CN104487594A - 与cdk抑制剂相关的生物标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供监测生物标志物的差异基因表达以确定患者对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKi)的敏感性的方法、确定细胞对CDKi的敏感性的方法、利用CDKi治疗患者的方法和筛选候选CDKi的方法。

Description

与CDK抑制剂相关的生物标志物
发明领域
本发明涉及药物基因组学领域，以及用于确定对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂的细胞敏感性的生物标志物的用途，治疗方法和筛选化合物的方法。
发明背景
在1992年通过筛选会调节细胞周期，尤其是G1-S期进展中，的基因首次克隆了人细胞周期蛋白D3(CCND3)(Xiong等,Genomics 1992,13:575-584,Motokura等,J.Biol.Chem.1992,267:20412-20415)。其是三个D型细胞周期蛋白(细胞周期蛋白D1、D2和D3)之一。发现，CCND3作为D型细胞周期蛋白会与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4和CDK6装配，以形成促进细胞周期进展通过G1的全酶(Bates等，Oncogene 1994,9:71-79)。一旦经过G1晚期，CCND3对细胞周期进展就不再是必需的(Sherr,Trends in Bio.Sci 1995,20(5)187-190)。
结构上，CCND3含有细胞周期蛋白结构域和两个PEST结构域。PEST结构域用于泛素介导的降解并且发现于细胞需要快速调节或更新的蛋白质中。PEST结构域富含脯氨酸(P)、谷氨酸(E)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)残基，并且长度在12-60个氨基酸范围内。人CCND3在氨基酸256-268(含端点)和271-291(含端点)处含有PEST结构域。在研究PEST结构域的作用中，研究者已经发现CCND3中的单个等位基因SNP导致氨基酸259处从丝氨酸至丙氨酸的氨基酸改变(S259A)。S259A改变破坏PEST结构域，因此，当与未突变的等位基因相比时，变体CCND3具有增加的稳定性(Savas等,OMICS 2007,11(2):200-208)。
CCND3为淋巴细胞的发育所需。当产生CCND3敲除小鼠(CCND3-/-)以测试CCND3功能(Sicinska等,Cancer Cell 2003,4(6):451-461)时，这些敲除小鼠不经历幼T细胞的正常增殖，这是非常的组织特异性缺陷。为了说明CCND3在T细胞恶性肿瘤中起的作用，CCND3敲除小鼠与过量表达p56LCK(其展示大量的T细胞肿瘤)的小鼠杂交。表达野生型CCND3/p56LCK的小鼠快速形成T细胞恶性肿瘤。相反，T细胞恶性肿瘤在CCND3敲除/p56LCK小鼠中延迟6-8周。使用该数据研究人恶性肿瘤，同一个团队使用siRNA方法以在人T细胞急性成淋巴细胞性白血病(T-ALL)细胞系中敲低CCND3。在所测试的所有12个细胞系中敲低CCND3显著抑制了细胞增殖，验证了小鼠数据并证明了CCND3在人T细胞恶性肿瘤中的重要性。
DNA测序技术的便利、速度和成本上的改善允许研究者检查癌细胞完整基因组的改变。采用该方法，两个团队进行了弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的完整基因组分析，以发现可能负责该癌症的特定基因和途径(Pasqualucci等,Nature Genetics 2011,43(9):830-837:Morin等,Nature2011,476:298-303)。该方法在3/54所测试的DLBCLs中发现了CCND3突变。
在该公开内容中，CCND3突变用作生物标志物或指示物，预测和靶定特异性疗法的患者。寻找指示哪个患者应该接受治疗有用的生物标志物是有用的，尤其是在癌症方面。与试错方法相反，这允许更及时并且更强效的治疗。此外，指示在施用后细胞继续对疗法敏感的生物标志物的发现也是有用的。这些生物标志物可以用于监测接受治疗的那些患者的反应。如果生物标志物指示患者已经对治疗开始不敏感，那么所施用的剂量可以增加、减少、完全终止或是施用额外的治疗。如此，需要开发与细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂相关的生物标志物。该方法保证正确的患者接受适当的治疗并且在治疗过程中，可以监测所述患者持续的CDK抑制剂敏感性。
在CDK抑制剂的开发中，特异的生物标志物将帮助理解施用时的作用机制。所述作用机制可涉及细胞周期中调节机制的复杂级联和差异基因表达。在药物开发的临床前阶段完成该分析，以确定癌细胞对CDK抑制剂候选物的特定敏感性和候选物的活性。药效学研究中特别感兴趣的是鉴定特异标志物的敏感性和活性，如本文公开的那些。
发明概述
本公开内容提供，细胞周期蛋白D3(此后为“CCND3”)PEST结构域中的突变在确定细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶4和/或细胞周期蛋白依赖性激酶6的抑制剂(此后为“CDKi”)的敏感性中充当特定的生物标志物。本公开内容包括产生CDKi的“基因标签”的CCND3突变分析，其在预测何种癌细胞对CDKi敏感中具有增加的准确性和特异性。所述方法分析从患者获取的癌样品中PEST结构域中的CCND3突变，将其与非癌或正常对照相比较并预测癌样品对CDKi的敏感性。CCND3突变的分析可以指示有利的反应或不利的反应。本发明是“个性化医疗”的实例，其中基于对该个体特异的功能基因组标签治疗患者。
还可以在利用CDKi治疗后使用CCND3突变的预测值来确定患者是否仍然对治疗敏感。一旦已经施用CDKi治疗，CCND3突变可以用作生物标志物，以监测患者对CDKi治疗的持续敏感性。这在确定患者接受正确的治疗过程中有用。本公开内容包括预测并监测患者对CDKi治疗的敏感性的方法。所述方法包括向患者施用CDKi，分析从治疗患者获得的生物样品上的CCND3突变并将其与非癌或正常样品中的CCND3进行比较的步骤。基于对PEST结构域中CCND3突变的检测评估患者的反应。此外，与正常或野生型对照细胞相比，来自含有CCND3突变的细胞的CCND3蛋白质表达水平的检测和/或改变预示患者对治疗的敏感性。CCND3突变体蛋白质表达水平改变的模式可以指示有利的患者反应或不利的患者反应。
附图描述
图1是CCND3蛋白质和某些突变的图解。CCND3的PEST结构域是人CCND3的氨基酸256-268和271-291。
图2A是含有野生型CCND3的细胞(其证明对CDKi(1)不敏感)的细胞活力图解。
图2B是含有突变体CCND3的细胞(其证明对CDKi(1)敏感)的细胞活力图解。
图2C是用CDKi(1)处理的野生型和突变CCND3细胞系的EC50值的盒形图。
图3A是含有野生型CCND3的细胞(其证明对CDKi(2)不敏感)的细胞活力图解。
图3B是含有突变体CCND3的细胞(其证明对CDKi(2)敏感)的细胞活力图解。
图3C是用CDKi(2)处理的野生型和突变CCND3细胞系的EC50值的盒形图。
图4A是含有野生型CCND3的细胞(其证明对CDKi(3)不敏感)的细胞活力图解。
图4B是含有突变体CCND3的细胞(其证明对CDKi(3)不敏感)的细胞活力图解。
图4C是用CDKi(3)处理的野生型和突变CCND3细胞系的EC50值的盒形图。
图5A/B是Western印迹，其证明CCND3突变导致增加的蛋白质稳定性。
图6A是Western印迹，其显示含有CCND3突变的细胞导致更高水平的CCND3突变体蛋白质。
