CN102329885B - 一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒 - Google Patents
一种用于检测vkorc1和cyp2c9基因多态性的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种快速检测VKORC1和CYP2C9的基因多态的试剂盒，用于指导临床华法林用药剂量。该试剂盒包括SEQIDNo.1~6所示的三对引物，并且还可以进一步包括以下试剂中的一种或多种：PCR反应液、阴性对照、阳性对照、PCR测序反应液、人外周血基因组提取试剂。本发明提供的试剂盒采用敏感性及特异性均较高的基因测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，该试剂盒为临床提高华法林应用的安全性和有效性提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用基因测序技术检测VKORC1和CYP2C9基因多态性，进而指导华法林选择用药剂量的试剂盒。
背景技术
华法林是属于香豆素类药，通过抑制维生素K依赖性凝血因子的合成，延长凝血酶原活化时间，达到抗凝的目的。它在临床上常用于治疗血栓性疾病，具有抗凝和溶栓的双重作用，是目前国际上最常用的长效抗凝剂，也是治疗和预防静脉血栓性疾病的主要药物之一。但华法林的有效血药浓度范围狭窄，剂量偏小会降低治疗血栓形成的效果，剂量偏大则会增大出血的风险，甚至引发大出血等副作用。
临床上常以凝血酶原时间(PT)及国际标准化比率(INR)作为监测指标，以达到安全有效地使用它。因此临床医生常先给予一定标准剂量，然后根据每个患者INR值的情况，增加或减少剂量直至INR达到靶标，从而确定需要的维持剂量，长时间的进行维持治疗。使用华法林的另一个特点是其稳定剂量在不同种族间及个体间存在着较大差异，不同个体间稳定剂量的差异可达20倍以上。因此，将不同患者的华法林剂量调整到既安全又有效的范围，是长期以来临床用药上一个非常棘手的问题。
造成华法林用量个体差异的原因很多，可分为非遗传因素和遗传因素。非遗传因素主要有年龄、身高、体重，药物的相互作用，饮食习惯，疾病状态等。然而，非遗传因素的影响程度较为有限，并非华法林用量个体差异的主要原因。近年的研究表明，遗传因素在华法林用量个体差异的表现中起到关键的作用。影响华法林用量个体差异的遗传因素是指与华法林的药动学和药效学有关的蛋白或酶的基因发生变异，影响蛋白的表达或酶的活性，从而增强或降低华法林的疗效，使不同个体间的用量产生差异。目前，已知与华法林的药效学和药动学相关的基因达30余种，其中维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1基因(VKORC1)和细胞色素2C9(CYP2C9)的多态性是影响华法林用量个体差异最主要的两个遗传因素。到目前为止，已发现的CYP2C9等位基因有30余种，其中以*l(野生型)、*2(Arg144Cys)、*3(Ile359Leu)最为常见，而VKORC1主要表现为G-1639A位点多态性。目前，研究人员更倾向于将遗传因素与非遗传因素相结合，建立新的华法林稳定剂量预测算法，提高了剂量预测的效能。大多数这样的算法可解释华法林用量个体差异50%以上的原因。研究显示VKORC1和CYP2C9的多态性对华法林用量个体差异的贡献比例分别6-37%和5-22%。
因此，通过对患者的基因进行检测，来确定华法林需求的维持剂量，就可以实现个体化用药，既可避免剂量不够造成血栓，又可防止剂量过大引起出血并发症。采用敏感性及特异性均较高的基因测序法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性，可为临床提高华法林应用的安全性和有效性提供一种全新的快速简便的基因诊断技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异的检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，为临床个体化使用华法林剂量提供依据。
本发明的试剂盒利用基因测序技术，设计了VKORC1和CYP2C9基因PCR扩增引物，为此，本发明首先提供一种用于VKORC1和CYP2C9基因多态性检测的引物：
1）VKORC1第3外显子基因
上游引物序列为：5′- CAGTGCCTGAAGCCCACA -3 ′，
下游引物序列为： 5′- CTCACATGCCAAAGCAAAGC -3 ′ ；
2）CYP2C9第3外显子基因
上游引物序列为：5′- GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG -3’，
下游引物序列为：5′- ATATTCACCCCAAGGCTGTCT -3’；
3）CYP2C9第7外显子基因
上游引物序列为：5′- GTGCCATTTTTCTCCTTTTCC -3’，
下游引物序列为：5′- AATGTCACAGGTCACTGCATG -3’。
进一步本发明提供一种利用基因测序技术检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其包括上述VKORC1和CYP2C9基因多态性扩增引物。基于此，本发明可以采用现有常规方法提取人外周血基因组、进行PCR扩增、并测序。优选本发明试剂盒进一步包括以下试剂中的一种或多种：人外周血基因组提取试剂、阴性对照和阳性对照、PCR反应液和PCR测序试剂。
其中人外周血基因组提取试剂包括：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇(24：1)混合液，异丙醇和无水乙醇。
其中的阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以已知多态性人基因组DNA为阳性对照。
