CN110923345A - 一种沙眼衣原体检测胶体金层析试剂盒及其应用 - Google Patents

一种沙眼衣原体检测胶体金层析试剂盒及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种沙眼衣原体检测胶体金层析试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物‑‑‑特异探针‑‑‑金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。本发明没有RNA的提取过程，不需要特殊仪器，基于RNA恒温扩增，在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使沙眼衣原体核酸检测得到广泛应用成为一种可能。

Description

一种沙眼衣原体检测胶体金层析试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术检测沙眼衣原体核酸的试剂盒及其应用。
背景技术
沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，CT)是一类在细胞内寄生的微生物，大小约250～450nm，革兰阴性，圆形或椭圆形；含DNA和RNA以及核糖体；有细胞壁，其结构和组成类似于革兰阴性菌。沙眼衣原体基于抗外膜蛋白单克隆或多克隆抗体的血清分型，将沙眼衣原体分为12个血清型：A-K。其中，A、B/Ba和C型主要引起沙眼；D～K型主要引起泌尿生殖道感染。
沙眼衣原体(CT)可引起非淋菌性尿道炎和盆腔炎。沙眼衣原体感染后表现出一系列临床症状，如尿道炎、宫颈炎、前列腺炎、性病性淋巴肉芽肿、Reiter综合征等。沙眼衣原体感染后若未经及时治疗，可引起输卵管性不孕、异位妊娠等一系列并发症，而长期反复的生殖道沙眼衣原体感染，可增加宫颈鳞状上皮细胞癌和艾滋病发病的危险。
沙眼衣原体感染在发达国家和发展中国家均极为常见，在很多国家，淋病的发病数逐渐下降，而沙眼衣原体感染的发病数逐年上升。沙眼衣原体感染的传播途径通常是经过性传播，孕妇感染还可以发生围产期传播，感染新生儿。沙眼衣原体感染的临床表现特征是慢性经过，很多感染者无明显临床表现，但有可能引起严重的后遗症，也是主要的传染源。若得不到及时诊疗可能会导致严重的泌尿生殖道疾病，尤其是女性患者常导致盆腔炎或继发不孕不育，及时准确诊断沙眼衣原体感染已成为治疗性病的关键。
在泌尿生殖道CT感染的实验诊断中，经典的细胞培养方法虽然特异，但耗时长、费用大、技术设备要求高，不适合处理大量样本，且灵敏度低；应用免疫学方法进行沙眼衣原体抗原或者抗体的检测，优点是操作简单、特异性强，但是缺点是敏感度低，并且抗体检测存在窗口期，在沙眼衣原体感染初期不易检测到；PCR方法可直接检测CT核酸，灵敏度高、特异性强，检测速度也较快，在缩短检测窗口期、提高病原体检出率方面具有相当的优势，是CT病原体检测的主要方法之一，但PCR方法扩增产物污染导致假阳性，且对硬件设施有一定的要求，要有专门的PCR诊断实验室、昂贵的实验仪器，不利于在一些社区及偏远医院的普及应用。因此，人们仍然需要寻找一种操作简单、快速、价格低廉、灵敏度高的CT核酸的检测方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于RNA恒温扩增-金探针层析技术检测沙眼衣原体核酸的试剂盒及其应用。该试剂盒通过将采集的样本经细胞裂解液裂解后释放病原体核酸，然后在逆转录酶和T7RNA聚合酶的作用下，经过逆转录和转录过程，实现病原体核酸片段的扩增。扩增后的RNA产物被检测液中的特异探针识别捕获，形成RNA扩增产物---特异探针---金探针复合物，该复合物通过侧向流层析在NC膜上被固定形成可见的条带，实现病原体核酸的检测。因此，本发明没有复杂的RNA提取过程，也不需要特殊的仪器，基于RNA分子易降解的特点，本发明在实际检测中不易污染，具有灵敏度高、特异性强以及操作简单的优势，使沙眼衣原体核酸检测得到广泛应用成为一种可能。
为了实现上述目标，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种沙眼衣原体核酸检测胶体金层析试剂盒，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：
1)扩增反应液：含40mM Tris-HCl(pH 8.0)，12mM MgCl2，70mM KCl，15％DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2μM，扩增中需要两对引物：CT扩增引物、内参基因扩增引物：
(1)CT(OMP1基因一段保守序列)扩增引物：
CT-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGATCGTAACGCCTCTTCATCGG；
CT-F引物(5’-3’)：CATGCAGCACGTTTTGCAAC；
(2)内参基因(人18SrRNA一段保守区序列)扩增引物：
