CN102277441A - 一种快速检测IL28B SNP rs12979860多态性的试剂盒 - Google Patents
一种快速检测IL28B SNP rs12979860多态性的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种快速检测IL28B基因的SNPrs12979860多态性的试剂盒。该试剂盒通过设计特异性引物，与样品中模板DNA进行普通PCR反应，根据PCR反应的结果判断样品IL28BSNPrs12979860的多态性形式（CC、CT、TT），从而为丙型肝炎患者的临床抗病毒治疗提供疗效预测的结果。该试剂盒操作简便、检测过程短、经济有效，可广泛用于丙型肝炎患者抗病毒治疗前的疗效筛查，便于临床医生有针对性的制定治疗方案，有很高的临床应用价值，特别适合临床推广。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种快速检测IL28B SNP rs12979860多态性的试剂盒，用于预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果。
背景技术
丙型肝炎(Hepatitis C infection)是严重危害人类健康的感染性疾病，其流行呈世界性分布。据WHO统计数据，全球约有1.4亿-1.7亿丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)感染者。我国HCV的感染率约为3.2％，约3800万HCV感染者，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例。
以往的研究表明，丙型肝炎的治疗方式与治疗效果与病毒基因型密切相关，基因型1和基因型4的患者使用聚乙二醇干扰素、利巴韦林(PegIFN/RBV)联合治疗48周；基因型2和基因型3的患者使用聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗24周。新近的研究表明，除了病毒方面的因素(基因型、HCV RNA水平)外，患者自身的因素也能对抗病毒治疗效果进行预测，其中IL28B多态性是一个重要的预测因子(Manns and others，2001)。
IL28B基因位于第19号染色体短臂(19q13)，编码干扰素λ(IFN-λ-3)参与抗病毒免疫反应，IL28B能刺激干扰素释放，增加细胞毒性T淋巴细胞的数量。通过全基因组相关性研究(GWAS)发现，IL28B基因附近的SNP rs12979860多态性与聚乙二醇干扰素、利巴韦林联合治疗的效果显著相关，在HCV基因型1和4的患者中，IL28B保护性变异即SNP rs12979860CC型患者获得的持续病毒反应(SVR)比TT型高2倍；在HCV基因型2和3型的丙型肝炎患者中SVR变化较小(Lange and Zeuzem，2011)。在欧美人群中，IL28B rs12979860CC型比CT或TT型丙型肝炎患者的病毒清除率高2-3倍之多(Thomas DL，2009)。在汉族人群中也发现，CC型比非CC型丙型肝炎患者获得显著增高的持续病毒反应与治疗终末反应(ETR)(Liao XW，2011)。IL28B基因多态性是目前为止GWAS发现用于个性化临床治疗的最好典范之一(Maxmen，2011)。IL28B rs12979860多态性检测还可用于肝移植前的供体筛查，复发性丙型肝炎患者的管理。
在丙型肝炎临床治疗中，快速病毒反应(RVR)是评价疗效的重要指标，在 不能获得快速病毒反应的患者中，IL28B rs12979860CC型患者较非CC型患者更易获得持续病毒反应(Clark and others，2011)，充分表明CC型是所谓的“保护型”。综合大量临床研究的结果，在丙型肝炎抗病毒治疗的宿主和病毒多种影响因素中，IL28B多态性是预测持续病毒反应的最有效因子。在抗病毒治疗前，对患者进行IL28B多态性检测，确定IL28B rs12979860基因型将极大地有助于临床医生选择治疗方案，如选择抗病毒药物的种类和决定治疗持续时间。
目前可用于SNP多态性检测的方法有限制性片段长度多态性、荧光定量PCR、基因测序法等。限制性片段长度多态性技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，影响结果判断；荧光定量PCR和基因测序法成本高，不易临床推广；普通PCR操作简便，成本低廉，便于临床推广使用。
因此，有必要选择一种简便快速的方法检测IL28B rs12979860多态性，指导临床治疗，预测丙型肝炎抗病毒治疗效果。我们根据IL28B rs12979860多态性存在CC，CT，TT的三种形式，针对SNP位点设计特异性引物，进行普通PCR反应，通过反应产物的“有或无”来判断待测样品属于哪一种多态性形式。
目前尚无文献报道利用普通PCR反应进行IL28B SNP rs12979860检测的试剂盒。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种能快速、简便、敏感、特异的检测IL28B SNP rs12979860多态性的试剂盒，用以预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果。
