CN103725772A - 一种检测阪崎杆菌用核酸侧向流试纸条的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了食源性病原微生物阪崎肠杆菌(CronobactersakazakiiSakazakii)的快速核酸试纸条检测试剂盒及其应用方法，属于分子生物学和免疫学领域。本发明将核酸检测中的聚合酶链式反应的高灵敏度、高特异性方法与免疫学检测中的免疫胶体金快速检测技术相结合，通过设计独特的引物，对引物加以标记，对提取的靶DNA进行特异性扩增以及扩增产物在展开液中与试纸条条上固定的金标记抗体结合而形成稳定、可见的检测带及质控带，从而实现对主要食源性病原微生物快速、准确的检测。

Description

一种检测阪崎杆菌用核酸侧向流试纸条的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学和免疫学领域，涉及食品及加工原料中阪崎肠杆菌的核酸扩增产物侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。 

背景技术

为有效控制食品生产和进出口贸易中因致病性微生物引起的食源性疾病，保证食品领域的公共安全，需要开发灵敏、便捷、准确的食源性病原微生物检测方法。在食源性疾病危险因素中，在我国流行的食源性疾病中，微生物性食物中毒位居第一，而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球、单增李斯特菌、大肠杆菌O157：H7等病原菌。阪崎肠杆菌是人和动物肠道内寄生的一种革兰阴性无芽孢杆菌，属肠杆菌科肠杆菌属，是肠道正常菌丛中的一种，在一定条件下可引起人和动物致病，阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，并且可引起神经系统后 遗症和死亡。阪崎肠杆菌感染的大多数病例都是婴儿，特别是早产儿、 出生体重偏低等身体状况较差的新生儿。2008年,阪崎肠杆菌被提议由原分类种名Enterobacter Sakazakii重新定义为隶属于肠杆菌科的一个包含有5个新种的新属Cronobacter。，该属内五个种之间毒力作用存在差异。 

在传统的食品生产、质量监督和进出口检验检疫中常规的细菌培养及鉴定方法，检验步骤繁琐，检验周期长，同时对于有些细菌仍无法给出快速和准确的鉴定，不能完全满足农产品及进出口检验检疫的检测要求。基于核酸扩增的方法检测对象是来自病原微生物的DNA，经特异性扩增后进行产物鉴定，这类方法因灵敏度高，特异性好，耗时少而发展迅速，主要的方法包括普通/荧光PCR方法、核酸恒温扩增的LAMP和NASBA方法以及基因芯片技术。 

荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法，基本原理是在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性，具有实时性和准确性等特点，特别是依赖探针结合的TaqMan方法，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。但是，实时定量PCR检测对设备依赖性强，难以实现现场检测，常规的PCR扩增检测需要对PCR产物凝胶电泳后进行图像采集和分析，耗费时间较长，且难以保证检测的灵敏度。公开号为CN102816761的发明专利“阪崎肠杆菌的高特异性基因片段及其应用”提供了一种以16S RNA序列作为PCR检测对象的鉴定方法，发明专利“阪崎肠杆菌的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和检测试剂盒”（公开号：CN102154451）、“阪崎肠杆菌快速检测试剂盒及其检测方法”（公开号：CN101319249A）及公开号为CN101368204 

的发明专利“阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法”各自设计了环介导等温扩增的特异引物和检测方法，发明专利“快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法及试剂盒”（公开号：CN102127592）描述了以标准质粒结合定量检测进行奶粉中阪崎杆菌定量检测的方法，以上方法均以特异引物为基础，后续的检测以荧光实时定量结果为判据。

  

另一类检测方法是基于双抗体夹心的免疫学检测方法，其检测对象主要是蛋白质分子，竞争法检测的对象为小分子化合物和半抗原分子，这两种免疫学检测方法都可以用免疫胶体金试纸条的方法实现，是快速检测的常规方法，具有快速、简单、成本低廉的优点，广泛用于食品中毒素、病原微生物以及农药、抗生素残留的筛查。过去病原微生物的免疫学检测主要依据上述抗原与抗体的结合反应，“检测阪崎肠杆菌的酶联免疫吸附测试方法及其中所用的抗体”（公开号：CN101082624A）提供了一种可识别阪崎杆菌α-葡萄糖苷酶的特异性抗体的制备方法以及在酶联免疫吸附（ELISA）中的使用方法。在免疫胶体金检测中，利用抗原和抗体的特异性结合的特点，形成抗原一抗体一有色颗粒复合物而富集在包被线上，形成肉眼可见的有色沉淀线，对蛋白的检测依赖高亲和力和高特异性抗体的获得，在病原物分析时因为基因编码的规律和简并规则，DNA较蛋白质更易于产生序列差异，这种差异也更易于准确检出，通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率，通过在PCR扩增引物中引入特殊的标记物就可以实现双链产物的免疫学检测。

