CN104131006A - 一种人腺病毒快速检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于技术领域，提供一种用于提取人腺病毒DNA的提取液、检测人腺病毒的PCR反应液、用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列、人腺病毒快速检测试剂盒及定量检测人腺病毒数量的方法。本发明提供的人腺病毒快速检测试剂盒，包括：用于提取人腺病毒DNA的提取液、检测人腺病毒的PCR反应液、用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列，还包括：腺病毒阳性对照以及用于检测阳性对照的扩增引物序列。本发明的试剂盒对腺病毒的检测灵敏度可达500copies/ml。定量线性范围500-5.0E+08copies/ml，适用于微量样本中腺病毒检测，为腺病毒感染的早期诊断提供可靠依据。

Description

一种人腺病毒快速检测试剂盒

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，涉及一种人腺病毒快速检测试剂盒，具体涉及一种用于提取人腺病毒DNA的提取液、检测人腺病毒的PCR反应液、用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列、人腺病毒快速检测试剂盒及定量检测人腺病毒数量的方法。

背景技术

腺病毒是一种没有包膜的直径为70～90nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。每个壳粒的直径为7～9nm。衣壳里是线状双链DNA分子，约含35000bp，两端各有长约100bp的反向重复序列。

人体腺病毒已知有52种，分别命名为adl～ad52，研究得最详细是ad2。腺病毒基因组转录产生mRNA，已知的转录单位至少有5个：EⅠ区位于病毒基因组左侧，可再分成EⅠA和EⅠB，与细胞转化有关；EⅡ区编码DNA结合蛋白，参与病毒的复制；EⅢ区编码出现在宿主细胞表面的一种糖蛋白；EⅣ区位于ad2基因组右端，受EⅡ区编码的DNA结合蛋白质调控；第5个转录单位在病毒感染中期合成ad2蛋白质Ⅳ。

腺病毒对啮齿类动物有致癌能力，或能转化体外培养的啮齿类动物细胞。使细胞转化只需要腺病毒基因组的一部分，这些基因位于基因组的左端，约占整个基因组的7％～10％。人体细胞是一类允许细胞(permissive cell)，即这类细胞允许感染入侵的病毒在细胞内复制增殖，最后细胞裂解死亡而释放出大量子代病毒。在体外培养的多种人体肿瘤细胞中均未查出腺病毒颗粒，但在人的1号染色体上有adl2的整合位点，这意味着人体细胞对于腺病毒也可能是非允许细胞，即这类细胞在病毒感染后，病毒不能在细胞内复制增殖，但可整合在受感染细胞的基因组内。这些细胞被病毒转化，表型发生改变，且可在体外无限期地培养传代。腺病毒对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，人腺病毒约1/3的已知血清型通常与人类疾病相关，但一种血清型可引起不同的临床疾患；相反，不同血清型也可引起同一种疾患。因此快速及时的检测出病因对于正确治疗以及防止病情恶化有着极为重要的作用。

病毒常用的检测方法是分离培养和病毒鉴定。从感染部位采集标本。加抗生素处理过夜，离心取上清接种敏感细胞(293、Hep-2或HeLa细胞等)，37℃孵育后可观察到典型CPE，即细胞变圆、团聚、有拉丝现象，最突出的表现是许多病变细胞聚在一起呈葡萄串状。用荧光标记的抗六邻体抗体与分离培养细胞作用来鉴定腺病毒，也常用血凝抑制试验或中和试验检测属和组特异性抗原并鉴定病毒的血清型。腺病毒可用Shell vial技术进行快速鉴定。病毒标本经抗生素和离心处理，取上清接种于有细胞的Shell vial培养瓶，孵育1～2天，用特异性六邻体单克隆抗体对其抗原表位进行检测。也可用病人鼻粘膜上皮脱落细胞直接染色检测病毒抗原。

