CN103820545A - 用于检测人abcg2基因突变的探针、引物及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测人ABCG2基因突变的探针、引物及试剂盒。本发明针对ABCG2基因的Q126X位点、Q141K位点设计探针和引物，建立了实时荧光PCR体系，可同时检测ABCG2基因2种突变形式；本发明检测灵敏度高，10-20拷贝的突变可以检出；本发明可直接采用从拭子、新鲜和冷冻的全血、血浆和体液等来源的人基因组DNA，操作简单，检测廉价，临床应用范围广；本发明检测特异性强，检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测人ABCG2基因突变的探针、引物及试剂盒。
背景技术
痛风，特指急性特征性关节炎和慢性痛风石疾病，是由单钠尿酸盐沉积所致的晶体相关性关节病，与嘌呤代谢紊乱和（或）尿酸排泄减少所致的高尿酸血症直接相关。痛风常伴腹型肥胖、高脂血症、高血压、2型糖尿病及心血管病等表现，重者可出现关节残疾和肾功能不全。
痛风分布在世界各地，受种族、饮食、饮酒、职业、环境和受教育程度等多因素影响。在我国，近年来痛风的发病率呈上升趋势，我国普通人群患病率约1.14%，其中台湾和青岛地区是痛风高发区，18岁以上台湾土著居民患病率约11.7%。痛风的发生与性别和年龄相关，多见于中老年人，约占90%，发病高峰年龄为40～50岁，男女比例约为20:1。痛风患者由于关节受累，疼痛难忍，1-2个月都无法消除，无法正常工作，严重的患者甚至会造成身体残疾，丧失劳动力，给社会和家庭带来巨大的经济损失。并且近年来随着人们生活水平的提高，高蛋白饮食习惯以及抽烟喝酒等不良生活习惯造成了痛风的发病年龄年轻化的趋势。
痛风的发生与遗传有一定相关性。Hirotaka Matsuo等日本科学家实验发现，与尿酸排出有关的基因ABCG2发生变异，不到29岁的年轻人患上痛风的风险也会大幅升高。通过检测ABCG2基因的变异情况，评估患痛风这种疾病的风险程度，有效预防痛风发作，引起个体对自己健康的重视，提醒并激励个体改变不良的生活方式和行为，采取措施消除各种影响健康的不利因素，以达到改善健康状况的目的，对提高国人健康水平都具有非常重要的意义。
ABCG2（ATP-binding cassette sub-family G member2）为ABC转运蛋白超家族G亚家族第2成员，是一种ATP结合转运蛋白，在人的正常细胞和肿瘤组织中均有表达，具有抑制消化道吸收某些外源性物质，参与形成血脑、胎血屏障等生理功能。同时ABCG2也是新的药物排出泵，是肿瘤多药耐药的重要机制之一。ABCG2基因的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphism，SNP)可能影响ABCG2蛋白的表达与功能，与疾病的易感性及药动学等相关。
人类ABCG2基因位于4q22～23，编码655个氨基酸残基。ABCG2全长66kb，由16个外显子和15个内含子组成，外显子为60～332bp不等。研究表明，其126位氨基酸如果从谷酰胺（gln Q）突变为其他氨基酸（X），即Q126X，其第141位氨基酸如果从谷酰胺（glnQ）突变为赖氨酸（lys K），即Q141K，就会造成ABCG2蛋白的功能失调，从而造成机体高尿酸血症，从而引起痛风。所以检测ABCG2基因Q126X，Q141K突变可以为痛风的早期诊断提供参考依据。
目前检测ABCG2突变的方法还是DNA直接测序法，然而直接测序法灵敏度低，只有20-30%，检测步骤繁琐，效率低下，至少需要2-3天时间才能出结果；并且如果样本基因组DNA含量稀少时，直接测序法会导致大量的漏检和假阴性。所以特别要一种高灵敏度和高特异性的检测方法来实现基因突变的检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供用于检测人ABCG2基因突变的探针。
本发明要解决的技术问题之二是提供用于检测人ABCG2基因突变的引物。
本发明要解决的技术问题之三是提供用于检测人ABCG2基因突变的试剂盒。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：
在本发明的一方面，提供一种用于检测人ABCG2基因突变的探针，该探针是针对ABCG2基因的Q126X位点设计的，其序列为：
126P:5’-FAM-AGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAA-BHQ1，如SEQ ID No.1所示或其互补链。
此外，本发明提供另一种用于检测人ABCG2基因突变的探针，该探针是针对ABCG2基因的Q141K位点设计的，其序列为：
141P:5’-FAM-TAAGGATGATGTTGTGATGGGCACT-BHQ1，如SEQ ID No.2所示或其互补链。
