CN105203759A

CN105203759A - 一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒

Info

Publication number: CN105203759A
Application number: CN201510658696.1A
Authority: CN
Inventors: 李先强; 姜昕; 陈巨
Original assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Current assignee: Wuhan Zhongzhi Biotechnologies Inc
Priority date: 2015-10-12
Filing date: 2015-10-12
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2035-10-12
Also published as: CN105203759B

Abstract

本发明公开了一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒，属于医学生物技术领域。本发明中将核酸探针直接标记上胶体金颗粒，且标记的核酸探针序列设计为通用序列，也可以用于其他病原体的检测；本发明在设计时引入的特异探针A和特异探针B有桥分子成分的作用，两种探针成功的将金标探针和MP核酸扩增片段串联结合到一块，实现MP核酸片段的特异检测；其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度；结合MP的依赖核酸序列的扩增技术和扩增后产物的胶体金标记检测的优点，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于MP核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。

Description

一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及医学生物技术，特别涉及一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒。

背景技术

肺炎支原体(Mycoplasmalpneumonia，MP)是一种介于病毒和细菌之间的微生物，是人类支原体肺炎的病原体。支原体肺炎约占各种肺炎的10％，已成为发病率较高的传播疾病，严重的支原体肺炎也可导致死亡。

MP感染的实验室诊断方法有很多，一般可以分为MP分离培养，血清学检查和PCR诊断。MP分离培养是最传统的检测，该方法虽然可靠，但要求苛刻，敏感性低，耗时也很长（2到3周），因此使该方法无法在临床上得到有效应用。血清学检测主要包括补体结合试验、ELISA、冷凝集试验以及间接血凝试验。血清学检测方法特异性和灵敏度适中，简便快捷，也是现在临床上常用的检测方法，但存在难以解决的假阴性假阳性问题。PCR的方法可直接检测MP的核酸，灵敏度高、特异性强，检测速度也较快，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势，是MP病原体检测的主要方法之一。但是PCR的方法对硬件设施有一定的要求，要有专门的PCR诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉的MP病原体诊断方法。

与PCR不同的是近年来陆续出现的恒温扩增技术。这些扩增技术应用不同的原理和方法，可在某一特定温度条件下，实现核酸（DNA或RNA）的扩增。国际上已有的恒温扩增技术如下：

链置换扩增术（SDA）、核酸序列扩增术（NASBA）、转录酶扩增术（TMA）、滚环扩增术（RCA）、圆环恒温扩增术（LAMP）、解链酶扩增术（HAD）。

恒温扩增技术对所需仪器的要求大大简化，反应时间大大缩短，因而具有巨大的实际应用价值。

无论是PCR或恒温扩增技术，其扩增产物均为核酸。这些核酸产物均需以一定的技术手段予以检测。如实时荧光定量PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的激光扫描从而实时检测核酸产物量，但标记探针的荧光染料和荧光PCR仪较昂贵。琼脂糖凝胶电泳是通过对核酸产物分离后染色，从而直观地看到扩增产物。但该方法只能判断扩增物的大小，其特异性不高。

免疫胶体金技术是上世纪80年代继荧光素、放射性同位素和酶三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术。该技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，形成肉眼可见的红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新型层析材料基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。该技术在检测时，由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动，形成抗原-抗体-金标颗粒复合物而富集在包被线上，形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控线对照，故当有两条红线时判为阳性，只有一条红线时，判为阴性。胶体金颗粒本身为红色，不需要加入发色试剂，省却了酶标致癌性底物显色及终止显色的步骤，对人体无毒害；免疫胶体金层析技术快速简便、准确，结果直观、而且试剂和样品用量极少，无需仪器设备，简化了繁琐的常规操作过程，同时也减小了因操作引起的误差。

但以免疫反应为基础的检测试剂有不足之处，真正阻碍这种蛋白质薄膜层析诊断技术发展的不是技术与设备，而是特异性单克隆抗体的制备。单克隆抗体的制备复杂费时，使得蛋白质层析诊断的产品研制周期长，不能很快形成系列产品，难以形成有效的覆盖面。而且检验的灵敏度和特异性有时还不够理想。另外，从感染到抗体产生还存在窗口期问题。

