CN105316428A - 检测人巨细胞病毒pp65基因的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学领域，具体涉及荧光探针PCR检测人巨细胞病毒PP65基因的方法及试剂盒。本发明的方法具体为：从待测样本中提取DNA，以所得DNA为模板，采用特异性引物对和荧光标记探针进行PCR扩增，进行实时荧光探针PCR检测；所述特异性引物对是序列如SEQIDNO：1所示的上游引物PP65-F和序列如SEQIDNO：2所示的下游引物PP65-R；所述荧光标记探针序列如SEQIDNO：3所示。所述试剂盒包括序列如SEQIDNO：1所示的上游引物PP65-F和序列如SEQIDNO：2所示的下游引物PP65-R，进一步，还包括序列如SEQIDNO：3所示的荧光标记探针。本发明的方法和试剂盒操作简单，具有无创性、灵敏度高和特异性高的优点，适用于临床分子诊断。

Description

检测人巨细胞病毒PP65基因的方法及试剂盒

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及荧光探针PCR检测人巨细胞病毒PP65基因的方法及试剂盒。

背景技术

人巨细胞病毒（HumanCytomegalovirus,HCMV），属于疱疹病毒科β亚科，是一种双螺旋DNA病毒。HCMV呈世界性分布，在人群中广泛传播，在人体感染过程中，分为急性感染和潜伏感染，一经感染，人体将终身携带。HCMV多以潜伏感染形式存在于人体多种细胞中，在免疫系统功能正常的人体中，潜伏感染不致病，但HCMV感染在孕妇和婴幼儿等免疫功能低下的人群中，可导致包括致死在内的严重后果。妊娠期妇女由于其内分泌和免疫状态的改变可使体内潜伏的HCMV被激活，通过母婴垂直传播给胎儿，导致死胎、流产、胎儿发育迟缓及多种机型。此外，自身免疫病患者、接受免疫抑制治疗患者、以及接受化疗、放疗的肿瘤或器官骨髓移植的患者等极易通过感染而发生HCMV急性感染，引起诸如HCMV肝炎、肺炎、单核细胞增多症等HCMV致病表现。如当骨髓移植，肝、肾、心脏等器官移植患者免疫功能受损时，潜伏病毒被激活、增值而发生严重感染，将导致患者器官移植失败甚至死亡。

研究表明，一旦出现HCMV感染的临床症状，抗病毒药物不能控制该病的病理进程，这意味着抗病毒药物必须在HCMV感染的临床症状出现前就使用，这就有赖于实验室的分析。

HCMV感染的常用检测方法有病毒分离培养法和血清学方法。病毒分离培养法为HCMV实验室诊断的金标准，但培养所需时间过长，一般5-10天，结果受标本保存时间影响大，且分离培养条件和技术要求高，不适合大范围推广作为临床常规检测。血清学主要检测HCMV-IgG和IgM，IgG阳性仅能提示人体曾感染HCMV，不能证明是否为HCMV急性感染；IgM阳性表明存在急性感染，但针对免疫功能低下的患者，机体难以产生足够量的IgM，因此存在大量假阴性结果，且不能区分潜伏感染和活动性感染。抗原血症检测技术是一项快速、敏感的诊断技术，但是传统检测方法多以白细胞为病毒抗原检测载体，限制了其临床应用。

PP65是HCMV病毒复制的早期蛋白，它出现于病毒感染的早期，在细胞感染后3-4小时即开始出现，是HCMV病毒含量最丰富的蛋白。其功能是将病毒的DNA锚定在受感染细胞的核膜上，在胞浆的高尔基体内合成，然后运回核内。随着研究的深入，HCMV-PP65抗原被认为是HCMV感染表达的早期抗原，PP65抗原分析能敏感地在早期预测HCMV病。申请号为201310549511.4的发明专利公开了一种应用免疫荧光技术检测HCMVPP65抗原，利用与PP65具有特异性的适配子，构建了一种磁珠-适配子-抗原-单克隆抗体复合体，提高了PP65检验效率。申请号为201310549370.6的发明专利公开了一种基于生物芯片快速检测PP65的方法，利用与PP65具有特异性的适配子，应用生物芯片技术检测HCMVPP65抗原，提高了PP65检验效率。申请号为201410040889.6的发明专利公开了一种检测人巨细胞病毒（HCMV）PP65抗原的ELISA方法，包括以下步骤：（1）制备检测试剂盒：包被有大鼠抗重组PP65322-561多克隆抗体（pAb）的酶标板、兔抗重组PP65322-561pAb、标准品、HRP-羊抗兔IgG、PBST洗涤液、底物显色液、终止液和封板膜；（2）制备待测标本；（3）检测人巨细胞病毒PP65抗原。

