CN101570782B - 乳制品中8种致病菌检测试剂盒及其检测方法 - Google Patents

Abstract

用于食品微生物污染监控及检测的乳制品中8种致病菌检测试剂盒及其检测方法。所述的试剂盒包括检测溶液A和检测溶液B；检测溶液A和B中均含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM及Taq DNA聚合酶5U/μL，还分别各自含4种目标菌的特异性引物对各10μM。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测乳制品中8种致病菌，并且检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。

Description

乳制品中8种致病菌检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及乳制品中8种致病菌检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及利用mPCR-DHPLC技术进行检测的检测方法及所使用的试剂。。 

背景技术

2004年，安徽阜阳劣质奶粉哺喂的“大头娃娃”事件曝光后，奶粉安全已成为全社会的焦点，2008年因婴幼儿配方奶粉中三聚氰胺问题而引发的婴幼儿疾病的事件，更使全世界的目光都聚焦在奶粉等的食用安全方面。针对国内外不同品牌奶粉和进口原料奶粉中对婴幼儿有害病原菌的污染情况进行调研，发现奶粉中污染坂崎肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella Pnaumoniae)、变形杆菌(Proteuse)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、溶血性链球菌(Streptococcus)、粘质沙雷氏菌(serratia macescens)、气味沙雷氏菌(serratia odorifera)等的污染几率较高。奶粉是母乳的替代品，婴幼儿的主要食物来源，奶粉安全意义重大。 

阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科的一种。该菌在一定条件下可引起人和动物致病，因此被称为条件致病菌。1961年，英国首次报道2例由阪崎肠杆菌引起的脑膜炎病例，以后相继在美国、希腊、荷兰、冰岛、加拿大、比利时等国家报道了新生儿阪崎肠杆菌感染事件。具不完全资料报道，阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可能引起神经系统后遗症和死亡，死亡率高达50％以上。2001年4月美国田纳西州发生阪崎肠杆菌感染事件后，医务人员与疾病控制中心协同对感染源进行了调查，结果从10例婴儿体内分离到的阪崎肠杆菌，与从婴儿所食用的已开罐和未开罐的婴儿配方奶粉中分离到的指纹图谱一致。由此导致国际间第一次因阪崎肠杆菌污染而致商业婴儿配方粉的广泛召回。目前，虽然还不能确定阪崎肠杆菌的宿主和转播途径，但多起新生儿阪崎肠杆菌感染事件基本证实了婴儿配方奶粉是主要感染源。 

变形杆菌属有4个种：普通变形杆菌、奇异变形杆菌、产粘变形杆菌和潘 氏变形杆菌，其中以普通变形杆菌和奇异变形杆菌与临床关系较密切，特别是奇异变形杆菌可引起败血症，病死率较高。近年来，有关变形杆菌引起食物中毒的事件有所增加。 

绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌，属于假单胞菌属，在自然界中分布广泛，多见于水、空气、土壤中和物体表面上，也可见于正常人体表及人和动物的肠道中，人、畜肠道是绿脓杆菌的繁殖场所，为环境的主要污染源之一，也是一种重要的条件致病菌，常引起人皮肤化脓感染，特别是烧伤、烫伤、眼部疾病患者被感染后，常使病情恶化，并可引起败血症。2004年也见从卫生巾中分离出绿脓杆菌的报道。国家质量监督检验检疫总局、卫生部等部门有明确规定，在食品、化妆品、外用药品以及絮用纤维制品、妇女卫生用品等物品中不得检出绿脓杆菌。传统的检测方法主要依靠绿脓杆菌的生物学特征，通过分离培养结合生化鉴定等方法进行检测，不仅操作繁琐、耗时长，且容易延误诊断。 

目前国内外对微生物的检测方法还多停留在检测效率低、目标单一的水平上，还主要依靠传统的增菌、分离、生化鉴定方法，对于产芽孢菌的检测则更为落后。一般说来鉴定一种细菌需要7～10天，一些生化特性复杂的细菌(如致病性嗜水气单胞菌)最长的检测周期可达20天之久，这就影响了检测鉴定的周期。该现状显然不能满足目前食品安全迅速发展的需求。即便现在已经发展起来了PCR和实时PCR技术，也仅可达到对已知的常规微生物进行检测。而对于混合微生物样本、不常见的、苛刻的、发生变异的细菌则缺乏稳定而可靠的鉴定手段。致病性嗜水气单胞菌等对培养条件要求较高，生长缓慢，检测和鉴定周期长，而且传统培养生化检测方法检出率不高。因此，建立针对乳制品中多种微生物的高效、灵敏、便捷的检测方法很有必要。 

