracil-N-glucosilasa (UNG), acetato de manganeso 3 mM, 100 nM de cebadores directos (limitantes) (SEC ID n° 1 y SEC ID n° 4); 700 nM de cebadores inversos (en exceso) (SEC ID n° 2 y SEC ID n° 5), y 200 nM de sondas (SEC ID n° 3 y SEC ID n° 6).

La amplificacion y la deteccion se llevaron a cabo utilizando el instrumento Roche LightCycler™ LC480. Las reacciones se sometieron al perfil de temperaturas siguientes: 50°C durante 2 min. (etapa de uNg); 95°C durante 1 min. (inactivacion de UNG); 60°C durante 30 min. (transcripcion inversa), seguido de 44 ciclos de amplificacion de 90°C durante 15 s (desnaturalizacion) y 61°C durante 60 s (hibridacion y extension).

La etapa de fusion se incorporo tras los 15 ciclos iniciales de amplificacion. Durante los ciclos 16 a 27 se llevo a cabo la fusion tras cada segundo ciclo. Durante los ciclos 28 a 39 se llevo a cabo la fusion tras cada ciclo. Durante los ciclos 40 a 44 se llevo a cabo la fusion tras cada segundo ciclo. La etapa de fusion se inicio tras completar la etapa de hibridacion y extension a 61°C y consistfa de 90°C durante 5 s a una tasa de incremento de 1,2°C por segundo; enfriamiento a 40°C a una tasa de 1,8°C por segundo, y calentamiento a 90°C a una tasa de 1,8°C por segundo, adquiriendo en continuo los datos de fluorescencia, a razon de dos veces por grado, leyendo en tres canales.

Por cada lectura de fluorescencia obtenida en la etapa de fusion se obtuvo una curva de fusion (funcion F/T). Para cada curva de fusion se obtuvo la funcion derivada o "pico de fusion" (dF/dT) y se determino un valor del maximo de pico de fusion segun el metodo de la presente invencion (figura 1). Los valores de maximo de pico de fusion resultantes se representaron frente al numero de ciclos de amplificacion, rindiendo las curvas de crecimiento mostradas en la figura 2 (para SENP1) y en la figura 3 (para PPP1CA).

Se muestran los resultados cuantitativos en la Tabla 2. La tabla muestra el numero de ciclos en los que se alcanza un "umbral de fusion" (Cm) predeterminado. Para SENP1, el umbral se fijo en 0,181. Para PPPC1A, el umbral se fijo en 0,055. Para cada diana el umbral se alcanzo antes con la entrada inicial mas grande de acidos nucleicos.

Tabla 2

Datos cuantitativos (ciclos hasta los valores de umbral de fusion (Cm))

ARN de entrada (ng)

0 0.2 2 20 200 2000

SENP11

NC 35,3 32,1 31,1 30,3 29,4

PPPC1A

NC 32,3 31,2 30,8 30,1 29,8

NC: no calculado

Tal como se muestra en las figuras 2 y 3, para cada cantidad del acido nucleico diana se llevo a cabo el experimento por duplicado. Para cada diana, la totalidad de las doce reacciones (incluyendo dos reacciones de control sin molde) utilizaron la misma sonda marcada fluorescentemente.

Aunque la invencion se ha descrito en detalle haciendo referencia a ejemplos espedficos, resultara evidente para el experto en la materia que pueden llevarse a cabo diversas modificaciones dentro del alcance de la presente invencion. De esta manera, el alcance de la invencion no debena considerarse limitado a los ejemplos indicados en la presente memoria, sino a las reivindicaciones proporcionadas posteriormente.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG Roche Diagnostics GmbH

<120> ENSAYO CUANTITATIVO DE AMPLIFICACION Y FUSION MULTIPLEX Y ENSAYO DE FUSION

<130> 25659 EP-HS

<140> 12/400,966 <141> 2009-03-10

<160> 6

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<170> PatentIn version 3.5

<210> 1 <211> 29 <212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: cebador sintetico <400> 1

cagcttcaaa tacacaatct gaaggatca 29

<210> 2 <211> 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: cebador sintetico <400> 2

tgcctggaag aaagtagaac tggga 25

<210> 3 <211> 41 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: sonda sintetica <400> 3

gactctgtga ttttactgaa agtgaaagat tcccagactc c 41

<210> 4 <211> 26 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: cebador sintetico <220>

<221> base_modificada <222> (26)..(26)

