CN106148498B - Kras基因突变检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于人KRAS基因突变检测试剂盒及其检测方法，所属的技术领域为B2D10当前优先发展的高新技术产业化重点领域指南/生物/新型医用精密诊断及治疗设备。其特征在于本试剂盒包含用于KRAS基因突变位点8对特异性扩增的引物、2条野生序列的高效封阻探针，2条KRAS基因特异性TaqMan荧光探针。该试剂盒可以检测突变拷贝数低至5～10拷贝，突变含量低至0.1％的标本。本发明可同时检测KRAS基因5种基因突变，灵敏度高，操作简单，检测廉价，临床应用范围广，样本可以为新鲜的病理组织，石蜡包埋组织、胸腔液、血清或血浆，检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及一种与肿瘤用药选择和诊断相关的KRAS基因突变的快速检测。
背景技术
世界卫生组织在2014年的世界癌症日到来之际发表《世界癌症报告》称，癌症已经成为全世界人类最大致死原因，发病率和死亡率均呈持续上升趋势。全球癌症发病率四年中升高11％，到2012年约有1410万病例，因癌症死亡人数高达820万。2012年的全球癌症新病例中有一半发生在亚洲，其中大部份发生在中国大陆。并预测未来20年内，世界癌症病例将增长75％，达到近2500万。中国肿瘤登记中心2013年初发布《2012中国肿瘤登记年报》显示，中国每年新发癌症病例约达312万，死亡病例超过200万，每分钟有6个人被确诊为癌症，每天有8550人成为癌症患者，每7到8人中就有一人因癌症而死。肺癌、胃癌、直肠癌、肝癌、食管癌成为中国人患病最多的癌症，乳腺癌、结直肠癌等癌症患者亦呈明显上升趋势。随着环境恶化，水质污染、雾霾以及食品安全方面形势的逐步严峻，专家预测，中国每年的癌症新发病例总数到2020年将达到400万左右，每年病例总数将达到600万。
结直肠癌是世界第三大常见恶性肿瘤，每年导致近60万人死亡。中国近年来结直肠癌发病率及死亡率均快速上升，结直肠癌在肿瘤发病中排位第三，平均每1.5分钟就有1人被诊断为结直肠癌，随着城市化进程和人口老龄化，未来中国结直肠癌发病率预计还将继续升高。
KRAS属于RAS基因家族(KRAS、NRAS和HRAS)，编码一种鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，是配体结合的表皮生长因子受体(EGFR)的重要效应分子，参与细胞生长的调节，在ras基因中，KRAS对人类癌症影响最大。KRAS可以通过与其催化亚基直接作用而激活PI3K。KRAS突变也发生于多种肿瘤细胞，例如结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、胰腺癌、胆管癌，其中20％非小细胞肺癌(NSCLC)、30-40％结直肠癌患者中存在KRAS基因突变。而85％-90％的突变发生在12或13位密码子，其余的发生在第61位(5％)及146位(5％)密码子上。这些突变使得GTP酶失活，导致肿瘤相关的KRAS蛋白积聚于活化的GTP结合构象中，KRAS的过度表达与扩增导致持续的细胞增殖，这是肿瘤发生的关键一步。
西妥昔单抗和帕尼单抗是以EGFR为靶点的治疗结直肠癌的靶向药物，通过与细胞外表面EGFR区域结合阻断EGFR信号转导，来抑制细胞生长、增殖、转移和血管生成。在2008年第44届美国临床肿瘤学会(ASCO)年会上，与会专家公布了肿瘤靶向治疗的一些最新进展，其中一项重要的结果就是西妥昔单抗对于k-ras基因“野生型”转移性结直肠癌患者显示出卓越的疗效。并且k-ras表达状况的检测使结直肠癌个体化的靶向治疗成为可能。
美国国家癌症综合治疗联盟(NCCN)《结直肠癌临床实践指南》(V3.2011)明确指出：(1)所有转移性结直肠癌患者都应检测KRAS基因状态；(2)只有KRAS野生型患者才建议接受EGFR抑制剂(如爱必妥和帕尼单抗)治疗；(3)如果KRAS无突变，应考虑检测KRAS基因状态。我国卫生部颁布的《结直肠癌诊疗规范(2010年版)》也明确指出：确定为复发或转移性结直肠癌时，检测肿瘤组织KRAS基因状态，以确定合适的治疗方案。
另外，K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，并且原发灶和转移灶的KRAS基因高度保持一致，而且，KRAS基因状态不会因治疗而发生变化。检测KRAS基因突变是深入了解癌基因的情况、了解各种癌症的发展预后、放化疗疗效的重要指标。