发明内容

本发明的目的在于提供用于乳制品中8种致病菌的检测试剂盒及其mPCR-DHPLC检测方法，这几种乳制品中的常见致病菌分别是阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌、普通变形杆菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌、致病性嗜水气单胞菌。 

首先，本发明所述的乳制品中8种致病菌检测试剂盒，该试剂盒包括检测溶液A和检测溶液B； 

其中，检测溶液A中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP 混合物(包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5mM)、Taq DNA聚合酶5U/μL及阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌的引物对各10μM； 

检测溶液B中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP混合物(包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5mM)、Taq DNA聚合酶5U/μL及致病性嗜水气单胞菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌和气味沙雷氏菌的引物对各10μM； 

其中，所述8种致病菌的特异性引物序列如下： 

本发明还提供了利用上述试剂盒检测乳制品中8种致病菌的检测方法，包括如下步骤： 

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul检测溶液A和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；另取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul检测溶液B和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；两个反应体系分别在5000r/min离心10s，然后按下列参数分别进行PCR扩增： 

预变性：94℃，3min； 

进入循环：94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环； 

终止延伸：72℃，7min； 

②将PCR扩增产物进行DHPLC分析： 

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm； 

柱温：50℃； 

流动相(体积比)：0.0min，51.0％缓冲溶液A，49.0％缓冲溶液B； 

                0.5min，45.7％缓冲溶液A，54.3％缓冲溶液B； 

                2.7min，41.3％缓冲溶液A，58.7％缓冲溶液B； 

                4.9min，38.7％缓冲溶液A，61.3％缓冲溶液B； 

                7.1min，37.1％缓冲溶液A，62.9％缓冲溶液B； 

                9.3min，35.9％缓冲溶液A，64.1％缓冲溶液B； 

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液； 

流速：0.9mL/min； 

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s； 

上样量：PCR产物5μL。 

检测结束后，根据DHPLC检测图谱中特征色谱峰的峰形、保留时间以及与阳性对照谱图的对照，来确定样品的染菌情况。 

本发明采用mPCR-DHPLC技术，针对乳制品中8种致病菌建立灵敏便捷的检测方法，并建立应用于该方法的快速检测试剂盒。使用本发明的检测试剂盒及检测方法，可以高灵敏度地检测乳制品中8种致病菌，并且检测耗时短，操作简捷，可以节省大量的劳力和财力，适合快速检测的要求。 

附图说明

本发明附图7幅： 

图1是阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌单一菌PCR-电泳检测结果； 

图2是阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌四重PCR-电泳检测电泳图； 

图3是阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌的四重PCR-DHPLC检测谱图； 

图4是奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌和致病性嗜水气单胞菌单一菌PCR-电泳检测结果； 

图5是奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌和致病性嗜水气单胞菌四重PCR-电泳检测电泳图； 

图6是奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌和致病性嗜水气单胞菌四重PCR-DHPLC检测谱图； 

图7是阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌mPCR-DHPLC灵敏度试验结果； 

图8是奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌、气味沙雷氏菌和致病性嗜水气单胞菌mPCR-DHPLC灵敏度试验结果； 

上述附图中，横坐标均为保留时间(单位：分钟min)，纵坐标表示吸收峰信号强度(单位：毫伏mV)。 

具体实施方式

下面为本发明的具体实施例，其对本方法的建立及其应用作进一步的说明，但并不以任何形式限制本发明的内容。 

本部分试验所用的营养肉汤培养液，普通琼脂培养平板，以及所使用的各菌株的增菌、分离和生化鉴定培养基等均按照相关的国家标准(GB)、检验检疫行业标准(SN)或国际权威标准方法中的配方，购于美国BD公司。 

细菌基因组DNA提取试剂(TakaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNAExtraction kit)；Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer，dNTPs等试剂购自宝生物工程(大连)有限公司；三乙胺乙酰盐(TEAA，色谱纯)购自Transgenomic公司；乙腈(色谱纯)购自Fisher公司。 

本部分试验所用的主要仪器和设备包括基因扩增仪(美国ABI公司)和变性高效液相色谱(简称DHPLC，美国Transgenomic公司)。 

本研究所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心(ATCC)和中国医学微生物菌种保藏管理中心(CMCC)。 

实施例1、乳制品中8种致病菌检测试剂盒及其检测方法的建立 

(1)引物的设计、合成与试剂盒的组装： 

在此基础上，设计用于乳制品中8种致病菌检测的试剂盒，该试剂盒包括两组检测溶剂：检测溶液A和检测溶液B； 

其中，检测溶液A中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP混合物(包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5mM)、Taq DNA聚合酶5U/μL及阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌的引物对各10μM； 

