CN105506083B - Capg在制备诊断帕金森症产品中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CAPG基因可以作为诊断帕金森症的分子标志物。本发明研究证明与正常人相比,帕金森症患者血液中CAPG基因的mRNA表达水平显著下降。根据CAPG基因与帕金森症之间的存在的相关性,可以制备诊断帕金森症的试剂盒,该试剂盒可以通过检测收受试者血液中CAPG基因的mRNA水平来判断是否发生帕金森症,该试剂盒可在临床上广泛应用。
Description
技术领域
本发明属于分子诊断领域,涉及一种用于帕金森症诊断的分子标志物,具体涉及血液中的分子标志物-CAPG基因在制备诊断帕金森症的产品中的应用。
背景技术
帕金森病是临床常见的中枢神经系统退行性疾病,以静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常等运动症状为主要表现,并常伴感觉障碍、睡眠障碍、自主神经功能紊乱和神经精神障碍等非运动症状;病理特征为黑质多巴胺能神经元大量缺失,以及残留神经元胞质内出现嗜酸性包涵体,即路易小体(LB)。帕金森病患者一般仅在多巴胺能神经元减少50%、多巴胺水平降低达70%-80%的情况下才表现出典型的运动症状,由于神经元的不可再生特点,此时患者已错过了治疗的最佳时机。因此,积极寻找具有早期诊断价值的生物学标志物,在多巴胺能神经元存活时即明确诊断帕金森是生物学研究的热点。
目前,关于帕金森病早期诊断的生物化学标志物研究涉及免疫学、炎症反应、氧化应激反应、细胞凋亡等多个领域,其中以突触共核蛋白(a-Syn)最具研究前景。组织病理学研究显示,帕金森病患者黑质纹状体突触共核蛋白异常聚集、沉积及功能失调,而且突触共核蛋白是路易小体的主要成分,因此若在脑脊液、外周血或唾液等体液中检测到突触共核蛋蛋白,则判断受试者患有帕金森症。但是以蛋白为疾病标志物的检测方法缺乏特异性和灵敏性,且相比基因检测而言,蛋白检测还不能完全体现“早期”检测的概念,因此寻找一种有效的能够在早期即可诊断帕金森症发生的基因标志物是亟待解决的问题。
发明内容
为了弥补现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种可用于帕金森症早期诊断的分子标志物。相比传统的帕金森症的诊断方法,使用基因标志物来诊断帕金森症的具有及时性、特异性和灵敏性,从而使患者在疾病早期就能知晓疾病风险,针对风险高低,采取相应的预防和治疗措施。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
本发明提供了检测CAPG基因表达的产品在制备诊断帕金森症的工具中的应用。
进一步,上面所提到的检测CAPG基因表达的产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CAPG基因表达水平以诊断帕金森症的产品。
进一步,所述用RT-PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增CAPG基因的引物;所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增CAPG基因的引物;所述用免疫检测诊断帕金森症的产品包括:与CAPG蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊断帕金森症的产品包括:与CAPG基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断帕金森症的产品包括:蛋白芯片和基因芯片;其中,蛋白芯片包括与CAPG蛋白特异性结合的抗体,基因芯片包括与CAPG基因的核酸序列杂交的探针。
在本发明的具体实施方案中,所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增CAPG基因的引物的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
优选地,所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。其中,高通量测序平台是一种特殊的诊断工具,检测CAPG基因表达的产品可以应用于该平台实现对CAPG基因的表达情况的检测。随着高通量测序技术的发展,对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱,容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此,在高通量测序中获知CAPG基因的异常与帕金森症相关也属于CAPG基因的用途,同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种诊断帕金森症的工具,所述诊断工具包括芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
其中,所述芯片包括基因芯片、蛋白质芯片;所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括用于检测CAPG基因转录水平的针对CAPG基因的寡核苷酸探针;所述蛋白质芯片包括固相载体以及固定在固相载体的CAPG蛋白的特异性抗体;所述基因芯片可用于检测包括CAPG基因在内的多个基因(例如,与帕金森症相关的多个基因)的表达水平。所述蛋白质芯片可用于检测包括CAPG蛋白在内的多个蛋白质(例如与帕金森症相关的多个蛋白质)的表达水平。通过将多个与帕金森症的标志物同时检测,可大大提高帕金森症诊断的准确率。
其中,所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试剂盒包括用于检测CAPG基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括CAPG蛋白的特异性抗体。进一步,所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或芯片方法检测CAPG基因表达水平过程中所需的试剂。优选度,所述试剂包括针对CAPG基因的引物和/或探针。根据CAPG基因的核苷酸序列信息容易设计出可以用于检测CAPG基因表达水平的引物和探针。
