CN103966310A - 乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，包括检测Foxp3、FGFR2、CD14、BRCA1基因所对应的5个SNP多态性检测。本发明还公开一种乳腺癌易感基因快速检测方法。本发明的有益效果如下：通过半巢式AS-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，根据DNA电泳条带进行基因分型，筛选出具有潜在乳腺癌易感的个体，从而达到预防乳腺癌的目的；此方法操作简便，检测时间短、成本低，此外还具有灵敏度高，特异性强，应用前景广阔。
Description
技术领域：
本发明涉及生物基因检测技术领域，具体为一种乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
乳腺癌（Breast cancer）被称之为女性杀手，发病率仅次于肺癌。据世界卫生组织国际癌症研究中心发布的癌症报告（GLOBOCAN2008）估计，全世界每年约有138万妇女罹患乳腺癌，约有54万乳腺癌患者死亡。2008年中国女性乳腺癌新发病例数约16.9万，世界人口标化发病率为21.6/10万,居女性所有恶性肿瘤第2位；死亡率为5.7/10万，居女性癌症死亡的第6位。
早诊断早发现，乳腺癌病情的治愈还是相当令人乐观的。在第IV期得到诊断的乳腺癌患者—只有20%能够存活到5年之后，而在第I期就确诊的患者—100%活到5年之后。因此，乳腺癌的早期诊断是目前亟待解决的问题。
目前，临床上对乳腺癌检测有传统的检测方法，包括X线诊断、超声显象检查、细胞学及组织学诊断等，但这些检测手段针对性不强，检出率低，具有较大的局限性；还有一些基因检测手段，如免疫组化技术、荧光原位杂交技术、荧光定量PCR技术、基因芯片技术等。免疫组化技术可检测肿瘤和靶细胞蛋白表达情况，不能观察基因水平突变类型，FISH能直接和准确的判断靶基因是否存在扩增，但较昂贵和繁琐。基因芯片技术可检测人数多、位点多，时间短，但仅用于已公布的基因位点、重复准确性低，价格高。荧光定量PCR技术试剂昂贵，需精密仪器等。这些技术的缺点都大大的限制了乳腺癌早期诊断的应用。
国内外对乳腺癌易感基因的研究表明，乳腺癌患者在基因水平存在某些基因突变的现象，大多表现为SNP或碱基缺失多态性。乳腺癌具有发病率、死亡率高等特点，因此，通过早期基因筛查、风险评估和监测来规避乳腺癌的发生就显得尤为重要。
目前，乳腺癌与基因多态性关联性研究成果使乳腺癌易感基因筛查成为可能。研究表明，Foxp3、CD14、FGFR2、BRCA14个基因多态位点突变与乳腺癌发生显著相关。4个基因中，Foxp3为调节性T细胞特异性转录因子，对其发育和功能起着重要的调节作用，Foxp3+CD4+CD25在肿瘤免疫逃逸机制中起重要作用。CD14识别、结合LPS复合物，介导LPS所致的细胞反应，在LPS性炎症反应、内毒休克等病理反应中起重要作用，D14参与了乳腺癌，膀胱癌等肿瘤的发生过程；FGFR2指导细胞分裂、迁移和分化成更加具有功能性的细胞，FGFR2受体镶嵌在细胞表面，接受来自外部的信号，从而传递信号到内表面，最终指导细胞分化。FGFR2基因的突变，会引起细胞过度增生而引起癌症的发生；BRCA1主要作用是控制传递细胞繁殖的信息，如果出现变异，细胞将会无节制地繁殖，导致癌症。大约有10%的乳腺癌由遗传性的BRCA1基因突变引发的。
中国汉族乳腺癌人群中，广泛存在Foxp3、CD14、FGFR2、BRCA1，4个基因的单核苷酸多态性改变，从而导致乳腺癌的发生，因此筛查该4个基因的多态位点突变对于防治乳腺癌具有特殊的意义。
发明内容：
本发明的目的是以上述现有技术为基础，提供一种操作简易、多位点、高效率、低成本、高灵敏度的，对乳腺癌能起到预防作用的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒。
本发明另一目的是提供一种乳腺癌易感基因快速检测方法。
为了实现本发明目的，本发明采取的技术方案是：乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，包括检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点的引物混合物，其中，检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点的引物混合物为：
且摩尔数比为SEQ NO.1：SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=1：1：1；在检测时，浓度为10μM的上述引物SEQ NO.1，SEQ NO.2，SEQ NO.3和SEQ NO.4的用量为0.3μl-0.7μl。其中，上游引物为SEQ NO.1，下游引物为SEQ NO.2，多态性引物为SEQ NO.3和SEQ NO.4。
所述乳腺癌易感基因快速检测试剂盒还包括检测FGFR2基因上rs1219648和rs2981582号多态位点的引物混合物，其中，检测FGFR2基因上rs1219648多态位点的引物混合物为：
且摩尔数比为SEQ NO.5：SEQ NO.6/SEQ NO.7:SEQ NO.8=0.4-0.7：1：1；在检测时，浓度为10uM的上述SEQ NO.5引物的用量为0.4μl-0.7μl,浓度为10uM的上述SEQ NO.6，SEQ NO.7和SEQ NO.8引物用量为0.5μl-0.8μl。其中，上游引物为SEQ NO.5，下游引物为SEQ NO.6，多态性引物为SEQ NO.7和SEQ NO.8。