目前肿瘤相关基因突变检测方法主要有直接测序法(DNA sequencing)、实时荧光定量法(qPCR，包括Scorptions ARMS qPCR、PNA-LNA clamp qPCR等)、高分辨率熔解曲线(HRM)、PCR与质谱(mass spectrometry)及高效液相色谱法(high performance liquidchromatography，HPLC)联合检测法等。肿瘤相关基因表达水平的检测主要依赖于qPCR及基因芯片技术。直接测序法一直以来被认为是检测基因突变的金标准，该法费用较低，但操作耗时长，并且它有两个明显的缺点：一是灵敏度低，一般需要突变基因丰度达到20％以上才能准确检测。二是由于后续需要对PCR产物进行处理，容易出现污染导致结果不准确。荧光定量PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR，qPCR)作为新一代分子生物学研究工具，已成为分子诊断、临床检验以及基础生物医学研究的主流技术平台，广泛应用于传染病、肿瘤、遗传病、心血管等疾病的分子诊断。肿瘤的异质性决定了肿瘤标本绝大多数为混合标本，通常情况下，微量突变模板与大量野生型模板存在于同一扩增体系中时，此时大量野生型模板优势扩增，导致微量突变模板的扩增受到抑制而检测不到。因此目前的qPCR和HRM技术最高也只能检测到1％的突变体。
随着近年来肿瘤基因组测序方面研究的发展，人们发现，几乎所有的癌症患者的肿瘤组织中都存在某些体细胞的变异，而这些变异在正常人中检测不到。有些基因突变不仅仅可以作为癌症早期检测的分子指标，还可以为分子靶向治疗提供用药指导，如EGFR、KRAS、KRAS基因等。
肿瘤细胞会向血液中释放基因组DNA，这些变异DNA也随之释放到外周血中，被称为循环肿瘤DNA(circμLating tμMor DNAs)。研究发现，ctDNAs在早期原位癌(primarycancer)患者血液中就已经开始出现。由于外周血循环DNA的半衰期短，因此循环肿瘤DNA能够真实反映患者病变组织基因突变的真实情况。
但是，由于外周血循环DNA含量很少，其中肿瘤特异性的突变DNA含量更是少之又少，尤其是早期癌症患者，在常规的核酸扩增体系中，微量突变模板与大量野生型模板存在于同一扩增体系中时，大量野生型模板优势扩增，导致微量突变模板的扩增受到抑制而检测不到。因此在本领域需要一种可以高效快速准确全面地检测出KRAS基因突变的产品及方法，以便及时准确地获得KRAS基因突变的信息。
本发明拟公开一种人KRAS基因突变检测试剂盒的制备方法及其应用。所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大KRAS基因突变DNA，新型封闭探针封阻野生型KRAS基因模板，进一步提高突变模板选择性放大的特异性。该试剂盒检测特异性高，灵敏度高，检测低丰度KRAS突变的敏感性可达0.01％～0.1％。本检测试剂盒用于辅助临床医生筛选出病患KRAS基因突变情况，为临床医生用药提供指导和依据。
发明内容
本发明目的在于提供一种快速、准确、高灵敏的KRAS基因突变检测试剂盒。所述的试剂盒采用新型位点特异性扩增引物选择性放大KRAS基因突变DNA，新型封闭探针封阻野生型KRAS基因模板，进一步提高突变模板选择性放大的特异性。其优势主要体现在将突变检测敏感度由目前市场上同类试剂盒检测KRAS基因突变的1％提高到0.01％～0.1％，检测特异性高，灵敏度高，可应用于除组织标本外的血清、血浆等标本的非创伤性检测。
本发明提供了一套用于检测KRAS基因突变的引物、探针及检测试剂盒，发明相关内容表述如下：
KRAS基因突变检测试剂盒，包括引物探针混合液(引物2.5μM，荧光探针1μM，封阻探针4μM。含用于突变特异性扩增KRAS基因靶向序列的上游突变特异性引物8条，可检测KRAS基因发生在第12、13和61号密码子的8种基因突变，包括G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D、61，涵盖了KRAS基因97％以上的突变，下游通用引物1条、野生序列封阻探针2条，TaqMan荧光探针2条)，2×PCR反应液(含DNA聚合酶，dNTP，dUTP，UNG酶，Mg2+等)，阳性参比品、阴性参比品和无RNA酶和DNA酶的无菌水。
所述的引物包含KRAS基因包括与G12S、G12C、G12R、G12D、G12A、G12V、G13D、61在内的8种基因突变特异的上游突变引物8条、下游通用引物2条。
所述的上游突变引物特征是3’末端为突变碱基。引物的Tm值在40℃～57℃，低于PCR反应复性温度5℃～10℃，以提高突变检测的特异性。