抗原抗体结合的免疫学检测常用来直接检测腺病毒在呼吸道和胃肠道的感染,较快速且灵敏度较高。免疫荧光(尤其对呼吸道标本、咽拭子和活组织标本)和酶免疫分析(尤其对于粪便标本)是常用的方法,与细胞培养相比,免疫荧光所测腺病毒的灵敏性能提高40％～60％,其它直接测定抗原的方法包括免疫层析法和乳胶凝集法。但由于方法局限，免疫检测通量和灵敏就都受到限制。

聚合酶链式反应(PCR)技术在医学检测上的应用优势逐渐显现出来，PCR检测有检测灵敏度高，耗时短，重复性高，结果准确等特点，实时定量PCR是在普通PCR基础上发展出来的对PCR扩增结果实时记录检测的一种先进PCR反应体系。与传统PCR相比，实时定量PCR有更特异，结果更准确等优点。同时实时定量PCR也避免了PCR反应后的样品处理步骤，减少了检测之间的污染。

实时荧光定量PCR技术是目前腺病毒DNA的检测新方法，主要基于定量PCR技术，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该方法具有检测灵敏度高、简单方便且对试验环境要求低的优点，已被广泛用于免疫分析、细菌、病毒。但是，目前并没有报道一种在低反应量状态下即能快速准确检测人腺病毒的实时荧光定量PCR技术。

发明内容

本发明的目的是解决现有技术中人腺病毒检测时间长，灵敏度不高，不能定量检测的问题。

本发明的目的通过以下技术方案实现

1、本发明提供一种用于提取人腺病毒DNA的提取液，该提取液包括pH 8.0的50mM Tris-HCl，pH 8.0的100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K。

2.本发明还提供一种检测人腺病毒的PCR反应液，该反应液包括耐热TaqDNA聚合酶，dNTP，SyBr染料。

耐热Taq DNA聚合酶：南京诺唯赞生物科技有限公司；SyBr染料：南京诺唯赞生物科技有限公司；

3.上述2提供的一种检测人腺病毒的PCR反应液，其中，该反应体系还包括尿嘧啶糖基化酶和dUTP。

尿嘧啶糖基化酶：上海闪晶分子生物科技有限公司

4.本发明还提供一种用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列，该引物序列：

上游引物序列Adv-F：如SEQ ID NO.1所示；

下游引物序列Adv-R：如SEQ ID NO.2所示。

5.本发明还包括上述1-4任一项或多项的人腺病毒快速检测试剂盒。

即该人腺病毒快速检测试剂盒可以包括：上述1提供的用于提取人腺病毒DNA的提取液或者上述2提供的检测人腺病毒的PCR反应液或者上述3提供的用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列或者上述1提供的用于提取人腺病毒DNA的提取液和上述2提供的检测人腺病毒的PCR反应液或者上述2提供的检测人腺病毒的PCR反应液和上述3提供的用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列或者上述1提供的用于提取人腺病毒DNA的提取液和上述3提供的用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列。

6.本发明提供的一种人腺病毒快速检测试剂盒，该试剂盒包括：

一种用于提取人腺病毒DNA的提取液，包括pH 8.0的50mM Tris-HCl，pH8.0的100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K；

一种检测人腺病毒的PCR反应液，包括耐热Taq DNA聚合酶，dNTP，SyBr染料，反应所需的缓冲体系，尿嘧啶糖基化酶和dUTP；

一种用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列：

上游引物序列Adv-F：如SEQ ID NO.1所示；

下游引物序列Adv-R：如SEQ ID NO.2所示。

7.上述6提供的一种人腺病毒快速检测试剂盒，该试剂盒还包括：腺病毒阳性对照以及用于检测阳性对照的扩增引物序列：

阳性对照上游引物序列：如SEQ ID NO.3所示；

阳性对照下游引物序列：如SEQ ID NO.4所示。

本发明的阳性对照模板是PUC19重组质粒，扩增片段是该载体一段100bp插入片段：序列如SEQ ID NO.5所示，用于检测可能出现的假阴性结果。

8.本发明还提供一种定量检测人腺病毒数量的方法，该方法以人腺病毒标准品为基准，通过上述5-6任一项提供的试剂盒进行测定。

本发明的有益效果：

1.本发明采用实施定量PCR技术，检测人腺病毒，具有高灵敏性高特异性，快速准确的特点，应用于临床可以为临床检验提供更客观更准确的结果，能及时的了解病情并做出准确的治疗。