其中的PCR反应液包括：10×PCR缓冲液、2.5~4.0 mM的MgCl2、2U的Taq酶、0.2~0.4 mM的dNTPs、0.3~0.6 mM dUTP，上述引物溶于PCR反应液中，浓度为0.25 pmol/μl。在扩增时，通常模板为1~2 μl。
其中PCR测序反应液为：4 μl测序Buffer，1 μl测序引物（上述扩增引物作为测序引物），添加1 μl DNA测序模板。
用本发明的试剂盒检测人外周血基因组中VKORC1和CYP2C9基因多态性，检测方法如下：首先获取临床病人外周血标本，使用外周血基因组DNA提取试剂得到患者外周血基因组DNA，利用合成的PCR引物进行PCR扩增。扩增产物直接采用凝胶回收试剂盒进行快速胶回收，取回收DNA进行测序反应，结束后采用醋酸钠/乙醇法纯化PCR产物，电泳前测序PCR产物在PCR仪上进行热变性(95℃ 2min)，冰中骤冷，然后可进行上机测序。将测序结果与NCBI核酸数据库进行序列比对，得出待检者VKORC1和CYP2C9基因多态性，即可预测其华法林的用量。
本发明试剂盒的优点和效果如下：
(1)敏感：基因测序技术是综合了PCR技术、荧光标记技术、激光技术、数码显像技术为一体的技术，因此它的检测灵敏度很高；
(2)特异：使用特异性探针对定量分子进行识别，具有很高的准确性，特异性好、假阳性低；
(3)简便安全：操作简单、安全、自动化程度高、防污染；
(4)快速：速度快、高通量，可在12~14小时完成。
附图说明
图1 VKORC1第3外显子基因测序比对结果：A为基因测序结果，箭头所示基因多态性位置，B为与NCBI核酸数据库比对结果，方框表示基因多态性位置；
图2 CYP2C9第3外显子基因测序比对结果：A为基因测序结果，箭头所示基因多态性位置，B为与NCBI核酸数据库比对结果，方框表示基因多态性位置；
图3 CYP2C9第7外显子基因测序比对结果：A为基因测序结果，箭头所示基因多态性位置，B为与NCBI核酸数据库比对结果，方框表示基因多态性位置。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步描述，但不用来限制本发明的范围。实施例中的方法若未特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1 本发明试剂盒的制备
本发明试剂盒组成如下：
（1）人外周血基因组提取试剂为：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇(24：1)混合液，异丙醇和无水乙醇。
（2）引物：
1）VKORC1第3外显子基因
上游引物序列为：5′- CAGTGCCTGAAGCCCACA -3 ′，
下游引物序列为： 5′- CTCACATGCCAAAGCAAAGC -3 ′ ；
2）CYP2C9第3外显子基因
上游引物序列为：5′- GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG -3’，
下游引物序列为：5′- ATATTCACCCCAAGGCTGTCT -3’；
3）CYP2C9第7外显子基因
上游引物序列为：5′- GTGCCATTTTTCTCCTTTTCC -3’，
下游引物序列为：5′- AATGTCACAGGTCACTGCATG -3’。
上述引物序列由上海Life Technology生物技术公司合成。
（3）阴性对照和阳性对照：以去离子水为阴性对照，以已知多态性的人基因组DNA为阳性对照。
（4）PCR反应液：10×PCR 缓冲液、2.5mM的MgCl2、2U的Taq酶、0.2 mM的dNTPs、0.3 mM dUTP，上述引物溶于PCR反应液中，浓度为0.25 pmol/μl。扩增时通常取2 μl的模板。
（5）PCR测序反应液为：4 μl测序Buffer（BigDye? Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit，ABI）， 1 μl测序引物（与以上扩增引物相同）。
试剂盒的使用方法如下：
（1）外周血基因组DNA的抽提：按外周血基因组DNA抽提纯化的方法抽提丙型肝炎患者外周血中基因组 DNA。
（2）PCR扩增：PCR反应体系为20μl：含10×PCR 反应混合液 10.0 μL，引物浓度0.25 pmol/μl，超纯水补齐。在ABI 9700仪器上通常是先95℃ 5 min，然后95℃ 30 s，57℃ 45s，72℃ 1 min，循环30次，最后72℃ 10 min。
（3）2%的DNA凝胶电泳后切取PCR产物，利用Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。
（4）测序反应液：4 μl测序Buffer，1 μl DNA模板（步骤3得到的DNA片段），1 μl测序引物，在ABI9700仪器上先98℃变性2 min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
（5）采用醋酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，按照ABI3130测序仪操作说明进行测序。
实施例2 用实施例1制备的试剂盒检测VKORC1和CYP2C9的基因多态性
以检测20例需正在使用华法林药物患者的外周血样品中VKORC1和CYP2C9的基因多态性结果为例。
检测流程：首先根据NCBI核酸数据库提供的VKORC1和CYP2C9基因序列设计特异性引物。获取临床正在使用华法林药物患者的外周血样品，采用全血DNA提取试剂提取外周血DNA，配制PCR反应液进行PCR扩增，然后回收PCR扩增产物，进行测序反应，结束后将测序反应产物纯化后进行测序，最后在NCBI核酸数据库中进行核酸序列比对，确定所测序列多态性。
具体步骤如下：
（1）外周血基因组DNA的抽提：按外周血基因组DNA抽提纯化的方法抽提丙型肝炎患者外周血中基因组 DNA。