图6B是野生型细胞系和含有CCND3突变的细胞系中mRNA表达的图示。
发明描述
确定癌细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKi)的敏感性的方法，所述方法包括：a)测定癌细胞中细胞周期蛋白D3(CCND3)突变；和b)比较CCND3突变与非癌或正常对照细胞，其中癌细胞中CCND3突变的存在指示其对CDKi敏感。
方法，其中癌细胞选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改变。
方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改变。
方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。
方法，其中CDKi选自表1。
预测癌症患者对利用CDKi治疗的敏感性的方法，所述方法包括：a)测定从患者获得的癌样品中的CCND3突变；和b)比较CCND3突变与非癌或正常对照样品，其中癌样品中CCND3突变的存在指示患者对利用CDKi的治疗敏感。
方法，其中癌样品选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改变。
方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改变。
方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。
方法，其中CDKi选自表1。
方法，其进一步包括：c)测量从患者获得的癌样品中CCND3的差异蛋白质表达；和d)比较癌样品中CCND3的蛋白质表达与非癌或正常对照样品的CCND3蛋白质表达，其中癌样品中CCND3蛋白质的增加水平指示所述患者对利用CDKi的治疗敏感。
利用CDKi治疗癌症患者的方法，所述方法包括：a)测定从患者获得的癌样品中的CCND3突变；b)比较癌样品中的CCND3突变状态与非癌或正常对照样品中的CCND3突变状态，其中CCND3突变的存在指示所述患者对利用CDKi的治疗敏感；c)向该患者施用CDKi；和d)测定肿瘤生长的抑制。
方法，其中癌样品选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改变。
方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改变。
方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。
方法，其中以治疗有效量施用CDKi。
方法，其中CDKi选自表1。
筛选CDKi候选物的方法，所述方法包括：a)使含有CCND3突变的细胞与CDKi候选物接触；b)测定细胞活力的降低；和c)比较来自与CDKi候选物接触的CCND3突变体细胞的细胞活力的降低和与对照CDKi接触的CCND3突变体细胞的细胞活力的降低。
方法，其中对照CDKi选自表1。
方法，其中含有CCND3突变的细胞选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改变。
方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改变。
方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。
组合物，其包含用于在所选癌症患者群体中治疗癌症的CDKi，其中与正常对照细胞样品相比，在从所述患者获得的癌细胞样品中显示CCND3突变的基础上选择癌症患者群体。
组合物，其中癌样品选自弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
用于预测癌症患者对利用CDKi治疗的敏感性的试剂盒，其包含：i)用于检测CCND3突变的工具；和ii)怎样使用所述试剂盒的说明书。
定义
除非上下文明确说明，如说明书和权利要求中所用，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数参考。例如，术语“细胞”包括多个细胞，包括其混合物。
所有的数字名称，例如pH、温度、时间、浓度和分子量，包括范围均是近似值，其以0.1的增量(+)或(-)变化。应理解，尽管不总是明确说明，所有数字名称前面具有术语“约”。还应理解，尽管不总是明确说明，本文描述的试剂仅是示例性的并且其等同物为本领域所知。
术语“标志物”或“生物标志物”在本文中可互换使用。生物标志物是核酸或多肽，并且多肽突变或差异表达的存在或缺失用于确定对任何CDKi的敏感性。例如，CCND3是癌细胞中的生物标志物，当其与正常(非癌)细胞或对照细胞中的CCND3相比被突变时。
当与未处理的对照相比，利用CDKi治疗后细胞活力降低时，细胞对CDKi抑制“敏感”或展示“敏感性”。
“CCND3”指细胞周期蛋白D3基因。除非另有明确说明，如本文所用的CCND3指人CCND3，登录号BC011616(CCND3核酸(SEQ ID NO.1))和AAH11616(CCND3蛋白质(SEQ ID NO.2))。
“野生型”、“正常”或“非突变体”指这样的CCND3序列，其包含检索号BC011616/AAH11616(分别为核酸(SEQ ID NO.1)和蛋白质(SEQ IDNO.2))。
“突变体”或“突变”是偏离野生型CCND3的DNA或蛋白质序列的任何改变。这包括，但不限于：CCND3基因及其相应蛋白质的单碱基核酸改变或单氨基酸改变、插入、缺失和截短。
“对照细胞”、“正常细胞”或“野生型”指非癌组织或细胞。
“对照组织”、“正常组织”或“野生型”指非癌组织或细胞。
术语“核酸”和“多核苷酸”可以互换使用并且指任何长度的核苷酸的聚合形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以具有任何三维结构并且可以执行任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针，和引物。多核苷酸可以包含经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在多聚体组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。所述术语还指双链和单链分子。除非另外指明或要求，本发明的任何多核苷酸的实施方案包括双链形式和已知的或预测构成双链形式的两条互补的单链形式的每一条链。
“基因”指含至少一个可读框(ORF)的多核苷酸，其在转录和翻译后能编码特定的多肽或蛋白质。能将多核苷酸序列用于鉴定与其相关的基因的较大片段或全长编码序列。分离较大片段序列的方法是本领域技术人员已知的。
“基因表达”或备选地“基因产物”指基因转录和翻译时产生的核酸或氨基酸(例如，肽或多肽)。
术语“多肽”可与术语“蛋白质”互换使用，并在广义上指两个或多个亚基氨基酸(subunit amino acid)的化合物、氨基酸类似物或拟肽。亚基能通过肽键连接。在另一个实施方案中，亚基可以通过其他键，例如酯、醚等连接。
如本文中所用，术语“氨基酸”指天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，以及D和L旋光异构体、氨基酸类似物和拟肽。如果肽链很短，那么通常将三个或三个以上氨基酸的肽称为寡肽。如果肽链很长，那么通常将肽称为多肽或蛋白质。
