CN103820574B - 人疱疹病毒6型实时荧光定量pcr分型检测试剂盒 - Google Patents

人疱疹病毒6型实时荧光定量pcr分型检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，由定量PCR反应液、HHV-6A标准品、HHV-6B标准品、HHV-6A阳性对照品、HHV-6B阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上、下游扩增引物、HHV-6A荧光探针和HHV-6B荧光探针。本发明试剂盒采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针，能通过一步法检测HHV-6的两个亚型，对样品中的HHV-6A和HHV-6B能同时进行分型，对阳性的病毒亚型能实时准确定量，可满足早期、准确、分型诊断HHV-6感染的迫切需要，为HHV-6感染的流行病学调查和针对性治疗提供依据。

Description

人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及荧光定量PCR检测试剂盒，具体涉及一种双探针实时荧光定量PCR检测并分型患者血液、尿液、脑脊液等样本中人疱疹病毒6型（human herpesvirus 6, HHV-6）的诊断试剂盒，能同时分型和定量的HHV-6的两个亚型HHV-6A和HHV-6B。
背景技术
疱疹病毒科是一群中等大小、有包膜的DNA病毒，现已发现100种以上。已知与人类疾病相关的疱疹病毒包括单纯疱疹病毒1型和2型（HSV-1、HSV-2）、水痘－带状疱疹病毒（VZV）、爱泼斯坦－马尔病毒（EBV）、人巨细胞病毒（HCMV）、人疱疹病毒6型、7型和8型（HHV-6、HHV-7、HHV-8）。其中，HHV-6属β疱疹病毒亚科，可分为6A型和6B型两个亚型，为较新发现的人疱疹病毒，是幼儿急疹（ES）的病原体。近年发现HHV-6还可引起儿童病毒性脑炎，并可能导致死亡和严重的神经系统后遗症。HHV-6A和HHV-6B在病毒学和流行病学上具有显著差别，在引起脑炎的致病性上也存在差异，因此在临床诊断HHV-6感染时有必要进行准确的病原学分型。当机体免疫功能低下或受抑制时，易引起HHV-6感染或激活，早期诊断和及时抗病毒治疗可明显改善预后，降低病死率。因HHV-6感染的临床表现多样，且与其他疱疹病毒相比临床症状和体征多无特异性，因此早期诊断和及时治疗需依赖实验室检测。
传统的疱疹病毒检测方法主要包括病毒分离培养和血清学检测，前者曾为疱疹病毒的诊断“金标准”，但存在需时长（3-30天）、敏感性低（尤其在抗病毒药物治疗后）、分型困难等缺陷；后者又分为抗原直接检测法和抗体间接检测法，抗原直接检测法由于某些病毒不产生可检测的抗原而导致敏感性低，抗体间接检测法由于疱疹病毒感染后需1周左右才产生有效浓度的抗体而无法进行早期诊断，且不同疱疹病毒间存在交叉反应，抗体特异性不高。
随着分子生物学技术的迅速发展，聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）技术，特别是近几年兴起的实时荧光定量PCR技术为病原微生物的检测提供了新方向。实时荧光定量PCR技术的基本原理是利用Taq酶的5’-3’外切酶核酸活性，在普通PCR基础上设计荧光双标记探针，两端分别标记荧光报告基团（R）和淬灭基团（Q）；探针保持完整时R基团的荧光信号被Q基团抑制，一旦探针被切断，Q基团的抑制作用消失，R基团的荧光信号就可被检测到。该技术通过对荧光信号的检测实现对PCR过程中产物量的实时监测，并可精确计算初始模板量，除具有定量准确、检测快速等优点外，最大的优势是采用完全闭管检测，省去了对PCR产物的后处理，避免了交叉污染。
目前的实时荧光定量PCR技术随着材料和仪器的进一步发展，通过在荧光探针的5’端标记不同的荧光染料（FAM、HEX、ROX等）及多通道荧光定量PCR仪，可以实现基因分型、基因突变检测、SNP分析等研究。本发明基于上述技术背景，设计针对HHV-6A和HHV-6B的特异性探针，开发能一步法分型和定量HHV-6的荧光定量PCR检测试剂盒，旨在满足临床HHV-6感染早期、快速、分型诊断的需求，为临床HHV-6感染的流行病学调查和针对性治疗提供帮助。
发明内容
本发明的目的是提供一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒。是一种同时分型和定量HHV-6的实时荧光定量PCR检测试剂盒，由定量PCR反应液、HHV-6A标准品、HHV-6B标准品、HHV-6A阳性对照品、HHV-6B阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体组成，其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HHV-6A荧光探针和HHV-6B荧光探针。
PCR扩增引物序列为：
上游扩增引物（SEQ ID No：1）：5’-CCGTGAAGTTGGGGGATGAG-3’；
下游扩增引物（SEQ ID No：2）：5’-CAGAAGCAGCAATCGCAACAC-3’；
检测各疱疹病毒的荧光探针和荧光标记物为：
HHV-6A荧光探针（SEQ ID No：3）：5’FAM-ACAGACTCACGGATACAAG-BHQ-1-3’；
HHV-6B荧光探针（SEQ ID No：4）：5’HEX-ACAGACTCGCGAACACAAG-BHQ-1-3’。
HHV-6A标准品序列为（SEQ ID No：5）：CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACTCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTATCCGT GAGTCTGTGC TTGGGAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAGA ACTGTTCGGA TCCGATGATG AAACTTCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTGAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA TTGCTGCTTC TG。
HHV-6B标准品序列为（SEQ ID No：6）：CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACCCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTGTTCGC GAGTCTGTGC TTGGAAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAAA ACTGTTCGGA TCCAATGATG AAACTCCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTCAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA TTGCTGCTTC TG。
HHV-6A阳性对照和HHV-6B阳性对照分别为HHV-6A和HHV-6B灭活病毒株样品，阴性对照为无菌注射用水样品。
本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明试剂盒使用方法：
