CN104662172B - Pcr中具有减少的硬件和要求的多重化和定量 - Google Patents

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Abstract

提供了用于多重单检测通道扩增过程和产生的扩增子的定量的方法和算法。提供了用于定量和验证反应中的扩增子的多种数学途径。此类方法和途径的利用允许升级现有的单通道和多通道设备以实现进一步的多重化能力。

Description

PCR中具有减少的硬件和要求的多重化和定量
相关申请的交叉引用
本申请要求在2012年8月3日提交的“PCR中具有减少的硬件和要求的多重化(multiplexing)和定量”的美国临时申请号61/679,547的优先权，其在此通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开涉及生物化学技术领域，且更具体地涉及在多重实时定量聚合酶链式反应(qPCR)技术中使用的方法和算法。
背景
实时定量聚合酶链式反应(qPCR)中的多重化允许在单个qPCR测定中检测和定量不同的扩增靶(例如扩增子)，因此节约了样品材料(例如酶、核苷酸等)并避免了如果通过将样品分开到多个单独的室、孔或管中进行多重化时可发生的孔与孔的变化。通常实现多重qPCR需要针对每个不同扩增子具有不同的光谱(例如发射波长)的报告物(reporter)和检测每个不同光谱的不同检测通道。在一个特定情况下，特定报告物(例如靶特异性探针)被用于允许使用相同发射光谱(例如波长)的多重qPCR，因此减少了检测发射所需的硬件(例如减少数目的检测通道)。根据本公开的教导，允许通过使用例如简单非特异性染料(例如嵌入染料)和相同发射光谱在单个通道检测中的多重qPCR和定量，因此提供了简单并有成本效益的多重化和定量解决方案。
概述
根据本公开的第一方面，提供了方法，该方法包括：使用产生对应于多种不同扩增子的加和幅度信号(a sum amplitude signal)的单通道检测器，检测在多重扩增反应期间产生的多种不同扩增子；定量多种检测的不同扩增子，以及验证多种检测的不同扩增子，其中该定量和该验证包括使用产生的加和幅度信号的数学分析。
根据本公开的第二方面，提供了用于分析多重扩增反应的基于处理器的硬件分析仪，其中基于处理器的硬件分析仪被配置以基于提供的对应于多重扩增反应的多种不同扩增子的加和幅度信号的数字表示，定量和验证多重扩增反应。
附图简述
被并入并构成该说明书的一部分的附图，阐述了本公开的一个或更多个实施方案，并与示例的实施方案的描述一起用于解释本公开的原理和实施。
图1A-1D显示了在具有两种扩增子的多重反应的幅度曲线(amplitude curve)之间的多种可能关系。
图2显示了根据本公开的用于单色检测多重反应的算法的流程图。
图3显示了两种扩增子的示例性加和解链曲线和其与每种扩增子相关的两个组成解链曲线(constituent melt curve)。
图4显示了具有彼此接近的循环阈值(CT)点的两种扩增子的示例性扩增曲线。
图5A和5B分别显示了扩增过程的典型三步和两步温度循环以及与扩增的扩增子相关的解链温度。
图6B显示了根据本公开的在图6A中描绘的三步循环的修改的温度循环的实施方案，其中在扩增子的不同解链温度附近的过渡区域的区段被修改为具有较不陡的斜率，过渡区域是循环的温度的斜降(ramping down)。
图7A和7B相当于在两步循环情况下的图6A/6B且其中过渡区域是循环的温度的斜升(ramping up)。
图8显示了SYBR Green和Alexa Fluor染料的激发和发射光谱，以及用于检测两种染料的发射光谱的部分的宽检测滤波器。
图9显示了根据本公开的实施方案可被用于表示多重扩增过程的估计模型。
图10显示了在两个归一化曲线之间和两个非归一化曲线之间的最小累积逐点距离(minimum cumulative point wise distance)中的误差。
图11是用于单色检测多重扩增反应的处理器控制的硬件的示例性实施方案。
详述
根据本公开的若干实施方案，公开了用于多重化和定量测定的方法和算法。此类方法和算法可与可在扩增期间测量全部或靶扩增子浓度的任何技术联合使用，所述技术包括但不限于可定量总的或特定DNA的量的具有荧光检测、电化学检测或任何其他实时检测技术的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)。
对于定点护理(Point of Care，POC)应用，单色多重化设备(a single colormultiplexing instrument)(例如，检测单发射波长，单通道检测)与多色设备相比具有更简单、更紧凑和制造更廉价的益处。由于此单色多重化设备可更有效地收集发射光且因此减少观察对应信号所需的时间，它也是更快速的。技术人员将知道当前的多色设备具有使用每种颜色的专用检测通道的额外复杂性，其中每个检测通道可包括单独的激发光源、反射器、激发滤波器、专用的光学元件(例如棱镜、光栅、色散元件等)和窄带(例如带通)发射滤波器，以检测不同的发射光谱同时摈弃设备中所用的其他光谱。由于多重实时qPCR中所用的染料的重叠发射光谱，带通滤波器典型地被用于区分多种发射的光谱带，而从染料发射的部分未被用于减少光谱重叠，因此可获得较不有效的检测，其可需要更长积分(integration)时间。
根据本公开的一些实施方案，可通过使用在发射侧具有更宽的带宽的吸收滤波器、干涉滤波器或滤波器的组合来制备单色(例如单检测通道)多重化设备，例如可使用更大部分的发射光谱(例如更宽范围的波长)以检测扩增过程，其可转而增加检测的信号强度并因此减少积分时间同时执行荧光检测。根据本公开另外的实施方案，此单色多重化设备可被用于检测、定量和验证在与用于每种扩增子的不同染料和/或探针/引物相关的不同波长峰下发射的扩增子。在一些情况下，仅检测与扩增子相关的部分发射光谱，其可在扩增过程的定量阶段期间被考虑进去。
用于疾病的测试在多种应用中是非常有用的。然而，为了确保反应的质量，阳性和阴性对照对于确定是否存在污染以及是否适当地发生扩增是有用的。通过在一个孔(例如套筒(cartridge)，反应容器)中进行qPCR，人们可使流控技术(fluidic)设计变得容易、节约试剂成本、以及减少误差和污染。减少误差和污染可转而消除对在单独的孔中添加阳性和阴性对照的需求。在冻干的试剂的情况下，仅需添加洗脱的DNA且反应可在一个室中运行。
根据本公开的实施方案可与用于检测扩增子浓度的多种定量方法联合使用，所述方法使用例如在测定中与任何双链DNA(double string DNA)结合的嵌入染料，或与使用附接到仅与靶DNA链结合的特异性引物(例如Promega Plexor引物)的荧光团的方法联合使用。使用例如杂交探针诸如水解探针、分子信标、荧光共振能量转移(FRET)、杂交等……的多种其他检测方法以及电化学方法和电泳方法与根据本公开的多个实施方案相容。
根据本公开的多个实施方案允许在以下情况下多种靶(例如不同的靶)的多重检测和定量(例如允许更大的多重化)：