内参-R引物(5’-3’)：TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTGGGTAATTTGCGCGC；
内参-F引物(5’-3’)：GCGACGACCCATTCGAAC；
在设计引物时同时要保证各自单项引物扩增效率高、不同引物彼此之间无干扰。两对引物的R引物5’端都引入了T7 RNA聚合酶启动子序列；
2)扩增酶：包括逆转录酶(如AMV或M-MLV)、T7 RNA聚合酶和RnaseH；
3)细胞裂解液(购至美国Signosis公司，货号CL-0001)：可以裂解细胞，释放核酸；
4)检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针(金探针)、每个指标的特异探针盐溶液、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
(1)金探针
金探针5’端被巯基化修饰，所述序列为：
5’-CATCTGCAAGCTCCGTCATCCAGTAGATCTCCAtttttAGAAGGCGTCCCAGATTGAGGC-3’；
(2)沙眼衣原体(CT)特异探针
CT-CES1(5’-3’)：AGGGCGACCTGGAGTATttttAGTGCACTGAGAATGTGCAG；
CT-CES2(5’-3’)：CCACGGATTTTATTCGTAttttAGTGCACTGAGAATGTGCAG；
CT-LES1(5’-3’)：TCTTCTTCAAGATGACGAttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
CT-LES2(5’-3’)：TGGACAAGTATTACAAACttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
CT-LES3(5’-3’)：TCACTCCATTTCCGCTGGttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
(3)内参(18S)特异探针:
内参-CES1(5’-3’)：GTCTGCCCTATCAACTTTttttCAGTCAGTGAGGAGCGTAT；
内参-CES2(5’-3’)：CGATGGTAGTCGCCGTGCttttCAGTCAGTGAGGAGCGTAT；
内参-LES1(5’-3’)：CTACCATGGTGACCACGGttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
内参-LES2(5’-3’)：GTGACGGGGAATCAGGGTttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
内参-LES3(5’-3’)：TCGATTCCGGAGAGGGAGttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
(4)C线显色探针(5’-3’)：
CCTAGAAGCACGTCGTTCGTttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
5)试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有C线(质控线)和两条T线(检测线)，从样品垫到吸水纸方向分别为CT-T、内参-T、和C线(如图3)，CT-T处包被CT包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列为：
CT包被探针(5’-3’)：
CTGCACATTCTCAGTGCACTttttCTGCACATTCTCAGTGCACT；
内参包被探针(5’-3’)：
ATACGCTCCTCACTGACTGAttttATACGCTCCTCACTGACTGA；
C线包被探针(5’-3’)：
ACGAACGACGTGCTTCTAGGttttACGAACGACGTGCTTCTAGG。
本发明提供利用上述基于RNA恒温扩增-金探针层析技术联合检测沙眼衣原体核酸的试剂盒检测沙眼衣原体核酸的方法，包括如下步骤：
(1)RNA恒温扩增
本发明检测指标有两个：CT核酸和内参基因。针对每个指标设计一对(F/R引物)扩增引物，其中R引物5’端带有T7 RNA聚合酶启动子。本发明在同一扩增管内实现各个指标核酸的扩增，具体如下：扩增时，在带有T7启动子的R引物和逆转录酶的作用下，将待测RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；在F引物和反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，形成带有T7启动子的双链DNA；带有T7启动子的双链DNA在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成RNA分子产物，在逆转录酶的作用下将转录的RNA转化为RNA:cDNA杂合体；扩增酶中的RnaseH消化RNA:cDNA中的RNA，得到单链cDNA；接着R引物会结合到单链cDNA上，在反转录酶的DNA聚合酶功能的作用下合成第二链，再次富集合成更多的带有T7启动子的双链DNA分子，为T7 RNA聚合酶提供更多的转录模板，进而在T7 RNA聚合酶的作用下转录生成大量的RNA分子产物(如图1)。