如上所述，通过将PCR扩增使用的引物标记特定的蛋白质或化合物可以在其扩增产物中引入同时包括两种化合物/蛋白质标记的核酸复合物，这个标记的产物可以通过抗体或者配体以类似双抗体夹心的方式进行检测，这个过程类似常规的免疫金标记检测技术，这种方法已经在单核苷酸多态性以及恒温扩增靶基因的方法中使用，公开号为CN 102134596 A的发明专利-一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法即以此方法进行单核苷酸多态性的检测。而公开号为CN 102520172 A的发明专利-单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用描述了一种分别采用生物素和地高辛标记引物的单增李斯特菌检测方法。因此类方法仅对扩增产物的有无进行判断，不对产物的分子量确认，因此在扩增反应中的干扰因素更多一些，常见的引起假阳性的原因包括：非特异性扩增、引物二聚体、扩增产物间的异常复性，解决引物二聚体、异常退火造成的干扰可以从PCR聚合酶的选择、引物序列优化、dNTP底物、杂交过程的控制几个方面开展。选择具有热启动（Hot-start）功能的DNA聚合酶可以明显降低引物二聚体和非特异扩增产物的形成。在引物优化方面，公开号为CN 102146432 A的发明专利-“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”描述了一种在引物5′端带有短回文序列的引物设计方法，该引物常温下自身环化，避免形成异源二聚体，公开号为CN 102719547 A的发明专利-“检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂”也采用了类似的方法用于实时定量PCR的扩增；公开号为CN 101842494 A的发明专利-“使用嵌合引物降低异源二聚体形成”描述了一种使用嵌合引物进行扩增的方法；在对反应底物的优化中，公开号CN 101171343A的发明专利“含有假异胞口密院核碱基衍生物的3′修饰寡核昔酸及其作为引物或探针的应用”提供了一种使用特别修饰的核苷酸作为底物以减少引物二聚体形成的方法，使用探针或者引入内控探针也可以降低非特异扩增的干扰，公开号为CN 101957373 A的发明专利-“一种加入内控核酸对病原体核酸进行半定量检测的方法”即采用内控探针来降低干扰，上述方法中，使用热启动技术和环化引物是通行的方法，其余方法或者采用了特殊合成的底物及底物，或者需要通过探针引入第二次杂交过程，都会增加检测过程的复杂程度，特别是探针杂交方法，因需要保温过程而失去了试纸条方法的便利性。 

本发明引物设计中，选择阪崎肠杆菌在保持特异性基础上，对引物对及引物内5′及3′末端退火的自由能进行评估后选择合适的区域避免二聚体的形成，针对试纸条检测方法二聚体的干扰情况以适当的扩增子长度，配合展开缓冲液中去污剂及变性剂的浓度优化，可以实现引物二聚体和非特异扩增产物的有效清除。 

发明内容

将生物小分子或化合物标记的核酸分子可以被该小分子或化合物的抗体特异性识别，从而通过免疫学方法检测。常见的可用于核酸分子标记的分子包括半抗原分子生物素（Biotin）、地高辛（Digoxin），荧光染料分子罗丹明(RBITC)、异硫氰酸荧光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC)、Cy3、Cy5等。上述标记分子中，地高辛、异硫氰酸荧光素都易于获得特异的抗体，而生物素分子与其配体-链亲和素具有高度特异的结合特性，因此这几种分子都可以选择用于核酸分子的标记和免疫学检测。本发明旨在将抗原或半抗原小分子标记单链寡核酸作为引物，对待检的靶核酸特异性扩增，形成的复合物分子同时具备两种抗原或半抗原标记，免疫原性的，该复合物即可用与特异抗体或特异配体结合，实现核酸扩增产物的免疫胶体金检测。 