a.使用单激发(例如单一波长)的用于不同靶的单一荧光团(例如单一发射波长)。在此类实施方案中，相同荧光团且因此单检测器可与不同序列特异性引物一起使用并从而检测不同的扩增子。
b.使用单激发的用于不同靶的不同荧光团(例如不同发射波长)(例如可使用单一激发波长被全部激发的FRET探针)。
c.使用多激发波长与单检测器和单发射滤波器的用于不同靶的不同荧光团。单发射滤波器可以是更宽的带宽滤波器以允许包含来自多种荧光团(例如染料)的发射信号的更大部分，以获得发射强度的等价加和。
d.使用多激发波长与多个检测器和发射滤波器的用于不同靶的不同荧光团。
根据本公开的多个实施方案还允许使用DNA结合染料(例如荧光)如SYBR Green和FAM，或与特异性靶结合的探针、引物附接的荧光团或其他DNA结合探针。在根据本公开另外的实施方案中，还提供了在扩增过程(例如qPCR)期间的多个点处而不是仅在退火或延伸阶段结束时的基于荧光对温度曲线的分析的多重化和定量。
根据本公开的多个实施方案还描述了用于通过使用例如单发射波长获得(例如扩增子的)多个(例如不同的)定量的方法。应当注意的是，扩增子从包含不同靶(例如DNA序列或RNA序列)的相同测定中获得。还应当注意的是，为了清楚起见，展示了通过两种不同靶的扩增获得的两种不同扩增子的示例性情况。两种扩增子的此类示例性情况不应当被认为是对展示的实施方案的限制，而是作为如本文所公开的发明构思的示例性情况。
靶基因或序列的扩增技术被用于确定(例如定量)靶基因或序列的初始浓度。如技术人员已知的，此初始浓度被称为循环阈值(CT)或通过其被鉴定，所述循环阈值(CT)通过扩增曲线中对应于扩增循环(例如qPCR温度循环)的扩增子的可检测浓度的可检测初始拐点被定义。然后，检测的CT值可与先前已知的浓度关联以推导出靶基因的浓度，由此完成定量过程。典型地，CT值的推导在确定成功(例如适当的)扩增反应之后进行，所述成功(例如适当的)扩增反应可通过对扩增子进行例如终点解链曲线分析或使用阳性和阴性对照被验证(例如验证过程)。在其中两种不同扩增子被扩增(例如两种不同靶基因)的示例性情况下，终点解链曲线分析可确定单特异性扩增子是否被扩增，两种扩增子是否都被扩增或扩增子是否都未被扩增。在成功扩增中，所述成功扩增也被称为适当反应，如果针对两种扩增子的靶都存在，则两种扩增子都被扩增，并因此人们可继续获得每种扩增子的CT值。在一些情况下，扩增反应(例如产生扩增子)之一为CT值(例如浓度)是已知的对照反应。在其他情况下，两种靶的浓度是未知的。根据本公开的多个实施方案，在两种情况下未知的初始浓度(例如CT值)可通过分析多重反应的幅度曲线来获得，所述多重反应的幅度曲线还被称为加和幅度曲线，所述加和幅度曲线涉及每检测循环扩增子的总数。在一些情况下，加和幅度曲线的分析使用通过分析解链曲线(例如解链曲线分析)获得的信息。根据本申请的若干实施方案，可使用在信号处理、估计理论等领域中的技术人员所熟知的强大的已知数学函数和模型来进行加和幅度曲线和解链曲线的详细分析。
当使用嵌入染料时，荧光强度与扩增子的长度约成比例(例如扩增子越长，荧光强度越强)。根据本公开的一些实施方案，提供了分析多重扩增子的加和幅度曲线(例如对应于总的检测的强度)的方法，所述方法使得能够推导出每个多重反应的CT和对应的幅度曲线。此类方法与其中使用了具有附接的荧光团的引物的情况也是相容的。在根据本公开的其他实施方案中，可将与其他引物组相比更多的染料分子附接至一个引物组，以获得与其他扩增子相比针对一种扩增子的更高的荧光(例如幅度)作为相关的扩增曲线的区别特征。如前所述，根据本公开的多个实施方案的方法可被扩展至多种(例如多于两种)扩增子。在根据本公开的一些实施方案中，反应的效率可不同或被设计为不同，以限制(例如给定的反应的)扩增曲线的对应斜率和形状，以便于检测多个个体曲线和对应的CT值。在一个示例性实施方案中，可通过使用用于在多重反应中使用的不同靶的不同引物浓度来改变扩增效率，以获得具有不同斜率和形状的个体靶扩增曲线。根据本公开的多个实施方案的算法可被用于(例如根据单检测通道)分离彼此叠加的不同扩增曲线。根据本公开另外的实施方案，提供了使用解链曲线来获得每个反应的总的荧光的方法。
图1A-1D显示了在使用两种靶基因的多重反应的情况下扩增曲线之间的多种可能关系，每一种靶基因分别通过对应的扩增子(扩增子1、扩增子2)被鉴定。假定反应是适当的，例如正确的基因以预期的效率(例如幅度斜率)被扩增，并通过例如终点解链曲线分析被验证。对于由图1A-1D表示的四种不同情况的每种，总的检测的信号(例如通过单检测通道检测的总的发射的荧光强度)由加和幅度曲线(加和)表示，所述加和幅度曲线(加和)对应于个体幅度曲线(扩增子1)和(扩增子2)的加和。此外，展示了四种情况的每种的加和幅度曲线(加和)的导数、以及其二阶导数和其归一化的二阶导数。
在由图1C和1D表示的情况中，由于如通过导数曲线中两个不同的峰所进一步展示的，几乎不存在两个扩增曲线(例如扩增斜率)的重叠，以不同循环数发生的两种靶的扩增使得相对容易地通过使用简单数学分析，诸如例如通过使用加和幅度曲线的二阶导数，来确定每个反应的CT值。在由图1C和1D表示的情况中，与两种扩增子相关的斜率相隔足够远，以允许通过分析平台部分和/或具有(加和)曲线的斜率的部分获得每个反应的CT值。例如，参见由图1D表示的图，陡的斜率开始于约8个循环处，其可表明可检测扩增的开始，且再次地，第二陡的斜率开始于约19个循环处，其可表明另一个扩增的开始。通过进一步检查例如每个斜率的初始幅度，人们可以确定在每个斜率期间单扩增子被扩增(例如通过验证代表指数扩增率的斜率幅度)。解链曲线分析可验证被扩增的两种靶扩增子。尽管建立了CT点，人们还需要将这些点与多重反应的特定扩增子关联。根据本公开的多个实施方案，加和曲线分析和解链曲线分析的结合可提供所述关联。
在由图1A表示的情况中，CT值是接近的且因此当与单扩增子的单扩增曲线相比时，在(加和)曲线的导数和二阶导数中不存在另外的峰，因此使得确定CT值是困难的。
在由图1B表示的情况中，CT值是接近的且在加和曲线的导数中存在单个峰。然而，对导数曲线更密切的关注显示了由于两个CT点的偏斜引起的非对称的(钟形)曲线形状。根据本公开的一些实施方案，在导数曲线中非对称的量可被用于确定两个CT点的相对位置。同样在由图1B表示的情况中，二阶导数具有比单扩增子的扩增曲线更多的峰，这进一步表明两个CT点的偏斜。
根据本公开的多个实施方案，提供了通过数学分析加和幅度曲线和/或解链曲线以使得所有可能情况(例如如由图1A-1D表示的)的CT值的导数以及与单检测通道多重反应的特定扩增子的关联成为可能的方法。
根据本公开的实施方案，图2显示了用于具有阳性和阴性对照的一种靶的单色检测的算法的流程图。例如在qPCR反应的情况下，这里假定反应以重复的循环的顺序运行，其中另外的扩增可随循环的每一次运行获得。提出的算法提供了通过检测与多重的靶和阳性对照的相对距离无关的对应CT值来推导出它们的浓度的方法。图2的算法进行了以下步骤：
1.在反应(例如全部循环)结束时运行解链曲线分析，其产生了以下：
a.哪些扩增子确实进行了扩增，因为根据设计每种扩增子具有不同解链温度(TM)。