1996年，美国西北大学Mirkin研究组利用纳米金与巯基之间能够形成稳定的Au-S键的性质制备了纳米金-DNA复合纳米探针，可用于检测DNA。纳米金与巯基形成的Au-S键是牢固的共价键。近年来，免疫组织化学中的常用方法-胶体金标记/银染信号放大法因其价格低廉、灵敏度高、操作简单在核酸标记方面已被证明具有较高的实用价值,胶体金在DNA芯片的检测已有相关报道。通常是将目标分子标记上巯基,因胶体金颗粒的表面包围着一层结合力比较弱的带电配体如柠檬酸,这些配体分子很容易被结合力强的巯基基团所取代,因而可以将胶体金连接上目标核酸,然后将标记的目标分子与芯片上的探针杂交实现对其的检测。但这种方法操作繁琐,且每次杂交均需标记特异的靶标分子,不具备通用性。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种肺炎支原体的胶体金标检测试剂盒，包括：

（1）胶体金试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线），通用探针1的5’端巯基化修饰后标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A系列互补配对杂交，将标记胶体金后的通用探针1固定于试纸条的玻璃纤维素膜上；所述检测线处包被链霉亲和素，质控线包被抗地高辛抗体；

（2）、分别盛有通用探针2、特异探针A系列、特异探针B系列的探针管：所述通用探针2标记有生物素，且和特异探针B系列互补配对杂交，特异探针A系列标记有地高辛，其一端和肺炎支原体特异扩增产物杂交，另一端和通用探针1杂交，特异探针B系列一端和肺炎支原体特异扩增产物杂交，另一端和通用探针2杂交；特异探针A系列可以有多种，如A1、A2……，分别和支原体特异扩增产物的不同区域互补配对杂交，装在不同的探针管里；特异探针B系列可以有多种，如B1、B2……，分别和支原体特异扩增产物的不同区域互补配对杂交，分别装在不同的探针管里；

（3）、盛装着对肺炎支原体的16srRNA一段保守序列特异性的引物的引物管；

（4）、盛装着三种酶混合物的管：逆转录酶（如AMV或M-MLV）、T7RNA聚合酶和RnaseH；

所述通用探针1序列为SeqNo.1；

所述特异探针A系列的序列分别为SeqNo.2、SeqNo.3；

所述特异探针B系列的序列分别为SeqNo.4、SeqNo.5；

所述通用探针2序列为SeqNo.6；

所述通用探针1序列为：

5’-SH-CATCTTCCAGCGGCCTTATGCAGTTGCTCTCCATTTTTAGAAGGCGTCCGTCTTTGAGGC-3’（SeqNo.1）

所述特异探针A1、A2（两条）序列为：

5’-Dig-GGTTCGCCTCGAAGAATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’（SeqNo.2）

5’-Dig-CCCTCGACCAAGCCAATTTTGCCTCAAAGACGGACGCCTTCT-3’（SeqNo.3）

所述特异探针B1、B2（两条）为：

5’-CCTCCAGCTCTGAACGTTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA-3’（SeqNo.4）

5’-GGGGCGGGGTGAAGGATTTTGGCCTCTAAGTCGTAGCCCA-3’（SeqNo.5）

所述通用探针2序列为：

5’-Biotin-TGGGCTACGACTTAGAGGCC-3’（SeqNo.6）

所述引物具有如下序列：

R引物：5’-TAATACGACTCACTATAGGGAGACTCGTGAACTTGGTGTGGTTT-3’

（SeqNo.7）

F引物：5’-GGCAGTCAGACGATGATTACAGGC-3’（SeqNo.8）

本发明提供一种肺炎支原体核酸金标快速检测方法，结合MP核酸的扩增和扩增后产物的定性检测，将胶体金免疫层析技术的操作简单、快速、价格低廉等特点应用到MP核酸的检测中来。包括如下步骤：

（1）、扩增肺炎支原体的目标检测区域：选择MP的16srRNA一段保守区序列，扩增的方法为依赖核酸序列的扩增技术（NucleicAcidSequence-basedAmplification，NASBA），扩增中需要两条引物：R引物（SeqNo.7）、F引物（SeqNo.8）

