CN103602734A - 用于检测egfr基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法 - Google Patents

用于检测egfr基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测EGFR基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法，所述引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:9所示，所述试剂盒包括有上述引物、PCR MIX反应液、针对不同突变进行酶切的限制性内切酶、BSA溶液、酶切缓冲液、阴性对照品、阳性对照品、去离子水、分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。本发明可以外周血为样品，对EGFR基因三个最常见的热点突变进行快速检测，检测敏感性高、费时短，可在第一时间得到临床所需资料。

Description

用于检测EGFR基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及基因突变检测引物和试剂盒，尤其涉及一种用于检测EGFR基因热点突变的引物、试剂盒和检测方法。 
背景技术
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种跨膜受体酪氨酸激酶，属于受体酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK）erbB／HER家族的一个成员，EGFR的激活即磷酸化对调节肿瘤细胞的生长、侵袭、转化、存活、血管生成及转移具有重要意义，研究表明，EGFR在许多恶性肿瘤中过高表达。 
近年来，随着医学分子生物学的发展，分子靶向治疗作为恶性肿瘤治疗的新手段，正日益受到临床工作者们的重视，因此，EGFR作为恶性肿瘤治疗的分子靶标而受到普遍关注。目前已开发出了吉非替尼（gefitinib）和厄洛替尼（erlotinib）等表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinases inhibitor，EGFR-TKI），然而在临床中，有些患者对EGFR-TKI的治疗并不敏感或对该类药物产生耐药，故对EGFR-TKI耐药机制的探索成为国内外研究的热点。 
研究表明，这些靶向药物的敏感性及耐药性与肿瘤细胞EGFR突变密切相关。目前，在约半数耐药患者中发现了EGFR第20外显子T790M（T790M，threonine at position790）突变；而EGFR第19号外显子内缺失突变和第21外显子L858R突变则使突变细胞对药物亲和力增高，作用时间延长，对EGFR-TKI的敏感性增高。因此，在一线治疗的恶性肿瘤患者中检测EGFR基因突变具有重要的临床意义，是决定患者是否能够应用EGFR-TKI治疗的先决条件。 
目前检测EGFR突变主要通过直接测序法，该方法需要取得肿瘤组织标本，通过石蜡组织DNA提取，再进行PCR扩增、测序，最后对测序数据进行分析。这个方法对石蜡包埋组织标本要求高，要求标本中肿瘤组织含量达20%以上，检测敏感度低，检测流程复杂繁琐，对数据分析要求高，且目前无商用试剂盒，对实验室的仪器配备要求也较高。 
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种用于检测EGFR基因热点突变的引物，本发明还公开了包括有该引物的试剂盒及其使用方法。 
本申请的发明人根据EGFR基因的第19号外显子内缺失突变（EXON19缺失突变）、第20外显子T790M突变（EXON20T790M）和第21外显子L858R突变（EXON21L858R）设计并合成了特异性引物，以外周血为样本提取基因组DNA，可以快速检测EGFR基因中这三处热点突变，检测敏感度高，可更高效地筛查出适宜EGFR-TKI治疗方案的恶性肿瘤患者。 
根据本发明的实施例，提供了一种用于检测EGFR基因热点突变的引物，所述引物序列如下： 
SEQ ID NO:1 5’-ATCCCAGAAGGTGAGAAAGATAAAATTC-3’ 
SEQ ID NO:2 5’-CCTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’ 
SEQ ID NO:3 5’-AGAGCCATGGACCCCCACAC-3’ 
SEQ ID NO:4 5’-CGAAGCCACACTGACGTGC-3’ 
SEQ ID NO:5 5’-CGAAGGGCATGAGCCGC-3’ 
SEQ ID NO:6 5’-CCTCCAGGAAGCCTACGTGA-3’ 
SEQ ID NO:7 5’-CAGCCAGGAACGTACTGGTGA-3’ 
SEQ ID NO:8 5’-TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT-3’ 
SEQ ID NO:9 5’-CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’。 
根据本发明的实施例，还提供了一种用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒，其主要包括：1）引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:9所示，PCR MIX反应液，针对不同突变进行酶切的限制性内切酶，BSA溶液， 酶切缓冲液，阴性对照品，阳性对照品，去离子水；2）分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。 
优选的，上述引物的浓度均为5～10μmol/L。 
