CN102796811B - 检测kras突变的试剂及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测KRAS突变的试剂及方法。揭示了一类特别适合于扩增和鉴定出KRAS密码子12、13及61位置处基因突变的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高，可以快速地鉴定出同一密码子的不同碱基的突变，也可以快速地鉴定出同一基因不同密码子的突变。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及检测KRAS突变的试剂及方法。
背景技术
目前，靶向治疗已经成为肿瘤临床治疗的重要手段。表皮生长因子受体(EGFR)是靶向治疗的主要作用靶点。EGFR的靶向药物包括EGFR单克隆抗体药西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗，以及EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼。这些药物能通过抑制肿瘤发生、发展中必须的表皮生长因子受体酪氨酸激酶阻断肿瘤细胞的信号传导，从而达到抑制肿瘤细胞的增生、侵袭、转移、血管生成并促进肿瘤细胞的凋亡。但是，临床试验表明这些靶向药物仅对部分肿瘤患者有显著的疗效。进一步的研究发现，肿瘤组织中KRAS基因发生突变(体细胞突变)的肿瘤患者对此类靶向药物完全耐药。因此，检测肿瘤患者KRAS基因是否突变成为决定能否使用EGFR靶向药物的必要前提条件。
Ras基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种—H-ras、KRAS和N-ras，分别定位在11、12和1号染色体上。作为原癌基因的ras基因被激活后就变成有致癌活性的癌基因，ras基因通过突变而激活。其中，KRAS则对人类癌症影响最大，正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则不受上游EGFR的信号影响，导致细胞持续生长，并阻止细胞凋亡。这是具有突变型KRAS基因患者对抗EGFR药物治疗无效的理论基础。
根据上述可见，临床上准确、快速地判断肿瘤患者是否存在KRAS基因的突变是决定用药策略的关键。因此，非常有必要优化检测突变型KRAS基因的新试剂，以快速、全面、准确地鉴定出突变型KRAS基因。
发明内容
本发明的目的在于提供检测KRAS突变的试剂及方法。
在本发明的第一方面，提供一种检测样品中是否存在KRAS基因变异的试剂，所述的试剂是引物组合，选自下组：
用于检测KRAS第12密码子突变的引物组合：正向引物SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和反向引物SEQ ID NO:9；
用于检测KRAS第13密码子突变的引物组合：正向引物SEQ ID NO:18和反向引物SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17；或
用于检测KRAS第61密码子突变的引物组合：正向引物SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和反向引物SEQ ID NO:25。
在另一优选例中，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5被制成混合的引物。
在另一优选例中，SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8被制成混合的引物。
在另一优选例中，SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14被制成混合的引物。
在另一优选例中，SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17被制成混合的引物。
在另一优选例中，所述的试剂同时包括：用于检测KRAS第12密码子突变的引物组合；用于检测KRAS第13密码子突变的引物组合和用于检测KRAS第61密码子突变的引物组合。
在本发明的另一方面，提供所述的试剂的用途，用于制备检测样品中是否存在KRAS基因变异的试剂盒。
在本发明的另一方面，提供一种检测样品中是否存在KRAS基因变异的试剂盒，所述的试剂盒中含有选自所述的一种或多种引物组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒中同时含有：用于检测KRAS第12密码子突变的引物组合；用于检测KRAS第13密码子突变的引物组合和用于检测KRAS第61密码子突变的引物组合。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：PCR扩增试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：核酸提取试剂。
