CN103773849A - 一种检测肠出血性大肠杆菌o157的核酸侧向流试纸条试剂盒的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了肠出血性大肠杆菌O157:H7的快速核酸试纸条检测试剂盒的制备及应用方法,属于细菌检验技术领域。本发明将核酸检测中的聚合酶链式反应的高灵敏度、高特异性方法与免疫学检测中的免疫胶体金快速检测技术相结合,以标记的独特引物对靶DNA进行特异性扩增,将扩增产物在展开液中与试纸条条上固定的金标记抗体结合而形成稳定、可见的检测带及质控带,可以实现对大肠杆菌O157:H7快速、准确的检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和免疫学领域,涉及食品及加工原料中肠出血性大肠杆菌(O-157)的核酸扩增产物侧向流免疫胶体金试纸条试剂盒的制备和应用方法。
背景技术
为有效控制食品生产和进出口贸易中因致病性微生物引起的食源性疾病,保证食品领域的公共安全,需要开发灵敏、便捷、准确的食源性病原微生物检测方法。在食源性疾病危险因素中,在我国流行的食源性疾病中,微生物性食物中毒位居第一,而在食源性病原微生物中其中最典型的致病菌是大肠杆菌O157:H7、阪崎肠杆菌、金黄色葡萄球、单增李斯特菌等病原菌。大肠杆菌O157:H7是革兰氏阴性杆菌,寄生于人类和动物肠道内,可产生大量的Vero毒素(VT),也称作类志贺氏毒素(SLT),是EHEC的主要致病因子。Vero毒素按免疫原性等方面的不同可分为VT1和VT2。该毒素有一个A亚单位和5~6个B亚单位组成。B亚单位与宿主肠壁细胞糖脂受体结合,具有毒素活性的A亚单位进入细胞,改变60s核糖体的组分,干扰蛋白质的合成。编码VT的基因位于噬菌体上,可缺失而不产生VT。
在传统的食品生产、质量监督和进出口检验检疫中常规的细菌培养及鉴定方法,检验步骤繁琐,检验周期长,同时对于有些细菌仍无法给出快速和准确的鉴定,不能完全满足农产品及进出口检验检疫的检测要求。基于核酸扩增的方法检测对象是来自病原微生物的DNA,经特异性扩增后进行产物鉴定,这类方法因灵敏度高,特异性好,耗时少而发展迅速,主要的方法包括普通/荧光PCR方法、以及环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)、分支滚环扩增(hyper-branched rolling cycle amplification,HRCA)及链替代扩增(SDA)等恒温扩增-检测技术。
荧光定量PCR技术是一种高灵敏度核酸检测和定量方法,基本原理是在实时荧光定量PCR反应中,引入了一种荧光化学物质,随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断积累,荧光信号强度也等比例增加。荧光定量PCR技术使定性检测迈上了可以量化的台阶,而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性,具有实时性和准确性等特点,特别是依赖探针结合的TaqMan方法,目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。但是,实时定量PCR检测对设备依赖性强,难以实现现场检测,常规的PCR扩增检测需要对PCR产物凝胶电泳后进行图像采集和分析,耗费时间较长,且难以保证检测的灵敏度。
发明专利“MGB探针多重荧光定量PCR检测大肠杆菌O157的方法(公开号:CN1952647A)”同时对rfbE和vt2两个靶基因片段进行扩增后定量分析以增加检测的灵敏度和准确性。通过多重PCR或者芯片可以实现多种病原微生物的共检,公开号为CN102816850的发明专利“同时检测鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核增生李斯特菌的方法”及公开号为CN201210356725的发明专利“四种致腹泻性大肠杆菌的多重PCR检测方法及其引物组”分别提供了以多对引物同时检测三种或四种病原微生物的方法,两种方法均采用琼脂糖凝胶电泳的方法检测。发明专利“大肠杆菌O157的环介导等温扩增检测引物组、检测方法和试剂盒”(公开号:CN102943113)描述了一种以环介导恒温扩增方法结合荧光显色进行实现快速检测的方法,但检测手段并无明显改良,操作较为复杂。