此外，本发明提供另一种用于检测人ABCG2基因突变的探针，包括以上两种探针。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测人ABCG2基因突变的引物，该引物是针对ABCG2基因的Q126X位点设计的，其序列为：
126F:CTGGAGATGTTCTGATAAATG，如SEQ ID No.3所示；
126CR:GCAAACCCACTAATACTTACTT，如SEQ ID No.4所示；
126TR:GCAAACCCACTAATACTTACTTA，如SEQ ID No.5所示。
此外，本发明提供另一种用于检测人ABCG2基因突变的引物，该引物是针对ABCG2基因的Q141K位点设计的，其序列为：
141F:TTGCCTTAAGGATGATGTTG，如SEQ ID No.6所示；
141AR:CAGAGCTGCTGAGAACTT，如SEQ ID No.7所示；
141CR:CAGAGCTGCTGAGAACT，如SEQ ID No.8所示。
此外，本发明提供另一种用于检测人ABCG2基因突变的引物，包括以上两种引物。
本发明用于检测人ABCG2基因突变的PCR引物和探针设计方法，具体为：在基因高度同源和保守的区域设计正向PCR通用引物及探针；在变异基因的位置设计与变异基因完全互补的反向引物。
在本发明的另一方面，提供一种用于检测人ABCG2基因突变的PCR扩增试剂盒，其包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl体系、反向突变型特异性引物、探针，所述反向突变型特异性引物为如上所述的126F、126CR引物对，以及如上所述的126F、126TR引物对；所述探针为如上所述的126P探针。
此外，本发明提供另一种用于检测人ABCG2基因突变的PCR扩增试剂盒，其包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl体系、反向突变型特异性引物、探针，所述反向突变型特异性引物为如上所述的141F、141AR引物对，以及如上所述的141F、141CR引物对；所述探针为如上所述的141P探针。
此外，本发明提供另一种用于检测人ABCG2基因突变的PCR扩增试剂盒，包括：如上所述的126F、126CR引物对，如上所述的126F、126TR引物对，如上所述的141F、141AR引物对，以及如上所述的141F、141CR引物对；还包括：如上所述的126P探针，以及如上所述的141P探针。
所述反向突变型特异性引物对于野生型基因的扩增存在阻碍及滞后，而对于突变型基因模板则可以正常扩增。本发明采用AS-PCR（等位基因特异性-聚合酶链反应）的原理参见图1，在基因高度同源和保守区设计正向PCR通用引物及探针，在变异基因的位置（突变碱基）设计与变异基因完全互补的反向引物（突变引物，即反向突变型特异性引物），该突变引物对于野生型基因的扩增存在阻碍及滞后（即图1中的野生型不扩增），而对于突变型基因模板则可以正常扩增（即图1中的突变型扩增）。
在本发明的另一方面，提供上述探针在制备诊断痛风疾病的试剂盒中的应用。
在本发明的另一方面，提供上述引物在制备诊断痛风疾病的试剂盒中的应用。
本发明可与现行用于临床检验的其它技术联合使用，这些技术包括：实时荧光PCR、PCR-ELISA、PCR-反向分子杂交、PCR-基因芯片分析；本发明适用于人疾病相关致病基因的检测，致病基因包括但不限于ABCG2基因126密码子的突变（突变类型为Q126X）、ABCG2基因141密码子的突变（突变类型为Q141K）等。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明建立了实时荧光PCR体系，可同时检测ABCG2基因2种突变形式；
（2）检测灵敏度高，10-20拷贝的突变可以检出；
（3）可直接采用从拭子、新鲜和冷冻的全血、血浆和体液等来源的人基因组DNA，操作简单，检测廉价，临床应用范围广；
（4）检测速度快，检测过程只需要90分钟即可完成，与直接测序法相比，本发明可以在90分钟内完成检测，实验结果一致率100%，但实验时间至少节省了2-3天；
（5）检测特异性强，经实验验证，用本发明的引物和探针获得的ABCG突变位点与直接测序法获得的突变位点一致，检测特异性强。在今后通风病的预防、诊断中有广泛的应用前景。
附图说明
图1为本发明中AS-PCR的技术原理示意图。
图2是本发明实施例1中ABCG2 126T扩增曲线（10000-10拷贝）示意图。
图3是本发明实施例2中ABCG2 141A扩增曲线（10000-10拷贝）示意图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