检测溶液B中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP混合物(包括dATP、dGTP、dCTP和dTTP各2.5mM)、Taq DNA聚合酶5U/μL及致病性嗜水气单胞菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌和气味沙雷氏菌的引物对各10μM。 

(2)mPCR-DHPLC检测方法 

本检测方法使用本实施例建立的检测试剂盒，包括如下检测步骤： 

①待检样品的制备： 

a.奶制品样品：无菌方法称取100克样品，加到已预热的(44℃)装有900mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(mLST)的2L三角瓶中，振摇使样品充分混匀后，44℃恒温培养22-24h。在液面1cm以下取mLST增菌液0.2mL加到装有5mL心脑浸液肉汤(BHI)的小试管中，混匀，36℃恒温水浴4h，水面要高于 试管中培养基高度。取BHI增菌液1.5mL，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。 

b.标准菌株：挑取单个菌落于营养肉汤中培养18～24h，使用细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，制取PCR模板。标记，直接作为PCR模板或-20℃保存。； 

②PCR扩增： 

取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul检测溶液A和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；另取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul检测溶液B和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；两个反应体系分别在5000r/min离心10s，然后按下列参数分别进行PCR扩增： 

预变性：94℃，3min； 

进入循环：94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环； 

终止延伸：72℃，7min； 

③DHPLC分析： 

色谱柱：PS-DVB & C18 DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm； 

柱温：50℃； 

流动相(体积比)：0.0min，51.0％缓冲溶液A，49.0％缓冲溶液B； 

                0.5min，45.7％缓冲溶液A，54.3％缓冲溶液B； 

                2.7min，41.3％缓冲溶液A，58.7％缓冲溶液B； 

                4.9min，38.7％缓冲溶液A，61.3％缓冲溶液B； 

                7.1min，37.1％缓冲溶液A，62.9％缓冲溶液B； 

                9.3min，35.9％缓冲溶液A，64.1％缓冲溶液B； 

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液； 

流速：0.9mL/min； 

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s； 

上样量：PCR产物5μL。 

实施例2、与常规PCR-电泳检测方法的比较 

实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法涉及两组PCR体系，第一组复合 PCR体系一次检测阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌；第二组复合PCR体系一次检测致病性嗜水气单胞菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌和气味沙雷氏菌。 

按照实施例1所建立的方法提取标准菌株的DNA作为模板，按照实施例1所建立的方法的PCR条件进行扩增：第一组阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌四种菌的预期扩增片段分别为：228bp、332bp、396bp、413bp；第二组致病性嗜水气单胞菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌和气味沙雷氏菌四种菌的预期扩增片段分别为：209bp、241bp、368bp、412bp；对扩增后的扩增产物分别采用电泳及实施例1所建立的DHPLC检测条件检测。 

第一组阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌各自单一PCR扩增的电泳检测结果见附图1所示；四重PCR扩增的电泳结果见附图2所示；四重PCR扩增的DHPLC检测结果见附图3所示；第二组致病性嗜水气单胞菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌和气味沙雷氏菌各自单一PCR扩增的电泳检测结果见附图4所示；四重PCR扩增的电泳结果见附图5所示；四重PCR扩增的DHPLC检测结果见附图6所示。 

由图1～3可见，当第一组四种细菌作单一PCR扩增和电泳检测时，均能明显地检测出各自单一的条带；而当该四种细菌作复合PCR扩增和电泳检测时，396bp、413bp的扩增条带却无法分开；但DHPLC检测中它们能清晰地分离并被准确检测；由图4～6可见，当第二组四种细菌作单一PCR扩增和电泳检测时，均能明显地检测出各自单一的条带；而当该四种细菌作复合PCR扩增和电泳检测时，209bp和241bp的扩增条带很难分开，368bp、412bp的扩增条带很难分开，但DHPLC检测中它们能清晰地分离并被准确检测。由此可见，本发明实施例1所建立的mPCR-DHPLC有更好的检测效果。 

实施例3、PCR-DHPLC检测方法特异性试验 

取表1中所列试验菌种，经培养后分别提取基因组DNA，建立模板库。然后以这些基因组DNA为模板，采用实施例1所建立的方法进行PCR-DHPLC分析检测。 

表1 

特异性试验结果表明，采用实施例1所建立的检测试剂盒及检测方法，两 次检测即可特异地检测8种目标致病菌；采用检测试剂A进行的检测，只有阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌检测出特异样品峰；采用检测试剂B进行的检测，只有致病性嗜水气单胞菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌和气味沙雷氏菌检测出特异样品峰，其它对照细菌的检测结果都为阴性，没有假阳性和假阴性结果，具有很高的特异性。 