其中，PCR MIX反应液为本领域常规的PCR MIX反应液；优选的，所述PCR MIX反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq DNA聚合酶的浓度为50units/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM，所述MgCl2的浓度为3mM。 
其中，针对不同突变进行酶切的限制性内切酶包括：针对EGFR基因EXON19缺失突变的限制性内切酶MseⅠ，针对EGFR基因EXON20T790M的限制性内切酶BstUⅠ和NlaⅢ，针对EGFR基因EXON21L858R的限制性内切酶MscⅠ和Sau96Ⅰ；优选的，上述限制性内切酶的浓度分别为5000单位/ml、10000单位/ml。 
其中，所述BSA溶液中BSA的浓度为100mg/ml。 
其中，所述酶切缓冲液为本领域常规的酶切缓冲液；优选的，所述酶切缓冲液中的各组分的摩尔浓度或者质量浓度如下：500mM NaCl、1000mMTris-HCl、100mM MgCl2、0.25%Trito-X-100（pH7.5,25℃）。 
其中，所述阳性对照品为：EGFR19缺失型DNA，EGFR20T790M突变型DNA，EGFR21L858R突变型DNA；所述阴性对照品为：EGFR19野生型DNA，EGFR20野生型DNA，EGFR21野生型DNA。 
本发明的引物和试剂盒的使用方法，包括以下步骤： 
（1）采集被测者的外周血样本，使用常规方法提取样本的基因组DNA； 
（2）以步骤（1）提取的DNA为模板，以进行第一轮PCR扩增，其中，针对EXON19缺失突变的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示，针对EXON20T790M的PCR扩增使用的引物序列如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示，针对EXON21L858R的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示； 
（3）对步骤（2）所得的PCR产物进行第一次酶切，其中，针对EXON19缺失突变的酶切使用的限制性内切酶是MseⅠ，针对EXON20T790M的酶 切使用的限制性内切酶是BstUⅠ，针对EXON21L858R的酶切使用的限制性内切酶是MscⅠ； 
（4）进行第二轮PCR扩增，其中，针对EXON19缺失突变的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，针对EXON20T790M的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:5所示，针对EXON21L858R的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8所示； 
（5）对步骤（4）所得的PCR产物进行第二次酶切，其中，针对EXON19缺失突变不需进行第二次酶切，针对EXON20T790M的酶切使用的限制性内切酶是NlaⅢ，针对EXON21L858R的酶切使用的限制性内切酶是Sau96Ⅰ；（6）按照DHPLC（变性高效液相色谱分析）常规操作方法，将酶切后产物（针对EXON19缺失突变为两次PCR和一次酶切后产物，针对EXON20T790M突变为两次PCR和两次酶切后产物，针对EXON21L858R突变为两次PCR和两次酶切后产物）、非酶切产物（针对EXON19缺失突变为两次PCR和一次不含酶的酶切后产物，针对EXON20T790M突变为两次PCR和两次不含酶的酶切后产物，针对EXON21L858R突变为两次PCR和两次不含酶的酶切后产物）、阴性对照和阳性对照进行上机检测，判读检测结果。 
通过以上技术方案，本发明的有益效果如下： 
（1）可对EGFR基因三个最常见的热点突变（EXON19缺失突变、EXON20T790M和EXON21L858R）进行检测，检测面广，真实反映出患者体内EGFR基因的突变情况，有助于对患者使用EGFR-TKI药物的策略进行判断。 
（2）取外周血作为标本材料，临床标本取材方便，可较早地发现该基因的突变，检测流程简单快捷，价格低廉，检测敏感性高，可直接、快速地判断检测结果，在第一时间得到临床所需资料。 
附图说明
图1为使用本发明的实施例的试剂盒检测某患者EGFR基因热点突变 所得的DHPLC试验结果。 
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步描述，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 
实施例 
用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒及其使用 
1.该用于检测EGFR基因热点突变的试剂盒中装有： 
⑴引物 
两对EGFR基因EXON19缺失突变特异性的正、反向引物，其中，第一对EGFR基因EXON19缺失突变特异性的正、反向引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第二对EGFR基因EXON19缺失突变特异性的正、反向引物如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示； 
两对EGFR基因EXON20T790M特异性的正、反向引物，其中，第一对EGFR基因EXON20T790M特异性的正、反向引物如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，第二对EGFR基因EXON20T790M特异性的正、反向引物如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:5所示； 