2.由于本发明的PCR混合液中包含尿嘧啶糖基化酶以及dUTP,尿嘧啶糖基化酶可以降解含dU的PCR产物，利用这个体系可以有效预防PCR产物污染的作用，从而避免假阳性的结果。同时，由于含有阳性模板，可以检测到假阴性结果。因此，本发明提供的产品准确度很高。

3.本发明的试剂盒对腺病毒的检测灵敏度可达500copies/ml.定量线性范围500-5.0E+08copies/ml,适用于微量样本中腺病毒检测，为腺病毒感染的早期诊断提供可靠依据。

4.本发明的DNA提取液提供一种相对温和的DNA提取方案，很大程度上减少了样本处理过程中对DNA的破坏。

附图说明

图1：微量样品中腺病毒检测实时定量扩增结果图

①-⑦：样品1-7；⑧空白阴性对照

图2：试剂盒定量测定样品中人腺病毒结果图

①、②：样品1、2；③：阳性对照组；④：阴性空白对照组

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

实施例1

微量样品中腺病毒检测

1.痰液样本DNA提取：将取得的小量痰液样品(江苏省疾病预防控制中心)7份，每份5μl与相应5倍体积的DNA提取液：包括pH 8.0的50mM Tris-HCl，pH 8.0的100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K。混合均匀，置于55度金属浴中55℃30min加热并震荡10分钟后加入等倍体积的分析纯异丙醇混合均匀，室温放置2分钟，12000rpm离心2min后弃去上清，加入20ul无菌水溶解制成模板DNA，备用。

2.利用primer primier5设计引物，由金斯瑞生物科技合成

腺病毒扩增引物：上游引物序列Adv-F：如SEQ ID NO.1所示；

                下游引物序列Adv-R：如SEQ ID NO.2所示。

阳性对照引物：上游引物序列：如SEQ ID NO.3所示；

              下游引物序列：如SEQ ID NO.4所示。

阴性对照模板PUC19重组质粒(南京诺唯赞生物公司)，通过普通的分子克隆技术插入100bp片段。

冰上溶解引物。

3.PCR扩增

(1)配制PCR反应体系：加入模板DNA 2ul，上下游扩增引物各0.5ul，加灭菌水补足50ul。加入PCR反应液10ul：包括耐热Taq DNA聚合酶，dNTP，SyBr染料。其中，Taq DNA聚合酶，dNTP，SyBr染料由25ul的AceQ^TMqPCRSTBR Green Master Mix提供。同时，加入尿嘧啶糖基化酶(1U/ul)2ul，dUTP5ul。

(2)PCR反应条件：

设定PCR反应条件：94℃4min，90℃1min，60℃1min，72℃1min，40个循环，72℃10min，4℃保存。

将配好的PCR体系放入实时定量PCR仪(Applied biosystem公司)中反应。

4.对照试验

本试验设置阴性空白对照：

阴性空白对照试验：PCR反应体系不包括模板DNA，其他反应体系和反应过程如步骤3所述,总反应体系50ul。

5.结果分析：反应结束后，PCR仪器自动保存结果，可用仪器自带的结果分析软件计算各样品扩增的Ct值，通过对比标准品扩增的Ct值来确定待测样品中腺病毒DNA的量。如图1所示，定量曲线中，横坐标为循环数，纵坐标为吸光值，样品1-7，CT值分别为14.424、17.322、20.918、25.019、31.803，样品8为阴性空白对照。