实施例4、PCR-DHPLC模拟污染样品灵敏度试验 

以奶粉为例，制备乳制品中微生物模拟污染样品，用比浊法定量所模拟污染的菌液浓度，单位为CFU/mL。将致病菌的模拟污染肉汤进行系列稀释得到10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10的菌液，然后采用实施例1所建立的试剂盒及方法提取DNA，各取2μL做为模板，同样按照实施例1的方法进行mPCR-DHPLC检测，将检测结果与稀释梯度结果比较，确定检测灵敏度。检测结果如附图7(第一组)和附图8(第二组)所示。 

表1和表2为致病菌在不同稀释度下的细菌数量。 

表1第一细模拟污染液梯度稀释细菌数量表 

序号
		L01	阪崎肠杆菌29000\粘质沙雷氏菌51000\绿脓杆菌35000\普通变形杆菌17000
L02	阪崎肠杆菌2900\粘质沙雷氏菌5100\绿脓杆菌3500\普通变形杆菌1700
		L03	阪崎肠杆菌290\粘质沙雷氏菌510\绿脓杆菌350\普通变形杆菌170
L04	阪崎肠杆菌29\粘质沙雷氏菌51\绿脓杆菌35\普通变形杆菌17

表2第二组模拟污染液梯度稀释细菌数量表 

序号
		L05	奇异变形杆菌16000\肺炎克雷伯氏菌40000\气味沙雷氏菌29000\致病性嗜水气单胞菌120000
L06	奇异变形杆菌1600\肺炎克雷伯氏菌4000\气味沙雷氏菌2900\致病性嗜水气单胞菌12000
		L07	奇异变形杆菌160\肺炎克雷伯氏菌400\气味沙雷氏菌290\致病性嗜水气单胞菌1200
L08	奇异变形杆菌16\肺炎克雷伯氏菌40\气味沙雷氏菌29\致病性嗜水气单胞菌120

如附图7所示，第一组可以检测到表2中L03梯度的阪崎肠杆菌290CFU/mL，粘质沙雷氏菌510CFU/mL，绿脓杆菌350CFU/mL，普通变形杆菌170CFU/mL，即可以检测到10²的数量级的菌浓度；而PCR-凝胶电泳却只能检 测到L02梯度(10³的数量级)的菌浓度。 

如附图8所示，第二组可以检测到表2中L07梯度的奇异变形杆菌160CFU/mL，肺炎克雷伯氏菌400CFU/mL，气味沙雷氏菌290CFU/mL，致病性嗜水气单胞菌1200CFU/mL，即可以检测到10²的数量级的菌浓度；而PCR-凝胶电泳却只能检测到L06梯度(10³的数量级)的菌浓度。 

结果表明，本研究所建立的乳粉中致病菌PCR-DHPLC高通量检测方法的灵敏度非常高，可以达到10²CFU/mL的数量级。 

实施例5、应用于实际样品的检测试验 

自2007年12月至2008年6月的7个月期间，采用实施例1建立的多重PCR-DHPLC方法快速筛选，同时采用检验检疫行业标准(SN/T 1632.1-3-2005、SN/T 0751-1999、SN/T 0738-1997)的培养鉴定方法进行验证比较，同时检测实际样品，共检测2675份乳制品样品。结果表明，用多重PCR-DHPLC方法筛选检出的21份阳性样本，其中检出普通变形杆菌13份，奇异变形杆菌3份，4份样品检出阪崎肠杆菌，1份样品检出粘质沙雷氏菌，采用经典的生化方法进行验证，均证实多重PCR-DHPLC方法检测准确率100％。 

本实施例中，采用检验检疫行业标准SN/T 1632.1-3-2005、SN/T 0751-1999、SN/T 0738-1997)的方法，对8种菌均进行检测，平均总耗时(包括样品制备)576h，检测耗时(不包括样品制备)575h；使用mPCR-DHPLC方法，检测每个样品平均总耗时(包括样品制备)29h，检测耗时(不包括样品制备)0.5h。 

实施例6、应用于实际阳性样品的检测试验 

对既往检测工作中，已经由行标检测确认为阳性的样品应用实施例1的PCR-DHPLC方法进行检测。 

(1)在普通变形杆菌和奇异变形杆菌阳性样品检测中的应用 

①乳制品中普通变形杆菌和奇异变形杆菌检测结果 

留存样品中，有3份样品已证实同时检出普通变形杆菌和奇异变形杆菌。用实施例1建立的方法检测这3份样品，经多重PCR-DHPLC检出3份样品普通变形杆菌和奇异变形杆菌阳性。 