每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，标准品用无菌去离子水稀释为1×104－1×107拷贝。
疱疹病毒DNA的提取：严格按照商品化的QIAamp DNA抽提试剂盒操作，从临床标本或病毒分离培养物中提取疱疹病毒DNA。
PCR扩增检测：在双色（或以上）荧光定量PCR仪上进行，每个PCR反应体系总体积为25                                                ，其中包括20  PCR反应液和5 模板（提取的疱疹病毒DNA、标准品、阳性或阴性对照）。探针检测模式为：FAM、HEX通道分别用于检测HHV-6A、HHV-6B。PCR反应条件：94℃ 5分钟预变性，94℃ 20秒→60℃ 60秒，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。
荧光定量结果报告：① 检测样品的扩增曲线无对数增长期或双探针CT（域值循环数, threshold cycle）值均≥40为阴性；② 检测样品某一探针CT值≤38且扩增曲线有明显对数增长期，则该探针对应的HHV-6亚型为阳性；同一反应体系中两个探针CT值≤38且扩增曲线有明显对数增长期，则为HHV-6A和HHV-6B混合阳性；③检测样品某一探针38＜CT值＜40，需对样品重新进行DNA提取和PCR检测。
本发明采用实时荧光定量PCR技术和双色荧光探针，开发研制了用于HHV-6分型和定量检测的试剂盒。该发明试剂盒能通过一步法检测HHV-6的两个亚型，对临床样品中的HHV-6A和HHV-6B不仅能同时进行分型，而且对阳性的病毒亚型能进行实时准确定量，可满足临床早期、准确、分型诊断HHV-6感染的迫切需要，为HHV-6感染的流行病学调查和针对性治疗提供依据。
附图说明
图1为本发明试剂盒的结构示意图。
图2为HHV-6A和HHV-6B浓度梯度标准品的标准曲线。
具体实施方式
本发明结合实施例和附图作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明的范围。
实施例1
参见图1，本发明提供的人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，由定量PCR反应液1、HHV-6A标准品2、HHV-6B标准品3、HHV-6A阳性对照品4、HHV-6B阳性对照品5、阴性对照品6、说明书7和盒体8组成。
其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HHV-6A荧光探针和HHV-6B荧光探针。
PCR扩增引物序列为：
上游扩增引物（SEQ ID No：1）：5’-CCGTGAAGTTGGGGGATGAG-3’；
下游扩增引物（SEQ ID No：2）：5’-CAGAAGCAGCAATCGCAACAC-3’；
检测各疱疹病毒的荧光探针和荧光标记物为：
HHV-6A荧光探针（SEQ ID No：3）：5’FAM-ACAGACTCACGGATACAAG-BHQ-1-3’；
HHV-6B荧光探针（SEQ ID No：4）：5’HEX-ACAGACTCGCGAACACAAG-BHQ-1-3’。
HHV-6A标准品序列为（SEQ ID No：5）：CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACTCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTATCCGT GAGTCTGTGC TTGGGAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAGA ACTGTTCGGA TCCGATGATG AAACTTCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTGAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA TTGCTGCTTC TG。
HHV-6B标准品序列为（SEQ ID No：6）：CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACCCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTGTTCGC GAGTCTGTGC TTGGAAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAAA ACTGTTCGGA TCCAATGATG AAACTCCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTCAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA TTGCTGCTTC TG。
HHV-6A阳性对照和HHV-6B阳性对照分别为HHV-6A和HHV-6B灭活病毒株样品，阴性对照为无菌注射用水样品。
本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
实施例2  人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒的敏感性和特异性试验
（一）材料：
选取病原微生物包括：实验组：HHV-6B（GS株）由南京医科大学微生物教研组提供，HHV-6A由浙江大学附属儿童医院从临床血标本中筛选获得；对照组：金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组由浙江大学附属儿童医院细菌室、病毒室和基因扩增室提供。
（二）引物及探针的设计与合成：
对HHV-6A和HHV-6B的保守区序列进行生物信息学分析，设计并筛选PCR扩增引物和特异性荧光探针，委托上海生工生物公司合成。
上游扩增引物1序列为：5’-CCGTGAAGTTGGGGGATGAG-3’；
下游扩增引物2序列为：5’-CAGAAGCAGCAATCGCAACAC-3’；
HHV-6A荧光探针序列为：5’FAM-ACAGACTCACGGATACAAG-BHQ-1-3’；
HHV-6B荧光探针序列为：5’HEX-ACAGACTCGCGAACACAAG-BHQ-1-3’。
（三）检测标准品的制备：
用上游扩增引物和下游扩增引物分别扩增HHV-6A和HHV-6B病毒株，各扩增片段纯化后插入pGEM-T-Easy克隆载体构建重组质粒，用分光光度计对各质粒进行定量，并用无菌去离子水以10倍比稀释各质粒进行荧光定量PCR敏感性试验。
（四）试剂盒的敏感性和特异性试验：
采用人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒对上述常见病原微生物进行检测，实验组两种疱疹病毒检测结果均为阳性且分型符合，对照组金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乙型肝炎病毒、新型隐球菌、白色念珠菌和人类基因组等检测结果均为阴性，特异性为100%。构建的重组质粒标准品倍比稀释后检测敏感性可达10拷贝；用104、105、106、107四个定量的浓度梯度标准品作标准曲线，其CT值与质粒拷贝数之间具有良好的线性关系（图2）。
本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限度的范围。
<110> 浙江大学
<120> 人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒
<160> 6
 