检测FGFR2基因上rs2981582号多态位点的引物混合物为：
且摩尔数比为SEQ NO.9：SEQ NO.10/SEQ NO.11:SEQ NO.12=1：1：1；在检测时，浓度为10uM的上述引物（SEQ NO.9，SEQ NO.10，SEQ NO.11和SEQ NO.12）的用量为0.4μl-0.7μl；其中，上游引物为SEQ NO.9，下游引物为SEQ NO.10，多态性引物为SEQ NO.11和SEQ NO.12。
所述乳腺癌易感基因快速检测试剂盒还包括检测CD14、BRCA1基因多态位点的引物混合物，其中，检测CD14基因上rs2569190号多态位点的引物混合物为：
且摩尔数比为SEQ NO.13：SEQ NO.14/SEQ NO.15:SEQ NO.16=0.5：1：1；在检测时，浓度为10uM的上述SEQ NO.13引物的用量为0.3μl-0.7μl,浓度为10uM的上述引物SEQ NO.14，SEQ NO.15和SEQ NO.16的用量为0.3μl-0.7μl。其中，上游引物为SEQ NO.13，下游引物为SEQ NO.14，多态性引物为SEQNO.15和SEQ NO.16。
检测BRCA1基因上rs2046210号多态位点的引物混合物为：
且摩尔数比为SEQ NO.17：SEQ NO.18/SEQ NO.19:SEQ NO.20=0.25：1：1；在检测时，浓度为10uM的上述SEQ NO.17引物的用量为0.5ul-0.7ul,浓度为10uM的上述引物SEQ NO.18，SEQ NO.19和SEQ NO.20用量为0.6ul-1ul。其中，上游引物为SEQ NO.17，下游引物为SEQ NO.18，多态性引物为SEQ NO.19和SEQNO.20。
所述乳腺癌易感基因快速检测试剂盒还包括扩增试剂，所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTPs混合物、热启动Taq酶和超纯水；
优选的，所述扩增试剂包括10xPCR缓冲液（其中，Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物，5U/μl的热启动Taq酶（Taq HS）用量为0.1-0.125μl。
其中，所述PCR缓冲液中的Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），所述dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM，热启动Taq酶（Taq HS）为5U/μl。
所述试剂盒还包括扩增后的基因分型用试剂，所述扩增后的基因分型用试剂包括琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准（DNA Marker）、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。所述DNA无毒染料可以是Biotium Gelred无毒染料。
优选的，扩增试剂由以下体积的组分组成：
对于上述Foxp3基因、FGFR2基因、CD14基因、BRCA1基因所对应的引物中，所述上游引物的浓度为10uM,所述多态性引物的浓度为10uM，所述下游引物的浓度为10uM。对于所述Foxp3基因、FGFR2基因、CD14基因、BRCA1基因所述上游引物、多态性引物和下游引物的用量按以上所述。
乳腺癌易感基因快速检测方法,其步骤包括：
（1）、检材基因组的DNA提取；
（2）、扩增和扩增产物的检测分析；
其中，PCR扩增试剂由以下体积的组分组成：
对于上述Foxp3基因、FGFR2基因、CD14基因、BRCA1基因所对应的引物中，所述上游引物的浓度为10uM,所述多态性引物的浓度为10uM，所述下游引物的浓度为10uM。对于所述Foxp3基因、FGFR2基因、CD14基因、BRCA1基因，所述上游引物、多态性引物和下游引物的用量按以上所述。
其中，所述PCR缓冲液（其中，Tris-HCl pH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），所述dNTPs混合物的各组分浓度为2.5mM，热启动Taq酶（Taq HS）为5U/μl；
PCR扩增程序如下：
（3）、琼脂糖凝胶电泳分析。
所述扩增采用AS-PCR（等位基因特异性PCR）来进行，然后采用琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统进行多态性分型检测。
其中，所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA；所述来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑或血液。
其中，下游引物为检测共用引物;所述多态性引物的3′端第二位碱基分别为错配碱基，用于检测上游引物；
通过AS-PCR及琼脂糖凝胶电泳特异性检测乳腺癌易感基因；用于基因检测的引物为以上所述，基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