实施例2

试剂盒定量测定样品中人腺病毒。

1.样本准备：取小量痰液样品(江苏省疾病预防控制中心)2份，每份6μl用TE缓冲液稀释到1ng/ul。

2.利用本发明提供的人腺病毒快速检测试剂盒，按照实施例1提供的样品与试剂的比例，进行配制。

同时，按照同样比例，用本发明提供的人腺病毒快速检测试剂盒进行阴性空白对照、阳性对照、标准品检测。

阴性空白对照：反应体系不包括模板DNA，即为样品4。

阳性对照试验：在配制PCR反应体系中加入2ul插入了100bp片段后的PUC19重组载体代替模板DNA，即为样品3。

3.PCR扩增

设定PCR反应条件：94℃4min，90℃1min，60℃1min，72℃1min，40个循环，72℃10min，4℃保存。

将配好的PCR体系放入实时定量PCR仪(Applied biosystem公司)中反应。

4.结果分析：反应结束后，仪器自动保存结果，可用仪器自带的结果分析软件计算各样品扩增的Ct值，通过对比标准品扩增的Ct值来确定待测样品中腺病毒DNA的量。

通过对比标准品扩增的Ct值来确定待测样品中腺病毒DNA的量：

样品1：平均CT值为22.444，通过计算得到腺病毒DNA的量为：

5.0E+5.66copies/ml

样品2：平均CT值为25.311，通过计算得到腺病毒DNA的量为：

5.0E+4.84copies/ml

样品3：平均CT值为29.762，通过计算得到腺病毒DNA的量为：

5.0E+3.56copies/ml

样品4：为阴性对照组。

实施例3

纯化DNA样品中人腺病毒敏感性检测

将DNA样本用TE缓冲液稀释到5、5*10、5*10²、5*10³、5*10⁴copies/ml5个浓度差组，每组6ul，分别以5个浓度差组为模板。

按照实施例1的反应条件和反应体系，进行实施定量PCR反应，测定CT值，如表1所示，“+”表示吸光值随循环次数的增加有明显变化，“-”表示变化不大，以此确定本发明提供的体系检测人腺病毒的敏感性。通过比对，得到当反应液浓度≥5*10²copies/ml，吸光值随循环次数的增加会有明显的变化，得出检测灵敏度可达500copies/ml。

4.结果分析：反应结束后，仪器自动保存结果，可用仪器自带的结果分析软件计算各样品扩增的Ct值，通过对比标准品扩增的Ct值来确定待测样品中腺病毒DNA的量。

Claims (8)

1.一种用于提取人腺病毒DNA的提取液，其特征在于：该提取液包括pH8.0的50mM Tris-HCl，pH 8.0的100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K。

2.一种检测人腺病毒的PCR反应液，其特征在于：该反应液包括耐热TaqDNA聚合酶，dNTP，SyBr染料。

3.权利要求2所述的一种检测人腺病毒的PCR反应液，其特征在于：PCR反应体系还包括尿嘧啶糖基化酶和dUTP。

4.一种用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列，其特征在于：该引物序列为：

上游引物序列Adv-F：如SEQ ID NO.1所示；

下游引物序列Adv-R：如SEQ ID NO.2所示。

5.包括权利要求1-4任一项或多项的人腺病毒快速检测试剂盒。

6.一种人腺病毒快速检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒包括：

一种用于提取人腺病毒DNA的提取液，包括pH 8.0的50mM Tris-HCl，pH8.0的100mM EDTA，100mM NaCl，1％SDS，0.5mg/ml蛋白酶K；

一种检测人腺病毒的PCR反应液，包括耐热Taq DNA聚合酶，dNTP，SyBr染料，反应所需的缓冲体系，尿嘧啶糖基化酶和dUTP；

一种用于检测人腺病毒DNA的PCR引物序列：

上游引物序列Adv-F：如SEQ ID NO.1所示；

下游引物序列Adv-R：如SEQ ID NO.2所示。

7.权利要求6所述的一种人腺病毒快速检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还包括：腺病毒阳性对照以及用于检测阳性对照的扩增引物序列：

阳性对照上游引物序列：如SEQ ID NO.3所示；

阳性对照下游引物序列：如SEQ ID NO.4所示。

8.一种定量检测人腺病毒数量的方法，其特征在于：以人腺病毒标准品为基准，通过权利要求5-6任一项所述的试剂盒进行测定。