b.假定每一种扩增的扩增子达到了平台水平，其荧光的幅度是什么。其还给出了循环结束时的幅度，即使其未达到平台。
c.背景荧光，例如通过观察在解链曲线分析结束时检测的荧光水平。
d.扩增的质量达到的某种程度，例如通过将观察到的解链曲线的形状和基于已知参数的预期形状相比较。
2.如果阴性对照确实进行了扩增，则反应失败。
3.如果阳性对照没有扩增，则反应失败。
4.如果靶没有扩增，则靶不存在/不可检测。报告该情况并转到结束。
5.否则，进行加和扩增曲线的分析：
a.分析加和幅度曲线以获得峰：
i.使用加和幅度曲线的导数和二阶导数。
ii.使用本领域已知的多种峰检测算法，诸如例如CFAR型检测算法(例如，如在雷达理论中所用的)。
b.如果检测到具有置信度的足够的峰，那么CT值足够地远：
i.推导出扩增子和阳性对照两者的CT值。应当注意的是，阳性对照的CT值可以是事先已知的。可使阳性对照的CT值在更靠后的循环处，例如，可将其放到针对临床相关性可被接受或可以是反应的接受的最大CT之后。由于阳性对照将不影响靶CT值的确定，这简化了获得有效扩增的CT值。在平台期或其后的阳性对照的幅度还可通过限制例如引物的量被限制。
ii.任选地，使用如以下描述的基于距离的方法(步骤c.vi.)验证推导出的CT值。
c.如果没有检测到足够的峰，那么CT值是接近的(假定扩增具有如预期的/指定的效率)：
iii.任选地，使用从解链曲线分析获得的幅度来归一化靶和阳性对照的幅度。
(幅度可被归一化以根据用于使CT点与已知浓度关联的参考数据假定每个个体幅度曲线的相同幅度，否则准确度可被降低，如图10中所示的)。使用总的荧光强度(例如幅度)和其中每种扩增子的解链发生的点估计每个个体荧光曲线的最大值。
iv.对峰进行偏斜分析以估计两种扩增子的CT差异。如通过解链曲线分析获得的两种扩增子(例如靶和阳性对照)的幅度信息可被用于该步骤。
v.针对靶扩增和针对阳性对照扩增假定不同的CT值并基于假定的不同值产生对应的加和幅度曲线。运行多种实验并储存对应的数据或使用数学模型或两者的组合可获得这些CT值。如果阳性对照的CT值是未知的，那么其可被固定且加和幅度曲线可仅通过假定的靶扩增的CT值而不同。
vi.基于假定的CT值和实际测量的加和幅度曲线获得加和幅度曲线之间的绝对值的差异(例如绝对差或平方差)。分析结果并选择CT值(或在其中阳性对照值是未知的情况下的值)，所述CT值被估计与实际值最为接近。任选地，对应于最小距离的CT值可被选择作为实际值。任选地，可将距离曲线/表面/函数的形状考虑进去。
6.结束。
由于由图2表示的算法允许在POC设备和在市售机器中的可靠检测，使用由图2表示的算法实施单色检测方法以在具有阳性和阴性对照两者的情况下扩增靶是引人注目的。
在多色机器(例如具有多个检测器)中，该多重化技术(例如图2)可被用于每种颜色因此使得以下成为可能：
·使一种颜色上具有阳性和阴性对照并单独地使用其他颜色用于检测其他靶
·使每种颜色和靶具有阳性和阴性对照
·增加扩增子的数目，其可被检测为增加了两倍或三倍。(稍后我们展示如何甚至进一步地增加扩增子的数目)。
根据本公开的实施方案，提供了用于通过加和解链曲线分析获得扩增曲线的幅度以及通过单通道检测从观察到的加和解链曲线获得组成解链曲线的方法。图3显示了对应于通过扩增过程产生的两种扩增子(a1、a2)的示例性加和解链曲线(MC1+MC2)。基于该加和解链曲线，期望提取其组成曲线(MC1)和(MC2)，所述组成曲线另外显示在图3中。加和解链曲线在接近(TM1)和(TM2)时斜率明显改变，所述(TM1)和(TM2)分别是扩增子(a1)和(a2)的解链温度。根据观察到的加和解链曲线(MC1+MC2)，在曲线的多个区域的斜率是已知的并可与个体曲线(MC1)和(MC2)的多个区域的斜率关联，如图3中所示。基于观察到的加和解链曲线(MC1+MC2)且如在图3中描绘的，通过定义：
s1bTm：(MC1)在其解链温度(TM1)之前的斜率
s1aTm：(MC1)在其解链温度(TM1)之后的斜率
s2bTm：(MC2)在其解链温度(TM2)之前的斜率
s2aTm：(MC2)在其解链温度(TM2)之后的斜率
以下表达式是已知的：
(a)s1bTm+s2bTm
(b)s1bTm+s2aTm
(c)s1bTm
(d)s1aTm
因此这四种独立的表达式允许确定与组成解链曲线(MC1)和(MC2)关联的两个斜率的每一个。假定组成解链曲线(MC1)和(MC2)的幅度分别是(A1)和(A2)，那么基于观察到的单通道加和解链曲线，以下幅度是已知的：
(e)A1+A2
(f)M1
(g)M2
使用公知的数学技术，技术人员将知道如何通过使用(M1、M2)与(TM1、TM2)的关系来估计(A1)和(A2)。
根据以上所述和图3中描绘的方法获得(例如加和解链曲线)的多个组成解链曲线的幅度，通过使用例如通过以上提供的加和解链曲线分析(例如图3)和根据本公开的多个实施方案的任何一个从加和幅度曲线获得的幅度曲线获得的相对幅度，允许使幅度曲线(例如CT值)与特定扩增子关联。解链曲线可(例如通过已知的解链温度)将扩增子与相对幅度关联，其然后可与幅度曲线的幅度关联。例如并与图3相关，对应于扩增子(a2)的幅度(A2)与扩增子(a1)的幅度(A1)相比相对更大。因此，如果对应于扩增子(a1、a2)的产生的加和幅度曲线的分析产生两个单独的CT值，较大的值将对应于扩增子(a2)且较小的值将对应于扩增子(a1)。
在一些情况下，幅度曲线在平台期(例如继指数期之后的最小扩增区域)的斜率可能难以确定。因此，根据本公开的实施方案，只有假定的幅度曲线的指数期(例如随后图4所描述的)可被用于分析(例如算法的步骤5)。类似地，根据假定的和/或实际幅度曲线，幅度曲线中没有扩增是可检测的阶段(例如曲线的相对平坦的区域)可从分析中排除。从分析步骤中消除曲线的包含最少信息的区域(例如阶段)的此技术可给予更好和更稳健的分析结果。应当注意的是，用于分析的目的区域典型地是在对应的CT点附近的幅度曲线的指数扩增的区域。假定扩增是适当的(例如最大效率和产生了预期的扩增子)，那么由于在CT点附近的扩增以2N的速率发生，其中N是与扩增循环相关的数目，则预期在CT点附近的幅度变化(例如扩增)遵循指数曲线。技术人员将不需要关于该内容的进一步解释并将理解使用/分析幅度曲线的相关区域(例如斜率)以检测多个CT点的益处。
图4显示了具有彼此接近的CT点的两种扩增子的示例性扩增曲线。根据先前段落，通过观察并分析加和扩增曲线的斜率(例如通过反应的效率e表示)，直接地确定每种扩增子的CT点是可能的。通过仅跟踪加和幅度曲线的指数期并假定每个反应适当地进行(例如以适当的速率扩增)，每个组成幅度曲线可如图4中所显示的被表示。当第一扩增子在对应的CT值以上开始被检测出而第二扩增子未被检测出时，效率e接近于1(例如一种扩增子被适当扩增)，如图4的第一区段中所显示的。当第二扩增子穿过其对应的CT值时，两个适当的扩增反应是可检测的，每个都处于对应的指数期。因此，在图4的第二区段中，对应的效率(例如斜率)值接近2，显示两个扩增都处于指数期。基于任一种扩增子的指数期都具有为约1的对观察到的加和幅度曲线的效率(例如斜率)贡献的事实，获得这两个初始区段足以获得两种扩增子的每种的CT值。在其中两个CT值是相同的情况下，那么两个区段被合并且具有约2的效率值的单一区段被观察到。在第三区段，由于扩增开始接近平台期，一种或两种扩增子的扩增的效率开始下降，因此观察到的总效率也开始从约2的值下降。在第三区段，效率值(例如斜率)从小于2的值变化到0，在0的情况下，两个扩增都进入平台期。