本发明选取Foxp3基因、FGFR2基因、CD14基因、BRCA1基因4个与乳腺癌发生显著相关的基因的多态位点作为筛查靶点，应用AS-PCR技术实现快速检测、筛查携带乳腺癌易感基因多态位点的潜在乳腺癌风险个体，从而达到预防乳腺癌发生之目的。
本发明同时检测Foxp3基因、FGFR2基因、CD14基因、BRCA1基因4个基因的SNP（单核苷酸多态性）多态位点。每个SNP多态位点的检测需要4条PCR引物(一对上下游引物，两条多态引物)，共需要设计20条引物。每个SNP多态位点的检测需要做两管PCR扩增，每5个SNP多态位点，加一管阴控，共做11管PCR扩增反应。由于11管PCR扩增反应是在同一台PCR仪上同步进行的，为了实现乳腺癌易感基因检测的高效性，特异性，要求上述20条PCR引物的Tm值（退火温度）相近，为此在PCR引物的设计需要做大量的DAN序列软件分析工作，所述Tm值的优化需要通过大量的实验结果来确定设计的合理性。基于以上原因，本试剂盒各基因SNP多态性的检测是既相对独立又相互联系的，不可分割。
本发明的有益效果如下：通过半巢式AS-PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测，根据DNA电泳条带进行基因分型，筛选出具有乳腺癌易感风险的个体，达到预防乳腺癌发生的目的；此方法操作简便，时间短、成本低，灵敏度高，特异性强，具有良好的社会效益，应用前景广阔。
附图说明
图1是本发明乳腺癌易感基因快速检测试剂盒基因分型电泳图1；
图2是本发明乳腺癌易感基因快速检测试剂盒基因分型电泳图2；
图3是本发明乳腺癌易感基因快速检测试剂盒对基因CD14多态性扩增引物比分型电泳图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明乳腺癌易感基因快速检测试剂盒进行详细的描述说明。
乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂；
所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTPs混合物、热启动Taq酶、引物混合物和超纯水；还包括扩增后的基因分型用试剂：试剂琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。所述DNA上样缓冲液(DNA loadingbuffer，6X)，是一种常规的六倍浓缩的DNA上样缓冲液，以溴酚蓝为指示剂，稀释至1X（倍）后比重仍然较大，上样时极易下沉，且颜色清晰可见，此DNA上样缓冲液在市场上可以购买到。
所述扩增试剂包括扩增试剂包括10倍PCR buffer（缓冲液）（其中，Tris-HClpH8.3100mM;KCl500Mm;MgCl215mM），各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物，5U/μl的热启动Taq酶（Taq HS）用量为0.1-0.125μl。优选的，5U/μl的热启动Taq酶（Taq HS）用量为0.125μl。其中，dNTP混合物为三磷酸鸟嘌呤脱氧核苷酸dGTP，三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脱氧核苷酸dCTP四中核苷酸组成。
乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，还包括Foxp3基因、FGFR2基因、CD14基因、BRCA1基因所对应的引物混合物。
其中，检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.1：5’-CCCGCAGGAAGGAGGAGGTCT-3’；
SEQ NO.2：5’-TTCCGAACAGCATCGTCCT-3’；
SEQ NO.3：5’-GGCAGGGGCTCATGGAC-3’；
SEQ NO.4：5’-GGCAGGGGCTCATGGAT-3’；
且摩尔数比为SEQ NO.1：SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=1：1：1；在检测时，浓度为10μM的上述引物（SEQ NO.1，SEQ NO.2，SEQ NO.3和SEQ NO.4）的用量为0.4μl-0.6μl。
检测FGFR2基因上rs1219648号多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.5：5’-ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3’
SEQ NO.6：5’-TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3’
SEQ NO.7：5’-CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3’
SEQ NO.8：5’-CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3’
且摩尔数比为SEQ NO.5：SEQ NO.6/SEQ NO.7:SEQ NO.8=0.5-0.6：1：1；在检测时，浓度为10uM的上述SEQ NO.5引物的用量为0.5μl-0.6μl,浓度为10uM的上述SEQ NO.6，SEQ NO.7和SEQ NO.8引物用量为0.6μl-0.7μl。