核酸检验作为一种医学检验技术已经在感染性病原体诊断中体现出了巨大的优势和作用。现有HCMV试剂盒大多检测外周血，采集标本会造成创伤，且存在灵敏度低、稳定性差等缺点。研发无创性、高灵敏度和高特异性的HCMV核酸检测试剂盒对诊断HCMV感染有着积极的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，该方法操作简单，具有无创性、灵敏度高和特异性高的优点，适用于临床分子诊断。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，所述的方法具体为：

从待测样本中提取DNA，以所得DNA为模板，采用特异性引物对和荧光标记探针进行PCR扩增，进行实时荧光探针PCR检测；所述特异性引物对是序列如SEQIDNO：1所示的上游引物PP65-F和序列如SEQIDNO：2所示的下游引物PP65-R；所述荧光标记探针序列如SEQIDNO：3所示。荧光探针PCR检测是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。在本发明中，设计了一条带有FAM荧光素的荧光标记探针，其在PCR反应的退火期与PCR扩增的目标互补单链DNA杂交，并被TaqDNA聚合酶的5'核酸外切酶活性水解，水解后FAM荧光素将远离3'淬灭基团，从而在激发光作用下产生荧光信号。

所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，所述的待测样本为临床尿液样本，以尿液样本为待检测样本，实现了本发明的无创检测。

所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，所述PCR扩增的反应体系：2.5×PCRbuffer（已包含TaqDNA聚合酶）8ul，20×Enhancerbuffer1ul，10uM上游引物PP65-F1ul，10uM下游引物PP65-F1ul，10uM探针PP65-P0.5ul，模板DNA2ul，其余为无核酸酶的灭菌高纯双蒸水，终体积为20ul。

所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，所述PCR扩增程序为：（1）50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟；（2）按照95℃变性15秒，55℃退火40秒为一个循环，共循环40次。

本发明的目的之二在于提供一种用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，该试剂盒对HCMVPP65基因进行PCR检测，有很好的特异性和灵敏度。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，所述试剂盒包括用于扩增PP65基因的特异性引物对，所述特异性引物对是序列如SEQIDNO：1所示的上游引物PP65-F和序列如SEQIDNO：2所示的下游引物PP65-R。利用特异性引物对可对待测样本的DNA进行特异性扩增。

进一步，所述试剂盒还包括荧光标记探针，所述荧光标记探针序列如SEQIDNO：3所示，该试剂盒对HCMV进行荧光探针PCR检测，有很好的特异性和灵敏度。

进一步，所述试剂盒还包括HCMV核酸标准品，所述的HCMV核酸标准品是将得到的HCMVPP65基因序列连接到载体PBackZero-Tvector上形成PBackZero-HCMVPP65质粒即作为HCMV核酸标准品，利用标准品做成标准曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。本发明中，HCMVPP65基因的序列是通过TA克隆连接到载体PBackZero-Tvector上进行克隆，得到PBackZero-HCMVPP65质粒。TA克隆技术（TAcloning）利用Taq聚合酶具有末端转移酶（TdT）活性，但却不具有3'-5'端外切酶校准活性的特点，可在PCR产物的3'端加上一个非模板依赖碱基“A”。pMD18-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在XbaI和SalI识别位点间插入一个EcoRV位点，然后用EcoRV进行酶切使质粒线性化，并在它的3'端添加“T”构建而成。因其3'端带有一个突出的“T”尾，能高效地与带“A”尾的PCR产物连接，极大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR产物最简便、快捷的方法。

进一步，所述试剂盒还包括从待测样本中提取DNA的DNA提取试剂，所述的DNA提取试剂为本领域提取DNA常用的试剂。

进一步，所述试剂盒还包括对提取的DNA进行特异性扩增的PCR扩增试剂，如PCR缓冲液、MgCl₂溶液、dNTPs、DNA聚合酶等等。

本发明的有益效果在于：（1）本发明的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，该方法操作简单，具有无创性、灵敏度高和特异性高的优点，适用于临床分子诊断。（2）本发明的用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒对HCMVPP65基因进行PCR检测，有很好的特异性和灵敏度。

附图说明

图1为标准品PCR荧光曲线图；

图2为样本PCR荧光曲线图。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中，HCMV的PP65基因序列如SEQIDNO：4所示。