1、人基因组DNA提取：采用博大泰克细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒（货号DP1091）从拭子、新鲜和冷冻的全血、血浆和体液等来源的样本中获取人基因组DNA，用紫外分光光度计确认DNA抽提质量和浓度。-70摄氏度低温冰箱保存。
2、ABCG2特异性引物和探针的合成：根据人ABCG2基因外显子4和外显子5突变位点，设计两条探针，5’端标记FAM(绿色荧光),3’端标记BHQ-1淬灭基团，由苏州金唯智生物科技有限公司合成和标记。探针序列及标记如下：
126P:5’-FAM-AGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAA-BHQ1（如SEQ ID No.1所示）；
141P:5’-FAM-TAAGGATGATGTTGTGATGGGCACT-BHQ1（如SEQ ID No.2所示）；
PCR引物用PRIMER5程序设计，Q126X位点序列引物如下：
126F:CTGGAGATGTTCTGATAAATG（如SEQ ID No.3所示）；
126CR:GCAAACCCACTAATACTTACTT（如SEQ ID No.4所示）；
126TR:GCAAACCCACTAATACTTACTTA（如SEQ ID No.5所示）；
Q141K位点序列引物如下：
141F:TTGCCTTAAGGATGATGTTG（如SEQ ID No.6所示）；
141AR:CAGAGCTGCTGAGAACTT（如SEQ ID No.7所示）；
141CR:CAGAGCTGCTGAGAACT（如SEQ ID No.8所示）；
上述引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
3、荧光PCR反应：以基因工程重组质粒检测本发明，以Q126X突变型为检测对象。经基因工程构建的带有ABCG基因的质粒作为检测对象，质粒pDJ为带有Q126X和Q141K双突变ABCG基因的质粒，质粒pABCG为带有野生型ABCG基因的质粒。这些质粒溶解在TE缓冲液（10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH=8.0）中，经紫外分光光度计测定质量和浓度，计算质粒拷贝数，用TE缓冲液梯度稀释获得10000、1000、100、10拷贝/ul的pDJ和pABCG质粒溶液，然后作为PCR模板进行扩增反应，使用2×GoldernStar Taq Master Mix(购自康为世纪，含0.05U/μlTaq酶、0.5mM dNTP、PCR缓冲液（含Mg2+）及10%甘油)及上述引物、探针配制20μlPCR反应体系，每个样本共计4个反应，注意各个反应所取DNA模板量必须一样，反应体系具体如下：
126C:
| 成分 | 体积 |
| 模板（质粒） | 2μl |
| 2×GOLDSTART Taq Master Mix | 10μl |
| 126F、126CR（引物） | 1-5pMol |
| 126P（探针） | 1-3pMol |
| ddH20 | 至20ul |
126T:
| 成分 | 体积/量 |
| 模板（质粒） | 2μl |
| 2×GOLDSTART Taq Master Mix | 10μl |
| 126F、126TR（引物） | 1-5pMol |
| 126P（探针） | 1-3pMol |
| ddH20 | 至20ul |
使用ABI7500系列荧光定量PCR仪进行反应，具体的反应程序设置如下：
检测结果分析：
确认未选择校正荧光参照，对扩增曲线进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20），Threshold值（Rn）选择为扩增曲线升起的拐点处（即刚进入对数增长期），点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反应的Ct值，根据判断标准进行结果判定（ΔCt=（126T）Ct－（126C）Ct，ΔCt≤6.5为阳性，ΔCt＞7.0则为阴性）。
灵敏度分析：根据以上分析发现，本发明检测的灵敏度高，可以检测到10拷贝的基因突变，如图2所示。
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒1000拷贝，100拷贝，重复10次实验，每次实验结果的Ct值基本一致，相差不到0.1个循环，说明试剂盒实试剂稳定，重复性能强。
选择性能力分析：固定每次PCR反应的总DNA为500拷贝，将突变质粒pDJ和野生型质粒pABCG DNA的浓度分别都调整到100拷贝/ul，梯度稀释，改变突变型DNA占总DNA（野生型+突变型）的比例。结果表明，发明选择性能力为0.1%。
实施例2：