以上公开的基于加和幅度曲线的斜率的检测CT值的技术，通过该技术的简单扩展，容易适应于其中CT值相隔很远的情况。由于该技术寻求获得扩增的指数期，其是稳健的，所述扩增的指数期在其中效率接近于1的(例如组成扩增子之一的)反应的部分期间发生，并因此不依赖于由于例如在反应后期有限的试剂可用性引起的采用其他形状的扩增曲线。
根据本公开另外的实施方案，用于具有阳性和阴性对照的一种靶的单色检测的公开的算法可被进一步扩展为包括多于两种靶同时保留阳性和阴性对照两者。对于单一靶的情况，在导数和二阶导数曲线中的峰和(例如如通过解链曲线分析所检测的)幅度可被用来从加和幅度曲线分离多种扩增子的每种的幅度曲线(例如，单一扩增子算法的步骤5.a.和5.b.)。
对于具有一个阳性对照和一个阴性对照的多种靶的情况，除了可被以下步骤替代的步骤5.c.v.和步骤5.c.vi.之外，可使用如用于单一靶的情况的相同算法：
基于先前的分析结果，对每种扩增的扩增子假定一些CT值。
对所有假定的CT值
产生全部或部分加和幅度曲线
获得从产生的加和幅度曲线的全部或部分到测量的加和幅度曲线的距离(例如可计算跨越例如曲线的指数期的部分的距离)
结束
选择最可能的CT值(例如其将距离最小化)
根据本公开的一些实施方案，提出的多重化算法可被用于增加用于扩增靶基因的设备的多重化能力，所述设备具有多个光学检测通道。例如，通过在4通道设备中实施此算法，使用公开的多重化算法，该设备可被升级为检测12种靶，每种颜色3种多重化的靶。在其中使用公开的算法，每种颜色4种靶被多重化的情况下，那么相同的4通道设备可被升级为检测16个靶。基于与嵌入设备的处理器控制的硬件之内的软件和/或固件代码组合实施的算法，技术人员将知道此类设备执行其观察到的/检测的发射强度(例如荧光)的数据分析的全部或部分，所述设备的处理器控制的硬件诸如例如图11中描绘的处理器控制的硬件。此类算法对观察到的/检测的发射强度的数字表示执行读取入处理器控制的硬件(或其部分)可访问的存储器模块。该数字表示可例如通过将表示观察到的/检测的发射信号的模拟信号转化为等价的数字表示的模数转换器模块获得。技术人员将认识到对此类软件和/或固件的全部或部分的可能升级以包括提出的单通道多重化算法。在根据本公开的可选的实施方案中，通过呈其标准配置的设备观察到的/检测的数据可使用提出的多重化算法离线分析，以不干扰现有设备。在该情况下，提出的多重化算法可在计算机和/或处理器控制的硬件上运行的软件和/或固件中整体实施。
图11是如在前段落中讨论的处理器控制的硬件(10)(例如计算机系统)的示例性实施方案。该处理器控制的硬件包括处理器(15)、存储器组(memory bank)(20)、本地接口总线(35)和一个或更多个输入/输出设备(40)。基于储存在存储器(20)中的一些可执行的程序，该处理器可执行与实施用于定量并验证扩增过程的所讨论的数学分析和相关的算法相关的以及如由操作系统(25)提供的一个或更多个指令。这些指令通过本地接口(35)并如由针对本地接口和处理器(15)的一些数据接口协议指定的被传送到处理器(20)。应当注意的是，本地接口(35)是诸如控制器、缓冲存储器(高速缓冲存储器)、驱动器、中继器和接收器的若干元件的符号表示，所述元件通常旨在提供基于处理器的系统的多个元件之间的地址、控制、和/或数据连接。在一些实施方案中，处理器(15)可与一些本地存储器(高速缓冲存储器)相符合，其中所述本地存储器(高速缓冲存储器)可存储待被执行的用于一些增加的执行速度的一些指令。通过处理器执行指令可需要使用一些输入/输出设备(40)，例如从存储在硬盘上的文件输入数据(例如表示加和幅度和/或加和解链曲线的数据)、从键盘输入命令、将数据输出到显示器、或将数据输出到USB闪存驱动器。在一些实施方案中，尽管处理器控制的硬件设备(10)的基本架构将与如图11中描绘的保持相同，操作系统可以不存在且所有任务都在处理器(15)的直接控制下。在一些实施方案中，多个处理器可被用于并行配置用于增加的执行速度。在这样的情况下，可将可执行的程序具体调整为并行执行。而且，在一些实施方案中，处理器(15)可执行定量和/或验证的部分，且一些其他部分可使用放置于靶硬件(10)经由本地接口(35)可访问的输入/输出位置的专用的硬件/固件(例如，用于数字化检测的扩增信号的专用的PCB板)来执行。处理器控制的硬件(10)可包括多个可执行程序(30)，其中每个可独立地运行或彼此结合运行。
如技术人员已知的，当嵌入染料被用于检测扩增反应时，(例如，与嵌入染料相关的)荧光的幅度将随着扩增子长度而改变。在其中序列特异性探针(例如仅与特定靶结合的探针)被用于监测扩增反应的情况下，可将嵌入染料添加到反应(例如包含多种试剂的测定)中而不影响扩增反应的监测效率且提供了允许解链曲线分析的优势。技术人员将知道一些序列特异性探针与解链曲线分析不相容，因此嵌入染料的添加可在例如进行公开的单色多重反应检测算法中是有益的。
对于基于探针的反应，对于不同的扩增子，探针上荧光团的数目可不同。报告物分子可不同但以相同波长或以基本上相同的两个波长发射，例如同一检测器可以以足够高的效率检测两个波长。例如FAM、Eva Green和SYBR Green染料具有相似的、或基本相同的发射光谱。此类染料可被用于靶特异性探针并且还允许使用公开的单色多重反应检测算法多重检测若干靶。这例如可允许在同一检测通道中基于探针的检测。因此，使用单检测通道来获得探针的特异性以及不同靶的定量是可能的。
公开的单色检测算法与其中使用了不同光谱的染料的多重反应也是相容的。在该情况下，多种染料的相对宽的发射光谱被用于通过例如同一吸收滤波器检测发射光谱的全部或部分。例如，与例如SYBR Green相比，德克萨斯红(Texas Red)将具有其光谱的更大部分穿过具有520nm截止波长的吸收滤波器(例如穿过大于520nm的波长)。
在其中使用了具有FAM作为受体染料(例如单激发波长)和不同供体染料(例如不同发射光谱)的FRET探针的情况下，通过多重反应产生的不同扩增子的幅度可以是不同的，同时能够使用单激发波长。不同扩增子的幅度中的差别可有助于通过解链曲线分析检测的扩增子特定幅度，与根据本公开的单色多重反应检测算法中公开的分析从加和幅度曲线中检测的CT点的关联。
