CN103667514B

CN103667514B - 一种人白介素28b基因多态性荧光pcr检测试剂盒

Info

Publication number: CN103667514B
Application number: CN201310751791.7A
Authority: CN
Inventors: 吴大治; 夏懿; 吴梅
Original assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd; Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Current assignee: Shanghai Fosun Pharmaceutical Group Co Ltd; Shanghai Xingyao Medical Technology Development Co Ltd
Priority date: 2013-12-31
Filing date: 2013-12-31
Publication date: 2018-04-13
Anticipated expiration: 2033-12-31
Also published as: CN103667514A

Abstract

本发明涉及一种利用荧光PCR技术检测人白介素28B（IL28B）基因多态性的试剂盒。它在单个反应管中采用3条引物扩增rs12979860基因CC型和TT型序列，通过2条不同波长MGB荧光探针检测该基因的CC型和TT型。试剂盒操作简便、检测结果准确可靠，可应用于临床丙型肝炎患者IL28B rs12979860基因多态性检测，进而预测抗病毒药物治疗效果。

Description

一种人白介素28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒

技术领域

本发明涉及医学分子生物学领域，具体涉及一种人白介素28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

人白介素28B基因（Interleukin 28B，IL28B）位于人第19号染色体短臂（19q13），编码干扰素λ3（INF-λ3）参与人体抗病毒免疫反应，IL28B能刺激干扰素释放，增加细胞毒性T淋巴细胞数量，目前研究表明IL28B基因上游约3kb附近的单核苷酸多态性（SNP）rs12979860与聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗丙型肝炎的效果显著（Tanaka Y, etal，Nat Genet，2009，41:1105-1109），其中rs12979860多态性CC型比CT杂合型、TT型丙型肝炎或者的病毒清除率高2～3倍、且CC型比非CC型丙型肝炎患者获得显著增高的持续病毒反应与治疗终末反应（J Hepatol，2011，55：692-701； Nature，2009，461：798-801；AntivirTher，2011，16：141-47）。因此，丙型肝炎患者在抗病毒治疗前，检测与确定IL28Brs12979860基因多态性亚型，可以预测抗病毒药物疗效，有助于临床选择治疗方案，如选择抗病毒药物的种类和决定治疗持续的时间，同时还可用于肝移植前的供体筛查、复发性丙型肝炎患者的管理。

基因测序是检测IL28B rs12979860基因多态性的金标准方法，但是具有操作技术要求高、检测灵敏度低、不能区分杂合型的缺点，近年来也有利用等位基因特异性PCR（AS-PCR）、实时荧光PCR技术、熔解曲线或高分辨率熔解曲线分析（HRM）方法检测IL28Brs12979860基因多态性的文献报道（J Molecular Diagnostics，2011，13(4)：446-51；JClin Microbiol，2012：50：3353-55；中华检验医学杂志，2013，36(1)：59-62和36(8)：722-26），其中AS-PCR需要用凝胶电泳观察条带大小判断结果，检测灵敏度低、操作不方便；文献报道的荧光PCR检测或者采用单波长分管检测不同rs12979860基因亚型、操作复杂，或者使用单管检测但存在不同亚型交叉影响的问题，而HRM分析对仪器要求较高，多态性检测结果受仪器影响，这些检测方法存在的不足限制了IL28B rs12979860基因多态性检测在临床上的应用。

发明内容

本发明提供一种单管检测人白介素28B基因（IL28B）多态性的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用3条引物扩增IL28B rs12979860基因CC型和TT型序列，通过2条不同波长MGB荧光探针检测该基因的CC型和TT型；3条引物具有SEQ ID NO：1～3的序列，2条荧光探针具有SEQ ID NO：4和5的序列，SEQ ID NO：4序列探针5’端标记FAM荧光基团、SEQID NO：5序列探针5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团，探针3’端均标记MGB-NFQ基团；上述引物探针序列也可以是和上述序列同源性大于85%以上的序列。本发明通过双波长TaqManMGB探针荧光PCR技术实现单管检测IL28B rs12979860基因多态性，区分CC型、TT型以及杂合型，试剂盒使用简便、检测结果准确可靠，可应用于临床丙型肝炎患者IL28B rs12979860基因多态性检测，进行抗病毒治疗效果预测。