1、人基因组DNA提取：采用博大泰克细胞/组织基因组DNA抽提试剂盒（货号DP1091）从拭子、新鲜和冷冻的全血、血浆和体液等来源的样本中获取人基因组DNA，用紫外分光光度计确认DNA抽提质量和浓度。-70摄氏度低温冰箱保存。
2、ABCG2特异性引物和探针的合成：根据人ABCG2基因外显子4和外显子5突变位点，设计两条探针，5’端标记FAM(绿色荧光),3’端标记BHQ-1淬灭基团，由苏州金唯智生物科技有限公司合成和标记。探针序列及标记如下：
126P:5’-FAM-AGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAA-BHQ1（如SEQ ID No.1所示）；
141P:5’-FAM-TAAGGATGATGTTGTGATGGGCACT-BHQ1（如SEQ ID No.2所示）；
PCR引物用PRIMER5程序设计，Q126X位点序列引物如下：
126F:CTGGAGATGTTCTGATAAATG（如SEQ ID No.3所示）；
126CR:GCAAACCCACTAATACTTACTT（如SEQ ID No.4所示）；
126TR:GCAAACCCACTAATACTTACTTA（如SEQ ID No.5所示）；
Q141K位点序列引物如下：
141F:TTGCCTTAAGGATGATGTTG（如SEQ ID No.6所示）；
141AR:CAGAGCTGCTGAGAACTT（如SEQ ID No.7所示）；
141CR:CAGAGCTGCTGAGAACT（如SEQ ID No.8所示）；
上述引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
3、荧光PCR反应：以基因工程重组质粒检测本发明，以Q141K突变型为检测对象。经基因工程构建的带有ABCG基因的质粒作为检测对象，质粒pDJ为带有Q126X和Q141K双突变ABCG基因的质粒，质粒pABCG为带有野生型ABCG基因的质粒。这些质粒溶解在TE缓冲液（10mMTris-HCl，1mM EDTA，PH=8.0）中，经紫外分光光度计测定提取质量和浓度，用TE缓冲液稀释至100拷贝/ul后作为PCR模板进行扩增反应，使用2×GoldernStarTaq Master Mix(购自康为世纪，含0.05U/μlTaq酶、0.5mM dNTP、PCR缓冲液（含Mg2+）及10%甘油)及上述引物、探针配制20μlPCR反应体系，每个样本共计4个反应，注意各个反应所取DNA模板量必须一样，反应体系具体如下：
141C:
| 成分 | 体积/量 |
| 模板（质粒） | 2μl |
| 2×GOLDSTART Taq Master Mix | 10μl |
| 141F、141CR（引物） | 1-5pMol |
| 141P（探针） | 1-3pMol |
| ddH20 | 至20ul |
141A:
| 成分 | 体积/量 |
| 模板（质粒） | 2μl |
| 2×GOLDSTART Taq Master Mix | 10μl |
| 141F、141AR（引物） | 1-5pMol |
| 141P（探针） | 1-3pMol |
| ddH20 | 至20ul |
使用ABI7500系列荧光定量PCR仪进行反应，具体的反应程序设置如下：
检测结果分析：
确认未选择校正荧光参照，对扩增曲线进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20），Threshold值（Rn）选择为扩增曲线升起的拐点处（即刚进入对数增长期），点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反应的Ct值，根据判断标准进行结果判定（ΔCt=（141A）Ct－（141C）Ct，ΔCt≤7.0为阳性，ΔCt＞7.0则为阴性）。
灵敏度分析：根据以上分析发现，本发明的灵敏度高，可以检测到10拷贝的基因突变，如图3所示。
重复性试验：每个反应分别加入突变质粒1000拷贝，100拷贝，重复10次实验，每次实验结果的Ct值基本一致，相差不到0.1个循环，说明试剂盒实试剂稳定，重复性能强。
选择性能力分析：固定每次PCR反应的总DNA为500拷贝，将突变质粒pDJ和野生型质粒pABCG DNA的浓度分别都调整到100拷贝/ul，梯度稀释，改变突变型DNA占总DNA（野生型+突变型）的比例。结果表明，发明选择性能力为0.1%。
实施例3：
1、提取10例临床诊断为痛风病人的样本（从拭子、新鲜和冷冻的全血和体液等来源），经直接测序法检测AGBC基因突变情况如下：
| 126位点 | 141位点 | 病人数 |
| Q | Q | 5 |
| Q | K | 2 |
| X | Q | 1 |
| X | K | 2 |
2、利用本发明的特异性引物和荧光探针检测临床样本步骤如下：