检测FGFR2基因上rs2981582号多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.9：5’-TCCAAGTATCACAGGGCAT-3’
SEQ NO.10：5’-CAAGAGGCAGTTCCATAATCG-3’
SEQ NO.11：5’-CACTTAATGAACCTGTTTTC-3’
SEQ NO.12：5’-CACTTAATGAACCTGTTTTT-3’
且摩尔数比为SEQ NO.9：SEQ NO.10/SEQ NO.11:SEQ NO.12=1：1：1；在检测时，浓度为10uM的上述引物（SEQ NO.9，SEQ NO.10，SEQ NO.11和SEQ NO.12）的用量为0.5μl-0.6μl；
检测CD14基因上rs2569190号多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.13：5’-GCAGCAACAAGCAGGACG-3’
SEQ NO.14：5’-TGGTGCCAACAGATGAGG-3’
SEQ NO.15：5’-ATGTTTCAGGGAGGGGTG-3’
SEQ NO.16：5’-ATGTTTCAGGGAGGGGTA-3’；
且摩尔数比为SEQ NO.13：SEQ NO.14/SEQ NO.15:SEQ NO.16=0.5：1：1；在检测时，浓度为10uM的上述SEQ NO.13引物的用量为0.5μl-0.6μl,浓度为10uM的上述引物SEQ NO.14，SEQ NO.15和SEQ NO.16的用量为0.4μl-0.6μl。
检测BRCA1基因上rs2046210号多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.17：5’-CGGTCATTACAACACAGAACTAT-3’
SEQ NO.18：5’-CACAGAACTAAACCACCAAGAG-3’
SEQ NO.19：5’-CTTTTATTTCAGGTAGATTT-3’
SEQ NO.20：5’-CTTTTATTTCAGGTAGATTC-3’
且摩尔数比为SEQ NO.17：SEQ NO.18/SEQ NO.19:SEQ NO.20=0.25：1：1；在检测时，浓度为10uM的上述SEQ NO.17引物的用量为0.6ul-0.7ul,浓度为10uM的上述引物SEQ NO.18，SEQ NO.19和SEQ NO.20用量为0.7ul-0.9ul。
优选的，检测Foxp3基因多态位点的引物混合物SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQNO.3和SEQ NO.4的用量分别为0.5μl；检测FGFR2基因上rs1219648和rs2981582号多态位点的引物混合物SEQ NO.5-12的用量都为0.5μl；检测CD14基因多态位点的引物混合物SEQ NO.13，SEQ NO.14，SEQ NO.15和SEQ NO.16的用量分别为0.5μl；检测BRCA1基因多态位点的引物混合物中SEQ NO.17引物的用量为0.1μl,SEQ NO.18，SEQ NO.19和SEQ NO.20引物用量分别为0.5μl；
优选的，检测Foxp3基因多态位点的引物混合物SEQ NO.1，SEQ NO.2，SEQ NO.3和SEQ NO.4的用量分别为0.6μl；检测FGFR2基因上rs1219648号多态位点的引物混合物SEQ NO.5，SEQ NO.6，SEQ NO.7和SEQ NO.8的用量分别为0.6μl；检测FGFR2基因上rs2981582号多态位点的引物混合物SEQ NO.9，SEQ NO.10，SEQ NO.11和SEQ NO.12的用量分别为0.6μl；检测CD14基因多态位点的引物混合物SEQ NO.13，SEQ NO.14，SEQ NO.15和SEQ NO.16的用量分别为0.6μl；检测BRCA1基因多态位点的引物混合物中SEQ NO.17引物的用量为0.1μl,SEQ NO.18，SEQ NO.19和SEQ NO.20引物用量分别为0.6μl；
每个基因所对应的SNP位点的检测需要4条引物完成，由于在一个PCR扩增体系中需要同时扩增内参条带和多态性目的条带，因此，会产生PCR竞争性反应，为了提高内参条带和多态性条带的分辨率，需要通过实验将内参引物的摩尔数/体积与多态引物的摩尔数/体积的比例调整到上述最佳比例，以提高检测时分辨率。
实施例1
扩增试剂由以下体积的组分组成：
其中，所述内参上游引物的浓度为10uM,所述多态性引物的浓度为10uM，所述下游引物的浓度为10uM。
PCR扩增程序如下：
（3）、做琼脂糖凝胶电泳分析。
实施例2
扩增试剂由以下体积的组分组成：
实施例3
扩增试剂由以下体积的组分组成：
为了验证上述信息，可以将扩增产物在ABI3130基因遗传分析仪上的检测分析，以验证本发明上述检测结果。
由去离子甲酰胺与分子量内标组成上样混合物，将10μl上样混合物与1μl扩增产物或等位基因分析标准物混合，避免产生气泡，95℃变性5min，做电泳，用ABI3130基因遗传分析仪检测分析验证分析结果。
所述扩增采用AS-PCR（等位基因特异性PCR）来进行，采用琼脂糖凝胶电泳进行多态性分型检测。
其中所检测的人基因组DNA为使用Chelex法、磁珠提取法或酚/氯仿抽提法对来源样本进行处理得到的DNA；所述来源样本为来源于人类的滤纸片血斑/口腔拭子样本、FTA卡血斑或血液。