技术方案

通过对GenBank中人IL28B rs12979860基因序列查询，用Vector NTI、Oligo等软件对基因序列进行比对设计，按照TaqMan MGB荧光PCR设计的原则，优选了2条上游引物和1条下游引物扩增rs12979860基因CC型和TT型核苷酸序列中的66 bp片段、2条MGB探针分别检测该基因的CC型、TT型。上述引物探针设计具有如下特点：

具有SEQ ID NO：1和2序列的2条上游引物3’端末尾1～3个核苷酸位置设计了rs12979860基因单核苷酸突变位点，分别配合共有下游引物扩增CC型和TT型序列；具有SEQID NO：4和5序列的2条MGB探针3’端1～5个核苷酸分别与上游引物SEQ ID NO：1和2的3’端序列互补重叠，对应检测CC型和TT型。

3条引物和2条MGB荧光探针核苷酸序列（5’ -> 3’）如下：

CC型上游引物（CCpf）：gAgCTCCCCgAAggCgCg，序列记为SEQ ID NO：1。

TT型上游引物（TTpf）：gAgCTCCCCgAAggCgTg，序列记为SEQ ID NO：2。

下游共有引物（pr）：ggCgAggggCTTTgCTgg ，序列记为SEQ ID NO：3。

CC型荧光探针（CCprobe）：CAATTCAACCCTggTTCgC ，序列记为SEQ ID NO：4，其中探针5’端标记FAM（6-carboxy-fluorescein）荧光基团、3’端标记MGB-NFQ（Minor groovebinder-nonfluorescent quencher）淬灭基团。

TT型荧光探针（TTprobe）：CAATTCAACCCTggTTCACg，序列记为SEQ ID NO：5，其中探针5’端标记JOE（5-dichloro-dimethoxy-fluorescein）或HEX（5-hexachloro-fluorescein）或VIC荧光基团、3’端标记MGB-NFQ淬灭基团。

上述引物探针序列也可以是和SEQ ID NO：1～5序列同源性大于85%以上的序列。

所述荧光PCR反应体系各成分组成如下：Tris-HCl（pH8.3）10 mM、KCl 50 mM、dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM、MgCl₂ 3 mM、3条引物各0.8 μM、2条MGB荧光探针各0.2 μM、Taq DNA聚合酶2 U、UNG酶0.5 U，提取的模板10μl，总反应体积30μl。

所述荧光PCR扩增程序如下：50℃ 2min、95℃ 10min后按照95℃ 10sec、62℃35sec循环扩增40次，循环步骤中62℃时采集FAM和JOE波长荧光信号。

所述人IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒质控品包括阴性对照、CC型阳性对照、TT型阳性对照各1个，其中阴性对照为去离子水，CC型、TT型阳性对照分别为人工构建含有IL28B rs12979860基因CC型、TT型扩增片段的TA克隆质粒，浓度为10⁵ copy/ml。

通过上述设计优选获得的3条扩增引物和2条荧光探针，本发明提供了实时荧光PCR检测的试剂盒，优化了PCR反应体系和扩增程序。当然本研究领域技术人员根据荧光PCR的一般要求可以调整PCR反应体系和程序，也同样能实现检测的目的。

有益效果

本发明根据上述设计的引物探针和技术方案，通过优化反应体系和扩增条件研制成人IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒，其主要特点如下：