本试验采用普通变形杆菌和奇异变形杆菌阳性标准菌株、大肠杆菌阴性对照菌株(ATCC 17803)及水空白对照进行检测的结果表明，阳性对照检测出 DHPLC的阳性吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，阴性及水对照结果未见DHPLC吸收峰。多重PCR-DHPLC同时检测3株乳制品中的普通变形杆菌和奇异变形杆菌，均具有很好的阳性吸收峰重现性。 

②乳制品中普通变形杆菌和奇异变形杆菌分离株常规鉴定结果 

5株乳制品中的普通变形杆菌和奇异变形杆菌，常规分离培养鉴定结果与PCR-DHPLC检测结果比较，符合率为100％。 

结果表明：本实施例1建立的多重PCR-DHPLC检测乳制品致病菌的方法，与经典的培养生化鉴定方法具有很好的符合性和结果重现性。 

(2)在普通变形杆菌和阪崎肠杆菌阳性样品检测中的应用 

留存样品中，其中有2份样品已证实同时检出普通变形杆菌和阪崎肠杆菌。用实施例1建立的方法检测这2份样品，经多重PCR-DHPLC检出2份样品普通变形杆菌和阪崎肠杆菌阳性。取从样品中分离出的所留存的普通变形杆菌和阪崎肠杆菌分离株，提取DNA进行PCR-DHPLC的验证试验，普通变形杆菌和阪崎肠杆菌均经DHPLC检测到了扩增吸收峰，且出峰时间和峰型重现性较好，以大肠杆菌为阴性对照的检测结果则为阴性。 

[0114]SEQUENCE LISTING

<110>杨，春华

<120>乳制品中8种致病菌检测试剂盒及其检测方法

<130>N/A

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

gggttgtctg cgaaagcgaa                            20

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gtcttcgtgc tgcgagtttg                            20

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

ggaagcgact gcattattac cat                        23

<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tggtggtggc gatcactt                              18 

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gacaacgccc tcagcatcac cagc                                24

<210>6

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

cgctggccca ttcgctccag cgct                                24

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

gatggcaagt acaagtaag                                      19

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

gacgctgaga ttgaccta                                       18

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

caacgtgaga ttagtggtga                                     20 

<210>10

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

ctgctttaag ttcacaaatt aagtg                           25

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

tggcccgcgc ccagggttcg aaa                            23

<210>12

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gatgtcgtca tcgttgatgc cgag                           24

<210>13

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>13

tcgagcggta gcacagga                                  18

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>14

caacgtatta agctattg                                  18 

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>15

ccaaggggtc tgtggcgaca                         20

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<400>16

tttcaccggt aacaggattg                    

Claims (2)

1.乳制品中8种致病菌检测试剂盒，其特征在于包括检测溶液A和检测溶液B；

其中，检测溶液A中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及阪崎肠杆菌、粘质沙雷氏菌、绿脓杆菌和普通变形杆菌的引物对各10μM；

检测溶液B中含10mM Tris·Cl、50mM KCl、25mM MgCl₂、dNTP各2.5mM、Taq DNA聚合酶5U/μL及致病性嗜水气单胞菌、奇异变形杆菌、肺炎克雷伯氏菌和气味沙雷氏菌的引物对各10μM；

其中，所述8种致病菌的特异性引物序列如下：

2.乳制品中8种致病菌的检测方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤：

①取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul检测溶液A和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；另取1ul待测样品DNA溶液，加入10ul检测溶液B和14ul灭菌超纯水，总体积25ul；两个反应体系分别在5000r/min离心10s，然后按下列参数分别进行PCR扩增：

预变性：94℃，3min；

进入循环：94℃变性60s，56℃退火60s，72℃延伸60s，35次循环；

终止延伸：72℃，7min；

②将PCR扩增产物进行DHPLC分析：

色谱柱：PS-DVB&C18DNASep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；

柱温：50℃；

流动相(体积比)：0.0min，51.0％缓冲溶液A，49.0％缓冲溶液B；

0.5min，45.7％缓冲溶液A，54.3％缓冲溶液B；

2.7min，41.3％缓冲溶液A，58.7％缓冲溶液B；

4.9min，38.7％缓冲溶液A，61.3％缓冲溶液B；

7.1min，37.1％缓冲溶液A，62.9％缓冲溶液B；

9.3min，35.9％缓冲溶液A，64.1％缓冲溶液B；

其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液；缓冲溶液B是浓度为0.1M TEAA水溶液与乙腈按体积比3∶1的混合溶液；

流速：0.9mL/min；

检测器：荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；

上样量：PCR产物5μL。

Images