通过AS-PCR及琼脂糖凝胶电泳特异性检测乳腺癌易感基因，Foxp3、FGFR2、CD14、BRCA1基因的引物为SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4，所述基因的扩增采用聚合酶链式反应来实现，采用琼脂糖凝胶电泳进行检测。
效果说明
对上述琼脂糖凝胶电泳检测得到的电泳图分型完整清晰，如图1所示。其中，用M.DL1000DNA分子量标准；1-6泳道为FGFR2(rs1219648)基因的PCR扩增产物；7-12泳道为FGFR2(rs2981582)基因的PCR扩增产物；13-18泳道为Foxp3基因的PCR扩增产物；19-24泳道为CD14基因的PCR扩增产物；25-30泳道为BRCA1基因的PCR扩增产物;1、2、19、20泳道基因分型为GG型；3、4、21、22泳道基因分型为AG型；5、6、23、24泳道基因分型为AA型；7、8、17、18、25、26泳道基因分型为CC型；9、10、15、16、27、28泳道基因分型为CT型；11、12、13、14、29、30泳道基因分型为TT型。
在乳腺癌易感基因分型电泳图中，Foxp3基因的参考片段大小为835bp,目的条带大小为404bp;CD14基因的参考片段大小为732bp,目的条带大小为459bp；FGFR2(rs1219648)基因的参考片段大小为801bp,目的条带大小为430bp;FGFR2(rs2981582)基因的参考片段大小为835bp,目的条带大小为304bp;BRCA1基因的参考片段大小为923bp，目的条带大小为514bp。
如图2所示，正常人的基因型为：FGFR2(rs1219648)基因AA型，FGFR2(rs2981582)基因CC型，Foxp3基因CC或AA型，CD14基因AA型，BRAC1基因CC型。图中的其他基因型均为本实验室普通人样本和乳腺癌或者样本获得的基因型。7号样本心源性猝死基因分型电泳图中，FGFR2(rs1219648)基因GG型，FGFR2(rs2981582)基因TT型，Foxp3基因CT型，CD14基因GG型，BRAC1基因TT型。电泳扩曾条带，大小与理目的条带理论值都吻合吻合，与测序结果一致，表明该个体存在较高的罹患乳腺癌风险。
如图3所示，实施例中优化CD14基因扩增体系引物比。A表示上游引物：下游引物：多态引物=(0.1-0.2):1:(0.5-0.8)；B表示上游引物：下游引物：多态引物=(0.1-0.2):1:(0.1-0.4)。在A条件下能得到更好的扩增和分析效果。其他4个多态性都为通过该检测方法，获得最佳扩增引物比。
其中，以上实施例中所用的Taq热启动聚合酶及其他试剂和耗材均为市售产品。
本发明操作简便，检测时间短、成本低，此外还具有灵敏度高，特异性强等特点。与免疫组化技术相比：该技术利用特异性抗体检测肿瘤和靶细胞蛋白表达情况，敏感性差、特异性差、属于蛋白表达水平的粗略估计，不能观察基因层面突变类型；与荧光原位杂交（FISH）技术相比：FISH能直接和准确的判断靶基因是否存在扩增，但需较昂贵试剂和繁琐，操作不简便；与荧光偏振技术、焦磷酸测序技术及Massarray等高通量分析技术相比。这些技术可检测各种基因突变，显示每个碱基序列的形态结果；但需投入较大费用，购买昂贵专用设备（如基因测序仪、荧光偏振分析仪），不适用于一般实验室；和盛司潼发明的专利相比，他利用PCR技术和测序技术相结合，需测序这一步，增加了成本和检测时间；与彭金彪的专利相比，他利用荧光定量PCR技术，试剂昂贵。与已发明的专利和相关技术相比，本试剂盒充分体现了操作简便，检测时间短和成本低。通过测序验证如图2所示，体现了较高的灵敏度和特异性。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例，应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思做出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明构思在现有技术基础上通过逻辑分析、推理或者根据有限的实验可以得到的技术方案，均应该在由本权利要求书所确定的保护范围之中。
序列表
<110>广州市体育科学研究所
<120>乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法
<160>20
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>1
5’-CCCGCAGGAAGGAGGAGGTCT-3
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
5’-TTCCGAACAGCATCGTCCT-3
<210>3
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
5’-GGCAGGGGCTCATGGAC-3’
<210>4
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>4
5’-GGCAGGGGCTCATGGAT-3’
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