本发明的试剂盒利用普通PCR技术，包含：人外周血基因组提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液，还包含IL28B TT基因型扩增引物和CC基因型扩增引物，以及内部参照基因扩增引物，
TT基因型上游扩增引物序列为：
5′-TCGCCAGGGCCCCTAACCTC-3′
TT基因型下游扩增引物序列为：
5’-GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCA-3’
CC基因型上游扩增引物序列为：
5’-GAGGATCCCTCCTGGGGCGG-3’
CC基因型下游扩增引物序列为：
5’-GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCG-3’
内部参照基因上游扩增引物：
5’-TTATCGCATACGGCTAGGC-3’
内部参照基因下游扩增引物：
5’-CACAATTCCCACCACGAGA-3’。
其中的人外周血基因组提取试剂为：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)混合液，异丙醇和无水乙醇。
其中阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以已知基因型的外周血基因组DNA为阳性对照。
其中的PCR反应液包括：10×PCR混合液、0.25pmol/μL的引物、2.5～4.0mM的MgCl2、2U的Taq酶、0.2～0.4mM的dNTPs、0.3～0.6mM dUTP、通常取1～2μL的模板。
用本发明的试剂盒检测临床待检者外周血IL28B SNP rs12979860基因多态性，预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果情况：首先使用外周血基因组DNA提取试剂得到患者外周血基因组DNA，利用合成的PCR引物进行PCR扩增。扩增产物直接采用DNA凝胶电泳，凝胶成像系统下观察电泳条带，判断rs12979860基因多态性。
该试剂盒操作简便、检测过程短、经济有效，可广泛用于丙型肝炎患者抗病毒治疗前的疗效筛查，便于临床医生有针对性的制定治疗方案，有很高的临床应用价值，特别适合临床推广。
本发明试剂盒的优点和有益效果如下：
(1)敏感：本方法利用设计的特定性引物，采用PCR技术结合凝胶成像技术，因此它的检测灵敏度很高。
(2)特异：使用针对IL28B SNP rs12979860多态性位点的特异性引物对其进行分子识别，具有很高的准确性，特异性好、假阳性低。
(3)简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染。
(4)快速：速度快、高通量，可在2～3小时完成。
(5)经济、便捷：在一次测定中同时完成IL28B SNP rs12979860TT型、CC型及TC型的检测，便于临床广泛开展，节省患者开支。
附图说明
图1IL28B SNP rs12979860CC基因型分析结果：A为PCR扩增产物DNA凝胶电泳结果，B为基因测序比对结果。
图2IL28B SNP rs12979860TT基因型分析结果：A为PCR扩增产物DNA凝胶电泳结果，B为基因测序比对结果。
图3IL28B SNP rs12979860CT基因型分析结果：A为PCR扩增产物DNA凝胶电泳结果，B为基因测序比对结果。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1本发明试剂盒的制备
(1)外周血基因组DNA提取试剂组成如下：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇(24∶1，v/v)混合液，异丙醇和无水乙醇。
(2)引物：
TT基因型上游扩增引物序列为：
5′-TCGCCAGGGCCCCTAACCTC-3′(SEQ ID No.1)
TT基因型下游扩增引物序列为：
5’-GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCA-3’(SEQ ID No.2)
CC基因型上游扩增引物序列为：
5’-GAGGATCCCTCCTGGGGCGG-3’(SEQ ID No.3)
CC基因型下游扩增引物序列为：
5’-GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCG-3’(SEQ ID No.4)
内部参照基因上游扩增引物：
5’-TTATCGCATACGGCTAGGC-3’(SEQ ID No.5)
内部参照基因下游扩增引物：
5’-CACAATTCCCACCACGAGA-3’(SEQ ID No.6)
上述引物序列由上海Life Technology公司合成。
(3)阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以已知基因型的外周血基因 组DNA为阳性对照。
(4)PCR反应液：10×PCR混合液、0.25pmol/μL的引物、2.5～4.0mM的MgCl2、2U的Taq酶、0.2～0.4mM的dNTPs、0.3～0.6mM dUTP、通常取1～2μL的模板。
(5)PCR扩增程序的设定：在ABI9700仪器上通常是先95℃5min，然后95℃30s，57℃45s，72℃1min，循环30次，最后72℃10min。
(6)2％(g/ml)的DNA凝胶电泳后，凝胶成像系统下观察PCR产物，判别IL28BSNP rs12979860多态性。