两对EGFR基因EXON21L858R特异性的正、反向引物，其中，第一对EGFR基因EXON21L858R特异性的正、反向引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，第二对EGFR基因EXON21L858R特异性的正、反向引物如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8所示； 
上述引物的浓度均为5μmol/L。 
⑵PCR MIX反应液，包括：Taq DNA聚合酶，其浓度为50U/ml；dNTPs，包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM；MgCl2，其浓度为3mM。 
⑶限制性内切酶 
限制性内切酶为MseⅠ、BstUⅠ、NlaⅢ、MscⅠ和Sau96Ⅰ；上述限制性内切酶的浓度分别为5000U/ml、10000U/ml。 
⑷BSA溶液，其中，BSA的浓度为100mg/ml。 
⑸酶切缓冲液 
酶切缓冲液为本领域常规的酶切缓冲液，其中各组分的摩尔浓度或者质量浓度如下：500mM NaCl、1000mMTris-HCl、100mM MgCl2、0.25%Trito-X-100（pH7.5,25℃）。 
⑹对照品 
阳性对照品为:EGFR19缺失型DNA，EGFR20T790M突变型DNA，EGFR21L858R突变型DNA，阴性对照品为：所述阴性对照品为：EGFR19野生型DNA，EGFR20野生型DNA，EGFR21野生型DNA。 
⑺去离子水。 
2.试剂盒的使用方法如下： 
⑴采集患者外周血，提取外周血的血浆游离DNA，建议使用QIAamp DNA Blood Kit试剂盒，按照说明书进行提取，最后收集到50μl溶液，浓度为5ng/μl，直接进行检测或保存于-20℃。 
⑵进行第一轮PCR扩增；针对三个不同的突变检测，使用的引物不同，针对EXON19缺失突变的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，针对EXON20T790M的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，针对EXON21L858R的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，扩增体系如下： 
成分 体积（total25μl）
DNA模板 2.5μl
[0059] 
上游引物 1.0μl
下游引物 1.0μl
PCR MIX反应液 12.5μl
去离子水 8μl
反应程序为： 
95℃，3min，1个循环； 
95℃，30sec→60℃,30sec→72℃,20sec，22个循环； 
72℃，5min，1个循环。 
⑶进行第一轮酶切，对步骤（2）所得的PCR产物分别进行单酶切，酶切反应体系如下，下表中“/”代表未使用： 
Figure DEST_PATH_GDA0000436888250000071
其中，针对EXON19缺失突变的酶切反应条件为37℃酶切2h，针对EXON20T790M的酶切反应条件为60℃酶切2h，针对EXON21L858R的酶切反应条件为37℃酶切2h。 
⑷以步骤(3)所得的酶切后产物作为扩增模板，进行第二轮PCR扩增，针对三个不同的突变检测，使用的引物不同，针对EXON19缺失突变的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3所示，针对EXON20T790M的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:5所示，针对EXON21L858R的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8所示，扩增体系如下： 
成分 体积（total25μl）
DNA模板（酶切后产物） 1.0μl
上游引物 1.0μl
下游引物 1.0μl
PCR MIX反应液 12.5μl
去离子水 9.5μl
反应程序为： 
95℃，3min，1个循环； 
95℃，30sec→60℃,30sec→72℃,20sec，40个循环； 
72℃，5min，1个循环。 
(5)进行第二轮酶切，其中，针对EXON19缺失突变不需进行第二次酶切，针对EXON20T790M和EXON21L858R的酶切体系如下： 
Figure DEST_PATH_GDA0000436888250000081
针对EXON20T790M和针对EXON21L858R的酶切反应条件都为37℃酶切2h。 
(6)按照DHPLC（变性高效液相色谱分析）常规操作方法:使用前检查仪器状态是否正常，运行flush+equilibrate程序，除气泡并wash进样针2-3遍。上样前运行1-2针空白针（使用所需进样的检测方法），将酶切后产物（两次PCR和两轮酶切后产物）、非酶切产物（两次PCR和不含酶的两轮酶切后产物）、阴性对照和阳性对照进行上机检测，判读结果。 
判读依据如下： 
Exon19缺失突变的判读：Exon19野生型经酶切和PCR后，有单一野 生峰，酶切完全情况下无峰；Exon19突变型经酶切和PCR后，一般有三个峰（一个野生型峰、一个突变峰、一个杂合峰），酶切完全情况下野生型峰消失，如图1的上部所示，该样本检测出了Exon19缺失突变。 
Exon20T790M突变的判读：Exon20野生型DHPLC检测一般有一个主峰，酶切完全情况下无峰；Exon20T790M突变型DHPLC检测一般有一个主峰，位于野生型峰左侧，如图1的中部所示，该样本未检测出Exon20T790M突变。 