5’-ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3’
<210>6
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
5’-TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3’
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>7
5’-CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3’
<210>8
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>8
5’-CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3’
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>9
5’-TCCAAGTATCACAGGGCAT-3’
<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>10
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<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>11
5’-CACTTAATGAACCTGTTTTC-3’
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<400>12
5’-CACTTAATGAACCTGTTTTT-3’
<210>13
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>
<400>13
5’-GCAGCAACAAGCAGGACG-3’
<210>14
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<400>14
5’-TGGTGCCAACAGATGAGG-3’
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>18
5’-CACAGAACTAAACCACCAAGAG-3’
<210>19
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
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<220>
<223>
<400>20
5’-CTTTTATTTCAGGTAGATTC-3’
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市体育科学研究所
<120> 乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法
<160> 20
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400>1
5’- CCCGCAGGAAGGAGGAGGTCT -3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400>2
5’- TTCCGAACAGCATCGTCCT -3
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400>3
5’- GGCAGGGGCTCATGGAC -3’
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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<220>
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<213> 人工序列
<220>
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<400> 19
5’- CTTTTATTTCAGGTAGATTT -3’
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 20
5’- CTTTTATTTCAGGTAGATTC -3’
Claims (9)
1.乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，包括检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点，其中检测Foxp3基因多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.1：5’-CCCGCAGGAAGGAGGAGGTCT-3’；
SEQ NO.2：5’-TTCCGAACAGCATCGTCCT-3’；
SEQ NO.3：5’-GGCAGGGGCTCATGGAC-3’；
SEQ NO.4：5’-GGCAGGGGCTCATGGAT-3’。