因此，一方面，本发明提供一种试纸条法检测食源性病原微生物-阪崎肠杆菌(Enterobacter Sakazakii)的检测技术，主要包括： 

1)针对阪崎肠杆菌的16S RNA编码序列，设计两条独特的扩增引物，其中正向引物SKI-F具有如下序列：5′- GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3′，用抗原或半抗原分子生物素（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）或地高辛（Digoxin）中的一种标记；下游引物SKI-R的序列为5′-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3′，以不同于上游引物的一种标记；在适宜的扩增条件下，可扩增一段长度为282 bps的DNA片段；当无被检核酸模板存在时，无特异性核酸片段扩增产物；

2)将一种标准的通用抗体，如抗FITC抗体与胶体金颗粒交联，在颗粒表面形成包被的抗体；

3)将另一种标记分子的抗体或配体，如抗地高辛抗体或生物素分子的配体-链亲和素分子以线条状固定于膜上形成检测线；

4)当存在待检的特异性扩增产物时，因上、下游引物的作用，扩增产物中同时带有上述三种标记物种的两种，形成标记分子1-扩增产物-标记分子2的复合物；

5)将步骤4)形成的标志物1-扩增产物-标志物2与胶体金颗粒表面包被的标志物1的抗体结合，形成抗标志物1抗体-标志物1-扩增产物-标志物2有色颗粒复合物；

6)将步骤5)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至涂布有标志物2的抗体或配体的线条上，复合物因与标志物2的抗体（配体）结合而沉积，滞留在检测线上，形成肉眼可见的有色线条，判定为阳性；或者

7)当特异性扩增产物不存在时，不发生上述步骤4)-6)，不能形成标志物1-扩增产物-标志物2复合物，也就不能形沉积于检测线上标志物2的抗体（配体）之上，不形成可见的条带，判为阴性。

另一方面，本发明还提供了用于核酸序列检测的展开液，该展开液可以减少引物二聚体对实验结果的干扰； 

另一方面，本发明提供了用于食源性病原微生物的快速检测的试纸条，其包括在带有不干胶的衬垫，按顺序有：1：吸水滤纸垫；2：结合物垫，附有第一种核酸标记物的抗体或配体的生色颗粒（胶体金或乳胶）；3：侧向层析基质（硝酸纤维素膜或尼龙膜）；4：检测带，附有第二种核酸标记物的抗体；5：质控带，附有可结合特定种属来源抗体的抗体；6：衬底； 7：吸水垫。

另一方面，本发明还提供了用于检测核酸扩增产物的通用标准试纸条。 

    最后，本发明还提供了上述检测方法和试纸条在福氏志贺氏菌检测中的用途。 

    本发明说明书中所使用的技术术语解释： 

引物：DNA合成的起始物。一般为一对单链寡核普酸，在与模板杂交后，DNA合成从其3’末端开始。

标记：将可检测的信号分子(如半抗原，荧光，放射性等)与单链寡核苷酸相偶连的方法。 

杂交：特指互补的DNA单链通过碱基配对形成双链结构。 

展开：经扩增反应的PCR产物在展开缓冲液的层析作用下由试纸条吸水垫底端开始向检测线、质控线方向移动的过程。 

核酸：脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。 

抗原和半抗原：具备免疫原性的物质。通常为大分子蛋白质或细胞组分。但有些小分子也具备免疫原性，被称为半抗原((Hapten)。半抗原常被用于标记探针。 

抗体：能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。 

复合体：由两种或两种以上分子特异性结成的结合物。 

引物二聚体：在聚合酶链式反应（PCR）过程中，因引物对间、或单条引物相互退火形成的二聚体分子，由两条不同引物构成的二聚体为异二聚体，因带有两种标记而可能引起与种抗体（配体）的结合而造成假阳性，由单一引物退火形成的二聚体为同二聚体，仅带有一种标记而不会引起假阳性，但过多的二聚体形成会降低扩增效率。 

免疫试纸条：用于快速检测的医学工具。又称为呈色薄膜层析。 

核酸聚合酶：合成核酸长链的酶类。分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。 

有益效果： 

由于本发明是以标记的特异性引物扩增适当长度的基因片段，能够保证检测的高度特异性，从而保证了检测结果的准确性。本发明的新颖之处避免了扩增产物稀释和探针杂交等流程，保持了免疫胶体金(试纸条)技术直观，快速，方便，成熟，廉价等优点，又具备PCR扩增方法高度灵敏度、高度特异性的特点，因此，本发明的方法是一种理想的阪崎肠杆菌检测手段。