在另一优选例中，所述的试剂盒中还含有：
核酸序列分析软件；和/或
使用说明书。
在本发明的另一方面，提供一种(体外非诊断性地)检测样品中是否存在KRAS基因变异的方法，所述的方法包括：
以核酸样品为模板，利用所述的引物组合对进行PCR扩增，若是获得扩增产物，则表明检测样品中存在KRAS突变。
在另一优选例中，通过琼脂糖凝胶电泳来分析PCR扩增后是否获得扩增产物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1显示了利用针对KRAS密码子12的引物来检测模板DNA突变情况的PCR扩增产物的电泳结果。
图2显示了利用针对KRAS密码子13的引物来检测模板DNA突变情况的PCR扩增产物的电泳结果。
图3显示了利用针对KRAS密码子61的引物来检测模板DNA突变情况的PCR扩增产物的电泳结果。
图4显示了密码子12突变(GGT→GCT)的DNA模板相应位置的序列测定结果。
图5显示了密码子13突变(GGC→GAC)的DNA模板相应位置的序列测定结果。
图6显示了密码子61突变(CAA→CAT)的DNA模板相应位置的序列测定结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，找到了一类特别适合于扩增和鉴定出KRAS密码子12、13及61位置处基因突变的引物，所述引物经过合理的设计、优选而获得，用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高，可以快速地鉴定出同一密码子的不同碱基的突变，也可以快速地鉴定出同一基因不同密码子的突变。
KRAS基因
KRAS基因是Ras基因家族中与人类肿瘤相关的基因。其全长基因序列参见GenBank登录号NM_004985.3；其编码的蛋白的序列参见GenBank登录号NP_004976.2。
KRAS突变的最常见的方式就是点突变，多发生在第12、13和61密码子，占所有突变率的90%以上，其中又以第12密码子突变最常见，密码子GGT的前2个核苷酸可分别突变成A/C/T、A/C/T。第13密码子GGC的前2个核苷酸可分别突变成A/C/T、A/C/T。第61密码子CAA的3个核苷酸可分别突变为A、T、T。KRAS基因的突变导致细胞逃逸凋亡，这种异常在胰肠癌、大肠癌、肺癌等肿瘤组织中发生率较高。据国外文献报道，最高为胰外分泌腺癌，达90%，结肠癌为40～50%，肺癌和膀胱癌为13%，而胃癌较低在10%以下。因此这几种癌症中KRAS基因野生型患者使用靶向EGFR药物的疗效也比较显著，特别是结肠直肠癌，美国癌症综合网络(NCCN)已把KRAS突变的检测列为《结肠癌临床治疗指南》与《直肠癌临床治疗指南》临床用药必检项目。
KRAS基因变异的检测试剂或试剂盒
基于KRAS基因与人类肿瘤的密切相关性，可以通过分析KRAS基因的变异情况：(i)进行肿瘤的鉴别诊断、和/或易感性分析；(ii)早期评估相关人群肿瘤的患病风险，早期监测早期防治。
可采用各种技术来检测KRAS基因变异位点，较为方便的是用KRAS基因突变型特异的引物进行聚合酶链反应(PCR)，对KRAS基因进行扩增，对扩增产物进行序列测定，从而判断是否发生变异。该技术也可检测KRAS基因的转录产物。
在检测KRAS基因变异时，检测可以针对cDNA，也可针对基因组DNA。
本发明人在研究中发现，检测KRAS基因突变时，利用一般的引物，PCR扩增时往往存在特异性差，扩增效率低下；并且，由于KRAS基因存在多个密码子多个碱基位点的突变，一般的引物难以快速高效地测定。因此，需要设计和筛选特异性好的引物，且需要巧妙地设计出多种组合应用的引物以提高检测效率。经过大量的试验和比较，本发明人找到了分别对应于KRAS基因的密码子12、13和61的引物。所述引物用于PCR扩增时特异性良好，且扩增效率高，可以快速地鉴定出同一密码子的不同碱基的突变，也可以快速地鉴定出同一基因不同密码子的突变。
KRAS基因变异的检测试剂盒
本发明还提供了用于在分析物中检测含有KRAS基因变异的试剂盒，该试剂盒包括装在适当容器中的、用于特异性扩增KRAS基因的引物，并且用所述引物扩增出的扩增产物含有KRAS基因相关密码子上疾病相关的变异部位。
此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取DNA、PCR扩增等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、洗液等。这些试剂均是本领域人员所了解的。