其中R引物的5’端有T7RNA聚合酶启动子序列；

三种酶：逆转录酶（如AMV或M-MLV）、T7RNA聚合酶和RnaseH；

（2）、设计四种探针：通用探针1、通用探针2、特异探针A系列、特异探针B系列，其中，通用探针1的5’端巯基化修饰（也可以是其他化学基团修饰，如-NH2等）后标记胶体金颗粒，且和特异探针A系列互补配对杂交；通用探针2标记抗原或半抗原a，且和特异探针B系列互补配对杂交；特异探针A系列标记抗原或半抗原b，其一端和MP特异扩增产物杂交，另一端也和通用探针1杂交；特异探针B系列一端和MP特异扩增产物杂交，另一端和通用探针2杂交，所述的特异探针A、特异探针B可以同时有2条以上，与待测核酸不同部位杂交结合；

（3）、制备胶体金试纸条：所述试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线）；所述检测线上包被抗抗原或半抗原a的抗体，能特异性捕获结合抗原或半抗原a的通用探针2；所述质控线上包被抗抗原或半抗原b，能特异性捕获结合特异探针A；将通用探针1标记上胶体金颗粒后固定于玻璃纤维素膜上，将特异探针A、特异探针B、通用探针2和MP核酸扩增产物杂交后滴在样品垫上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效。

所述通用探针1可用于检测各种病原体核酸分子，在设计时必须注重GC%的比例，尽量避免与金颗粒的非特异结合；通用探针1和通用探针2还必须注意和其他探针结合部分的Tm值，尽量提高在较低温度条件下杂交的有效性，经过实验效果的比较，所公布的通用探针1序列为最优设计序列。

所述的特异探针A系列上标记的抗原或半抗原b和通用探针2上标记的抗原或半抗原a可以为地高辛、生物素及其他的抗原或半抗原，如荧光染料（Cy3、Cy5、Fam、Fit），则在试纸条T线或C线上与它们特异性结合的分子为相应的抗地高辛抗体、链霉亲和素或抗荧光染料抗体。

所述的特异探针A系列标记地高辛，通用探针2标记生物素，则在试纸条T线处包被链霉亲和素，C线处包被抗地高辛抗体。

结合工作原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：

1、设计四种探针：通用探针1、通用探针2、特异探针A、特异探针B（设计两条B1、B2）。其中，通用探针1的5’端巯基化修饰（也可以是其他化学基团修饰，如-NH2等）后标记胶体金颗粒，且可以和特异探针A互补配对杂交；通用探针2标记生物素，且可以和特异探针B互补配对杂交；特异探针A系列标记地高辛，其一端可以和MP特异扩增产物杂交，另一端也可以和通用探针1杂交；特异探针B系列一端可以和MP特异扩增产物杂交，另一端也可以和通用探针2杂交。

2、试纸条上“T线”（检测线）处包被链霉亲和素，可以捕捉通用探针2上的生物素，形成T线；“C线”（质控线）处包被抗地高辛抗体，用来捕获游离的标有胶体金的通用探针1--特异探针A系列复合物，形成C线。

3、通用探针1标记胶体金颗粒后，可以和特异探针A系列杂交，形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物。

4、标有生物素的通用探针2可以和特异探针B系列杂交，形成biotin通用探针2--特异探针B复合物。

5、当有特异扩增产物时，特异扩增产物可以和3、4中的复合物杂交结合，形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛--MP特异扩增产物--特异探针B--biotin通用探针2复合物。

6、步骤5中得到的胶体金复合物在NC膜上通过毛细现象沿纤维膜向前渗析，当到达T线处，与T线处包被的链霉亲和素结合，从而将5中得到的复合物滞留在T线上，形成肉眼可见的有色条带，此为阳性（如图1）。或者，

7、当特异扩增产物不存在时，就不会发生5～6步，就不能形成金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛--特异扩增产物--特异探针B--biotin通用探针2复合物，胶体金颗粒就不能再T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性（如图2）。