实施例2用实施例1制备的试剂盒检测人外周血IL28B SNP rs12979860多态性
以检测20例丙型肝炎患者外周血样品基因组DNA中IL28B SNP rs12979860多态性为例。
(1)检测流程：
首先根据NCBI核酸数据库提供的人IL28B SNP rs12979860序列设计特异性引物。获取临床丙型肝炎患者外周血样品，快速提取基因组DNA；配置PCR反应液进行PCR扩增，然后凝胶成像系统下观察特征性PCR扩增产物大小，判别rs12979860多态性。
具体步骤如下：
(1)外周血基因组DNA的抽提：按外周血基因组DNA抽提纯化的方法抽提丙型肝炎患者外周血中基因组DNA。
(2)PCR扩增：PCR反应体系为20μl：含2X PCR premix(混合液)10.0μL，引物浓度0.2μmol/L，超纯水补齐。在ABI9700仪器上通常是先95℃5min，然后95℃30s，57℃45s，72℃1min，循环30次，最后72℃10min。
(3)2％(g/ml)的DNA凝胶电泳后凝胶成像系统下观察特征性PCR产物大小，判别rs12979860多态性(图1、图2、图3)。
(4)结果：
实施例3试剂盒检测能力评价：
前期实验表明，本试剂盒敏感性、特异性及灵敏度与测序法比较，二者没有差异，完全符合目前临床诊疗实用要求：
表1两种方法检测rs12979860多态性的比较
其中：
①特异性：100％；
②灵敏度：100％；
③阳性预测值：阳性预测值达到100％；
④阴性预测值：阴性预测值达到100％；
⑤重复性：多次重复实验结果一致；
⑥耗时：一份临床标本的检测时间约为2～3h，耗时短。
上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的PCR扩增法对待检者外周血IL28B SNP rs12979860基因多态性进行检测，预测丙型肝炎患者抗病毒治疗效果情况，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，该试剂盒为临床丙型肝炎患者的治疗及健康管理提供了一种全新的快速简便的基因检测方法。
SEQUENCE LISTING
<110> 李, 艳
童, 永清
<120> 一种快速检测IL28B SNP rs12979860多态性的试剂盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcgccagggc ccctaacctc 20
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggagtgcaat tcaaccctgg ttca 24
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gaggatccct cctggggcgg 20
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ggagtgcaat tcaaccctgg ttcg 24
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttatcgcata cggctaggc 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cacaattccc accacgaga 19
Claims (4)
1.一种快速检测IL28B SNP rs12979860多态性的试剂盒，包含：人外周血基因组提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液，还包含IL28B TT基因型扩增引物和CC基因型扩增引物，以及内部参照基因扩增引物，
TT基因型上游扩增引物序列为：
5'- TCGCCAGGGCCCCTAACCTC -3'
TT基因型下游扩增引物序列为：
5’-GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCA-3’
CC基因型上游扩增引物序列为：
5’-GAGGATCCCTCCTGGGGCGG-3’
CC基因型下游扩增引物序列为：
5’-GGAGTGCAATTCAACCCTGGTTCG-3’
内部参照基因上游扩增引物：
5’-TTATCGCATACGGCTAGGC-3’
内部参照基因下游扩增引物：
5’-CACAATTCCCACCACGAGA-3’。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，其中的人外周血基因组提取试剂为：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇按体积比24：1的混合液，异丙醇和无水乙醇。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以已知基因型的外周血基因组DNA为阳性对照。
4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，其中的PCR反应液包括：10×PCR 混合液、0.25 pmol/μL的引物、2.5~4.0 mM的MgCl2、2U的Taq酶、0.2~0.4 mM的dNTPs、0.3~0.6 mM dUTP。
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