本发明设计内参基因检测的目的是为了监测样本采集的有效性、扩增体系的有效性。当样本采集合格时样本中一定会含有人脱落细胞，在检测时一定会被检测到，样本检测阴性时，内参应该为阳性，否则整个检测需要重新采样进行重测。
(2)金探针层析法
a，设计金探针、特异探针、C线显色探针和包被探针
金探针：金探针5’端被巯基化修饰，巯基基团可以和胶体金颗粒形成共价键，被标记到胶体金颗粒上。可以与特异探针LES系列的一端及质控线检测探针的一部分结合。
特异探针：每个指标特异探针包括在两种：CES系列和LES系列，每种探针可以设计多条。其中CES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和包被在硝酸纤维素膜的包被探针结合，起到固定扩增产物RNA的作用，这两个部分用4～5个T链接。每条LES探针包含两个部分，一端可以和扩增的RNA产物特异性结合，另一端可以和金探针结合，起到链接金探针显色的作用，这两个部分用4～5个T链接。
包被探针：包被探针固定于硝酸纤维素膜上，可以与特异探针CES的一端结合，起到固定的作用。包被探针包含来个拷贝，每个拷贝之间用4～5个T连接。
C线显色探针：包含两个部分，之间用4～5个T链接。该探针一端可以和金探针结合，另一端可以和包被在NC膜上的C线包被探针结合。在层析时，无论有无RNA扩增产物，C线显色探针都可以形成“C线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时可以被NC膜上的C线包被探针捕获拦截，形成肉眼可见的条带。该探针可以质控试纸条和检测液的质量，层析过程无误。
所述特异探针在设计时必须要求同种指标不同探针之间无交叉，CES系列同金探针和包被探针无交叉，以保证检测的特异性。
所述特异探针的CES系列和LES系列设计多条的目的是为了提高固定的效率和结合更多的金探针，从而提高检测的灵敏度。
b，试纸条检测
所用试纸条有检测线和质控线，所述检测线包括在CT-T、内参-T，其中CT-T处包被的CT包被探针能够特异性结合沙眼衣原体CES系列探针的一端；内参-T处包被的内参包被探针，能够特异性结合内参CES系列探针的一端。所述质控线(C线)上包被C线包被探针能特异性结合C线显色探针。将特异探针CES、特异探针LES、金探针和待测核酸特异扩增产物杂交后滴在试纸条上层析，检测线显色表示有待测核酸存在，质控线显色表示检测有效(如图2)。
结合上述原理，对本发明上述方法的工作过程介绍如下：
(1)核酸提取
采集患者样本，使用细胞裂解液裂解的方法释放病毒RNA分子。
(2)RNA恒温扩增
向17μL的含有沙眼衣原体和内参引物的扩增反应液中加入2μL核酸提取物，95℃加热两分钟，42℃预热2分钟，加入1μL扩增酶，42℃恒温扩增1小时。待测样本中若有沙眼衣原体核酸，扩增时会对指标RNA分子进行大量扩增富集。
(3)试纸条层析
a，预杂交
将RNA恒温扩增产物与检测液(包括特异探针、金探针以及C线显色探针)混合，42℃预杂交10分钟。扩增出的RNA分子与特异探针(包括CES系列探针与LES系列探针)互补配对结合。CES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端同NC膜上的包被探针结合；LES系列探针一端同RNA分子杂交互补配对，另一端可以与金探针互补配对结合，当有扩增产物时可以形成“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”。
b，层析检测
将预杂交产物滴在试纸条样品垫处，预杂交液会沿着NC膜向吸水纸方向层析，当有待测RNA扩增产物时，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就会形成，在层析时会被NC膜上包被的包被探针拦截，形成肉眼看见的条带，此为阳性(如图4)。
若无待测RNA产物扩增，“CES探针-RNA分子-LES探针-金探针复合物”就不会形成，胶体金颗粒就不能在T线处聚集，就不会形成肉眼可见的条带，此为阴性(如图4)。
无论有无待测RNA产物扩增，C线显色探针都可以形成“C线显色探针---金探针”复合物，该复合物在层析时会沿着NC膜向前流动，当到达C线时，与C线处包被的序列结合，从而滞留在C线处，形成肉眼可见的有色条带，此为实验结果有效(如图4)。
第二方面，提供上述沙眼衣原体核酸检测胶体金层析试剂盒在制备沙眼衣原体检测试剂中的应用。
本发明和现有技术相比较，具有如下有益效果：
1、本发明通过RNA恒温扩增的方法在扩增CT核酸、内参基因两种指标，所扩增出的核酸产物为RNA，RNA在自然环境中容易降解，相比较于PCR的方法扩增出DNA更容易起到防止污染的效果。RNA恒温扩增是在42℃环境中进行，即使是一个水浴锅都能实现扩增反应，最大限度的降低了实验仪器的要求。