（2）PCR扩增：PCR反应体系为20μl：含10× PCR 反应混合液10.0 μl，引物浓度0.25 pmol/μl，超纯水补齐。在ABI9700仪器上通常是先95℃ 5 min，然后95℃ 30 s，57℃ 45s，72℃ 1 min，循环30次，最后72℃ 10 min。
（3）2%的DNA凝胶电泳后切取PCR产物，利用Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。
（4）测序反应液：4 μl测序Buffer，1 μl DNA模板，1 μl测序引物（与以上扩增引物相同），在ABI9700仪器上先98℃变性2 min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 4 min，25个循环，扩增结束后设置4℃保温。
（5）采用醋酸钠/乙醇法纯化测序反应产物，按照ABI3130测序仪操作说明进行测序。
（6）数据收集处理和分析：将所测得序列在NCBI核酸数据库中VKORC1和CYP2C9基因标准序列进行比对分析，确定VKORC1（图1）和CYP2C9基因多态性 (图2、图3)
（7）结果如表1所示。
表1 通过本发明试剂盒确定的华法林用药量
通过检测患者外周血基因组VKORC1和CYP2C9基因多态性，能有效地给予患者恰当剂量的华法林（FDA推荐剂量），结合患者体重、年龄等因素，可以进一步精确华法林使用剂量（预测使用量），从而避免了传统使用华法林策略导致的毒副作用风险，极大地提高了华法林用药的安全性。
实施例3 本发明试剂盒检测能力评价
根据利用实例1，采用本检测试剂盒(基因测序法)检测45例液相芯片法检测过的使用华法林用药患者外周血。实验表明，本试剂盒敏感性、特异性及灵敏度较液相芯片法更为精确，完全符合目前临床诊疗实用要求：
表2 二种方法检出VKORC1和CYP2C9基因多态性的比较
其中：
(1)特异性：100%；
(2)灵敏度：100%；
(3)阳性预测值：阳性预测值达到100%；
(4)阴性预测值：阴性预测值达到100%；
(5)重复性：多次重复实验结果一致；
(6)耗时：一份临床标本的检测时间约为12~14h，耗时短。
上述实验可以说明，采用敏感性及特异性均较高的基因测序法对VKORC1和CYP2C9基因多态性检测，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高，该试剂盒为指导临床华法林个体化用药剂量提供了一种全新的快速简便的基因分子诊断技术。
序列表
<110> 武汉大学
<120> 一种用于检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cagtgcctga agcccaca 18
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcacatgcc aaagcaaagc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctgttaagg gaatttgtag g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atattcaccc caaggctgtc t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gtgccatttt tctccttttc c 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
aatgtcacag gtcactgcat g 21
Claims (8)
1.一种用于检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的引物，其包括以下引物对：
1）VKORC1第3外显子基因
上游引物序列为：5′-CAGTGCCTGAAGCCCACA-3′，
下游引物序列为：5′-CTCACATGCCAAAGCAAAGC-3′；
2）CYP2C9第3外显子基因
上游引物序列为：5′-GCTGTTAAGGGAATTTGTAGG-3’，
下游引物序列为：5′-ATATTCACCCCAAGGCTGTCT-3’；
3）CYP2C9第7外显子基因
上游引物序列为：5′-GTGCCATTTTTCTCCTTTTCC-3’，
下游引物序列为：5′-AATGTCACAGGTCACTGCATG-3’。
2.一种利用基因测序方法检测VKORC1和CYP2C9基因多态性的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于还包括以下试剂中的一种或多种：PCR反应液、阴性对照、阳性对照、PCR测序反应液、人外周血基因组提取试剂。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：10×PCR缓冲液、2.5~4.0mM的MgCl2、2U的Taq酶、0.2~0.4mM的dNTPs、0.3~0.6mM dUTP，所述引物溶于PCR反应液中，浓度为0.25pmol/μl。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照为已知多态性人基因组DNA样品。
7.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR测序反应液包括：4μl测序Buffer，1μl浓度为0.25pmol/μl作为测序引物的权利要求1所述引物。
8.根据权利要求3~7任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述人外周血基因组提取试剂包括：去离子水，6M NaI，氯仿/异戊醇混合液，异丙醇和无水乙醇。
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