在一些情况下，不同激发波长与被设计在不同波长下发射的不同探针一起被使用。使用不同发射波长将产生多种探针的不同扩增子幅度，其可被用于基于幅度进一步区分多种扩增子。例如，Alexa Fluor 610最小被475nm的波长(475/25蓝色滤波器)激发，因此蓝色LED(或蓝色滤波器)可仅被用于激发SYBR Green，这产生了针对具有SYBR Green的探针的扩增子的检测。在另一方面，410nm的波长可激发SYBR Green和Alexa Fluor两种染料，并因此产生了针对具有SYBR Green和Alexa Fluor两者的探针的扩增子的检测。如图8中描绘的，其取自2013年8月2日检索的网页http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Application s/Cell-Analysis/Labeling-Chemistry/Fluorescence-SpectraViewer.html，具有覆盖[500nm,700nm]的波长范围的足够宽的带宽的检测滤波器(例如600/200发射滤波器(Em Filter))可被选择来检测对应于SYBR Green和Alexa Fluor两种染料的(例如，部分)发射光谱。以一个激发源检测两种扩增子的发射且然后以第二激发源仅检测一种扩增子的发射可允许确定每种扩增子的发射。如图8描绘的，人们可使用单检测器但不同激发源进行多重化，并与使用针对每个发射波长的带通滤波器相比，仍捕获了染料的大部分光谱。人们可通过用多个串联的激发源获得解链曲线来获得幅度信息，以获得两者的幅度。这意味选择激发源，运行多重反应并使用提供的算法分析反应，然后选择不同的激发源，运行多重反应并使用相同算法分析反应。因此，激发源的多重化允许增加设备每个检测通道的检测能力。
为了控制扩增子的幅度，引物可被限制。例如，阳性对照可具有有限的引物，以便其在平台期接近设计的值。如前所述，控制多重反应中扩增子的幅度可有助于根据公开的单色多重反应检测算法检测对应的CT值。
其中扩增中的任何扩增子都没有进入指数期(例如对应于具有最陡斜率的幅度曲线区域)的反应的初始阶段，可被处理作为背景荧光并可从总荧光波形(例如加和幅度曲线)中被减去。
根据本公开的一个实施方案，部分解链曲线分析是在诸如例如多重qPCR反应的扩增反应的每个循环中进行。此逐个循环的部分解链曲线分析可确定扩增反应过程中多种扩增子的定量。图5A和5B显示了扩增过程的一个典型的循环(例如温度循环)，据此包含待扩增的基因的测定的温度经受对应于与基因相关的DNA序列的变性阶段、退火阶段和延伸阶段的多个水平。如图5A中表示的，用于退火阶段和延伸阶段的温度水平是不同的，而在图5B的情况下，这些水平是相等的。技术人员将不需要关于扩增过程的内部运转以及与扩增过程的三个主要阶段相关的多个温度水平的相关性的另外的信息。在典型扩增过程中，从对应于循环的一个阶段的循环的一个温度水平到对应于该循环的不同阶段的另一个温度水平的过渡区域对于扩增过程不是关键的，并且是典型地与相关的扩增过程设备的加热/冷却元件和室相关的特征的函数。图5A和5B显示了与被扩增的两种不同扩增子相关的解链温度(TM1、TM2)。如由技术人员已知的，这些解链温度是先验地已知的并根据在反应中使用的靶特异性引物的设计被设置。根据本公开的多个实施方案，例如如与解链温度(TM1、TM2)相关的扩增过程的多种扩增子的解链分析，可在这些温度的附近(在循环中温度斜升区域或温度的斜降区域)进行。在根据本公开的一些实施方案中，循环可被减慢，以允许在此部分解链曲线分析期间的更好的检测/分辨。在一些实施方案中，为了保持相对快的循环，循环内的温度可被控制为快速地达到其中多种扩增子显示信号(signature)的解链曲线(例如部分解链曲线)的预期温度(例如根据每种不同扩增子的设计的解链温度)，并快速地穿过其他温度点。循环内此温度的控制可在温度的斜升或斜降期间进行，获得的更好的结果依赖于所用的加热方法。图6B显示了图6A中表示的循环的修改的循环，据此对应于变性和退火阶段之间的过渡的循环的温度被控制，以允许在两个解链温度点(TM1)和(TM2)的附近的部分解链曲线分析。在由图6B描绘的实施方案中，在与变性和退火阶段相关的两个温度水平之间的过渡区域被分段为在每个不同的解链温度点附近并包括其的区域和不含解链点的区段，例如区段的加和包含整个过渡区域。如图6B描绘的，包含解链点的区段提供了对应于较低温度变化率的较低斜率，以允许更好的解链曲线分析，而不含解链点的区段具有较大的斜率以快速地穿过温度过渡并使循环的持续时间最小化。尽管在由图6B描绘的示例性情况中，部分解链曲线分析是在循环的温度曲线(profile)的斜降期间进行的，根据本公开的其他实施方案，部分解链曲线分析可在循环的温度曲线的斜升期间进行，如例如图7A和7B中描绘的。在一些情况下，部分解链曲线可仅在扩增过程的一些(例如不是全部的)循环期间进行。在其中系统的热特征(例如包括qPCR流体)是如此以使得斜变率(ramp rate)不需要被降低而仍获得信号的情况下，循环可以以正常斜变率进行而不需要减慢至接近(TM1)或(TM2)。
在一些实施方案中，在一些循环中的部分解链曲线分析可被跳过，以减少总的反应时间(例如，全部循环时间的加和)并然后仅基于阈值定量。通常，预期Ct值被定量。在一些实施方案中，一旦扩增子的信号变为可检测的，寻找扩增子的解链信号(例如检测的荧光对解链温度点的温度的形状/斜率中的特定变化)可被停止。在一些实施方案中，可期望运行最终的解链曲线分析以验证反应并交叉核查观察到的扩增子(例如没有不期望的扩增子产生)。
部分解链曲线分析算法如下：
开始循环
对于每个循环
-如果荧光高于阈值(扩增开始的信号)
-运行针对未检测的靶的解链曲线(或寻找期望的信号而不是缓慢地穿过全部温度)
-如果检测到靶，标记它并任选地在接下来的循环中排除分析它(不需要在接下来的循环中缓慢地斜穿该解链温度)
-如果检测到全部靶，终止
结束
任选地使用结束时的解链曲线来验证
在一些情况下，可以以需要额外时间获得解链曲线为代价，期望运行扩增反应的循环之间的完整的解链曲线分析。然而，由于每种扩增子的解链温度是事先已知的，人们可以测量在特定温度下(例如在扩增子的已知解链温度的附近)的荧光(例如发射的强度)，并跳过不包含扩增子的解链温度的温度范围，而不是如解链曲线分析中典型进行的在更多温度下记录(例如测量荧光)。通过跟踪每个运行解链曲线的(例如与扩增子相关的)每个已知解链温度的观察到的荧光中的峰，人们可以检测扩增子(例如以一定浓度)的存在。加速解链曲线分析的此方法可节约(例如用于扩增子的检测/定量的)总体时间，同时可获得具有不同解链温度的许多扩增子的定量。而且通过加和幅度曲线获得的幅度信息可被用于检测具有相同或非常接近的解链温度的两种扩增子。例如，以(例如与在指数扩增期的单一扩增子的扩增速率相比)两倍速率或类似速率增加的荧光，指示两种扩增子而不是一种扩增子被扩增。
根据本公开另外的实施方案，以下展示了用于加速的解链曲线分析的算法。此算法可在其中期望获得在例如多重反应中的一种扩增子或多种扩增子的浓度(例如对应的CT)的情况下使用。假定每个反应将通过指数期，或换句话说反应是适当的：
开始循环
对于每个循环
-测量在与每种扩增子相关的温度下的荧光
-如果检测到靶，标记它并任选地在接下来的循环中排除分析它(在接下来的循环中不要缓慢斜穿检测的靶的解链温度)
-如果检测到全部的靶，终止
结束
任选地使用在末端的解链曲线来验证
以上展示的相同算法可在具有类似解链温度的多种扩增子的情况下使用。