另一类检测方法是基于双抗体夹心的免疫学检测方法,其检测对象主要是蛋白质分子,竞争法检测的对象为小分子化合物和半抗原分子,这两种免疫学检测方法都可以用免疫胶体金试纸条的方法实现,是快速检测的常规方法,具有快速、简单、成本低廉的优点,广泛用于食品中毒素、病原微生物以及农药、抗生素残留的筛查。过去病原微生物的免疫学检测主要依据上述抗原与抗体的结合反应,用酶联免疫吸附(ELISA)方法或免疫胶体金试纸条或完成检测。在免疫胶体金检测中,利用抗原和抗体的特异性结合的特点,形成抗原一抗体一有色颗粒复合物而富集在包被线上,形成肉眼可见的有色沉淀线,对蛋白的检测依赖高亲和力和高特异性抗体的获得,在病原物分析时因为基因编码的规律和简并规则,DNA较蛋白质更易于产生序列差异,这种差异也更易于准确检出,通过将免疫学检测的方法移植于核酸产物检测可以有效提高核酸产物的检测效率,通过在PCR扩增引物中引入特殊的标记物就可以实现双链产物的免疫学检测。
如上所述,通过将PCR扩增使用的引物标记特定的蛋白质或化合物可以在其扩增产物中引入同时包括两种化合物/蛋白质标记的核酸复合物,这个标记的产物可以通过抗体或者配体以类似双抗体夹心的方式进行检测,这个过程类似常规的免疫金标记检测技术,这种方法已经在单核苷酸多态性以及恒温扩增靶基因的方法中使用,公开号为CN 102134596 A的发明专利“一种基于核酸横向流试纸条检测单核苷酸多态性的方法”即以此方法进行单核苷酸多态性的检测。而公开号为CN 102520172 A的发明专利-“单增李斯特氏菌核酸层析检测试剂盒及其检测方法和应用”描述了一种分别采用生物素和地高辛标记引物的单增李斯特菌检测方法。对沙门氏菌的检测,公开号为CN102816855A的发明专利“基于超分支滚环扩增的核酸试纸条检测食品致病菌的方法及试剂盒”提供了一种使用LAMP方法进行扩增及对扩增产物进行试纸条检测的方法,具备恒温扩增和快速检测的特点,但由于LAMP方法自身的特点,扩增靶序列长度不宜超过300 bp,长于500 bp则很难扩增,同时多条引物在同一反应系统中共存,单一避免各类非特异产物的产生,故此类方法并不适于试纸条检测。要解决试纸条检测中因非特异性扩增、引物二聚体、扩增产物间的异常复性等产生的干扰可以从PCR聚合酶的选择、引物序列优化、dNTP底物、杂交过程的控制几个方面寻找解决方法。选择具有热启动(Hot-start)功能的DNA聚合酶可以明显降低引物二聚体和非特异扩增产物的形成。在引物优化方面,公开号为CN 102146432 A的发明专利-“一对部分同序引物减少其二聚体的方法”描述了一种在引物5′端带有短回文序列的引物设计方法,该引物常温下自身环化,避免形成异源二聚体,公开号为CN 102719547 A的发明专利-“检测HER2基因表达水平的实时荧光定量PCR试剂”也采用了类似的方法用于实时定量PCR的扩增;公开号为CN 101842494 A的发明专利-“使用嵌合引物降低异源二聚体形成”描述了一种使用嵌合引物进行扩增的方法;在对反应底物的优化中,公开号CN 101171343A的发明专利“含有假异胞嘧啶核碱基衍生物的3′修饰寡核苷酸及其作为引物或探针的应用”提供了一种使用特别修饰的核苷酸作为底物以减少引物二聚体形成的方法,使用探针或者引入内控探针也可以降低非特异扩增的干扰,公开号为CN 101957373 A的发明专利-“一种加入内控核酸对病原体核酸进行半定量检测的方法”即采用内控探针来降低干扰,上述方法中,使用热启动技术和环化引物是通行的方法,其余方法或者采用了特殊合成的底物及底物,或者需要通过探针引入第二次杂交过程,都会增加检测过程的复杂程度,特别是探针杂交方法,因需要保温过程而失去了试纸条方法的便利性。
本发明引物设计中,在保持特异性基础上,对引物对及引物内5′及3′末端退火的自由能进行评估后选择合适的区域避免二聚体的形成,针对试纸条检测方法二聚体的干扰情况以适当的扩增子长度,配合展开缓冲液中去污剂及变性剂的浓度优化,可以实现引物二聚体和非特异扩增产物的有效清除。
发明内容