术语“分离的”意为是自天然状态下与多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段通常相关的组分、细胞组分及其他分离的。例如，分离的多核苷酸与在自然或天然环境，例如在染色体上通常与其相关的3'和5'连续核苷酸分离。本领域技术人员显而易见的是，非天然存在的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要“分离”，以将其与其天然存在的对应物区分开来。此外，“浓缩的”、“分离的”或“经稀释的”多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段可与其天然存在的对应物区分开来，因为与天然存在的对应物相比，每一体积的浓缩物或者分子数在“浓缩的”形式中更多或者在“分离的”形式中更少。在一级序列或者例如糖基化模式上不同于天然存在的对应物的多核苷酸、肽、多肽、蛋白质、抗体或其片段并不需要以分离形式存在，因为可以通过一级序列或者备选地，通过另一特征如糖基化模式与其天然存在的对应物区分开来。因此，将非天然存在的多核苷酸提供为不同于分离的天然存在的多核苷酸的单独实施方案。将在细菌细胞中产生的蛋白质提供为区别于从真核细胞分离的天然存在的蛋白质的单独实施方案，其中在天然状态下所述真核细胞产生所述蛋白质。
当在多核苷酸操作的上下文中使用时，“探针”指寡核苷酸，其提供为通过与靶标杂交，检测可能存在于目的样品中的靶标的试剂。通常，探针包含标记或者杂交反应之前或之后标记可以结合的方法。合适的标记包括但不限于，放射性同位素、荧光色素、化学发光化合物、染料和蛋白质包括酶。
“引物”是通常具有游离的3'-OH基的短的多核苷酸，其通过与靶标杂交，与目的样品中可能存在的靶标或“模板”结合，从而促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。“聚合酶链反应”(“PCR”)是这样的反应：使用由“上游”和“下游”引物组成的“一对引物”或“一套引物”，聚合的催化剂如DNA聚合酶以及一般热稳定聚合酶，复制组成靶多核苷酸的拷贝。PCR方法是本领域熟知的，并且例如在PCR：A Practical Approach，M.MacPherson等人，IRL Press at Oxford University Press(1991)中教导。产生多核苷酸的复制拷贝的全部过程，例如PCR或基因克隆在本文中总称为“复制”。还可以将引物用作杂交反应，例如DNA或RNA印迹分析中的探针(Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版(1989))。
如本文中所用，“表达”指DNA转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA随后翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸来源于基因组DNA，表达可以包括真核细胞中mRNA的剪接。
当将“差异表达”应用于基因时，指从该基因转录和/或翻译的mRNA或者由该基因编码的蛋白质产物的差异产生。与正常或对照细胞的表达水平相比，差异表达基因可以是过量表达或者低表达(underexpress)。然而，如本文所用，过表达是基因表达的增加并且一般是在正常或对照对应物细胞或组织中检测到的至少1.25倍或，备选地至少1.5倍或，备选地至少2倍，或备选地至少3倍或备选地，至少4倍表达。如本文所用，低表达是基因表达的降低并且一般低于在正常或对照对应物细胞或组织中检测到的至少1.25倍或备选地，至少1.5倍或备选地，至少2倍或备选地，至少3倍或备选地，至少4倍表达。术语“差异表达的”还指其中在癌细胞或癌组织中检测到表达，但在对照细胞或正常组织(例如非癌细胞或组织)中不能检测到表达。
由于基因的过量表达或基因拷贝数目的增加可以出现基因的高表达水平。由于负调节物的失调或缺失，基因还可以被翻译至增加的蛋白质水平。最后，由于蛋白质增加的稳定作用或减少的降解可以出现基因的高表达，导致蛋白质的积累。
“基因表达谱”或“基因标签”指至少一个生物标志物的表达模式，其在多个样品中重现并且反映那些样品共有的性质，如突变、对特定治疗的反应、或细胞中特定生物学过程或途径的激活。基因表达谱区分共有共同性质的样品和没有共同性质的那些样品，这比通过将样品随机分配成两组实现的准确性更高。基因表达谱可以用于预测未知状态的样品是否共有共同的性质。将预测生物标志物和典型谱之间的一些变异，但是生物标志物与典型谱的整体相似性是这样的，在不共有生物标志物反映的共同性质的样品中偶然观察到相似性在统计学上是不太可能。
术语“cDNA”指互补DNA，即用酶如逆转录酶将细胞或生物中存在的mRNA分子制备成cDNA。“cDNA”文库是细胞或生物中存在的全部mRNA分子的集合，用逆转录酶将所述mRNA全部转变成cDNA分子，然后插入到“载体”(在添加外源DNA后可以继续复制的其他DNA分子)中。用于文库的示例性载体包括噬菌体、感染细菌的病毒，如λ噬菌体。然后可以针对特定的目的cDNA(和由此得到的mRNA)探测文库。
如本文中所用，可互换使用的“固相支持物”或“固相支持体”并不限于特定类型的支持体。相反，本领域普通技术人员可以获得并且已知大量的支持体。固相支持体包括硅胶、树脂、衍生的塑料薄膜、玻璃珠、塑料珠、氧化铝凝胶、微阵列和芯片。如本文中所用，“固相支持体”还包括合成的抗原呈递基质、细胞和脂质体。基于期望的最终用途和不同方案的适用性，可以选择合适的固相支持体。例如，对于肽合成，固相支持体可以涉及树脂，例如聚苯乙烯(例如，获自Bachem Inc.，Peninsula Laboratories的PAM-r树脂)、polyHIPE(R)TM树脂(获自Aminotech，加拿大)、聚酰胺树脂(获自Peninsula Laboratories)、用聚乙二醇嫁接(graft)的聚苯乙烯树脂(TentaGelRTM，Rapp Polymere，Tubingen，德国)或者聚二甲基丙烯酰胺树脂(获自Milligen/Biosearch，California)。
还可以将多核苷酸与固相支持体连接，用于高通量筛选测定。例如，PCT WO 97/10365公开了高密度寡核苷酸芯片的构建。也参见，美国专利No.5,405,783；5,412,087和5,445,934。使用该方法，在衍生的玻璃表面上合成探针，以形成芯片阵列。将光保护的核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性去保护，并与第二个所保护的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
作为实例，通过使用基于芯片如HG-U133-Plus-2GeneChips(Affymetrix,Santa Clara,CA)来测量信使RNA的水平，可以评估转录活性。因此，在可重复的系统中，有可能高通量、实时定量大量目的基因的RNA。
术语“严格杂交条件”指这样的条件，在所述条件下核酸探针可以与其靶序列特异性杂交，而不与其他序列杂交。确定杂交的严格性的条件包括：温度、离子强度和变性剂如甲酰胺的浓度。改变这些因素之一会影响另一因素，并且本领域技术人员理解，可以改变条件以维持期望的严格水平。高度严格杂交的实例是：65℃-68℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者42℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和50％甲酰胺(参见Sambrook，上文)。“中等严格”杂交的实例是条件：50℃-65℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠或者37℃-50℃，0.015M氯化钠、0.0015M柠檬酸钠和20％甲酰胺。当期望适量的核酸错配时，使用中等严格条件。本领域技术人员理解，洗涤是杂交条件的一部分。例如，洗涤条件可以包括02.X-0.1X SSC/0.1％SDS和42℃-68℃的温度，其中增加温度增加了洗涤条件的严格性。