非特异性探针诸如例如嵌入染料，可被用于通过使用例如解链曲线分析定量地获得哪种扩增子已经被扩增。非特异性探针可被用于进行具有需要定量的靶和不需要定量的靶(例如仅需要获得它们的存在并非浓度)的测定。序列特异性探针可被用于测量定量(例如CT值)。在两通道(例如检测)设备中，一个通道可被用于进行使用非特异性探针的多重测定的定量分析，而第二通道可被用于进行使用序列特异性探针的测定的特定靶的定量。因此，这样的配置在多重测定中提供了两种自由度(例如颜色和解链温度)。
在对应于阳性对照、阴性对照和靶的三种扩增子的示例性情况中，人们可以在相同反应中使用非特异性染料和(例如针对全部三种对应扩增子的)序列特异性杂交探针两者。根据本公开的实施方案，此多重反应可使用两个激发源和仅一个检测器被定量地和定性地分析。例如且如图8描绘的，如果非特异性染料是SYBR Green且用于序列特异性检测的染料是Alexa Fluor 610，那么人们可使用蓝色LED(例如475nm/25蓝色滤波器)来激发绿色染料同时Alexa Fluor未被明显激发。这将为扩增反应提供解链曲线和定性答案。
定量可通过测量循环期间的荧光被确定，而UV LED(例如410nm/25UV滤波器)提供了不会明显地激发绿色染料的激发波长。优势是仅使用了一个检测器和发射滤波器，因此可能允许更多光的捕获。在该情况下，对照的扩增不会干扰靶扩增子的荧光信号。
根据本公开另外的实施方案，在信号处理中使用的多种数学变换和函数(例如FFT、DFT、z-变换等…)可被用于在多重反应期间比较、匹配或进一步分析检测的信号/幅度。此类变换/函数可检测两个位移的波形例如检测的和/或假定的斜率、和/或加和幅度和/或解链曲线的多个导数之间的相差。它们还可有助于归一化幅度且与通过仅使用观察到的信号的斜率相比提供对多重反应的特点的更深入了解。这些变换/函数可应用到观察到的/检测的信号的整体和/或不同部分。
根据本公开另外的施方案，来自信号处理理论以及估计理论的教导可被用于进一步分析多重扩增反应期间观察到的/检测的信号。在根据本公开的示例性实施方案中，图9中给出的估计模型可被用于代表扩增过程。
在由图9描绘的估计模型中：
CTk＝对应扩增的CT
Ak＝对应扩增的幅度
Sk＝对应扩增的斜率/效率
其中取决于多重扩增子的数目k＝(1,2,…)。
通过将从多重扩增反应中观察到的信号y提供给对应于由矩阵h表示的建模过程的估计法(estimator)，人们可以推导出过程参数x的估值，其包括反应的主要信息(例如CT、幅度、斜率/效率)。
人们可使用多种估计法如ML(最大似然法)、MAP(最大先验法)和多种其他估计法来估计参数的值。过程(h)可以多种方式被建模。其可被递归地建模且卡尔曼(Kalman)滤波器可被用于使参数平滑或估计参数。信号处理和估计理论领域中的技术人员已知的多种其他对照算法可被用于分析多重反应中观察到的/检测的信号。如前所述，此类算法可以与软件/固件组合实施，所述软件/固件待被用于升级现有设备和/或在被配置以进行多重反应(例如单通道检测器)和/或被配置以简化离线分析检测的/观察到的数据/信号的新设备中使用。
根据本公开另外的实施方案，多重反应的质量和浓度可通过限制在反应过程中使用的引物获得，以控制多重反应的多种扩增子的平台水平。因此，使用此方法允许仅使用扩增曲线且不使用末端的解链曲线分析获得每种扩增子的CT值以及是否多种扩增子被扩增。通过限制引物和控制循环数，多种扩增子到达平台期，然后可对每种扩增子进行荧光的斜率的估计。在一些情况下，导数和二阶导数的峰将分离，以允许简单的定量和检测。在若干CT值重叠的情况下，通过限制扩增子特异性引物获得的先前的斜率知识可被用于分辨扩增的扩增子。例如，如果扩增的斜率高于任一扩增子的预期斜率(例如，在相同CT值的情况下)，那么可估计两种扩增子被扩增。而且在所有扩增结束时的荧光值可给出加和，由于根据设计，每种扩增子的平台水平是已知的，所述加和可被用于获得多少种扩增子确实进行了扩增。如在在前段落中描述的数学分析可进一步有助于分析观察到的/检测的幅度/斜率。
因此，根据本公开，提供了用于PCR中具有减少的硬件和要求的多重化和定量的系统和方法，其允许通过单检测器检测不同扩增子并使用已知的数学分析方法定量所述扩增子。
本领域技术人员将能够将本公开的教导扩展到可测量扩增期间的全部或靶扩增子浓度的任何类型的过程，包括但不限于具有荧光检测、电化学检测或其他实时检测技术的实时定量聚合酶链式反应(qPCR)，所述实时定量聚合酶链式反应(qPCR)可以以与本公开中已讨论的类似的方式来定量总的或特定的DNA的量。尽管装置和方法已通过具体实施方案和其应用的方式被描述，应当理解，本领域技术人员可对其进行许多修改和变化而不偏离本公开的精神和范围。因此，应当理解，在权利要求的范围之内，本公开除了如本文具体描述的之外可被实践。
本发明构思的许多实施方案已经被描述。然而，将理解，可进行多种修改而不偏离本发明教导的范围。
因此，应当理解，本发明构思不被具体阐述的实施方案所限制，而仅被所附权利要求的范围所限制。说明书可提供如在权利要求中引用的类似特征的实例，然而不应当假定此类类似特征与权利要求中的那些是相同的，除非该一致性对于理解权利要求的范围是必需的。在一些情况下，权利要求的特征和说明书的特征之间预期的区别通过使用略有不同的术语被理解。

Claims (50)

1.一种方法，所述方法包括：
使用产生对应于多种不同扩增子的加和幅度信号的单通道检测器，检测多重扩增反应期间产生的所述多种不同扩增子；
定量多种检测的不同扩增子，以及
验证所述多种检测的不同扩增子，
其中所述定量和所述验证包括使用对所述加和幅度信号的部分产生的加和幅度信号的数学分析，所述加和幅度信号是所述多种不同扩增子的每种不同扩增子的幅度信号的加和，并且
其中所述数学分析包括所述加和幅度信号的斜率区域内的斜率变化的分析，所述斜率变化的分析用于检测所述多种不同扩增子中的一种扩增子的循环阈值。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测基于来自序列特异性探针和/或序列特异性引物的发射波长。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测基于来自荧光DNA结合染料的发射波长。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述斜率取决于用于所述多种不同扩增子中的不同扩增子的不同引物浓度。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述加和幅度信号的部分包括所述加和幅度信号的平台区域。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述平台区域的所述数学分析用于鉴定所述多种不同扩增子中的一种扩增子。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述平台区域取决于用于所述多种不同扩增子的不同扩增子的不同引物浓度。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述数学分析还包括：
使用信号处理技术以从对应于所述加和幅度信号的加和幅度曲线中分离所述多种不同扩增子中的一种扩增子的幅度曲线，以及