此外，所述的试剂盒中还可包括使用说明书和/或核酸序列分析软件等，便于本领域人员使用和分析。
测定KRAS基因突变的方法
本发明人还提供了一种检测样品中是否存在KRAS基因变异的方法，所述的方法包括：以核酸样品为模板，利用本发明所述的引物组合进行PCR扩增，获得扩增产物。
较佳地，在检测KRAS基因变异时，还设置野生型的对照，以提高检测的准确率。
通过本发明的检测KRAS密码子12、13及61突变情况的方法，可以快速确定癌症患者对吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗、帕尼单抗等药物的敏感性。对患者样本进行DNA的抽提，利用突变特异的组合引物进行目标片段的扩增，电泳分析，检测KRAS密码子12、13和61的突变位点。
本发明通过设计突变特异的引物，以组合引物扩增目标序列，电泳分析检测KRAS密码子12、13及61的突变，有助于更准确地指导肿瘤患者对吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗等药物的治疗。
本发明的主要优点在于：
(1)首次针对KRAS基因的多个密码子设计了合适的引物组合，所述引物组合在用于PCR扩增时特异性良好，扩增效率高。
(2)本发明的引物组合可快速高效地确定KRAS基因多位点上多碱基突变情况，快速高效。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1、引物的设计
根据KRAS密码子12、13和61的突变位点设计引物。针对各个突变位点在基因结构中所处的位置以及突变的特点，对于引物的序列长短、位置均作为考察的因素。本发明人经过反复比较和优化，获得以下序列的引物：
针对KRAS密码子12，引物序列为：
正向：
野生型WF1：5’-cttgtggtagttggagctg(SEQ ID NO:1)；
野生型WF2：5’-cttgtggtagttggagctgg(SEQ ID NO:2)；
突变型MF1：5’-cttgtggtagttggagct(a/c/t)(SEQ ID NO:3/4/5)；
突变型MF2：5’-cttgtggtagttggagctg(a/c/t)(SEQ ID NO:6/7/8)；
反向：
R1：5’-tgcacagagagtgaacatc(SEQ ID NO:9)。
注：以上MF1和MF2为混合的引物，即合成时在末端碱基同时产生a/c/t。
针对KRAS密码子13，引物序列为：
反向：
野生型WR1：5’-caaggcactcttgcctacgc(SEQ ID NO:10)；
野生型WR2：5’-caaggcactcttgcctacgcc(SEQ ID NO:11)；
突变型MR1：5’-caaggcactcttgcctacg(a/g/t)(SEQ ID NO:12/13/14)；
突变型MR2：5’-caaggcactcttgcctacgc(a/g/t)(SEQ ID NO:15/16/17)；
正向：
F：5’-tacacgtctgcagtcaactg(SEQ ID NO:18)。
注：以上MR1和MR2为混合的引物，即合成时在末端碱基同时产生a/g/t。
针对KRAS密码子61，引物序列为：
正向：
野生型WF3：5’-atattctcgacacagcaggtc-3’(SEQ ID NO:19)；
野生型WF4：5’-atattctcgacacagcaggtca-3’(SEQ ID NO:20)；
野生型WF5：5’-atattctcgacacagcaggtcaa-3’(SEQ ID NO:21)；
突变型MF3：5’-atattctcgacacagcaggta-3’(SEQ ID NO:22)；
突变型MF4：5’-atattctcgacacagcaggtct-3’(SEQ ID NO:23)；
突变型MF5：5’-atattctcgacacagcaggtcat-3’(SEQ ID NO:24)；
反向：
R2：5’-aattactccttaatgtcagc-3’(SEQ ID NO:25)。
实施例2、引物组合检测
通过表1所列的引物组合方式进行检测。
表1
PCR反应体系如表2。
表2
| 试剂 | 终浓度 | 体积20μl |
| 1)Milli Q水 | 8.875μl | |
| 2)10×Taq缓冲液(含Mg2+) | 1× | 2μl |
| 3)2.5mM dNTP混合物 | 每种0.25mM | 2μl |
| 4)正向引物(10μM) | 0.5μM | 1μl |
| 5)反向引物(10μM) | 0.5μM | 1μl |
| 6)模板DNA | 5-10ng | 5μl |
| 7)Taq DNA聚合酶(5U/ul) | 0.0725u/μl | 0.125μl |