当在两条单链多核苷酸之间以反向平行构型发生杂交时，称该反应为“退火”，并且将这些多核苷酸描述为“互补”。如果在第一多核苷酸的链之一和第二多核苷酸之间发生杂交，那么双链多核苷酸与另一多核苷酸可以是“互补的”或者“同源的”。根据通常公认的碱基配对规则，按照相对链中期望彼此形成氢键的碱基的比例，可以量化“互补性”或“同源性”(一种多核苷酸与另一多核苷酸互补的程度)。
多核苷酸或多核苷酸区(多肽或多肽区)与另一序列具有“序列同一性”的确定百分比(例如，80％、85％、90％、95％、98％或99％)指的是，当比对时，在比较的两个序列中，碱基(或氨基酸)的百分比是相同的。可以使用本领域已知的软件程序，例如Current Protocols in MolecularBiology,Ausubel等人,eds.,(1987)Supplement 30,section 7.7.18,Table7.7.1中描述的那些程序进行这种比对并确定同源性和序列同一性百分比。优选地，将默认参数用于比对。优选的比对程序是BLAST，并使用默认参数。特别地，优选的程序是BLASTN和BLASTP，且使用以下的默认参数：遗传密码＝标准；过滤＝无；链＝两条；截断＝60；期望值＝10；Matrix＝BLOSUM62；描述＝50个序列；排序＝高得分；数据库＝非冗余的。
术语“细胞增殖性病症”应当包括表征为异常细胞生长和/或分裂或者功能丧失的正常生理功能的调节异常。“细胞增殖性病症”的实例包括但不限于，增生、瘤形成、组织转化或多种自身免疫病症，例如以T细胞凋亡的调节异常为特征的那些疾病。
如本文中所用，术语“赘生性细胞”、“肿瘤性疾病”、“瘤形成”、“肿瘤”、“肿瘤细胞”、“癌症”、“癌细胞”(可互换使用)指表现出相对自主生长的细胞，以致它们表现出以细胞增殖控制(即，下调细胞分裂)的显著丧失为特征的异常生长表型。赘生性细胞可以是恶性的或者良性的。“转移的细胞或组织”指的是细胞可以侵入并破坏邻近的机体结构。癌症可以包括但不限于弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
术语“PBMC”指外周血单核细胞，并包括“PBL”-外周血淋巴细胞。
“抑制”肿瘤生长或肿瘤生长的“抑制”表示当与未与CDKi化合物接触的肿瘤生长相比，与CDKi接触时肿瘤细胞生长的减慢。可以通过本领域已知的任何方法评估肿瘤细胞生长，其包括但不限于测量肿瘤大小、使用3H-胸苷掺入测定法确定肿瘤细胞是否正在增殖、通过FDG-PET(氟代脱氧葡萄糖正电子成像术)成像测量葡萄糖吸收、或者计数肿瘤细胞。“抑制”肿瘤细胞生长指的是以下状态的任一种或者全部：减缓、延迟和终止肿瘤生长，以及肿瘤缩小。
“组合物”是活性剂和另一载体的组合，所述载体例如惰性的(例如，可检测的试剂或标记)或者有活性的化合物或组合物，如佐剂、稀释剂、结合剂、稳定剂、缓冲液、盐、亲脂溶剂、防腐剂、辅助剂等。载体还可以包含单独的或者组合的按重量或体积为1-99.99％的药物赋形剂和添加剂，例如：可以单独或者组合存在的蛋白质、肽、氨基酸、脂和糖(例如，糖，包括单糖和寡糖；衍生的糖如糖醇、糖醛酸、酯化的糖等；以及多糖或糖聚合物)。糖赋形剂包括例如，单糖如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖如蜜三糖、松三糖、麦芽糖糊精、葡聚糖、淀粉等；以及糖醇如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)和肌醇。
示例性蛋白质赋形剂包括血清白蛋白例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可以在缓冲容量中发挥功能的代表性氨基酸/抗体组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。
术语“载体”还包括缓冲剂或pH调整剂；一般地，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或苯二甲酸的盐；Tris、氨丁三醇盐酸盐(tromethamine hydrochloride)或磷酸盐缓冲液。其他载体包括聚合的赋形剂/高分子添加剂如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合的糖)、葡聚糖结合剂(例如，环糊精，如2-羟丙基-正交(quadrature)-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯如TWEEN 20TM和TWEEN 80TM)、脂(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。
如本文中所用，术语“可药用载体”包括任一种标准的可药用载体，例如磷酸缓冲盐水溶液、水和乳剂，如油/水或水/油乳剂，以及多种类型的润湿剂。组合物还可以包括稳定剂和防腐剂，以及可应用于体内的任何上述载体。载体、稳定剂和佐剂的实例参见Remington’s PharmaceuticalScience.,15th Ed.(Mack Publ.Co.,Easton(1975)和the Physician’s DeskReference,52nd ed.,Medical Economics,Montvale,N.J.(1998)中。
“有效量”是足以实现有益或期望结果的量。可以在一次或多次施用或应用或给药时施用有效量。
“受试者”、“个体”或“患者”在本文中可互换使用，其指脊椎动物，优选地哺乳动物，更优选地人类。哺乳动物包括但不限于，小鼠、猿猴、人、家畜、运动动物和宠物。
如本文所用的CDK的“抑制剂”(CDKi)减少了CCND3与CDK4和/或CDK6的结合。该抑制可以包括，例如，在它们结合到一起之前减少CCND3与CDK4/6的结合，或在它们结合到一起之后减少CCND3与CDK4/6的结合，因此释放两个分子。减少可以在低，但可检测量，至分子完全解离的范围内。
目前已经鉴定了许多CCND3突变作为CDKi的生物标志物。PEST结构域中的CCND3突变可以用于确定患者对任何CDKi的敏感性。CCND3突变包括但不限于，PEST结构域中的插入、缺失、移码和一个或多个点突变。例如但不限于，PEST结构域中的CCND3突变包括：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。例如，PEST结构域中氨基酸290处从异亮氨酸至苏氨酸的CCND3突变(I290T)指示癌症患者对任何CDKi的施用敏感并且将有利地对任何CDKi的施用反应。
CDK抑制剂(CDKi)是这样的化合物，其是CCND3–CDK4/6结合的抑制剂并且用于与本发明的方法结合。CDKi用于药物组合物中用于人或兽医用途，其中例如在肿瘤和/或癌细胞生长的治疗中指示对CCND3–CDK4/6结合的抑制。CDKi化合物用于治疗例如弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
表1-CDKi化合物
CDKi(1)
CDKi(2)
CDKi(3)
CDKi(4)
表2
CCND3突变的检测
可以通过许多方式完成CCND3突变的检测，例如：DNA测序、基于PCR的方法，包括RT-PCR，微阵列分析、Southern印迹、Northern印迹和dip stick分析。
聚合酶链式反应(PCR)可以用于扩增和鉴定从肿瘤组织中提取的基因组DNA或RNA中的CCND3突变。PCR为本领域所熟知并详细描述于Saiki等,Science 1988,239:487和美国专利号4,683,195以及美国专利号4,683,203中。