2、本发明在扩增时所选用的扩增对象是CT的外膜蛋白的OMP1基因的一段保守区序列，OMP1基因为1.2Kb DNA，包括4个可变区和5个保守区；本发明设计的引物序列位于OMP1基因的保守区，可覆盖12种亚型。由表4可知本发明试剂盒对12种常见沙眼衣原体亚型具有很好的检出能力。
3、本发明在设计时引入的特异探针CES系列和特异探针LES系列有桥分子成分的作用，两种探针成功的将放大探针和RNA核酸扩增片段串联结合到一块，实现指标RNA核酸片段的特异检测。正是这种两套探针的使用，使得其中任何一套探针和指标核酸扩增片段杂交失败，都不能够被成功的固定在硝酸纤维素膜上，也就出现不了阳性检测结果，保证了检测的特异性。本发明试剂盒对表3所列的20种其它微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其它微生物之间没有交叉反应。其中每套探针都可以设计两条以上，这样的设计又有利于提高试纸条的灵敏度。本发明试剂盒对CT(ATCC VR-346)的最低检测限为5.0IFU/mL。对于215份诊断结果均为疑似沙眼衣原体患者临床样本的衣原体核酸检测灵敏度、特异性高于某商品化检测CT核酸荧光定量PCR试剂盒。
4、本发明作为一种核酸试纸条检测技术，成功的融合了胶体金快检的特点。通过胶体金试纸条检测核酸，只需10min左右即可进行结果判读。在操作上也十分简单，只需将核酸特异扩增物和检测探针混合后滴到检测试纸上即可，对实验人员技术要求低，更无需特殊的仪器设备，易于CT核酸检测向基层及偏远农村医疗机构的推广。
附图说明
图1RNA恒温扩增原理图；
图2试纸条显色原理图；
图3试纸条示意图；
图4检测阴阳性示意图；
a：CT阳性、内参阳性；
b：CT阴性、内参阳性；
c：CT阴性、内参阴性；
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室指南》第3版(New York:Cold Spring Harbor laboratory Press,2005)中所述的条件进行。
【实施例1】核酸检测试纸条的制备
在制备核酸检测试纸条时需要的主要原材料：硝酸纤维素膜(NC膜)、样本垫、吸水纸、PVC底板等。
1、喷膜：
检测线CT-T：能捕获结合CT特异探针CES序列，10μM CT包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；
检测线内参-T：能捕获结合内参特异探针CES序列，10μM内参包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；
质控线C线：能捕获结合C线显色探针序列，10μM C线包被探针，喷膜量：2～3μL/cm；
喷膜完毕后，在紫外交联仪中自动交联一次，放于37℃洁净恒温箱内干燥2小时，存于干燥环境中备用。
2、试纸条组装
分别裁取2cm长的吸水纸、包被好的NC膜、样品垫从上到下依次固定于PVC底板上，即成检测试纸条。试纸条的组装结构图如图3。
【实施例2】灵敏度测试
将ATCC VR-346来源的沙眼衣原体进行梯度稀释后进行最低检测限确定，每个梯度的稀释液重复3～5份，每份进行20次的重复检测，将具有90％～95％阳性检出率的水平作为最低检测限，检出结果如下：
CT最低检测限检测
表1.1不同滴度CT的检测实验数据
Figure BDA0002325497250000091
表1.2 CT最低检测限实验数据
Figure BDA0002325497250000092
Figure BDA0002325497250000101
综上，本发明试剂盒检测CT的灵敏度为5.0IFU/mL。
【实施例3】特异性验证
1，测试菌株
将不同的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体及滴度信息如下：
表2特异性验证测试菌株信息
Figure BDA0002325497250000102
2，特异性测试
将不同的微生物提取核酸后检测，验证本发明试剂盒引物及探针设计的特异性。相关病原体及滴度如下：
表3特异性验证检测结果
Figure BDA0002325497250000103
Figure BDA0002325497250000111
3，结论
从以上数据可以看出，本发明试剂盒对这些微生物的检测结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他微生物之间没有交叉反应，体现试剂盒检测病原体的特异性强。
【实施例4】病原体检出能力验证
使用本发明试剂盒对CT的12种毒株(来源于ATCC)进行实验，验证本试剂盒对不同病毒株的检出能力。检测结果如下：
表4不同病毒株检测结果
Figure BDA0002325497250000112
Figure BDA0002325497250000121
从以上结果可以看出，本试剂盒对常见CT亚型具有很好的检出能力。
【实施例5】临床样本的验证
1，临床样本信息
在武汉市第一医院共检测样本215份，其中男性标本和女性标本分别为115例和100例，分别占比为53.49％和46.51％。215例标本中，入组患者均为疑似沙眼衣原体患者。