作为一个核酸扩增产物检测的通用技术平台，本发明的方法及其试纸条可以广泛用于食源性病原微生物临床检测，农牧业和食品工业，海关检验检疫，环境检测等领域。常见的重要致病菌如阪崎肠杆菌，沙门氏菌，副溶血性弧菌，蜡样芽胞杆菌，金黄色葡萄球菌，肉毒梭菌，单核细胞增生性李斯特菌，空肠弯曲菌以及肉制品和蔬菜中的肠出血性大肠埃希菌等。这些都可以是本发明的核酸扩增产物检测试纸检测的对象。 

    核酸试纸条检测方法的发明将大大简化核酸扩增后的检测程序。结果判读简单明了、直观(检测示意结果如附图2)。 

本专专利所申请的食源性病原微生物试纸条快速检测技术作为一种新型的核酸扩增后检测技术，具有以下优点： 

操作简单：只需要把核酸扩增后的样品直接滴到核酸试剂检测版上即可，不需要专业人员操作，不仅可用于大医院，也可适用于农村，边远地区和基层医院；

快速：检测5分钟后判读结果；

灵敏：与琼脂糖凝胶电泳相比，检测灵敏度提高近100～200倍；

特异性高：由于在检测过程中加使用的为特异性标记引物，使结果更加准确；

价格便宜：费用大大低于传统的凝胶电泳和ELISA检测。

如下实施例举例说明本发明的检测方法及其检测效果。实施例仅用来举例，并不构成对本发明保护范围的任何限制，本发明的保护范围在所附的权利要求书说明。 

附图说明

    附图1显示本发明的核酸序列扩增产物检测的试纸条的基本结构；

    附图2是核酸检测试纸条的检测结果示意图；

    附图3是显示用实施例1的方法，采用特异性标记引物检测阪崎肠杆菌PCR-试纸条的检测结果；

附图4是显示用实施例2的方法，采用检测阪崎肠杆菌特异性标记引物的特异性PCR-试纸条的检测结果；

附图5是用实施例2的方法，显示核酸扩增后试纸条与凝胶电泳检测法的敏感度比较结果。

实施例

实施例1

1 材料与方法

阪崎肠杆菌DNA

1.2引物设计

1.3 PCR扩增体系：

反应条件：

同时分别取3μl 用于核酸试纸条检测，取3μL扩增产物点于样品垫，加入到97μL 展开液中进行检测，5分钟后观察结果。

1.4 PCR特异性实验 

利用建立起来的PCR反应体系对1.阪崎肠杆菌、2.小肠结肠炎耶尔森氏菌、3.大肠杆菌、4..沙门氏菌、5.肠出血性大肠杆菌O157、6. 金黄色葡萄球菌、7.单增李斯特菌、8.福氏志贺菌，9 空白对照(水)，验证其特异性。

2 结果 

2.1 PCR反应体系及条件

采用TAKARA公司的HS Taq DNA polymerase，总反应体系为20μl。用Bio-Rad PCR仪进行检测，反应参数为： 94℃ 5 min，94℃ 30s，56.5℃ 30s，72℃  80 s进行扩增，30个循环后转入72℃  5 min，4℃保存。取5 μl产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳后判断有无特异性条带。核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的检测结果显示于附图4中。

2.2特异性试验 

本发明建立的PCR方法对阪崎肠杆菌具有较好的特异性，对其他种属细菌及肠杆菌科细菌等无交叉反应。

实施例2

核酸试纸条检测方法的灵敏性，将PCR模板以1，1/10，1/10²， 1/10³，1/10⁴，1/10⁵，1/10⁶，1/10⁷，1/10⁸,1/10⁹，1/10¹⁰的比例稀释后,按已建立的PCR体系进行扩增。

1 材料与方法 

阪崎肠杆菌DNA

1.2引物设计

1.3 PCR扩增体系：

模板DNA：质粒DNA	10 μl
		PrimerF/R	0.8 μl
dNTP	2.0 μl
		10X PCRbuffer	2.0 μl
HS Taq DNA polymerase	0.2 μl
		ddH2O	4.2 μl
总体积	20 μl

反应条件：

95 ℃	5 min
		94 ℃	30 sec
56.5 ℃	30 sec
		72 ℃	80 sec
72 ℃	5 min
		共30循环

分别取5μl 用于琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳条件为：1X TBE缓冲液，电压100V，电泳时间30分。同时分别取3μl 用于核酸试纸条检测，取3μl 样品点于样品垫加入到97μL 展开液中进行检测，5分钟后观察结果。