基于所述幅度曲线推导出所述扩增子的循环阈值的值。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述信号处理技术包括以下的一种或更多种：
a)快速傅里叶变换(FFT)、b)离散傅里叶变换和c)z-变换。
10.根据权利要求8所述的方法，所述方法还包括：
针对所述多种不同扩增子中的每种扩增子，基于所述加和幅度曲线的在先数学分析假定循环阈值的值，以及
基于所述假定，产生对应于所述多种不同扩增子中的每种扩增子的假定的幅度曲线，
基于所述产生，产生假定的加和幅度曲线，
基于所述产生，测量所述加和幅度曲线和所述假定的加和幅度曲线之间的距离，
重复所述假定、产生、产生和测量，以及
基于所述重复，从假定的值推导出所述多种不同扩增子中的每种扩增子的所述循环阈值的值。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述距离的测量对所述加和幅度曲线和所述假定的加和幅度曲线的部分进行。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述部分包括所述曲线的指数期。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述数学分析还包括使用用于对所述多重扩增反应建模的模型，所述模型通过多个过程参数被定义，并基于与所述模型相关的估计法估计所述过程参数的值。
14.根据权利要求13所述的方法，其中定义所述模型的多个过程参数包括：所述多重扩增反应的对应扩增的a)循环阈值、b)幅度和c)斜率。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述估计法包括以下的一种：
a)最大似然估计法和b)最大先验估计法。
16.根据权利要求14所述的方法，其中所述估计法包括以下的一种：
a)最大似然估计法和b)最大先验估计法。
17.根据权利要求13所述的方法，其中所述模型使用卡尔曼滤波器被递归地建模。
18.根据权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述模型使用卡尔曼滤波器被递归地建模。
19.一种方法，所述方法包括：
使用产生对应于多种不同扩增子的加和幅度信号的单通道检测器，检测多重扩增反应期间产生的所述多种不同扩增子；
定量多种检测的不同扩增子，以及
验证所述多种检测的不同扩增子，
(i)其中所述定量和所述验证包括使用产生的加和幅度信号的数学分析，所述加和幅度信号是所述多种不同扩增子的每种不同扩增子的幅度信号的加和，
其中所述数学分析包括：
使用信号处理技术以从对应于所述加和幅度信号的加和幅度曲线中分离所述多种不同扩增子中的一种扩增子的幅度曲线，以及
基于所述幅度曲线推导出所述扩增子的循环阈值的值，
(ii)其中所述定量还包括：
针对所述多种不同扩增子中的每种扩增子，基于所述加和幅度曲线的在先数学分析假定循环阈值的值，以及
基于所述假定，产生对应于所述多种不同扩增子中的每种扩增子的假定的幅度曲线，
基于所述产生，产生假定的加和幅度曲线，
基于所述产生，测量所述加和幅度曲线和所述假定的加和幅度曲线之间的距离，
重复所述假定、产生、产生和测量，以及
基于所述重复，从假定的值推导出所述多种不同扩增子中的每种扩增子的所述循环阈值的值，并且
(iii)其中所述验证还包括：
运行解链曲线分析；
基于所述运行，验证所述多种不同扩增子中的不同扩增子的数目，以及
基于所述运行，检测所述多种不同扩增子中的一种扩增子的存在。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述解链曲线分析还包括：
定义包括所述多种不同扩增子的多个解链温度的温度范围；
将所述温度范围分段为包括所述多种不同扩增子的解链温度的温度区域和不含所述多种不同扩增子的解链温度的温度区域；
定义缓慢温度斜变速率和快速温度斜变速率；
将所述缓慢温度斜变速率与包括解链温度的所述温度区域关联并将所述快速温度斜变速率与不含解链温度的温度区域关联；
基于所述关联，使解链曲线分析温度跨越所述温度范围斜变，以及
基于所述斜变，在缓慢斜变速率期间分析对应于所述多种不同扩增子的解链的解链曲线。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述定量还包括：
等待所述多重扩增反应的一个循环的完成；
运行解链曲线分析；
基于所述运行，获得所述多种不同扩增子中的一种扩增子的定量，以及
重复所述等待、所述运行和所述获得。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述定量还包括在所述多重扩增反应的一个或更多个对应循环期间运行一个或更多个解链曲线分析。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述一个或更多个解链曲线分析的所述运行是在以下的一项之间的温度过渡区域中进行：a)所述一个或更多个对应循环的变性阶段和退火阶段，和b)所述一个或更多个对应循环的延伸阶段和变性阶段。
24.根据权利要求1-3、5、10和19中任一项所述的方法，其中所述数学分析还包括将所述多种不同扩增子中的第一扩增子和所述多种不同扩增子中的第二不同扩增子之间幅度的差异考虑进去，所述幅度的差异基于所述第一扩增子和所述第二不同扩增子之间的长度差异。
25.根据权利要求8所述的方法，其中所述数学分析还包括将所述多种不同扩增子中的第一扩增子和所述多种不同扩增子中的第二不同扩增子之间幅度的差异考虑进去，所述幅度的差异基于所述第一扩增子和所述第二不同扩增子之间的长度差异。
26.根据权利要求13所述的方法，其中所述数学分析还包括将所述多种不同扩增子中的第一扩增子和所述多种不同扩增子中的第二不同扩增子之间幅度的差异考虑进去，所述幅度的差异基于所述第一扩增子和所述第二不同扩增子之间的长度差异。
27.根据权利要求1-3、5、10和19中任一项所述的方法，其中所述数学分析还包括将与所述多种不同扩增子中的第一扩增子相关的第一幅度信号和与所述多种不同扩增子中的第二不同扩增子相关的第二幅度信号之间的差异考虑进去，所述差异基于用于所述第一扩增子和所述第二不同扩增子的引物浓度的差异。
28.根据权利要求8所述的方法，其中所述数学分析还包括将与所述多种不同扩增子中的第一扩增子相关的第一幅度信号和与所述多种不同扩增子中的第二不同扩增子相关的第二幅度信号之间的差异考虑进去，所述差异基于用于所述第一扩增子和所述第二不同扩增子的引物浓度的差异。
29.根据权利要求13所述的方法，其中所述数学分析还包括将与所述多种不同扩增子中的第一扩增子相关的第一幅度信号和与所述多种不同扩增子中的第二不同扩增子相关的第二幅度信号之间的差异考虑进去，所述差异基于用于所述第一扩增子和所述第二不同扩增子的引物浓度的差异。
30.根据权利要求1-3、5、10、19、25-26和28-29中任一项所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述多种不同扩增子的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生加和幅度信号。