<223> terc-butil-bencil-dA

<400> 4

aaccgcatat atggtttcta cgatga 26

<210> 5 <211> 24 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripcion de secuencia artificial: cebador sintetico <220>

<221> base_modificada <222> (24)..(24)

<223> terc-butil-bencil-dA

<400>5

cgatgagtgc aagagacgct acaa 24

<210>6 5 <211> 15

<212>ADN

<213> Secuencia artificial <220>

10 <223> Descripcion de secuencia artificial: sonda sintetica

<400> 6

actgtggaaa acctt 15

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Claims (9)

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   REIVINDICACIONES

   1. Metodo para la amplificacion por PCR en tiempo real, deteccion y cuantificacion multiplex simultaneas de uno o mas acidos nucleicos diana en un unico recipiente para muestras, que comprende las etapas siguientes:

   (a) poner en contacto una muestra, que se sospecha que contiene uno o mas acidos nucleicos diana, con por lo menos un juego de sondas oligonucleotidas, estando marcada cada sonda oligonucleotida en el juego con la misma o mismas fracciones informadoras, en el que cada una de dichas sondas oligonucleotidas marcadas

   i. es suficientemente complementaria respecto a por lo menos una subsecuencia de por lo menos un acido nucleico diana,

   ii. es capaz de unirse al acido nucleico diana correspondiente con una temperatura de fusion diferente de las temperaturas de fusion de las otras sondas oligonucleotidas marcadas en el mismo juego,

   (b) amplificar los acidos nucleicos diana en la muestra en un ciclo de una reaccion de amplificacion que incluye un intervalo de cambios de temperatura, en el que dichas sondas oligonucleotidas marcadas se disocia de los tubridos con los acidos nucleicos diana correspondientes,

   (c) detectar la emision lummica de dichas fracciones informadas en por lo menos una parte de dicho intervalo de cambio de temperatura, y

   (d) representar la primera derivada de dicha emision lummica detectada en la etapa (c) en por lo menos dicha parte del intervalo de cambio de temperatura,

   (e) determinar el valor del maximo de dicha derivada representada en la etapa (d),

   (f) repetir las etapas (b) a (e) multiples veces, y

   (g) representar los valores de maximo de dicha derivada determinada en la etapa (e) frente al numero de ciclos o el numero de repeticiones de las etapas (b) a (e), y determinar el numero de ciclos o el numero de repeticiones a las que se alcanza un valor umbral predeterminado del valor determinado en la etapa (e), cuantificando de esta manera la cantidad relativa de dicho acido nucleico diana,

   en el que dicha reaccion de amplificacion por PCR en tiempo real, deteccion y cuantificacion multiplex simultaneas comprenden la deteccion de por lo menos dos secuencias diana diferentes, comprendiendo cualquier amplificacion la utilizacion de parejas separadas de cebadores de amplificacion para cada secuencia diana y la deteccion utilizando una sonda oligonucleotida separada para cada secuencia diana o la amplificacion utilizando una pareja de cebadores de amplificacion y la deteccion utilizando mas de una sonda oligonucleotida para cada secuencia amplificada.
2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que un acido nucleico de control de concentracion conocida se somete a las etapas (a) a (f) simultaneamente con dichos acidos nucleicos diana y el valor determinado en la etapa (g) para cada acido nucleico diana se compara con el valor determinado en la etapa (g) para el acido nucleico de control, determinando de esta manera la cantidad absoluta de cada uno de dichos acidos nucleicos diana.
3. 3. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que cada una de dichas sondas oligonucleotidas en la etapa (a) se marca con una unica fraccion informadora.
4. 4. Metodo segun la reivindicacion 3, en el que dicha fraccion informadora es fluorescente.
5. 5. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que cada una de dichas sondas oligonucleotidas en la etapa (a) se marca con una fraccion informadora y una fraccion inhibidora.
6. 6. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicha fraccion informadora y dicha fraccion inhibidora son fluoroforos.
7. 7. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que dicha fraccion informadora es un fluoroforo y dicha fraccion inhibidora es un inhibidor oscuro.
8. 8. Metodo segun la reivindicacion 5, en el que dichas fracciones informadora e inhibidora estan separadas por un sitio de corte de nucleasa.
9. 9. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende ademas por lo menos un ciclo de amplificacion para amplificar los acidos nucleicos diana en la muestra antes de la etapa (b).