上游突变特异性引物：
KF1：5’-acttgtggtagttggagcta-3’ Seq ID No.1
KF2：5’-acttgtggtagttggagctt-3’ Seq ID No.2
KF3：5’-acttgtggtagttggagctc-3’ Seq ID No.3
KF4：5’-ttgtggtagttggagctga-3’ Seq ID No.4
KF5：5’-ttgtggtagttggagctgt-3’ Seq ID No.5
KF6：5’-ttgtggtagttggagctgc-3’ Seq ID No.6
KF7：5’-ggtagttggagctggtga-3’ Seq ID No.7
KF8：5’-cattgcactgtactcctcttt-3’ Seq ID No.8
所述的下游通用引物为KRAS基因第12、13密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，以及KRAS基因第61密码子下游50～500碱基对范围内的一段序列，该序列对突变没有选择性，可扩增所有的KRAS基因。
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’ Seq ID No.9
KR2：5’-acccacctataatggtgaata-3’ Seq ID No.10
其中，KR1与KF1～KF7配对，KR2与KF8配对。
所述的探针包括封阻探针一条，KRAS基因特异性TaqMan荧光探针2条。
所述的封阻探针与KRAS基因第12、13、61密码子野生型序列互补，其5’端锁核酸修饰，提高封阻探针的对Taq DNA聚合酶5’端外切酶活性的耐受能力；3’端磷酸基团修饰，阻断其3’端延伸功能；突变位点至少1-2个碱基LNA修饰，提高封阻探针的单碱基识别能力，前面有+的碱基为锁核酸碱基。
KB1：5’-+gagct+g+gtg+gcgtagg-PO4-3’ Seq ID No.10
KB2：5’-+tactcctctt+ga+cctgctgt-PO4-3’ Seq ID No.12
KRAS基因特异性TaqMan荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团。
Kp1：5’-ccttgacgatacagctaattc-3’ Seq ID No.13
Kp2：5’-aatatccaagagacaggtttc-3’ Seq ID No.14
所述的2×PCR反应液每10μL含：0.25～1U DNA聚合酶，100～300μM dATP，100～300μM dCTP，100～300μM dGTP，80～300μM dTTP，40～150μM dUTP，0.25～2UUNG酶，1～4mMMgCl2等。优选的：0.5U DNA聚合酶，150μM dATP，150μM dCTP，150μM dGTP，100μM dTTP，50μM dUTP，0.5UUNG酶，2mM MgCl2。
所述阳性参比品为KRAS突变阳性序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入KRAS基因的人工质粒。
阴性参比品为KRAS野生型序列，可以为纯化PCR产物或者嵌入KRAS基因的人工质粒。
本发明提供了一套KRAS基因突变的检测方法，具体来说包括以下步骤：
[1]根据COSMIC数据公布的人类KRAS基因为野生型基因序列，针对KRAS的突变热点设计特异性引物和探针。
[2]提取检测样本中基因组DNA，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、血浆等。
[3]配制实时荧光PCR扩增反应体系。
[4]根据荧光PCR扩增仪显示的Ct值判断检测KRAS基因突变情况：Ct值为0或大于35判为阴性：Ct值小于等于35判为阳性。当阴性参比品Ct值为0或大于40，阳性参比品Ct值大于24小于27时结果可信。
本发明采用了特异性引物选择性扩增KRAS基因突变序列，用高效封阻探针封闭野生型DNA序列对引物对突变型序列进行信号放大时可能造成的干扰，该方法具有以下优势：
[1]灵敏度高，可以检出低至5-10拷贝的突变；
[2]特异性强，5～20ng的野生型基因组DNA不会产生非特异性信号；
[3]检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