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测人疱疹病毒6型通用上游引物序列
<400> 1
CCGTGAAGTTGGGGGATGAG 20
 
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 检测人疱疹病毒6型通用下游引物序列
<400> 2
CAGAAGCAGCAATCGCAACAC 21
 
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人疱疹病毒HHV-6A荧光探针序列
<400> 3
ACAGACTCACGGATACAAG 19
 
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人疱疹病毒HHV-6B荧光探针序列
<400> 4
ACAGACTCGCGAACACAAG 19
 
<210> 5
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据人疱疹病毒HHV-6A U38基因序列设计的HHV-6A荧光定量检测标准品序列
<400> 5
CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACTCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTATCCGT GAGTCTGTGC   60
TTGGGAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAGA  120
ACTGTTCGGA TCCGATGATG AAACTTCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTGAAAACAA  180
CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA  240
TTGCTGCTTC TG   252
 
<210> 6
<211> 252
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 根据人疱疹病毒HHV-6B U38基因序列设计的HHV-6B荧光定量检测标准品序列
<400> 6
CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACCCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTGTTCGC GAGTCTGTGC   60
TTGGAAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAAA  120
ACTGTTCGGA TCCAATGATG AAACTCCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTCAAAACAA  180
CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA  240
TTGCTGCTTC TG   252                 

Claims (2)

1.一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，由定量PCR反应液（1）、HHV-6A标准品（2）、HHV-6B标准品（3）、HHV-6A阳性对照品（4）、HHV-6B阳性对照品（5）、阴性对照品（6）、说明书（7）和盒体（8）组成；其中定量PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、耐热DNA聚合酶、上游扩增引物、下游扩增引物、HHV-6A荧光探针和HHV-6B荧光探针；其特征在于，
PCR扩增引物序列为：
上游扩增引物：5’-CCGTGAAGTTGGGGGATGAG-3’；
下游扩增引物：5’-CAGAAGCAGCAATCGCAACAC-3’；
检测各疱疹病毒的荧光探针和荧光标记物为：
HHV-6A荧光探针：5’FAM-ACAGACTCACGGATACAAG-BHQ-1-3’；
HHV-6B荧光探针：5’HEX-ACAGACTCGCGAACACAAG-BHQ-1-3’；
HHV-6A标准品序列为：CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACTCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTATCCGT GAGTCTGTGC TTGGGAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAGA ACTGTTCGGA TCCGATGATG AAACTTCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTGAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA TTGCTGCTTC TG；
HHV-6B标准品序列为：CCGTGAAGTT GGGGGATGAG ACCCATCGGT TTGTGAAGCC TTGTGTTCGC GAGTCTGTGC TTGGAAGTCT ACTAAAGGAC TGGCTGGCCA AGAGACGAGA AGTGAAGGCG GAGATGCAAA ACTGTTCGGA TCCAATGATG AAACTCCTTC TGGATAAAAA GCAGCTCGCT CTCAAAACAA CATGTAACTC GGTGTACGGT GTCACGGGAG CGGCGCACGG GTTATTGCCG TGTGTTGCGA TTGCTGCTTC TG；
HHV-6A阳性对照和HHV-6B阳性对照分别为HHV-6A和HHV-6B灭活病毒株样品，阴性对照为无菌注射用水样品。
2.根据权利要求1所述的一种人疱疹病毒6型实时荧光定量PCR分型检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒保存于-20℃，减少反复冻融。
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