8、无论有无特异扩增产物，步骤3中形成的金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物都会有富余，则多余的金颗粒通用探针1--特异探针A地高辛复合物会越过T线继续沿着纤维膜向前流动，当到达C线时，与C线处包被的地高辛抗体结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效。

本发明通过NASBA的方法扩增目标病原体MP的16sRNA，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。在扩增RNA时，整个反应都在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。

本发明作为一种核酸试纸条检测技术，成功的融合了胶体金快检的特点。通过胶体金试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，只需将核酸特异扩增物和检测探针混合后滴到检测试纸上即可，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于MP核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。

在本发明中将核酸探针直接标记上胶体金颗粒，且标记的核酸探针序列设计为通用序列，即使目标病原体MP扩增区域发生变化，也可以继续使用，这就避免了当病原体MP目标扩增区域出现变异，灵敏度、特异性下降，需要重新选择目标区域时，又要标记一次胶体金的麻烦。

本发明在设计时引入的特异探针A和特异探针B有桥分子成分的作用，两种探针成功的将金标探针和MP核酸扩增片段串联结合到一块，实现MP核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和MP核酸扩增片段杂交失败，都不能够形成被试纸条检出的复合物，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。

附图说明

图1为用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸阳性结果的原理示意图

图2为用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸阴性结果的原理示意图

图3为核酸检测试纸条的组装结构图

图4为用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸阳性、阴性结果图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版（NewYork:ColdSpringHarborlaboratoryPress,2005)中所述的条件进行。

【实施例1】通用核酸探针标记胶体金颗粒

1、通用探针1设计完毕后，在其5’端进行巯基化修饰。

2、将合成好的通用探针20μl（终浓度0.1mM）加入到10μlTCEP-HCl（终浓度100mM）中，用ddH₂O补足至100μl，还原巯基化DNA通用探针。

3、将处理后的通用探针加入到500ml的30nm直径颗粒的胶体金液中，室温过夜孵育。

4、加入2%SDS液使其终浓度为0.01%，室温孵育30min。

5、向溶液中逐滴加入2M的NaCl，至终浓度为0.15M。

6、离心纯化金标核酸探针：15000rpm离心15min，沉淀用洗涤液（0.15MNaCl，

0.01%SDS）洗四次，胶体金沉淀重悬于重悬液（0.15MNaCl，5%BSA，0.25%Tween，10%蔗糖）中，既得标记好的通用核酸探针标记胶体金颗粒。

【实施例2】核酸检测试纸条的制备

在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：玻璃纤维膜、硝酸纤维素膜（NC膜）、样本垫、PVC底板等。

1、胶体金垫的制备：将玻璃纤维膜切割成0.5×1cm见方小模块，每个模块上用枪均匀滴加10μl的标金核酸探针液，室温使之干燥，封闭保存备用。

2、喷膜（包被NC膜）：

检测线（T线）：亲和素（约0.5~1.0mg/ml），喷膜量：1.5~3μl/cm；

质控线（C线）：抗地高辛抗体（约0.5~1.0mg/ml），喷膜量：1.5~3μl/cm；

喷膜完毕后，将膜条放于37℃洁净恒温箱内干燥3~4小时，存于干燥环境中备用。

3、试纸条组装：

分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的NC膜、吸附金标探针的玻璃纤维膜、样品垫从上到下依次固定于PVC底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3.

【实施例3】检测肺炎支原体（MP）NASBA扩增产物

a、扩增肺炎支原体核酸：

组分	体积（μl）
		肺炎支原体核酸（或裂解物）	2
扩增反应液：含dNTPs、NTPs、引物R&F以及各种盐离子	17
		合计	19

95℃，2min，42℃，2min后加扩增酶混合液（AMV、T7聚合酶及RNaseH）1μl，分别在42℃反应45min后，待检。

b、检测a中得到的肺炎支原体特异扩增产物：

扩增产物：10μl

特异探针A1（5μM）：1μl

特异探针A2（5μM）：1μl

特异探针B1（5μM）：1μl

特异探针B2（5μM）：1μl

通用探针2（1μM）：1μl

层析液（含5%甲酰胺的4×SSC）至总体积100μl

42℃10min后点在试纸条上5~10min后观察结果（如图4）。

SEQUENCELISTING

<110>武汉中帜生物科技股份有限公司

<120>一种用胶体金层析技术检测肺炎支原体核酸的方法及试剂盒

<130>1

<160>8

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>60

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>5'端巯基修饰，通用探针1

<400>1

catcttccagcggccttatgcagttgctctccatttttagaaggcgtccgtctttgaggc60

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<212>DNA

<213>Artificial

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ggttcgcctcgaagaattttgcctcaaagacggacgccttct42