根据PP65基因序列设计的特异性引物对是序列如SEQIDNO：1所示的上游引物PP65-F和序列如SEQIDNO：2所示的下游引物PP65-R；设计的荧光标记探针序列如SEQIDNO：3所示。荧光标记探针的5'端标记荧光报告基团（FAM），3'端标记荧光淬灭基团（TAMRA），当探针完整时，报告基团与淬灭基团非常接近，报告基团荧光被淬灭基团抑制。在PCR过程中，如果靶序列存在，荧光标记探针可特异性地结合到靶序列上。在PCR扩增过程中，由于TaqDNA聚合酶的5'端核酸外切酶活性，使已经退火并结合到模板上的荧光双标记探针被酶解，解除TAMRA对FAM的淬灭。从而使报告基团表现荧光的活性，在480nm的激发光下产生520nm的荧光。PCR扩增后，进行荧光强度的测定。

载体PBackZero-Tvector购自大连TaKaRaBiotechnology公司。

PCRbuffer和Enhancerbuffer均购自天根生化科技（北京）有限公司，Cat#:FP203-02，Lot#:L1130。

实施例1标准品的制备

1、HCMVDNA的扩增

从临床尿液样本中提取DNA，以该DNA作为模板，利用设计的上下游特异性引物进行扩增，上游引物和下游引物的序列如下：

上游引物PP65-F:5’-CCCTCCGGCAAGCTCTTT-3’；

下游引物PP65-R：5’-CAGGTCCTCTTCCACGTCAGA-3’；

扩增得到的产物送至华大基因公司测序，确定扩增序列与目标即HCMVPP65基因序列完全一致。并委托中国Invitrogen公司按照扩增序列进行人工合成HCMVPP65基因。

2、HCMV核酸标准品的制备

将人工合成的HCMVPP65基因通过TA克隆连接到载体PBackZero-Tvector上进行克隆，再次测序验证序列，并利用分光光度计测定质粒溶液浓度，所得到的PBackZero-HCMVPP65质粒作为HCMV核酸标准品。

将不同摩尔数的PBackZero-HCMVPP65质粒加入高压灭菌处理的TEbuffer中，得到浓度为10⁷copy/ul的标准品；再用灭菌处理的TEbuffer按10倍等比连续稀释样品，获得浓度为10⁶copy/ul、10⁵copy/ul、10⁴copy/ul、10³copy/ul的标准品，建立的对数浓度（X）-CT值（Y）的线性关系如图1所示，其标准曲线的斜率为-3.77，Y轴截距为32.94，相关系数为0.9995，阈值1.0。

实施例2人巨细胞病毒（HCMV）检测的对比实验

收集509例临床患儿尿液样本，每例样本采用本发明方法和比对试剂盒同时检测。比对试剂盒为购自中山大学达安基因股份有限公司的人巨细胞病毒核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光探针法）[Cat.#DA-B061]。

1、利用本发明的方法检测上述509例样本

分别从上述509例临床尿液样本中利用苯酚抽提法提取DNA，以提取的DNA为模板，按照表1所构建的反应体系，依次加入样品，按照表2所构建的扩增程序进行实时荧光探针PCR检测，样本PCR荧光曲线图如图2所示，从而对509例临床尿液样本中的HCMVPP65基因进行检测，根据样本的CT数比对标准曲线，从而计算出样本中PP65基因的拷贝数。

表1用于检测HCMV的反应体系

表2用于检测HCMV的扩增程序

2、利用购买的比对核酸检测试剂盒检测上述509例样本

具体按照购买的试剂盒说明书进行操作，其用于检测HCMV的反应体系和用于检测HCMV的扩增程序条件如下所示：

（1）用于检测HCMV的反应体系：HCMV反应液40ul，Taq酶3ul，模板DNA2ul，终体积为50ul。

（2）用于检测HCMV的扩增程序：93℃预变性2分钟；95℃变性45秒，55℃退火60秒，共10循环；95℃变性30秒，55℃退火45秒，共30循环。

3、实验结果

本发明方法与比对试剂盒检测结果见表3。由表3可见，比对核酸检测试剂盒的检测假阳性和假阴性率分别为20.9%（48/230）和14.7%（41/279），与临床符合度为82.5%（420/509）；本发明方法检测假阳性和假阴性率分别为6.45%（18/230）和14.7%（16/279），与临床符合度为93.3%（475/509），表明本方法在检测灵敏度和特异性方面更有优势。