2，检测结果
检测时同时使用本发明试剂盒和某商品化检测CT核酸检测荧光定量PCR试剂盒同时对样本进行检测，将检测结果汇总成四格表，如下：
Figure BDA0002325497250000122
对215份样本，测序成功110例，这110例样本与本试剂盒检测结果一一对应。
对于不一致的3例样本采用“基因测序法”进行复测，结果2例阳性，全为本发明试剂盒检测阳性某商品化检测CT核酸检测荧光定量PCR试剂盒检测阴性样本，有测序结果可知，某商品化检测CT核酸检测荧光定量PCR试剂盒漏检一例，假阳2例，显而易见，本发明专利试剂盒检测临床样本CT灵敏度更高，特异性更强。
序列表
<110> 武汉中帜生物科技股份有限公司
<120> 一种沙眼衣原体检测胶体金层析试剂盒及其应用
<160> 19
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taatacgact cactataggg agatcgtaac gcctcttcat cgg 43
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catgcagcac gttttgcaac 20
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taatacgact cactataggg agaagtgggt aatttgcgcg c 41
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgacgaccc attcgaac 18
<210> 5
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
catctgcaag ctccgtcatc cagtagatct ccatttttag aaggcgtccc agattgaggc 60
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agggcgacct ggagtatttt tagtgcactg agaatgtgca g 41
<210> 7
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccacggattt tattcgtatt ttagtgcact gagaatgtgc ag 42
<210> 8
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tcttcttcaa gatgacgatt ttgcctcaat ctgggacgcc ttct 44
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggacaagta ttacaaactt ttgcctcaat ctgggacgcc ttct 44
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tcactccatt tccgctggtt ttgcctcaat ctgggacgcc ttct 44
<210> 11
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gtctgcccta tcaacttttt ttcagtcagt gaggagcgta t 41
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgatggtagt cgccgtgctt ttcagtcagt gaggagcgta t 41
<210> 13
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctaccatggt gaccacggtt ttgcctcaat ctgggacgcc ttct 44
<210> 14
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtgacgggga atcagggttt ttgcctcaat ctgggacgcc ttct 44
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgattccgg agagggagtt ttgcctcaat ctgggacgcc ttct 44
<210> 16
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cctagaagca cgtcgttcgt ttttgcctca atctgggacg ccttct 46
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgcacattc tcagtgcact ttttctgcac attctcagtg cact 44
<210> 18