（1）基因组DNA的获得：按照QIAGEN血液基因组提取试剂盒使用说明提取，获得的DNA质量经紫外分光光度计检测合格，然后将各样本基因组DNA浓度稀释到30ng/ul，作为后续PCR模板。
（2）实时荧光PCR反应：
按以下反应体系配置扩增反应液：
| 成分 | 体积/量 |
| 模板（质粒） | 2μl |
| 2×GOLDSTART Taq Master Mix | 10μl |
| 各正、反向引物 | 1-5pMol |
| 各探针 | 1-3pMol |
| ddH20 | 至20ul |
使用ABI7500系列荧光定量PCR仪进行反应，具体的反应程序设置如下：
确认未选择校正荧光参照，对扩增曲线进行分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20），Threshold值（Rn）选择为扩增曲线升起的拐点处（即刚进入对数增长期），点击Analyze进行分析，然后到Plate窗口下记录每个反应的Ct值，根据判断标准进行结果判定：
126位点突变的判断方式：126C的Ct值应为22～35之间，ΔCt=（126T）Ct－（126C）Ct，ΔCt≤6.5为阳性，ΔCt＞6.5则为阴性；
141位点突变的判断方式：141C的Ct值应为22～35之间，ΔCt=（141A）Ct－（141C）Ct，ΔCt≤7.0为阳性，ΔCt＞7.0则为阴性；
检测结果表明：用本发明的引物和探针获得的ABCG突变位点与直接测序法获得的突变位点一致。与直接测序法相比，本发明可以在90分钟内完成检测，实验结果一致率100%，但实验时间至少节省了2-3天。
Claims (5)
1.用于检测人ABCG2基因突变的探针，其特征在于，该探针是针对ABCG2基因的Q126X位点设计的，其序列为：
126P:5’-FAM-AGCACCGCGACCTGCCAATTTCAAA-BHQ1，如SEQ ID No.1所示或其互补链；和/或
该探针是针对ABCG2基因的Q141K位点设计的，其序列为：
141P:5’-FAM-TAAGGATGATGTTGTGATGGGCACT-BHQ1，如SEQ ID No.2所示或其互补链。
2.用于检测人ABCG2基因突变的引物，其特征在于，该引物是针对ABCG2基因的Q126X位点设计的，其序列为：
126F:CTGGAGATGTTCTGATAAATG，如SEQ ID No.3所示；
126CR:GCAAACCCACTAATACTTACTT，如SEQ ID No.4所示；
126TR:GCAAACCCACTAATACTTACTTA，如SEQ ID No.5所示；和/或
该引物是针对ABCG2基因的Q141K位点设计的，其序列为：
141F:TTGCCTTAAGGATGATGTTG，如SEQ ID No.6所示；
141AR:CAGAGCTGCTGAGAACTT，如SEQ ID No.7所示；
141CR:CAGAGCTGCTGAGAACT，如SEQ ID No.8所示。
3.一种用于检测人ABCG2基因突变的PCR扩增试剂盒，其包括dNTP、Mg2+、Taq DNA聚合酶、Tris-KCl体系、反向突变型特异性引物、探针，其特征在于：所述反向突变型特异性引物为如权利要求2所述的126F、126CR引物对，以及如权利要求2所述的126F、126TR引物对；所述探针为如权利要求1所述的126P探针；和/或
所述反向突变型特异性引物为如权利要求2所述的141F、141AR引物对，以及如权利要求2所述的141F、141CR引物对；所述探针为如权利要求1所述的141P探针。
4.如权利要求1所述的探针在制备诊断痛风疾病的试剂盒中的应用。
5.如权利要求2所述的引物在制备诊断痛风疾病的试剂盒中的应用。
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Publications (2)
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| EP2520664A1 (en) * | 2011-05-02 | 2012-11-07 | ARKRAY, Inc. | Probe, polymorphism detection method, method of evaluating drug efficacy or tolerance, disease prediction method and reagent kit |
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2014
- 2014-02-11 CN CN201410047351.8A patent/CN103820545B/zh active Active
Patent Citations (1)
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