表3本发明方法与比对试剂盒检测结果比较

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110>重庆医科大学附属儿童医院

<120>检测人巨细胞病毒PP65基因的方法及试剂盒

<160>4

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>上游引物PP65-F

<400>1

ccctccggcaagctcttt18

<210>2

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>下游引物PP65-R

<400>2

caggtcctcttccacgtcaga21

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>荧光标记探针PP65-P

<400>3

tgcacgtcacgctgg15

<210>4

<211>1686

<212>DNA

<213>智人

<220>homosapiens

<223>人巨细胞病毒（HCMV）PP65基因序列

<400>4

atggagtcgcgcggtcgccgttgtcccgaaatgatatccgtactgggtcccatttcgggg60

cacgtgctgaaagccgtgtttagtcgcggcgatacgccggtgctgccgcacgagacgcga120

ctcctgcagacgggtatccacgtacgcgtgagccagccctcgctgatcttggtatcgcag180

tacacgcccgactcgacgccatgccaccgcggcgacaatcagctgcaggtgcagcacacg240

tactttacgggcagcgaggtggagaacgtgtcggtcaacgtgcacaaccccacgggccga300

agcatctgccccagccaggagcccatgtcgatctatgtgtacgcgctgccgctcaagatg360

ctgaacatccccagcatcaacgtgcaccactacccgtcggcggccgagcgcaaacaccga420

cacctgcccgtagctgacgctgtgattcacgcgtcgggcaagcagatgtggcaggcgcgt480

ctcacggtctcgggactggcctggacgcgtcagcagaaccagtggaaagagcccgacgtc540

tactacacgtcagcgttcgtgtttcccaccaaggacgtggcactgcggcacgtggtgtgc600

gcgcacgagctggtttgctccatggagaacacgcgcgcaaccaagatgcaggtgataggt660

gaccagtacgtcaaggtgtacctggagtccttctgcgaggacgtgccctccggcaagctc720

tttatgcacgtcacgctgggctctgacgtggaagaggacctgacgatgacccgcaacccg780

caacccttcatgcgcccccacgagcgcaacggctttacggtgttgtgtcccaaaaatatg840

ataatcaaaccgggcaagatctcgcacatcatgctggatgtggcttttacctcacacgag900

cattttgggctgctgtgtcccaagagcatcccgggcctgagcatctcaggtaacctgttg960

atgaacgggcagcagatcttcctggaggtacaagccatacgcgagaccgtggaactgcgt1020

cagtacgatcccgtggctgcgctcttctttttcgatatcgacttgctgctgcagcgcggg1080

cctcagtacagcgagcaccccaccttcaccagccagtatcgcatccagggcaagcttgag1140

taccgacacacctgggaccggcacgacgagggtgccgcccagggcgacgacgacgtctgg1200

accagcggatcggactccgacgaagaactcgtaaccaccgagcgcaagacgccccgcgtc1260

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gtgttcacctggccggcctggcaggccggcatcctggcccgcaacctggtgcccatggtg1500

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cgccaccggcaagacgccttgcccgggccatgcatcgcctcgacgcccaaaaagcaccga1680

ggttga1686

Claims (9)

1.一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，其特征在于，所述的方法具体为：

从待测样本中提取DNA，以所得DNA为模板，采用特异性引物对和荧光标记探针进行PCR扩增，进行荧光探针PCR检测；所述特异性引物对是序列如SEQIDNO：1所示的上游引物PP65-F和序列如SEQIDNO：2所示的下游引物PP65-R；所述荧光标记探针序列如SEQIDNO：3所示。

2.根据权利要求1所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，其特征在于：所述的待测样本为临床尿液样本。

3.根据权利要求1所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应体系：2.5×PCRbuffer8ul，20×Enhancerbuffer1ul，10uM上游引物PP65-F1ul，10uM下游引物PP65-F1ul，10uM探针PP65-P0.5ul，模板DNA2ul，其余为无核酸酶的灭菌高纯双蒸水，终体积为20ul。

4.根据权利要求1所述的一种检测人巨细胞病毒PP65基因的方法，其特征在于：所述PCR扩增程序为：（1）50℃处理2分钟，95℃预变性2分钟；（2）按照95℃变性15秒，55℃退火40秒为一个循环，共循环40次。

5.用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括用于扩增PP65基因的特异性引物对，所述特异性引物对是序列如SEQIDNO：1所示的上游引物PP65-F和序列如SEQIDNO：2所示的下游引物PP65-R。

6.根据权利要求5所述的用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光标记探针，所述荧光标记探针序列如SEQIDNO：3所示。

7.根据权利要求6所述的用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，特征在于：所述试剂盒还包括HCMV核酸标准品，所述的HCMV核酸标准品是将得到的HCMVPP65基因序列连接到载体PBackZero-Tvector上形成PBackZero-HCMVPP65质粒即作为HCMV核酸标准品。

8.根据权利要求5所述的用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括从待测样本中提取DNA的DNA提取试剂。

9.根据权利要求8所述的用于检测人巨细胞病毒PP65基因的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括对提取的DNA进行特异性扩增的PCR扩增试剂。