提供通过杂交检测CCND3突变的方法。所述方法包括通过使来自样品的核酸与能够与具有CCND3突变的核酸或其片段杂交的核酸探针接触并检测杂交来鉴定样品中的CCND3突变。利用标记如放射性同位素、荧光剂或显色剂可检测地标记核酸探针。放射性同位素可以包括但不限于3H、32P、33P和35S等。荧光剂可以包括但不限于：FITC、德克萨斯红、罗丹明等。
用于检测的能够与具有CCND3突变的核酸杂交的探针可以是约8个核苷酸-约100个核苷酸、约10个核苷酸-约75个核苷酸、约15个核苷酸-约50个核苷酸、或约20个核苷酸-约30个核苷酸。可以在试剂盒中提供一种或多种探针，所述试剂盒包含与CCND3突变杂交或在CCND3突变附近杂交的至少一种寡核苷酸探针。所述试剂盒还可以提供用于分析患者癌症样品的说明书，所述样品可以含有CCND3突变，并且所述CCND3突变指示患者对利用CDKi的治疗敏感或不敏感。
单链构象多态性(SSCP)也可以用于检测CCND3突变。在Orita等,PNAS 1989,86:2766-2770中充分描述了该技术。
针对CCND3的抗体可以用于检测癌症和检测CCND3的突变形式。可以产生这样的抗体，其识别并仅特异性结合CCND3的特异突变体并且不结合(或微弱结合)野生型CCND3。这些抗体将用于确定存在哪种特异性突变并且还用于定量CCND3蛋白质的水平。例如，抗体可以针对氨基酸位置290处异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)。识别该氨基酸改变并且不特异性结合野生型CCND3的抗体可以通过Western印迹鉴定组织切片中的特异性突变，还有蛋白质水平。可以通过使用含有目的特异性CCND3突变的肽针对CCND3突变产生此类抗体。
可以在磷酸化和非磷酸化表位之间区分的抗体为本领域已知(Luca等,PNAS USA 198683(4):1006-1010)。针对PEST结构域中位置283处苏氨酸(T283)上CCND3非磷酸化形式的抗体也可以用于检测CCND3的突变体形式。例如，CCND3的PEST结构域中的突变可以减少或阻止T283的磷酸化。利用仅识别CCND3的非磷酸化形式的抗体与仅识别CCND3的突变体形式的抗体组合的染色方法会进一步验证和确认患者样品对CDKi敏感。在另一实例中，可以在癌样品上进行PCR，以使用如上所述的标准PCR技术检测CCND3突变。如果通过PCR指示CCND3突变，那么可以通过针对磷酸化表位的抗CCND3抗体分析癌样品的蛋白质。来自PCR反应的阳性结果和来自抗体的阳性染色(其指示CCND3不被磷酸)会确定患者会对利用CDKi的治疗敏感。
可以裂解相信含有CCND3突变的癌细胞并且可以使用含有野生型CCND3的细胞作为对照进行Western印迹以定量CCND3突变体蛋白质的量。当与正常细胞中的野生型CCND3相比时，在癌细胞中很少或没有检测到CCND3的磷酸化形式与检测到较高的蛋白质水平组合会指示在癌细胞中CCND3已经发生了突变，其减少或防止磷酸化并且因此这一癌细胞会对CDKi敏感。
基因表达的测量
可以通过任何合适的方法检测基因表达，其包括例如检测由基因转录的mRNA的量或者由基因转录出的mRNA逆转录产生的cDNA的量或者由基因编码的多肽或蛋白质的量。基于样品或者改良的高通量分析，可以在样品上进行这些方法。例如，使用AffymetrixTM U133微阵列芯片。
在一个方面，通过与探针杂交来检测和定量基因表达，所述探针与该生物标志物的合适探针特异地杂交。使用本领域已知的方法，还可以将探针与用于高通量筛选测定的固相支持体连接。例如，WO 97/10365和美国专利No.5,405,783、5,412,087和5,445,934公开了可以含有本文中所公开的一个或多个序列的高密度寡核苷酸芯片的构建。使用美国专利No.5,405,783、,412,087和5,445,934中公开的方法，在衍生的玻璃表面合成本发明探针。将光保护的核苷亚磷酰胺偶联至玻璃表面，经光刻用掩模通过光解选择性地去保护，并与第二个所保护的核苷亚磷酰胺反应。重复偶联/去保护过程，直到完成期望的探针。
在一个方面，通过将核酸样品暴露于经探针修饰的芯片，来测定基因的表达水平。例如用荧光标记，优选地在扩增步骤期间标记提取的核酸。在合适的严格水平进行经标记的样品的杂交。使用检测设备定量测量探针-核酸杂交的程度。参见美国专利No.5,578,832和5,631,734。
备选地，使用已知技术可以测定基因拷贝数、转录或翻译中的任一种。例如，可以使用扩增方法如PCR。PCR的一般步骤教导于MacPherson等人，PCR：A Practical Approach,(IRL Press at Oxford University Press(1991))中。然而，用于每一应用反应的PCR条件是由经验确定的。许多参数都影响反应的成功。尤其是退火温度和时间、延伸时间、Mg 2+和/或ATP浓度、pH和引物的相对浓度、模板，以及脱氧核糖核苷酸。扩增后，可以通过琼脂糖凝胶电泳，之后用溴化乙锭染色和紫外照明来显示，检测得到的DNA片段。
在一个实施方案中，通过检测与样品核酸连接的一个或多个标记，来检测杂交的核酸。能通过本领域技术人员熟知的任意的多种方法掺入标记。然而，在一个方面，在制备样品核酸的扩增步骤期间，同时掺入标记。因此，例如使用经标记的引物或经标记的核苷酸进行的聚合酶链反应(PCR)可以提供经标记的扩增产物。在分离的实施方案中，使用经标记的核苷酸(例如，荧光素标记的UTP和/或CTP)进行如上所述的转录扩增，将标记掺入到转录的核酸中。
备选地，可以将标记直接加入到最初的核酸样品(例如，mRNA、多聚A、mRNA、cDNA等)中或者在扩增完成后直接加入到扩增产物中。将标记与核酸连接的方法是本领域技术人员熟知的，并包括例如，通过核酸的激酶的作用进行切口平移或末端标记(例如，使用经标记的RNA)，随后将结合了样品核酸的核酸接头与标记(例如，荧光团)结合(连接)。
适用于本公开内容的可检测标记包括可通过分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学或化学方法检测的任何组合物。用于本发明的标记包括用经标记的链霉亲和素缀合物染色的生物素、磁珠(例如，DynabeadsTM)、荧光染料(例如，荧光素、德克萨斯红、罗丹明、绿色荧光蛋白等)、放射性标记(例如，3H、125I、35S、14C或32P)、酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和在ELISA中常用的其他酶)，以及热量标记如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、胶乳等)珠。教导此类标记的用途的专利包括美国专利No.3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。
标记的检测是本领域技术人员熟知的。因此，例如可以使用胶片或者闪烁计数器检测放射性标记、可以使用检测发射光的光检测器检测荧光标记。通常通过提供酶和底物，并检测由于酶对底物作用而产生的反应产物来检测酶标记，以及通过简单的可视化颜色标记来检测量热标记。
如在WO 97/10365中所述，可以在杂交之前或之后，将可检测标记加入到靶(样品)核酸中。这些可检测标记在杂交之前直接与靶(样品)核酸连接或者掺入到靶(样品)核酸中。相反，“间接标记”是在杂交后与杂种双链体结合。通常，在杂交后间接标记与结合部分连接，所述结合部分已经与靶核酸连接。例如，可以在杂交之前生物素化靶核酸。杂交后，亲和素缀合的荧光团会结合携带生物素的杂种双链体，其提供的标记是容易检测的。标记核酸和检测经标记的杂交核酸方法的详细综述参见Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第24卷：Hybridization with Nucleic Acid Probes，P.Tijssened，Elsevier，N.Y.(1993)。
多肽的检测