除Taq DNA聚合酶外，以上所有试剂都在冰上解冻，并在碎冰上操作，最后从-20℃中取出Taq DNA聚合酶加入反应体系。以上模板DNA为突变阳性、突变阴性和被检基因组DNA。
反应条件如表3。
表3
以上反应在ABI9700PCR仪上进行。
结果分析、判定：
PCR结束后，用2%琼脂糖凝胶电泳分析。任何含突变(M)引物的管中有PCR扩增产物，均判定相应的外显子有突变。KRAS密码子12、13及61突变检测PCR产物分别为318bp、244bp、174bp。为了考察PCR及电泳结果的准确性，同时通过测序仪来对模板DNA测序，通过将电泳结果与测序结果比较来判定所述引物扩增的准确性。
图1为利用前述针对KRAS密码子12的引物来检测模板DNA突变情况的PCR及电泳结果。其中采用的野生型的模板DNA为已证实无突变的基因组DNA。突变型的DNA模板为已证实有突变的基因组DNA。
可见当模板DNA为野生型基因组DNA时，利用野生型的正向引物以及反向引物扩增，在318bp处出现电泳条带；而利用突变型的正向引物以及反向引物扩增，在318bp没有出现聚集的条带。当模板DNA为有突变的基因组DNA时，利用突变型的正向引物以及反向引物扩增，在318bp处出现电泳条带；而利用野生型的正向引物以及反向引物扩增，在318bp没有出现聚集的条带。其中，突变的DNA模板相应位置的序列测定结果如图4。
图2为利用前述针对KRAS密码子13的引物来检测模板DNA突变情况的PCR及电泳结果。其中采用的野生型的模板DNA为已证实无突变的基因组DNA。突变型的DNA模板为已证实有突变的基因组DNA。
可见当模板DNA为野生型基因组DNA时，利用正向引物以及野生型的反向引物扩增，在244bp处出现电泳条带；而利用正向引物以及突变型的反向引物扩增，在244bp没有出现聚集的条带。当模板DNA为有突变的基因组DNA时，利用正向引物以及突变型的反向引物扩增，在244bp处出现电泳条带；而利用正向引物以及野生型的反向引物扩增，在244bp没有出现聚集的条带。其中，突变的DNA模板相应位置的序列测定结果如图5。
图3为利用前述针对KRAS密码子61的引物来检测模板DNA突变情况的PCR及电泳结果。其中采用的野生型的模板DNA为已证实无突变的基因组DNA。突变型的DNA模板为已证实有突变的基因组DNA。
可见当模板DNA为野生型基因组DNA时，利用野生型的正向引物以及反向引物扩增，在174bp处出现电泳条带；而利用突变型的正向引物以及反向引物扩增，在174bp没有出现聚集的条带。当模板DNA为有突变的基因组DNA时，利用突变型的正向引物以及反向引物扩增，在174bp处出现电泳条带；而利用野生型的正向引物以及反向引物扩增，在174bp没有出现聚集的条带。其中，突变的DNA模板相应位置的序列测定结果如图6。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (6)
1.一种检测样品中是否存在KRAS基因变异的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有：
用于检测KRAS第12密码子突变的引物组合：正向引物SEQ ID NO:3、SEQID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和反向引物SEQ ID NO:9；
用于检测KRAS第13密码子突变的引物组合：正向引物SEQ ID NO:18和反向引物SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQID NO:16、SEQ ID NO:17；和
用于检测KRAS第61密码子突变的引物组合：正向引物SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24和反向引物SEQ ID NO:25。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：PCR扩增试剂。
3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：核酸提取试剂。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有：
核酸序列分析软件；和/或
使用说明书。
5.一种检测样品中是否存在KRAS基因变异的方法，其特征在于，所述的方法包括：
以核酸样品为模板，利用选自权利要求1的试剂盒中的引物组合对进行PCR扩增，若是获得扩增产物，则表明检测样品中存在KRAS突变。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，通过琼脂糖凝胶电泳来分析PCR扩增后是否获得扩增产物。
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