将生物小分子或化合物标记的核酸分子可以被该小分子或化合物的抗体特异性识别,从而通过免疫学方法检测。常见的可用于核酸分子标记的分子包括半抗原分子生物素(Biotin)、地高辛(Digoxin),荧光染料分子罗丹明(RBITC)、异硫氰酸荧光素 (Fluorescein isothiocyanate, FITC)、Cy3、Cy5等。上述标记分子中,地高辛、异硫氰酸荧光素都易于获得特异的抗体,而生物素分子与其配体-链亲和素具有高度特异的结合特性,因此这几种分子都可以选择用于核酸分子的标记和免疫学检测。本发明旨在将抗原或半抗原小分子标记单链寡核酸作为引物,对待检的靶核酸特异性扩增,形成的复合物分子同时具备两种抗原或半抗原标记,免疫原性的,该复合物即可用与特异抗体或特异配体结合,实现核酸扩增产物的免疫胶体金检测。
因此,一方面,本发明提供一种试纸条法检测食源性病原微生物-大肠杆菌O157:H7的检测技术,主要包括:
1)设计两条独特的扩增引物,其中正向引物O-157-F具有如下序列:5′- ATTGCGCTGAAGCCTTTG-3′,用抗原或半抗原分子生物素(Biotin)、异硫氰酸荧光素(FITC)或地高辛(Digoxin)中的一种标记;下游引物invA-R的序列为5′- CGAGTACATTGGCATCGTG-3′,以不同于上游引物的一种标记;在适宜的扩增条件下,可扩增一段长度为499 bps的DNA片段;当无被检核酸模板存在时,无特异性核酸片段扩增产物;
2)将一种标准的通用抗体,如抗FITC抗体与胶体金颗粒交联,在颗粒表面形成包被的抗体;
3)将另一种标记分子的抗体或配体,如抗地高辛抗体或生物素分子的配体-链亲和素分子以线条状固定于膜上形成检测线;
4)当存在待检的特异性扩增产物时,因上、下游引物的作用,扩增产物中同时带有上述三种标记物种的两种,形成标记分子1-扩增产物-标记分子2的复合物;
5)将步骤4)形成的标志物1-扩增产物-标志物2与胶体金颗粒表面包被的标志物1的抗体结合,形成抗标志物1抗体-标志物1-扩增产物-标志物2有色颗粒复合物;
6)将步骤5)得到的有色颗粒复合物在溶液中通过毛细现象沿纤维膜向上流动至涂布有标志物2的抗体或配体的线条上,复合物因与标志物2的抗体(配体)结合而沉积,滞留在检测线上,形成肉眼可见的有色线条,判定为阳性;或者
7)当特异性扩增产物不存在时,不发生上述步骤4)-6),不能形成标志物1-扩增产物-标志物2复合物,也就不能形沉积于检测线上标志物2的抗体(配体)之上,不形成可见的条带,判为阴性。
另一方面,本发明还提供了用于核酸序列检测的展开液,该展开液可以减少引物二聚体对实验结果的干扰;
另一方面,本发明提供了用于食源性病原微生物的快速检测的试纸条,其包括在带有不干胶的衬垫,按顺序有:1:吸水滤纸垫;2:结合物垫,附有第一种核酸标记物的抗体或配体的生色颗粒(胶体金或乳胶);3:侧向层析基质(硝酸纤维素膜或尼龙膜);4:检测带,附有第二种核酸标记物的抗体;5:质控带,附有可结合特定种属来源抗体的抗体;6:衬底; 7:吸水垫。
另一方面,本发明还提供了用于检测核酸扩增产物的通用标准试纸条。
最后,本发明还提供了上述检测方法和试纸条在大肠杆菌O157:H7菌检测中的用途。
本发明说明书中所使用的技术术语解释:
引物:DNA合成的起始物。一般为一对单链寡核苷酸,在与模板杂交后,DNA合成从其3’末端开始。
标记:将可检测的信号分子(如半抗原,荧光,放射性等)与单链寡核苷酸相偶联的方法。
杂交:特指互补的DNA单链通过碱基配对形成双链结构。
展开:经扩增反应的PCR产物在展开缓冲液的层析作用下由试纸条吸水垫底端开始向检测线、质控线方向移动的过程。
核酸:脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的通称。
抗原和半抗原:具备免疫原性的物质。通常为大分子蛋白质或细胞组分。但有些小分子也具备免疫原性,被称为半抗原((Hapten)。半抗原常被用于标记探针。
抗体:能与抗原或半抗原特异性结合的蛋白质分子。
复合体:由两种或两种以上分子特异性结成的结合物。
引物二聚体:在聚合酶链式反应(PCR)过程中,因引物对间、或单条引物相互退火形成的二聚体分子,由两条不同引物构成的二聚体为异二聚体,因带有两种标记而可能引起与种抗体(配体)的结合而造成假阳性,由单一引物退火形成的二聚体为同二聚体,仅带有一种标记而不会引起假阳性,但过多的二聚体形成会降低扩增效率。
免疫试纸条:用于快速检测的医学工具。又称为呈色薄膜层析。
核酸聚合酶:合成核酸长链的酶类。分为DNA聚合酶和RNA聚合酶两大类。
有益效果:
由于本发明是以标记的特异性引物扩增适当长度的基因片段,能够保证检测的高度特异性,从而保证了检测结果的准确性。本发明的新颖之处避免了扩增产物稀释和探针杂交等流程,保持了免疫胶体金(试纸条)技术直观,快速,方便,成熟,廉价等优点,又具备PCR扩增方法高度灵敏度、高度特异性的特点,因此,本发明的方法是一种理想的大肠杆菌O157:H7检测手段。
作为一个核酸扩增产物检测的通用技术平台,本发明的方法及其试纸条可以广泛用于食源性病原微生物临床检测,农牧业和食品工业,海关检验检疫,环境检测等领域。常见的肉制品和蔬菜中的肠杆菌O157:H7及其他重要致病菌如副溶血性弧菌,蜡样芽胞杆菌,金黄色葡萄球菌,肉毒梭菌,单核细胞增生性李斯特菌,空肠弯曲菌以及等。这些都可以是本发明的核酸扩增产物检测试纸检测的对象。
核酸试纸条检测方法的发明将大大简化核酸扩增后的检测程序。结果判读简单明了、直观(检测示意结果如附图2)。
本专利所申请的食源性病原微生物试纸条快速检测技术作为一种新型的核酸扩增后检测技术,具有以下优点:
操作简单:只需要把核酸扩增后的样品直接滴到核酸试剂检测板上即可,不需要专业人员操作,便于推广至现场检测;
快速:检测5分钟后判读结果;
灵敏:与琼脂糖凝胶电泳相比,检测灵敏度提高约100倍;
特异性高:由于在检测过程中加使用的为特异性标记引物,使结果更加准确;
价格便宜:费用大大低于传统的凝胶电泳和ELISA检测。
如下实施例举例说明本发明的检测方法及其检测效果。实施例仅用来举例,并不构成对本发明保护范围的任何限制,本发明的保护范围在所附的权利要求书说明。
附图的简要说明
附图1:显示本发明的核酸序列扩增产物检测的试纸条的基本结构
1:吸水滤纸垫;2:结合物垫,附有第一种核酸标记物的抗体或配体的生色颗粒(胶体金或乳胶);3:侧向层析基质(硝酸纤维素膜或尼龙膜);4:检测带,附有第二种核酸标记物的抗体;5:质控带,附有可结合特定种属来源抗体的抗体;6:衬底; 7:吸水垫。
附图2是核酸检测试纸条的检测结果示意
其中阳性显示为检测线和质控线均显色,阴性显示仅质控线显色,如检测线及质控线均不显色则检测结果无效。
附图3是显示用实施例1的方法,采用特异性标记引物检测大肠杆菌O157:H7PCR-试纸条的检测结果
大肠杆菌O157:H7为模板,PCR结果直接进行检测,以3μl扩增产物进行检测,此时检测结果1为阳性菌株检测线,结果阳性;2:大肠杆菌检测结果,阴性;3:空白对照,阴性。以上结果质控线阳性,表明结果可靠。
附图4是显示用实施例2的方法,采用大肠杆菌O157:H7特异性标记引物的特异性PCR-试纸条的检测结果。检测中包括大肠杆菌O157:H7同属菌株、其它肠杆菌科细菌和空白对照,
附图5是用实施例2的方法,显示核酸扩增后试纸条与凝胶电泳检测法的敏感度比较结果。
样本1-10分别为将核酸模进行原倍,10,102, 103,104,105,106,107,108及109连续稀释后,按已建立的PCR体系进行扩增,分别取5 μl扩增产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳检测和在试纸条上展开杂交检测的结果,可见试纸条的检测灵敏度较凝胶电泳高100倍左右。
实施例
实施例1
1 材料与方法
大肠杆菌O157:H7DNA
1.2引物设计
1.3 PCR扩增体系:
反应条件:
同时分别取3μl 用于核酸试纸条检测,取3μL扩增产物点于样品垫,加入到97μL 展开液中进行检测,5分钟后观察结果。
1.4 PCR特异性实验
利用建立起来的PCR反应体系对1.大肠杆菌O-157:H7、2.阴沟肠杆菌、3.肺炎克雷伯氏菌、4.团聚肠杆菌、5.阪崎肠杆菌、6.大肠杆菌、7.沙门氏菌、8.金黄色葡萄球菌、9.空白对照(水)进行扩增及检测,验证其特异性。
2 结果
2.1 PCR反应体系及条件
采用TaKaRa公司的HS Taq DNA polymerase,总反应体系为20μl。用Bio-Rad T00 PCR仪进行检测,反应参数为: 94℃ 5 min,94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 80 s进行扩增,30个循环后转入72℃ 5 min,4℃保存。取5μl产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳,电泳后判断有无特异性条带。
2.2特异性试验