可以通过特异的抗体检测翻译成蛋白质时的CCND3突变。CCND3蛋白质中的突变可以改变CCND3蛋白质的抗原性，从而针对CCND3突变体抗原(例如含有突变的特异肽)产生的抗体将特异性结合突变体CCND3并且不识别野生型。
还可以通过检查CCND3突变体的蛋白质表达或蛋白质产物确定CCND3突变的表达水平。确定蛋白质水平涉及测量从患者获得的样品中发生在抗体(其选择性识别并结合生物标志物的多肽)上的任何免疫特异性结合的量并将其与对照样品中至少一个生物标志物的免疫特异性结合的量进行比较。当与对照表达比较时，CCND3的蛋白质表达量可以是增加或减少的。
在本领域中多种技术可以用于蛋白质分析。它们包括但不限于放射性免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫放射量测定、原位免疫测定(使用例如，胶体金、酶或放射性同位素标记)、western印迹分析、免疫沉淀测定、免疫荧光测定、流式细胞术、免疫组织化学、共聚焦显微镜、酶促测定、表面等离振子共振和PAGE-SDS。
测定生物标志物和CDKi治疗
一旦已经测定了患者的CCND3状态并且预测其对CDKi敏感，那么向所述患者施用任何CDKi可以在整个治疗过程中以一次剂量、连续或间歇地实现。确定施用的最有效工具和剂量的方法为本领域技术人员所熟知并且将根据用于治疗的组合物、治疗目的、治疗的靶细胞和治疗的受试者而变化。可以以治疗医师选择的剂量水平和模式进行单次或多次施用。可以根据经验调整合适的剂量制剂和施用活性剂的方法。
可以在CDKi施用后测定CCND3突变，以确定患者是否仍然对CDKi治疗敏感。此外，可以在单次CDKi施用后在多个时间点上测定CCND3突变。例如，施用CDKi的初始推注，可以在第一次治疗后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3天、1周或1个月或几个月测定CCND3突变。
可以在每次CDKi施用后测定CCND3突变，因此如果有多次CDKi施用，那么在每次施用后测定CCND3突变可以确定持续的患者敏感性。患者可以经历多次CDKi施用，然后可以在不同的时间点上测定CCND3突变。例如，治疗过程可能需要施用初始剂量的CDKi，特定时间段后第二次剂量，并且在第二次剂量后几小时仍然第三次剂量。可以在施用每次剂量的CDKi后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3天、1周或1个月或几个月测定CCND3突变。
最后，可以施用不同的CDKi，随后测定CCND3突变。在该实施方案中，选择多于一种CDKi并向患者施用。然后在施用每种不同的CDKi后测定CCND3突变。也可以在施用不同的CDKi后的多个时间点上进行该测定。例如，可以向患者施用第一CDKi，并在施用后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3天、1周或1个月或几个月测定CCND3突变。然后可以施用第二CDKi并且在施用第二CDKi后1小时、2小时、3小时、4小时、8小时、16小时、24小时、48小时、3天、1周或1个月或几个月再次测定CCND3突变。
可以制备用于评估任何CDKi活性的试剂盒。例如，包含用于CCND3突变的PCR或微阵列杂交的核酸引物的试剂盒可以用于评估CDKi敏感性。备选地，补充有针对表2列出的CCND3突变的抗体的试剂盒可以用于测定CDKi敏感性。
本领域熟知的是，癌症可以对化学治疗变得有抗性，尤其是当延长治疗时。可以在利用任何化学治疗的延长治疗后进行对CCND3突变的测定，以确定癌症是否会对CDKi敏感。例如，激酶抑制剂如将强烈抑制特定的激酶，但也可以微弱地抑制其他激酶。如果先前已经用另外的化学治疗或另一CDKi治疗过患者，那么测定CCND3突变以确定肿瘤是否对CDKi敏感是有用的。如果癌症进入缓和，然后重新生长或已经转移到不同的位点，那么该测定对患者尤其有利。
筛选CDK抑制剂
使用CCND3突变以筛选其他CDKi是可能的。该方法包括提供含有来自表2的CCND3突变的细胞，使所述细胞与候选物CDKi接触，并将处理细胞的IC50与接触含有CCND3突变的细胞的已知CDKi进行比较。例如，对于在PEST结构域中包含CCND3突变的细胞，候选物CDKi将具有大于或等于CDKi(1)的IC50。
实施例
实施例1：针对CCND3突变聚簇
通过聚簇CCLE测序数据来完成对CCND3突变的最初发现。细胞系组是Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)初版(initiative)(Barretina J.,Caponigro G.,等The Cancer Cell Line Encyclopedia:using preclinicalmodels to predict anticancer drug sensitivity,Nature 2012483(7391):603-607)涵盖的一组。在CCLE细胞系上进行详细的基因组学、遗传学和药理学表征。
利用惯用的SureSelect Target Enrichment System(AgilientTechnologies,Santa Clara,CA)构建用于外显子组(exome)捕获测序的多重文库(Multiplexed library)。将来自细胞系的基因组DNA切开并连接到包括8bp index的Illumina测序接头上。然后根据大小选择长度在200-350bp之间的并且在溶液相中与过量的诱饵杂交的接头连接的DNA。
然后集合Barcoded外显子捕获文库并在Illumina仪器上进行测序(76bp配对的末端reads)。在reads 2开始时通过仪器读取8bp index并且将其用于分配测序reads至下游数据聚集渠道中的特定样品中。
测序reads通过BWA软件与NCBI Human Reference GenomeGRCh37比对(Li等,Bioinformatics 201025:1754-60)。使用所述的GATK局部重新比对仪(DePristo等,Nat Genet 201143:491-8)一起重新比对对应于可能包含小的插入或缺失(indel)的基因组区域的序列reads，以提高indel的检测并减少特别是3’末端的错误比对的reads引起的假阳性单核苷酸变异的数量。可能含有indel的位点被定义为已知种系indel变异的位点，其来自含有通过BWA与indels最初比对的reads的dbSNP数据库(Sherry等,Nucleic Acids Res 200129:308-11)位点和所检测核苷酸取代聚簇附近的位点。
变体检出、注释和过滤。
利用MuTect检测核苷酸取代并利用Broad Institute开发的Indelocator软件检出短的indels。以不需要匹配正常DNA并且鉴定不同于参考基因组的所有变体的方式诱发两个程序。使用来自UCSC GenomeBrowser’s“UCSC Genes”track的转录物的参考转录物注释所检测的变体。
排除具有低等位基因部分的变体
将等位基因部分针对每个样品中每个所检测到的变体计算为reads部分，其在重叠位置的reads之间支持可选(不同于参考的)等位基因。为了限制潜在的样品污染、亚克隆事件和由于比对假象的假阳性的作用，仅等位部分高于20％的突变用于下游分析。
排除常见的种系变体
从进一步分析中排除先前已经报告为种系多态性并且dbSNP134中其整体等位基因频率(GAF)或NHLBI Exome Sequencing Project中所检测的等位基因频率高于0.1％的变体。已知自然选择在消除功能有害突变中非常有效并且一般不允许它们在群体中达到相对高的频率；然而，在群体频率的低端的多态性可以极其有害并且与一些体细胞突变相同。因此，保留了与已知种系多态性相同但具有或低于0.1％群体频率的极少数突变。