[4]稳定率高。通常肿瘤标本中突变的DNA模板序列的绝对数并不高，尤其是外周血循环血DNA，多数标本处于1％～10％之间，突变检测敏感度在1％左右的方法常常对其临界含量，也就是突变含量1％～5％的标本检测稳定性不佳。我们的方法可以检测低至0.01％～0.1％的突变，就大大保证了1％～10％之间标本的检测稳定性。
附图说明
图1为含封阻探针及不含封阻探针检测结果比较。
图2为KRAS基因突变检测试剂盒检测KRAS基因人工质粒。
A：DNA终浓度为5×103拷贝
B：DNA终浓度为5×104拷贝
具体实施方式
下面用具体的实施例来解释本发明的突出的特点和显著进步，但本发明决非仅局限于实施例。
实施例1：本发明提供的试剂盒检测KRAS基因人工质粒
1、人工质粒DNA纯化
用QIAprep Spin Miniprep(Qiagen)试剂盒纯化KRAS野生型和突变型人工质粒，方法如下：
取1.5mL菌液，8000rpm离心3min收集菌体，加入将含有RNase A酶的P1缓冲液250μL混匀，再加入相同体积的P2缓冲液，上下混匀至溶液变清(不要将反应时间超过5min)，加入350μL N3缓冲液，立刻混匀，13000rpm离心10min，上清液转移至QIAprep spin管中，13000rpm离心1min，弃液体；用0.5mL PB清洗一次，再加含无水乙醇的PE缓冲液0.75mL洗涤2次，将QIAprep spin移至新1.5mL离心管中，加50μL无菌水，静置1min，离心1min，收集滤液。
纯化后的质粒用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，用TE缓冲液稀释到DNA终浓度分别为1×104拷贝copies/μL、1×103拷贝copies/μL，突变质粒含量分别是0.01％、0.1％、1％、10％、100％。2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：
3、PCR反应及数据分析
反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。
图2是用PCR反应结果，DNA总量为5×103拷贝可以检测低至0.1％的突变，DNA总量为5×104拷贝可以检测低至0.01％的突变。
实施例2：本发明提供的试剂盒检测新鲜组织标本
1、组织标本中基因组DNA纯化
用QIAamp DNA Mini(Qiagen)试剂盒纯化新鲜组织标本中的基因组DNA，方法如下：
取新鲜组织25mg以内用剪刀剪切样本至小碎片，放在1.5mL离心管中，加入180μLATL，20μL蛋白酶K，混匀，56℃孵育1～3h至样本溶解，每小时振荡2～3次；加入200μL AL，振荡15秒，70℃孵育10min；然后加入200μL无水乙醇，振荡15秒，小心将液体(包括沉淀)移至试剂盒提供柱子中，不要污染管口，8000rpm离心1min后，将柱子新的2mL离心管中，小心加入500μL AW1缓冲液，8000rpm离心1min，弃滤液；小心加入500μL AW2缓冲液，13000rpm离心3min，柱子转移至新的1.5mL离心管中，全速离心1min，再将柱子转移至另一新的1.5mL离心管中，小心加入200μL AE或蒸馏水，室温静置1min，8000rpm离心1min，收集滤液。
纯化后的基因组DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，DNA浓度在20ng/μL～200ng/μL之间。
2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：
3、PCR反应及数据分析
反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。
下表是试剂盒检测结果与DNA测序方法的比较，组织标本的试剂盒突变检出率与DNA测序结果相同。
实施例3：本发明提供的试剂盒检测血浆标本
1、血浆标本中基因组DNA纯化
收集80份结直肠癌患者和20份健康对照外周血标本5mL，2500rpm离心10分钟，吸取上清2mL用于循环游离DNA纯化。
用QIAamp DNA Blood Midi(Qiagen)试剂盒纯化血浆标本中的循环游离DNA，方法如下：
2mL血清(或全血)加入200μL PK和2mL AL，彻底混匀15秒，56℃孵育10min；加入2mL无水乙醇，彻底混匀15秒，将液体转移到QIAamp Midi Spin Column中，8000rpm离心2min，弃滤液；再离心一次，将柱子转移到另一收集管中，加入5mL AW1缓冲液，8000rpm离心1min，弃滤液，加入5mL AW2缓冲液，13000rpm离心1min，弃滤液，13000rpm离心3min，将柱子转移到一干净收集管中，加入100μL AE，室温放置1min，8000rpm离心1min，收集滤液为DNA标本。