2.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，还包括检测FGFR2基因上rs1219648和rs2981582号多态位点。
其中，检测FGFR2基因上rs1219648号多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.1：5’-ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3’；
SEQ NO.2：5’-TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3’；
SEQ NO.3：5’-CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3’；
SEQ NO.4：5’-CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3’；
SEQ NO.5：5’-ATAAATACATCCCTTGTTCTCGT-3’；
SEQ NO.6：5’-TCTGGGCTCTCTATTCTGTTC-3’；
SEQ NO.7：5’-CACGCCTATTTTACTTGACACATG-3’；
SEQ NO.8：5’-CACGCCTATTTTACTTGACACATT-3’；
检测FGFR2基因上rs2981582号多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.9：5’-TCCAAGTATCACAGGGCAT-3’；
SEQ NO.10：5’-CAAGAGGCAGTTCCATAATCG-3’；
SEQ NO.11：5’-CACTTAATGAACCTGTTTTC-3’；
SEQ NO.12：5’-CACTTAATGAACCTGTTTTT-3’。
3.根据权利要求2所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其 特征在于，还包括检测CD14基因上rs2569190号多态位点，其中，检测CD14基因多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.13：5’-GCAGCAACAAGCAGGACG-3’；
SEQ NO.14：5’-TGGTGCCAACAGATGAGG-3’；
SEQ NO.15：5’-ATGTTTCAGGGAGGGGTG-3’；
SEQ NO.16：5’-ATGTTTCAGGGAGGGGTA-3’。
4.根据权利要求3所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，还包括检测BRCA1基因上rs2046210号多态位点，其中，检测BRCA1基因多态位点的引物混合物为：
SEQ NO.17：5’-CGGTCATTACAACACAGAACTAT-3’；
SEQ NO.18：5’-CACAGAACTAAACCACCAAGAG-3’；
SEQ NO.19：5’-CTTTTATTTCAGGTAGATTT-3’；
SEQ NO.20：5’-CTTTTATTTCAGGTAGATTC-3’。
5.根据权利要求1、2、3或者4所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，检测Foxp3基因上rs2294021号多态位点的引物混合物的摩尔数比为SEQ NO.1：SEQ NO.2/SEQ NO.3:SEQ NO.4=1：1：1；检测FGFR2基因上rs1219648号多态位点的引物混合物的摩尔数比都为SEQ NO.5：SEQ NO.6/SEQ NO.7:SEQ NO.8=1：1：1；检测FGFR2基因上rs2981582号多态位点的引物混合物的摩尔数比都为SEQ NO.9：SEQ NO.10/SEQ NO.11:SEQ NO.12=1：1：1；检测CD14基因上rs2569190号多态位点的引物混合物的摩尔数比为SEQ NO.13：SEQ NO.14/SEQ NO.15:SEQ NO.16=1：1：1；检测BRCA1基因上rs2046210号多态位点的引物混合物的摩尔数比为SEQ NO.17：SEQ NO.19/SEQ NO.19:SEQ NO.20=0.2-0.5：1：1。
6.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂和扩增后的基因分型用试剂，所述扩增试剂包括PCR缓冲液、dNTPs混合物、热启动Taq酶和超纯水；所述扩 增后的基因分型用试剂包括琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准、DNA无毒染料和DNA上样缓冲液。
7.根据权利要求6所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括10X PCR buffer：其中，Tris-HCl pH8.0100mM;KCl500mM;MgCl215mM，各组分浓度为2.5mM的dNTPs混合物，5U/μl的热启动Taq酶用量为0.1-0.125μl。
8.根据权利要求1所述的乳腺癌易感基因快速检测试剂盒，其特征在于，扩增试剂由以下体积的组分组成：