Exon21L858R突变的判读：Exon21野生型经过第二次酶切后，DHPLC检测一般有一个主峰，若第一次酶切完全亦可能检测不到峰；Exon21L858R突变型一般会有两个峰，一个与野生型的峰的位置不同，一个是未完全切掉的野生型峰，酶切完全情况下仅有单一突变峰，据峰图即可判读结果，如图1的下部所示，该样本检测出了Exon21L858R突变。 
Figure IDA0000407674210000011
Figure IDA0000407674210000021

Claims (10)

1.一种引物，其特征在于，所述引物序列如下：
SEQ ID NO:15’-ATCCCAGAAGGTGAGAAAGATAAAATTC-3’
SEQ ID NO:25’-CCTGAGGTTCAGAGCCATGGA-3’
SEQ ID NO:35’-AGAGCCATGGACCCCCACAC-3’
SEQ ID NO:45’-CGAAGCCACACTGACGTGC-3’
SEQ ID NO:55’-CGAAGGGCATGAGCCGC-3’
SEQ ID NO:65’-CCTCCAGGAAGCCTACGTGA-3’
SEQ ID NO:75’-CAGCCAGGAACGTACTGGTGA-3’
SEQ ID NO:85’-TCCCTGGTGTCAGGAAAATGCT-3’
SEQ ID NO:95’-CGCAGCATGTCAAGATCACAGAT-3’。
2.一种包括有权利要求1所述的引物的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：1）引物，所述引物序列如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:9所示，PCR MIX反应液，针对不同突变进行酶切的限制性内切酶，BSA溶液，酶切缓冲液，阴性对照品，阳性对照品，去离子水；2）分隔并集中包装这些试剂的瓶或管以及包装盒。
3.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述引物的浓度均为5～10μmol/L。
4.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR MIX反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs和MgCl2；其中，所述Taq DNA聚合酶的浓度为50U/ml，所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP，它们的浓度均为400μM，所述MgCl2的浓度为3mM。
5.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述限制性内切酶分别为Mse Ⅰ、BstU Ⅰ、Nla Ⅲ、Msc Ⅰ和Sau96 Ⅰ，上述限制性内切酶的浓度均为5000U/ml。
6.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述酶切缓冲液中的各组分的摩尔浓度或者质量浓度如下：500mM NaCl、1000mMTris-HCl、100mMMgCl2、0.25%Trito-X-100。
7.按照权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述阳性对照品为：EGFR19缺失型DNA，EGFR20T790M突变型DNA，EGFR21L858R突变型DNA；所述阴性对照品为：EGFR19野生型DNA，EGFR20野生型DNA，EGFR21野生型DNA。
8.一种使用如权利要求1所述的引物的检测方法，包括以下步骤：
(1)采集被测者的外周血样本，使用常规方法提取样本的基因组DNA；
(2)以步骤（1）提取的DNA为模板，以进行第一轮PCR扩增，其中，针对EXON19缺失突变的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2所示，针对EXON20T790M的PCR扩增使用的引物序列如SEQ IDNO:4和SEQ ID NO:5所示，针对EXON21L858R的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；
(3)对步骤（2）所得的PCR产物进行第一次酶切，其中，针对EXON19缺失突变的酶切使用的限制性内切酶是Mse Ⅰ，针对EXON20T790M的酶切使用的限制性内切酶是BstU Ⅰ，针对EXON21L858R的酶切使用的限制性内切酶是Msc Ⅰ；
(4)以步骤（3）所得的酶切后产物为模板，进行第二轮PCR扩增，其中，针对EXON19缺失突变的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:1和SEQID NO:3所示，针对EXON20T790M的PCR扩增使用的引物序列如SEQ IDNO:6和SEQ ID NO:5所示，针对EXON21L858R的PCR扩增使用的引物序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:8所示；
(5)对步骤（4）所得的PCR产物进行第二次酶切，其中，针对EXON19缺失突变不需进行第二次酶切，针对EXON20T790M的酶切使用的限制性内切酶是Nla Ⅲ，针对EXON21L858R的酶切使用的限制性内切酶是Sau96 Ⅰ；
(6)按照DHPLC常规操作方法，将酶切后产物、阳性对照和阴性对照进行上机检测，判读检测结果。
9.按照权利要求1所述的引物在诊断EGFR基因的EXON19缺失突变、EXON20T790M突变和EXON21L858R突变中的应用。
10.按照权利要求2～7中任一所述的试剂盒在诊断EGFR基因的EXON19缺失突变、EXON20T790M突变和EXON21L858R突变中的应用。
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