排除在正常组中观察到的变体
从进一步分析中排除在作为1000Genomes Project一部分的Broad中测序的278份完整外显子组样品组中也检测到的变体。除了去除额外的种系变异外，该步骤还允许有效去除主要起源于比对假象的常见假阳性。
排除中性突变
因为可能是中性的，所以从进一步分析中排除产生在至少两种温血脊椎动物的蛋白质直向同源物的同源位置上被观察为野生型的残基的任何氨基酸取代。对于该过滤步骤，我们使用BLASTZ程序产生并从Universityof California Santa Cruz,Genome Browser储存库获得的多重氨基酸比对。
细胞周期蛋白D3(CCND3)C-末端突变鉴定为对B-细胞血液恶性肿瘤特异的
883个细胞系通过其细胞谱系和癌症类型被分成37个种类。然后我们搜索在种类之间具有统计学上显著的非随机分布的突变。在归一化后，我们使用卡方测验用于不同肿瘤中的广泛不同的突变率并用于变化测序深度(其影响检测突变的力度)。在该分析中揭露为强命中的基因之一是CCND3。在从血液恶性肿瘤，例如弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤建立的10个细胞系中存在CCND3突变，但在来自实体瘤的细胞系中缺少CCND3突变，该数据呈现于表2中。突变定位在已知促进细胞周期蛋白D3降解和核定位的C-末端结构域中(图1)。
实施例2：含有CCND3突变的细胞相对于非突变体细胞显示对CDKi 增加的敏感性
使用CCLE细胞系的药理学表征，测试含有CCND3突变的细胞系的CDKi敏感性。从Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH(DSMZ)购买DOHH-2、NU-DHL-1、SEM、SU-DHL-4、SU-DHL-6和SU-DHL-10细胞。从American Type Culture Collection(ATCC)购买DB和Pfeiffer细胞。从Health Science Research ResourcesBank(HSRRB)购买A4/FUK细胞。在补充有10％(A4/FUK、DB、DOHH-2、Pfeiffer和SEM细胞)或20％(NU-DHL-1、SU-DHL-4、SU-DHL-6和SU-DHL-10)胎牛血清(Gibco)的RPMI 1640培养基(ATCC)中培养这些细胞并在37℃/5％CO2下温育。为了筛选，将细胞以10,000(DB、DOHH-2、NU-DHL-1、SEM、SU-DHL-4、SU-DHL-6和SU-DHL-10)、15,000(A4/FUK)或20,000(Pfeiffer)细胞密度接种在96孔板(Costar#3904)中的80μl培养基中并在加入化合物之前温育过夜。A4/FUK、DOHH-2、NU-DHL-1、SU-DHL-10、DB、Pfeiffer、SU-DHL-4和SU-DHL-6细胞是弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)细胞系。SEM细胞是急性成淋巴细胞性B细胞白血病细胞。
在适当的培养基中新鲜制备化合物贮存液(5x)，并且通过电子多道移液器手工加入到平板中。在最少三个重复的孔中，通过Cell Titer Glo(Promega,Madison,WI)根据制造商的方案定量细胞ATP水平来评估化合物添加时的细胞数量&活力，以及72小时后单一试剂的作用。使用标准的四参数曲线拟合(XLFit,model 205)计算第0天扣除的EC50s。
在Novartis Pharma AG中合成CDKi(1)-CDKi(3)，并且在DMSO中制备10mM终浓度的化合物贮存液。以3倍增量在适当的细胞培养基中连续稀释工作贮存液，以达到10μM-1.5nM范围的最终测定浓度。
显示包含如图2A中显示的野生型CCND3或图2B中显示的突变体CCND3的DLBCL模型的第0天扣除的EC50曲线。注意，含有CCND3WT的细胞对利用CDKi(1)的处理敏感，并且在标准浓度时细胞活力降低。相反，当利用CDKi(1)处理时，含有CCND3突变的细胞展示非常大的细胞活力降低，证明当与含有野生型CCND3的细胞相比时，对CDKi(1)的敏感性增加。
在图2C中显示了其概要。显示了野生型或突变的CCND3第0天扣除的EC50值的盒形图。中心填充的盒显示下四分位数和上四分位数，用白线指示了组的中位数。线条描述了样品最小值(下边的线条)和最大值(上边的线条)，黑色圆圈描述了可以认为是离群值的样品最大值。“计数”表示每组细胞系的数量。与野生型相比，在具有PEST结构域突变的模型中观察到对CDKi(1)的敏感性大于3x的改变(shift)。
CDKi(2)是不同的化合物并且也称为PD0332991(Fry等,Mol.CancerTher.2004,3(11):1427-1438)。使用与上文描述的CDKi(1)相同的方案在相同的细胞系中测试CDKi(2)。结果显示于图3A和3B中。与CDKi(1)类似，含有CCND3WT的细胞对利用CDKi(2)的治疗显示正常敏感性，在标准浓度时细胞活力降低。当在CCND3突变体细胞上测试CDKi(2)时，细胞活力在低得多的浓度时降低，指示当与含有CCND3WT的细胞相比时，这些细胞对CDKi(2)更敏感。图3C中的盒形图显示当与野生型相比时，在CCND3中具有PEST结构域突变的细胞中敏感性具有3X改变(shift)。
CDKi(3)是pan CDK抑制剂，以不同程度的抑制作用于CDK家族的所有成员上。当测试CDKi(3)时，发现测试的所有细胞类型(CCND3和野生型)对pan-CDK抑制剂比对特异的CDK 4/6抑制剂更为敏感。这可以在图4A和4B中的细胞活力曲线中看到，并且如图4C中显示EC50没有差异。
实施例3：CCND3突变导致增加的蛋白质稳定性
利用100μg/mL的放线菌酮(cycloheximide)处理细胞并收集每个时间点上最少2x106个细胞用于总蛋白质分离。每隔30分钟制备细胞裂解物，共2小时，然后每隔2小时处理直至处理8小时。DLBCL细胞裂解在含有50mM Tris,pH 7.2,120mM NaCl,1mM EDTA,6mM EGTA,和1％NP40加蛋白酶(Roche#05892791001,Nutley,NJ)和磷酸酶抑制剂(Calbiochem#524625,Billerica,MA)的缓冲液中。裂解后，使用BCA法(Pierce#2325,Rockford,IL)测定蛋白质浓度。每个细胞系等量的总蛋白质在4-12％Bis-Tris NuPAGE SDS凝胶(Invitrogen,Grand Island,NY)上分离并随后使用干印迹系统(Invitrogen iBLOT,Grand Island,NY)转移到硝酸纤维素膜(Invitrogen,Grand Island,NY)上。使用适当的一级抗体和红外线染料检测系统(Odyssey IRDye,LI-COR,Lincoln,NE)根据制造商的方案检测蛋白质。用于Western印迹分析的单克隆抗体如下：细胞周期蛋白D3(BD Biosciences#610279,Billerica,MA)、Mcl-1(Cell Signaling Technology#4572,Danvers,MA),和β-肌动蛋白(Ambion#4302Grand Island,NY)。从Sigma(#C4859St.Louis,MO)购买放线菌酮。
在图5A中，利用放线菌酮处理含有野生型CCND3的细胞指定次数，并且经由SDS-PAGE分离等量的总蛋白质。显示了CCND3、β-肌动蛋白和Mcl-1的蛋白质水平。Mcl-1蛋白质具有短的半衰期并且用作对照。在野生型DLBCL细胞中，CCND3在处理4-6小时时显著衰减。在图5B中，也用环己酰胺(cyclohexamide)处理CCND3突变体细胞，并且其在晚至8小时时展示很少或没有衰减。相反，β-肌动蛋白同等稳定，而Mcl-1在不同的细胞系中不稳定。该数据提示，CCDN3的PEST结构域中的突变导致蛋白质稳定性的增加。