取PCR产物各3μl电泳检测,全部为阴性,见图4部分,其中1为ATCC35150标准菌株,全部为阴性,见图4,其中1为大肠杆菌O-157:H7标准菌株ATCC35150。具体编号:1.O-157、2.阴沟肠杆菌、3.肺炎克雷伯氏菌、4.团聚肠杆菌、5.阪崎肠杆菌、6.大肠杆菌、7.沙门氏菌、8.金黄色葡萄球菌、9.空白对照(水),试纸条检测结果与电泳结果一致,表明该方法对O-157:H7具有较好的特异性,对其他种属细菌及肠杆菌科细菌等无交叉反应。
实施例2
核酸试纸条检测方法的灵敏性,将PCR模板以1,1/10,1/102, 1/103,1/104,1/105,1/106,1/107,1/108,1/109的比例稀释后,按已建立的PCR体系进行扩增。
1 材料与方法
大肠杆菌O157:H7DNA
1.2引物设计
1.3 PCR扩增体系:
反应条件:
分别取5μl 用于琼脂糖凝胶电泳。凝胶电泳条件为:1X TBE缓冲液,电压100V,电泳时间30分。同时分别取3μl 用于核酸试纸条检测,取3μl 样品点于样品垫,加入到97μL 展开液中进行检测,5分钟后观察结果。
2 结果
2.1 PCR反应体系及条件
取5 μl产物在含溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳中进行电泳,电泳后判断有无特异性条带。核酸扩增后试纸条与凝胶电泳的敏感度比较结果显示于附图5中,由附图5的结果可以看出,与传统的凝胶电泳相比,其敏感度增加100倍左右。
ATTGCGCTGAAGCCTTTGGTTCTAAATATAAAGGTAAATATGTGGGAACATTTGGAGATATTTCTACTTTTAGCTTTTTTGGAAATAAAACTATTACTACAGGTGAAGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAAACACTTTATGACCGTTGTTTACATTTTAAAGGCCAAGGATTAGCTGTACATAGGCAATATTGGCATGACGTTATAGGCTACAATTATAGGATGACAAATATCTGCGCTGCTATAGGATTAGCCCAGTTAGAACAAGCTGATGATTTTATATCACGAAAACGTGAAATTGCTGATATTTATAAAAAAAATATCAACAGTCTTGTACAAGTCCACAAGGAAAGTAAAGATGTTTTTCACACTTATTGTATGGTCTCAATTCTAACTAGGACCGCAGAGGAAAGAGAGGAATTAAAGGATCACCTTGCAGATAAACTCATCGAAACAAGGCCAGTTTTTACCCTGTCCACACGATGCCAATGTACTCG
Claims (7)
1.本发明提供一种食源性病原微生物-大肠杆菌O157:H7的试纸条快速检测方法。
2.如权利要求1所述的检测方法,采用两条独特设计的引物PCR进行扩增反应,其中上游引物O-157-F的序列为:5′-ATTGCGCTGAAGCCTTTG-3′,下游引物O-157-R的序列为:5′-CGAGTACATTGGCATCGTG-3′,该引物对的5′端分别进行标记以便于检测。
3.如权利要求1所述的检测方法使用带有核酸变性剂的展开缓冲液完成试纸条上的层析,其成分为:10mM Tris、1% BSA、1%(V/V) Tween20以及浓度分别为0.05mol/L到0.5mol/L的NaOH。
4.权利要求1所述的用于核酸扩增产物检测的试纸条,其中有色颗粒是胶体金颗粒或乳胶颗粒,所述的纤维膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
5.如权利要求2所述的PCR过程,其引物对可以选择生物素分子(Biotin)、异硫氰酸荧光素(FITC)或地高辛(Digoxin)中两种不同的分子标记。
6.如权利要求2所述的PCR过程,其反应条件为:95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 sec;57 ℃退火 30 sec;72 ℃延伸 30sec,扩增30个循环,最后72 ℃延伸5 min。
7.权利要求1所述的PCR-免疫胶体金试纸条用于食源性病原微生物大肠杆菌O157:H7的扩增及通过免疫胶体金技术进行检测的用途。