（1）通过型特异性的引物探针特殊重叠设计，提高了试剂盒检测的特异性。

（2）通过反应体系和扩增程序优化，在两种基因型扩增效率和非特异扩增之间获得平衡，提高了试剂盒检测的准确性，避免因结果不准确造成误诊。

（3）试剂盒实现了单管检测IL28B rs12979860基因多态性，使用简便快速，可在2小时内报告检测结果。

（4）试剂盒扩增体系中的dUTP－UNG酶系统避免了因扩增产物污染导致的结果假阳性。

试剂盒的上述特点，均为采用特殊设计的IL28B rs12979860基因多态性引物探针并与荧光PCR技术组合应用而直接引起，实现rs12979860 CC型和TT型检测，本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于临床丙型肝炎患者的IL28B rs12979860基因多态性检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以通过技术常识对本发明作各种技术性改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1：IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒引物探针的设计

根据NCBI GenBank数据库中查询的人IL28B rs12979860基因序列，采用VectorNTI、Oligo等引物设计软件，优选获得的检测引物探针序列如表1所示，引物对扩增IL28Brs12979860基因上66 bp片段。

表1 设计的试剂盒EBV和内参照检测引物探针

以上引物探针委托英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

实施例2：IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒配制

试剂盒反应缓冲液为自行配制，按表2各组分浓度和体积配制32人份试剂盒反应缓冲液，配制的反应缓冲液每个反应分装用量为20μl，加入模板10μl后总反应体积为30μl。

表2 试剂盒反应缓冲液配制各组分体积

组分	初始浓度	反应终浓度（30μl）	32人份体积（μl）
				Tris-HCl(pH8.3)	1000mM	10mM	9.6
KCl	500mM	50mM	96
				dATP	100mM	0.2mM	1.92
dGTP	100mM	0.2mM	1.92
				dCTP	100mM	0.2mM	1.92
dUTP	100mM	0.2mM	1.92
				MgCl₂	50mM	3.0mM	57. 6
CCpf	10μM	0.8μM	76.8
				TTpf	10μM	0.8μM	76.8
pr	10μM	0.8μM	76.8
				CCprobe	5μM	0.2μM	38.4
TTprobe	5μM	0.2μM	38.4
				Taq酶	5U/μl	2U/反应	12.8
UNG酶	1U/μl	0.5U/反应	16
				水	--	--	133.12
总体积	--	--	640

试剂盒阴性对照采用去离子水，CC型、TT型阳性对照分别为人工构建含有IL28Brs12979860基因CC型、TT型扩增片段的TA克隆质粒，用TE稀释到10⁵ copy/ml作为阳性对照。

试剂盒扩增程序为：50℃ 2min、95℃ 10min后按照95℃ 10sec、62℃ 35sec循环扩增40次，循环步骤中62℃时采集FAM和JOE波长荧光信号。

通过上述配制的IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒包括PCR反应缓冲液和3个质控品，-20℃保存和运输。

实施例3：试剂盒在丙型肝炎患者全血标本IL28B基因多态性检测中的应用

（1）全血 DNA提取

从临床收集丙型肝炎患者EDTA抗凝全血标本10个，采用QIAGEN公司QIAamp DNABlood Mini Kit（Cat. No.51104）提取全血DNA，每个全血标本提取洗脱核酸各50 μl。

（2）荧光PCR检测

将实施例2中试剂盒扩增部分（反应缓冲液）从-20℃冰箱取出冻融、混匀、短暂离心，按20μl/人份将反应缓冲液分装到PCR反应管中，然后分别加入试剂盒阴性对照、CC型阳性对照、TT型阳性对照以及提取的10个标本模板各10 μl，每个反应管液体总体积为30μl，将上述反应管放到ABI7500荧光PCR仪上，设定反应管样本类型和扩增程序，即50℃ 2min、95℃ 10min后按照95℃ 10sec、62℃ 35sec循环扩增40次，循环步骤中62℃时采集FAM和JOE波长荧光信号。扩增结束后按照仪器软件和试剂盒说明书分析判断实验结果。