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atacgctcct cactgactga ttttatacgc tcctcactga ctga 44
<210> 19
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acgaacgacg tgcttctagg ttttacgaac gacgtgcttc tagg 44

Claims (2)

1.一种沙眼衣原体核酸检测胶体金层析试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是基于RNA恒温扩增-金探针层析技术，包括：
1）扩增反应液：含40 mM Tris-HCl (pH 8.0)，12 mM MgCl2，70 mM KCl，15% DMSO，5mMDTT，每种dNTP各1 mM，每种NTP各2mM，扩增引物各0.2 µM，扩增中需要两对引物：CT扩增引物、内参基因扩增引物：
（1）CT扩增引物：
CT-R引物（5’-3’）： TAATACGACTCACTATAGGGAGATCGTAACGCCTCTTCATCGG；
CT-F引物（5’-3’）： CATGCAGCACGTTTTGCAAC；
（2）内参基因扩增引物：
内参-R引物（5’-3’）：TAATACGACTCACTATAGGGAGAAGTGGGTAATTTGCGCGC；
内参-F引物（5’-3’）： GCGACGACCCATTCGAAC ；
2）扩增酶：包含三种，逆转录酶、T7 RNA聚合酶和RnaseH；优选地所述逆转录酶为AMV或M-MLV；
3）核酸提取试剂：细胞裂解液，购至美国Signosis公司，货号CL-0001；
4）检测液：包含胶体金颗粒标记的核酸探针（金探针）、每个指标的特异探针、C线显色探针，每个指标特异探针有两种，分别为CES系列和LES系列，其中CES系列和LES系列又可以设计多条，具体如下：
（1）金探针
金探针5’ 端被巯基化修饰，所述序列为：
5’-CATCTGCAAGCTCCGTCATCCAGTAGATCTCCAtttttAGAAGGCGTCCCAGATTGAGGC-3’；
（2）沙眼衣原体（CT）特异探针
CT-CES1（5’-3’）：AGGGCGACCTGGAGTATttttAGTGCACTGAGAATGTGCAG；
CT-CES2（5’-3’）：CCACGGATTTTATTCGTAttttAGTGCACTGAGAATGTGCAG ；
CT-LES1（5’-3’）：TCTTCTTCAAGATGACGAttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
CT-LES2（5’-3’）：TGGACAAGTATTACAAACttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
CT-LES3（5’-3’）：TCACTCCATTTCCGCTGGttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
（3）内参（18S）特异探针:
内参-CES1（5’-3’）：GTCTGCCCTATCAACTTTttttCAGTCAGTGAGGAGCGTAT；
内参-CES2（5’-3’）：CGATGGTAGTCGCCGTGCttttCAGTCAGTGAGGAGCGTAT；
内参-LES1（5’-3’）：CTACCATGGTGACCACGGttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
内参-LES2（5’-3’）：GTGACGGGGAATCAGGGTttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
内参-LES3（5’-3’）：TCGATTCCGGAGAGGGAGttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
（4）C线显色探针（5’-3’）：
TCAGATCACTATGTAttttGCCTCAATCTGGGACGCCTTCT；
5）试纸条：所用试纸条被固定于PVC底板上，从左往右依次是样品垫、NC膜、吸水纸；NC膜上有C线（质控线）和两条T线（检测线），从样品垫到吸水纸方向分别为CT-T、内参-T、和C线，CT-T处包被CT包被探针、内参-T处包被内参包被探针、C线处包被C线包被探针，具体序列为：
CT包被探针（5’-3’）：
CTGCACATTCTCAGTGCACTttttCTGCACATTCTCAGTGCACT；
内参包被探针（5’-3’）：
ATACGCTCCTCACTGACTGAttttATACGCTCCTCACTGACTGA；
C线包被探针（5’-3’）：
ACGAACGACGTGCTTCTAGGttttACGAACGACGTGCTTCTAGG。
2.权利要求1所述的试剂盒在制备沙眼衣原体检测试剂中的应用。
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