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CN (1) | CN103773849A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105331730A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-17 | 辽宁医学院 | 一种快速检测制药用水中微生物的方法 |
CN108977555A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-12-11 | 南京农业大学 | 一种禽致病性大肠杆菌o78血清型的特异性基因、检测方法及免疫层析试纸条 |
CN110734990A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-31 | 南京农业大学 | 检测试剂、试剂盒及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101082059A (zh) * | 2006-05-30 | 2007-12-05 | 贝瑞特生物技术(郑州)有限责任公司 | 大肠杆菌o157:h7抗原快速检测测试条 |
CN102851356A (zh) * | 2012-03-22 | 2013-01-02 | 冯家望 | 一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片及方法 |
CN103255217A (zh) * | 2013-04-25 | 2013-08-21 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种饲料中狗源成分检测侧向流试纸条检测试剂盒及其应用 |
-
2013
- 2013-12-10 CN CN201310670635.8A patent/CN103773849A/zh active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101082059A (zh) * | 2006-05-30 | 2007-12-05 | 贝瑞特生物技术(郑州)有限责任公司 | 大肠杆菌o157:h7抗原快速检测测试条 |
CN102851356A (zh) * | 2012-03-22 | 2013-01-02 | 冯家望 | 一种检测十四种常见致病菌的复合基因芯片及方法 |
CN103255217A (zh) * | 2013-04-25 | 2013-08-21 | 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 | 一种饲料中狗源成分检测侧向流试纸条检测试剂盒及其应用 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
LI Y ET AL.: "Human respose to Escherichia coli O157:H7 infection:antibodies to secreted virulence factors", 《INFECT IMMUN》 * |
王静等: "用PCR-ICT方法检测肠出血性大肠杆菌O157", 《卫生研究》 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN105331730A (zh) * | 2015-11-27 | 2016-02-17 | 辽宁医学院 | 一种快速检测制药用水中微生物的方法 |
CN108977555A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-12-11 | 南京农业大学 | 一种禽致病性大肠杆菌o78血清型的特异性基因、检测方法及免疫层析试纸条 |
CN108977555B (zh) * | 2018-03-20 | 2019-07-02 | 南京农业大学 | 一种禽致病性大肠杆菌o78血清型的特异性基因、检测方法及免疫层析试纸条 |
CN110734990A (zh) * | 2019-11-08 | 2020-01-31 | 南京农业大学 | 检测试剂、试剂盒及其应用 |
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