（3）基因测序检测

采用文献（J Molecular Diagnostics，2011，13(4)：446-51）报道的IL28Brs12979860基因测序引物（5’->3’引物序列，上游：gATTCCTggACgTggATg；下游：gCTCAgggTCAATCACAgAAg，扩增产物长度181bp）和条件，对上述提取的10个患者全血标本DNA模板进行扩增，将PCR产物测序结果进行分析确定rs12979860基因亚型，并和本发明试剂盒检测结果比较。

（4）结果分析

分别采用本发明IL28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒、基因测序法检测10个丙型肝炎患者标本IL28B rs12979860基因多态性结果如表3所示，可知10个标本中有8个为CC型、2个为TT型，本发明试剂盒与金标准基因测序法结果100%符合，试剂盒检测IL28Brs12979860基因多态性具有高度特异性和灵敏度。

表3试剂盒荧光PCR检测EBV标本结果

注：试剂盒FAM、JOE通道分别检测CC型和TT型，表中FAM和JOE列数值为两个通道检测Ct值（有Ct值为阳性）、undet表示阴性。

核苷酸序列表

SEQUENCE LISTING

<110> 上海星耀医学科技发展有限公司

上海复星医药（集团）股份有限公司

<120> 一种人白介素28B基因多态性荧光PCR检测试剂盒

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> SEQ_ID_NO:1

<222> (1)..(18)

<400> 1

gagctccccgaaggcgcg 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> SEQ_ID_NO:2

<222> (1)..(18)

<400> 2

gagctccccgaaggcgtg 18

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> SEQ_ID_NO:3

<222> (1)..(18)

<400> 3

ggcgaggggctttgctgg 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> SEQ_ID_NO:4

<222> (1)..(21)

<223> b=FAM;d=MGB-NFQ

<400> 4

bcaattcaac cctggttcgc d 21

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> SEQ_ID_NO:5

<222> (1)..(22)

<223> b=JOE or HEX or VIC; d=MGB-NFQ

<400> 5

bcaattcaac cctggttcac gd 22

Claims

1.一种单管检测人白介素28B基因多态性的荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述试剂盒采用3条引物和2条MGB荧光探针检测该基因rs12979860的CC型和TT型，并且3条引物核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1～3，2条荧光探针核苷酸序列分别为SEQ ID NO：4～5，SEQ ID NO：4序列探针5’端标记FAM荧光基团、SEQ ID NO：5序列探针5’端标记JOE或HEX或VIC荧光基团，两条探针3’端均标记MGB-NFQ淬灭基团。

2.如权利要求1所述的试剂盒，使用的3条引物中有2条上游引物SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2、1条下游引物SEQ ID NO：3，人白介素28B基因 rs12979860基因单核苷酸突变位点设计在上游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的3’端末尾1～3个核苷酸位置，辅以共有的下游引物SEQ ID NO：3分别扩增CC型和TT型。

3.如权利要求1所述的试剂盒，使用SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5这2条MGB荧光探针序列的3’端1～5个核苷酸分别与上游引物SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的3’端序列互补重叠，对应检测CC型和TT型。

4.如权利要求1所述的试剂盒，所述荧光PCR反应液各成分终浓度为：pH8.3的Tris-HCl10 mM，KCl 50 mM，dATP、dGTP、dCTP、dUTP各0.2 mM，MgCl₂ 3 mM，3条引物各0.8 μM，2条MGB荧光探针各0.2 μM，Taq DNA聚合酶2 U，UNG酶0.5 U，提取的模板10μl，总反应体积30μl。

5.如权利要求1所述的试剂盒，所述荧光PCR扩增程序为：50℃ 2min、95℃ 10min后按照95℃ 10sec、62℃ 35sec循环扩增40次，循环步骤中62℃时采集FAM和JOE波长荧光信号。

6.如权利要求1所述的试剂盒，其质控品包括阴性对照、CC型阳性对照、TT型阳性对照各1个。