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<212>DNA

<213>Artificial

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<222>(1)..(1)

<223>5'端地高辛标记，特异探针A2

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ccctcgaccaagccaattttgcctcaaagacggacgccttct42

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<223>5'端生物素修饰，通用探针2

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<223>对MP的16srRNA一段保守序列特异性的F引物

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ggcagtcagacgatgattacaggc24

Claims

1.一种肺炎支原体的胶体金标检测试剂盒，包括：

（4）、盛装着三种酶混合物的管：逆转录酶、T7RNA聚合酶和RnaseH。

2.根据权利要求1所述的检测肺炎支原体的胶体金标检测试剂盒，其特征在于：

所述通用探针1序列为SeqNo.1；

所述特异探针A系列的序列分别为SeqNo.2、SeqNo.3；

所述特异探针B系列的序列分别为SeqNo.4、SeqNo.5；

所述通用探针2序列为SeqNo.6；

所述引物具有如下序列：

R引物为SeqNo.7

F引物为SeqNo.8。

3.一种肺炎支原体核酸金标快速检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）、扩增肺炎支原体的目标检测区域：选择MP的16srRNA一段保守区序列，扩增的方法为依赖核酸序列的扩增技术（NucleicAcidSequence-basedAmplification，NASBA），扩增中需要两条引物：R引物为SeqNo.7、F引物为SeqNo.8；

其中R引物的5’端有T7RNA聚合酶启动子序列；

三种酶：逆转录酶（如AMV或M-MLV）、T7RNA聚合酶和RnaseH；

（2）、设计四种探针：通用探针1、通用探针2、特异探针A系列、特异探针B系列，其中，通用探针1的5’端巯基化修饰，也可以是其他化学基团修饰，如-NH2，然后标记胶体金颗粒，且和特异探针A系列互补配对杂交；通用探针2标记抗原或半抗原a，且和特异探针B系列互补配对杂交；特异探针A系列标记抗原或半抗原b，其一端和MP特异扩增产物杂交，另一端也和通用探针1杂交；特异探针B系列一端和MP特异扩增产物杂交，另一端和通用探针2杂交，所述的特异探针A、特异探针B可以同时有2条以上，与待测核酸不同部位杂交结合；

（3）、制备胶体金试纸条：所述试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、玻璃纤维、NC膜、吸水纸；NC膜上有T线（检测线）和C线（质控线）；所述检测线上包被抗抗原或半抗原a的抗体，能特异性捕获结合抗原或半抗原a的通用探针2；所述质控线上包被抗抗原或半抗原b，能特异性捕获结合特异探针A；将通用探针1标记上胶体金颗粒后固定于玻璃纤维素膜上，将特异探针A、特异探针B、通用探针2和MP核酸扩增产物杂交后滴在样品垫上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检。

4.根据权利要求3所述的肺炎支原体核酸金标快速检测方法，其特征在于：所述的特异探针A系列上的标记的抗原或半抗原b和通用探针2上的标记的抗原或半抗原a可以为地高辛、生物素及其他的抗原或半抗原，如荧光染料（Cy3、Cy5、Fam、Fit），则在试纸条T线或C线上与它们特异性结合的分子为相应的抗地高辛抗体、链霉亲和素或抗荧光染料抗体。

5.根据权利要求4所述的肺炎支原体核酸金标快速检测方法，其特征在于：所述的特异探针A系列标记地高辛，通用探针2标记生物素，则在试纸条T线处包被链霉亲和素，C线处包被抗地高辛抗体。