该蛋白质稳定性可以导致CCND3蛋白质的积累。图6A是Western印迹，其证明在含有CCND3的细胞中，PEST结构域突变具有突变体CCDN3的更高蛋白质水平。当比较来自CCND3WT和CCND3突变体细胞的mRNA水平时，表达水平相当相似，表明CCND3蛋白质的增加最可能是由于蛋白质稳定性的增加，而不是表达的增加。
因此，不希望受任何一种理论的束缚，因为CCND3突变不促进或降低CCND3mRNA表达，所以CCND3突变可以在翻译后水平上起作用。在图1中图示了CCND3蛋白质的图，并且当氨基酸位置283处的苏氨酸(T283)被磷酸化时，其将CCND3蛋白质靶向泛素化和随后的降解。CCND3在氨基酸256-268和271-291处含有PEST结构域。PEST结构域中的突变可以阻断或减少该磷酸化事件，因此稳定CCND3，导致在细胞中增加的半衰期和积累。该稳定的CCND3然后自由地结合并激活CDK4/CDK6，其起始不受控制的细胞增殖，导致癌症。癌细胞受较高水平的CDK4/6激活驱动或依赖于较高水平的CDK4/6激活，所以结合CDK4/6并减少CDK4/6与CCND3结合的任何CDKi会导致细胞增殖的减少，尽管CCND3的水平升高。

Claims (37)

1.确定癌细胞对细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKi)的敏感性的方法，所述方法包括：a)测定癌细胞中细胞周期蛋白D3(CCND3)突变；和b)比较CCND3突变与非癌或正常对照细胞，其中癌细胞中CCND3突变的存在指示其对CDKi敏感。
2.权利要求1的方法，其中癌细胞选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
3.权利要求1的方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
4.权利要求1的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改变。
5.权利要求1的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改变。
6.权利要求1的方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
7.权利要求1的方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。
8.权利要求1的方法，其中CDKi选自表1。
9.预测癌症患者对利用CDKi治疗的敏感性的方法，所述方法包括：a)测定从患者获得的癌样品中的CCND3突变；和b)比较CCND3突变与非癌或正常对照样品，其中癌样品中CCND3突变的存在指示患者对利用CDKi的治疗敏感。
10.权利要求9的方法，其中癌样品选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
11.权利要求9的方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
12.权利要求9的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改变。
13.权利要求9的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改变。
14.权利要求9的方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
15.权利要求9的方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。
16.权利要求9的方法，其中CDKi选自表1。
17.权利要求9的方法，其进一步包括：c)测量从患者获得的癌样品中CCND3的差异蛋白质表达；和d)比较癌样品中CCND3的蛋白质表达与非癌或正常对照样品的CCND3蛋白质表达，其中癌样品中CCND3蛋白质的增加水平指示所述患者对利用CDKi的治疗敏感。
18.利用CDKi治疗癌症患者的方法，所述方法包括：a)测定从患者获得的癌样品中的CCND3突变；b)比较癌样品中的CCND3突变状态与非癌或正常对照样品中的CCND3突变状态，其中CCND3突变的存在指示所述患者对利用CDKi的治疗敏感；c)向该患者施用CDKi；和d)测定肿瘤生长的抑制。
19.权利要求18的方法，其中癌样品选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
20.权利要求18的方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
21.权利要求18的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改变。
22.权利要求18的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改变。
23.权利要求18的方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
24.权利要求18的方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。
25.权利要求18的方法，其中以治疗有效量施用CDKi。
26.权利要求18的方法，其中CDKi选自表1。
27.筛选CDKi候选物的方法，所述方法包括：a)使含有CCND3突变的细胞与CDKi候选物接触；b)测定细胞活力的降低；和c)比较来自与CDKi候选物接触的CCND3突变体细胞的细胞活力的降低和与对照CDKi接触的CCND3突变体细胞的细胞活力的降低。
28.权利要求27的方法，其中对照CDKi选自表1。
29.权利要求27的方法，其中含有CCND3突变的细胞选自：弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
30.权利要求27的方法，其中CCND3突变位于PEST结构域中。
31.权利要求27的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸256-268中的至少一个氨基酸改变。
32.权利要求27的方法，其中CCND3突变是SEQ ID NO.2的氨基酸271-292中的至少一个氨基酸改变。
33.权利要求27的方法，其中CCND3突变是表2中的任何突变。
34.权利要求27的方法，其中CCND3突变选自：氨基酸290处的异亮氨酸至赖氨酸的改变(I290K)、氨基酸290处的异亮氨酸至苏氨酸的改变(I290T)、氨基酸284处的脯氨酸至亮氨酸的改变(P284L)、氨基酸284处的脯氨酸至丝氨酸的改变(P284S)，和氨基酸287处缬氨酸至天冬氨酸的改变(V287D)。
35.组合物，其包含用于在所选癌症患者群体中治疗癌症的CDKi，其中与正常对照细胞样品相比，在从所述患者获得的癌细胞样品中显示CCND3突变的基础上选择癌症患者群体。
36.权利要求35的组合物，其中癌样品选自弥散性大B细胞淋巴瘤、淋巴瘤、淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性B细胞白血病和伯基特淋巴瘤。
37.用于预测癌症患者对利用CDKi治疗的敏感性的试剂盒，其包含：i)用于检测CCND3突变的工具；和ii)怎样使用所述试剂盒的说明书。
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