对于上述Foxp3、FGFR2、CD14、BRCA1所对应的引物中，上、下游引物及多态性引物的浓度均为10μM；检测Foxp3基因多态位点的引物混合物SEQ NO.1，SEQ NO.2，SEQ NO.3和SEQ NO.4的用量分别为0.4μl-0.7μl；检测FGFR2基因2个多态位点的引物混合物SEQ NO.1-12的用量都分别为0.3μl-0.8μl；检测CD14基因多态位点的引物混合物SEQ NO.13，SEQ NO.14，SEQ NO.15和SEQ NO.16的用量分别为0.3μl-0.7μl；检测BRCA1基因多态位点的引物混合物中SEQ NO.17引物的用量为0.1μl-0.3μl,SEQ NO.18，SEQ NO.19和SEQ NO.20引物用量分别为0.3μl-0.7μl。
9.一种乳腺癌易感基因快速检测方法，其特征在于，其步骤包 括，
（1）、检材基因组的DNA提取；
（2）、扩增和扩增产物的检测分析；
对于上述Foxp3、FGFR2、CD14、BRCA1所对应的引物中，上、下游引物及多态性引物的浓度均为10μM；检测Foxp3基因多态位点的引物混合物SEQ NO.1，SEQ NO.2，SEQ NO.3和SEQ NO.4的用量分别为0.4μl-0.7μl；检测FGFR2基因2个多态位点的引物混合物SEQ NO.1-12的用量都分别为0.3μl-0.8μl；检测CD14基因多态位点的引物混合物SEQ NO.13，SEQ NO.14，SEQ NO.15和SEQ NO.16的用量分别为0.3μl-0.7μl；检测BRCA1基因多态位点的引物混合物中SEQ NO.17引物的用量为0.1μl-0.3μl,SEQ NO.18，SEQ NO.19和SEQ NO.20引物用量分别为0.3μl-0.7μl。
PCR扩增程序如下：
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|---|---|---|---|
| CN201410040644.3A CN103966310A (zh) | 2014-01-27 | 2014-01-27 | 乳腺癌易感基因快速检测试剂盒及检测方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103966310A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109234396A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-18 | 无锡市第五人民医院 | 一种乳腺癌易感基因BRCA2位点g.32336534T＞C突变体及其应用 |
| CN109666740A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-04-23 | 四川新开源健坤医疗科技有限公司 | 一种乳腺癌易感基因的快速检测试剂盒及其检测方法 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101772578A (zh) * | 2007-05-25 | 2010-07-07 | 解码遗传学私营有限责任公司 | 作为标记物用在乳腺癌风险评估、诊断、预后和治疗中的在CHR 5p12和10q26上的遗传变异体 |
| CN101985662A (zh) * | 2010-12-10 | 2011-03-16 | 苏州大学 | 一种检测乳腺癌易感性的试剂盒 |
| CN102712949A (zh) * | 2009-06-01 | 2012-10-03 | 遗传技术有限公司 | 用于乳腺癌风险评估的方法 |
-
2014
- 2014-01-27 CN CN201410040644.3A patent/CN103966310A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101772578A (zh) * | 2007-05-25 | 2010-07-07 | 解码遗传学私营有限责任公司 | 作为标记物用在乳腺癌风险评估、诊断、预后和治疗中的在CHR 5p12和10q26上的遗传变异体 |
| CN102712949A (zh) * | 2009-06-01 | 2012-10-03 | 遗传技术有限公司 | 用于乳腺癌风险评估的方法 |
| CN101985662A (zh) * | 2010-12-10 | 2011-03-16 | 苏州大学 | 一种检测乳腺癌易感性的试剂盒 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 贾天红 等: "乳腺癌易感基因突变的狭窄分布及其人群差异性", 《生命科学研究》, vol. 16, no. 1, 29 February 2012 (2012-02-29) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109234396A (zh) * | 2018-10-10 | 2019-01-18 | 无锡市第五人民医院 | 一种乳腺癌易感基因BRCA2位点g.32336534T＞C突变体及其应用 |
| CN109666740A (zh) * | 2018-10-15 | 2019-04-23 | 四川新开源健坤医疗科技有限公司 | 一种乳腺癌易感基因的快速检测试剂盒及其检测方法 |
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