31.根据权利要求8所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述多种不同扩增子的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生加和幅度信号。
32.根据权利要求13所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述多种不同扩增子的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生加和幅度信号。
33.根据权利要求24所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述多种不同扩增子的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生加和幅度信号。
34.根据权利要求27所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述多种不同扩增子的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生加和幅度信号。
35.根据权利要求1-3、5、10、25-26和28-29中任一项所述的方法，其中所述定量还包括：
运行解链曲线分析；
基于所述运行，推导出所述多种不同扩增子中的一种扩增子的相对幅度；
将所述相对幅度与从与所述加和幅度信号相关的加和解链曲线推导出的阈值点关联，以及
基于所述关联，确定所述扩增子的阈值点，其中所述阈值点定量所述扩增子。
36.根据权利要求8所述的方法，其中所述定量还包括：
运行解链曲线分析；
基于所述运行，推导出所述多种不同扩增子中的一种扩增子的相对幅度；
将所述相对幅度与从与所述加和幅度信号相关的加和解链曲线推导出的阈值点关联，以及
基于所述关联，确定所述扩增子的阈值点，其中所述阈值点定量所述扩增子。
37.根据权利要求13所述的方法，其中所述定量还包括：
运行解链曲线分析；
基于所述运行，推导出所述多种不同扩增子中的一种扩增子的相对幅度；
将所述相对幅度与从与所述加和幅度信号相关的加和解链曲线推导出的阈值点关联，以及
基于所述关联，确定所述扩增子的阈值点，其中所述阈值点定量所述扩增子。
38.根据权利要求24所述的方法，其中所述定量还包括：
运行解链曲线分析；
基于所述运行，推导出所述多种不同扩增子中的一种扩增子的相对幅度；
将所述相对幅度与从与所述加和幅度信号相关的加和解链曲线推导出的阈值点关联，以及
基于所述关联，确定所述扩增子的阈值点，其中所述阈值点定量所述扩增子。
39.根据权利要求27所述的方法，其中所述定量还包括：
运行解链曲线分析；
基于所述运行，推导出所述多种不同扩增子中的一种扩增子的相对幅度；
将所述相对幅度与从与所述加和幅度信号相关的加和解链曲线推导出的阈值点关联，以及
基于所述关联，确定所述扩增子的阈值点，其中所述阈值点定量所述扩增子。
40.一种用于进一步多重化单通道检测器的多重扩增反应的方法，所述方法包括：
提供多个激发源；
激活所述多个激发源中的一个；
基于所述激活，激发对应于来自多种不同扩增子中的一种或更多种不同扩增子的一种或更多种荧光团；
基于所述激发，按照根据权利要求1-3、5、8、10、13、19、22、和24-29中任一项所述的方法进行所述一种或更多种不同扩增子的检测、定量和验证；
停用所述一个激发源；以及
对所述多个激发源的每个剩余激发源重复所述激活、所述激发、所述进行和所述停用，其中所述重复检测、定量和验证所述多种不同扩增子。
41.根据权利要求1-3、5、10、19、22、25-26、28-29和40中任一项所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述一种或更多种不同扩增子中的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生所述加和幅度信号。
42.根据权利要求8所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述一种或更多种不同扩增子中的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生所述加和幅度信号。
43.根据权利要求13所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述一种或更多种不同扩增子中的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生所述加和幅度信号。
44.根据权利要求24所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述一种或更多种不同扩增子中的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生所述加和幅度信号。
45.根据权利要求27所述的方法，其中所述检测还包括：
使用被配置以检测更宽范围波长的滤波器；
基于所述使用，检测与所述一种或更多种不同扩增子中的不同扩增子相关的不同波长，以及
基于所述检测，产生所述加和幅度信号。
46.一种用于分析多重扩增反应的基于处理器的硬件分析仪，其中所述基于处理器的硬件分析仪被配置以基于提供的对应于所述多重扩增反应的多种不同扩增子的加和幅度信号的数字表示，定量和验证所述多重扩增反应，所述加和幅度信号对应于所述多种不同扩增子的每种不同扩增子的幅度信号的加和，
其中所述定量和验证使用所述加和幅度信号的部分的数字表示的数学分析进行，所述数学分析以软件和/或固件代码实施并在所述基于处理器的分析仪上执行，并且
其中所述数学分析还包括信号处理技术，所述信号处理技术应用于所述加和幅度信号的斜率区域以基于所述斜率区域内的斜率变化从所述加和幅度信号的所述数字表示中分离所述多种不同扩增子中的一种扩增子的幅度曲线，并且适于基于所述幅度曲线推导出所述扩增子的循环阈值的值。
47.根据权利要求46所述的基于处理器的分析仪，其中所述基于处理器的分析仪还被配置以基于提供的加和解链曲线推导出所述多种不同扩增子中的一种扩增子的相对幅度。
48.一种用于进行多重扩增反应的装置，所述装置包括：
单通道检测器，所述单通道检测器被配置以检测对应于所述多重扩增反应的多种不同扩增子的加和幅度信号并产生所述信号的数字表示，所述加和幅度信号对应于所述多种不同扩增子的每种不同扩增子的幅度信号的加和；以及
根据权利要求46所述的基于处理器的分析仪，所述基于处理器的分析仪被配置以接收所述加和幅度信号的所述数字表示。
49.根据权利要求48所述的装置，还包括多个激发源。
50.根据权利要求48或权利要求49所述的装置，还包括适于检测更宽范围波长的更宽的带宽滤波器。
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