2 结果 

2.1 PCR反应体系及条件

采用TAKARA公司的HS Taq DNA polymerase，总反应体系为20μl。用Bio-Rad PCR仪进行检测，反应参数为： 94℃ 5 min，94℃ 30s，56.5℃ 30s，72℃  80 s进行扩增，30个循环后转入72℃  5 min，4℃保存。取5 μl产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，电泳后判断有无特异性条带。核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的敏感度比较结果显示于附图5中，由附图5的结果可以看出，与传统的凝胶电泳相比，其敏感度增加100～200。

本发明公开了食源性病原微生物阪崎杆菌的快速核酸试纸条检测试剂盒制备及其应用方法，还公开了针对阪崎肠杆菌的特异性核酸序列PCR扩增产物的引物设计，以此PCR产物进行核酸侧向流试纸条检测的方法及用途。本发明的方法也可对其他来源病原微生物特异性PCR扩增产物进行检测，其特异性由扩增引物保证。

1. 阪崎肠杆菌检测 

阪崎肠杆菌为模板，PCR结果直接进行检测，结果见图3。表明，PCR检测以3μl扩增产物进行检测，此时检测结果，阳性菌株检测线为阳性；阴性对照、负对照检测线为阴性。

2.特异性检测 

（1）同属其它菌株：菌株见试验菌株1，菌株编号与结果编号相同，检测结果为3μl扩增产物，全部为阴性，见图4，其中1为阪崎肠杆菌标准菌株BAA894。

（2）阴性对照菌：菌株为肠杆菌科细菌，详见试验菌株2，菌株编号与结果编号相同，检测结果为3μl扩增产物直接检测，全部为阴性，见图4部分，其中a为BAA894标准菌株，具体编号：1.阪崎肠杆菌、2.小肠结肠炎耶尔森氏菌、3.大肠杆菌、4..沙门氏菌、5.肠出血性大肠杆菌O157、6. 金黄色葡萄球菌、7.单增李斯特菌、8.福氏志贺菌，9 空白对照(水)。 

3.灵敏度 

核酸扩增产物5 μl在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳，5 μl核酸扩增产物试纸条检测，核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的敏感度比较结果显示于附图5中，由附图5的结果可以看出，与传统的凝胶电泳相比，其敏感度增加100～200。

一种检测阪崎杆菌用核酸侧向流试纸条的制备方法及其应用 

阪崎肠杆菌（Enterobacter Sakazakii更名为Cronobacter）的序列

GGGTTGTCTGCGAAAGCGAAGTCCCTTTCGTCTAGAGGCCCAGGACACCGCCCTTTCACGGCGGTAACAGGGGTTCGAATCCCCTAAGGGACGCCACCTGCTGGTAATGAGTGAAAGGCGTTACCGATTAATATCTCAAAACTGACTGTAAAGTCACGTTTGAGATATTTGCTCTTTAACAATCCGGAACAAGCTGAAAATTGAAACAGACATGCTGCTGCATTTCTCCGTAATCAGGAATGCGCGGTGTGTCAGAGTCTCTCAAACTCGCAGCACGAAGAC。

Claims (7)

1.本发明提供一种食源性病原微生物-阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii)的试纸条快速检测方法。

2.如权利要求1所述的检测方法，采用两条独特设计的引物PCR进行扩增反

应，其中上游引物SKI-F的序列为：5′-Biotin-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3′，下游引物SKI-R的序列为5′-FITC-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3′，该引物对的5′端分别进行标记以便于检测。

3.如权利要求1所述的检测方法使用带有核酸变性剂的展开缓冲液完成试纸条上的层析，其成分为：10mM Tris、1% BSA、1% Tween 20以及浓度分别为0.05mol/L到0.5mol/L的NaOH。

4.权利要求1所述的用于核酸扩增产物检测的试纸条，其中有色颗粒是胶体金颗粒或乳胶颗粒，所述的纤维膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。

5.如权利要求2所述的PCR过程，其引物对可以选择生物素分子（Biotin）、异硫氰酸荧光素（FITC）或地高辛（Digoxin）中两种不同的方法标记。

6.如权利要求2所述的PCR过程，其反应条件为：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 sec；56.5 ℃退火 30 sec；72 ℃延伸 30sec，扩增30个循环，最后72 ℃延伸5 min。

7.权利要求1所述的PCR-免疫胶体金试纸条用于食源性病原微生物阪崎肠杆菌的扩增及通过免疫胶体金技术进行检测的用途。

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