纯化后的基因组DNA用Quant-iT PicoGreen(Invitrogen)试剂盒定量，DNA浓度在6ng/μL～40ng/μL之间。
2、荧光定量PCR体系的配制
将预先配置好的2×PCR反应液、引物探针混合液及DNA模板按一下配方配置，同时用不含核酸的TE缓冲液作为阴性对照。：
3、PCR反应及数据分析
反应条件为：95℃预变性10min，随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s检测FAM荧光信号，共35个循环。
下表是试剂盒检测结果与DNA测序方法的比较，癌症患者中，试剂盒突变检出率高于DNA测序；正常人中没有检出突变，试剂盒与DNA测序结果相同。
Claims (3)
1.一种用于人KRAS基因突变检测的试剂盒，其特征在于包含2×PCR反应体系、引物探针混合液、阳性参比品和阴性参比品；所述的引物探针混合液包含用于KRAS基因突变位点特异性扩增的8对引物、2条野生序列的高效封阻探针、2条KRAS基因特异性TaqMan荧光探针；
所述的8对突变位点特异性扩增引物序列为：
KF1：5’-acttgtggtagttggagcta-3’Seq ID No.1
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF2：5’-acttgtggtagttggagctt-3’Seq ID No.2
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF3：5’-acttgtggtagttggagctc-3’Seq ID No.3
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF4：5’-ttgtggtagttggagctga-3’Seq ID No.4
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF5：5’-ttgtggtagttggagctgt-3’Seq ID No.5
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF6：5’-ttgtggtagttggagctgc-3’Seq ID No.6
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF7：5’-ggtagttggagctggtga-3’Seq ID No.7
KR1：5’-ctgtatcaaagaatggtcctgcac-3’Seq ID No.9
KF8：5’-cattgcactgtactcctcttt-3’Seq ID No.8
KR2：5’-acccacctataatggtgaata-3’Seq ID No.10
所述的野生序列的封阻探针，前面有+的碱基为锁核酸碱基，序列为：
KB1：5’-+gagct+g+gtg+gcgtagg-PO4-3’Seq ID No.11
KB2：5’-+tactcctctt+ga+cctgctgt-PO4-3’Seq ID No.12
所述的KRAS基因特异性TaqMan荧光探针5’端标记荧光基团，3’端标记荧光淬灭基团，序列为：
Kp1：5’-ccttgacgatacagctaattc-3’Seq ID No.13
Kp2：5’-aatatccaagagacaggtttc-3’Seq ID No.14；
所述的2×PCR反应体系每10μL含：0.25～1U DNA聚合酶，100～300μM dATP，100～300μM dCTP，100～300μM dGTP，80～300μM dTTP，40～150μM dUTP，0.25～2U UNG酶，1～4mMMgCl2。
2.根据权利要求1所 述的用于人KRAS基因突变检测的试剂盒，其特征在于所述引物探针混合液中的引物浓度为1～5μM，探针浓度为0.5～3μM。
3.一种使用如权利要求1所述的试剂盒进行非诊断和治疗目的的KRAS基因突变检测的方法，其特征在于，PCR反应条件为：95℃预变性10min；随后94℃15s，60℃20s，共15个循环；然后94℃15s，58℃20s，共35个循环。
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