与CAPG基因的核酸序列杂交的探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制,只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合,任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样,所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长,甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响,所述探针的长度通常至少是14个碱基对,最长一般不超过30个碱基对,与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对,以免影响杂交效率。
所述高通量测序平台包括检测CAPG基因表达水平的试剂。
所述试纸包括试纸载体和固定在试纸载体上的寡核苷酸,所述寡核苷酸能够检测CAPG基因的转录水平。
进一步,所述CAPG蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述CAPG蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如,,嵌合抗体、scFv、Fab、F(ab’)2、Fv等。只要所述片段能够保留与CAPG蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水平的抗体的制备时本领域技术人员公知的,并且本发明可以使用任何方法来制备所述抗体。
在本发明的具体实施方案中,所述针对CAPG基因的引物序列如下:正向引物序列如SEQ ID NO.3所示,反向引物如SEQ ID NO.4所示。
用于诊断帕金森症的CAPG基因及其表达产物的来源包括但不限于血液、组织液、尿液、唾液、脊髓液等可以获得基因组DNA的体液。在本发明的具体实施方案中,用于诊断帕金森症的CAPG基因及其表达产物的来源是血液。
在本发明的上下文中,“CAPG基因”包括CAPG基因以及CAPG基因的任何功能等同物的多核苷酸。CAPG基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中CAPG基因(NC_000002.12)DNA序列具有70%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
优选地,CAPG基因的编码序列包括以下任一一种DNA分子:
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA序列;
(2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
(3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70%、优选地,90%以上同源性,且编码相同功能蛋白质的DNA分子。
在本发明的具体实施方案中,所述CAPG基因的编码序列是SEQ ID NO.1所示的DNA序列。
在本发明的上下文中,CAPG基因表达产物包括CAPG蛋白以及CAPG蛋白的部分肽。所述CAPG蛋白的部分肽含有与帕金森症相关的功能域。
“CAPG蛋白”包括CAPG蛋白以及CAPG蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括CAPG蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段,或其活性衍生物,等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与CAPG的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
优选地,CAPG蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质:
(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
(2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个,较佳地1-30个,更佳地1-20个,最佳地1-10个。
(3)与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一性),更优选地,与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性,常为96%、97%、98%、99%同源性的氨基酸序列构成的多肽。
在本发明的具体实施方案中,所述CAPG蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。
通常,已知的是,一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、缺失、插入、替换是保守修饰,其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是CAPG蛋白的融合蛋白。对于与CAPG蛋白融合的肽或者蛋白质没有限制,只要所得的融合蛋白保留CAPG蛋白的生物学活性即可。
本发明的CAPG蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰,只要经过修饰的蛋白质仍然能够保留CAPG蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的氨基酸数目通常是10个或者更少,例如6个或者更少,例如3个或者更少。
在本发明的上下文中,“诊断帕金森症”既包括判断受试者是否已经患有帕金森症、也包括判断受试者是否存在患有帕金森症的风险。
本发明的优点和有益效果:
本发明首次发现了CAPG基因表达与帕金森症相关,通过检测受试者中CAPG的表达,可以判断受试者是否患有帕金森症、或者判断受试者是否存在患有帕金森症的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种新的分子标记物-CAPG基因,相比传统的检测手段,基因诊断更及时、更特异、更灵敏,能够实现帕金森症的早期诊断,从而降低帕金森症的死亡率。
附图说明
图1显示利用QPCR检测CAPG基因在帕金森症患者和正常人中的表达差异。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选帕金森症患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象:
收集原发性PD患者8例,男4例,女4例,年龄30-85岁,病程3个月-22年。PD入组标准:诊断标准均符合PD临床诊断标准(参考“蒋雨平,王坚,丁正同,等,原发性帕金森病的诊断标准,2005,中国临床神经科学,2006,14:40”)。排除标准:(1)特发性震颤;(2)继发性帕金森综合征;(3)严重痴呆、构音障碍者;(4)患有其他精神疾患者。此项研究己通过医院伦理委员会批准且所有患者签署知情同意书。
正常组:选取年龄30-85岁的健康志愿者10例,男女各5例。
两组之间年龄、性别差异无统计学意义(P>0.10),具有可比性。
2、血液中总RNA的提取
使用百泰克血液RNA提取试剂盒进行血液总RNA的提取
(1)取全血250μl(或0.25g)至RNase-Free过滤柱中,13000rpm离心2分钟,收集下液,加入0.75ml裂解液RLS。
(2)将匀浆样品剧烈震荡混匀,在15-30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。
(3)可选步骤:4℃的条件下12,000rpm离心10分钟,小心取上清转入一个新的无RNA酶的离心管中。
(4)每1ml RLS加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖,剧烈振荡15秒并将其在室温下孵育3分钟。
(5)于4℃12,000rpm离心10分钟,样品会分成三层:下层有机相,中间层和上层无色的水相,RNA存在于水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的60%,把水相转移到新管中,进行下一步操作。
(6)加入1倍体积70%乙醇,颠倒混匀(此时可能会出现沉淀),得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
(7)10,000rpm离心45秒,弃掉废液,将吸附柱重新套回收集管。
(8)加500μl去蛋白液RE,12,000rpm离心45秒,弃掉废液。
(9)加入700μl漂洗液RW,12,000rpm离心60秒,弃掉废液。
(10)加入500μl漂洗液RW,12,000rpm离心60秒,弃掉废液。
(11)将吸附柱RA放回空收集管中,12,000rpm离心2分钟,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
(12)取出吸附柱RA,放入一个无RNA酶的离心管中,根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加50-80μl无RNA酶的水,室温放置2分钟,12,000rpm离心1分钟,收集洗脱液。
3、RNA样品的纯度分析(NanoDrop1000分光光度计)
NanoDrop1000分光光度计检测RNA样品,OD260/OD280为1.8-2.2。
4、RNA样品的质量分析(Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)
Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer检测RNA样品质量,观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构建的要求,可以用于文库构建及测序。
5、高通量转录组测序
(1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段,然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配,H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载,并作为参考基因组,利用TopHat与基因组匹配时,允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点,最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库,根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理,Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff,Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度,检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值<0.01,测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
6、结果
RNA-seq结果显示,与正常人相比,帕金森症患者血液中CAPG基因的mRNA水平显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2 QPCR实验验证帕金森症患者和正常人中差异表达的基因
1、研究对象:
筛选标准同实施例1,帕金森症患者和正常人各50例。
2、血液中总RNA的提取
步骤同实施例1。
3、逆转录
cDNA的合成使用TaqMan反转录试剂盒,在10μl反转录缓冲液(包括5.5mmol/LMgCl2,2.5mmol/L随机6核苷酸引物,4U RNA酶抑制剂和31.25U MultiScribe反转录酶)对200ng的总RNA进行反转录,按以下步骤操作:25℃10min,37℃60min,95℃5min。
4、QPCR
采用实时荧光检测方法对mRNA丰度进行定量。如上述获得的cDNA在ABI Prism7700序列检测器上进行扩增,CAPG基因引物、18S核糖体RNA基因引物设计如下:
CAPG:
上游引物:5’-CTCTGTATAAGGTCTCTG-3’(SEQ ID NO.3);
下游引物:5’-AAAGCAGTCATCAGATAT-3’(SEQ ID NO.4),
18S rRNA:
上游引物:5’-AATCAGGGTTCGATTCCGGA-3’(SEQ ID NO.5);
下游引物:5’-CCAAGATCCAACTACGAGCT-3’(SEQ ID NO.6),
CAPG基因的表达使用18S核糖体RNA作内参。用12.5μl的2倍量SYBR Green PCRmaster mix(包括5μmol/L的上游引物和5μmol/L下游引物)进行PCR,终体积为25μl。PCR条件为:95℃10min,50个循环(95℃30s,56℃30s,72℃30s)。使用ABIprism 7700型序列检测仪对报告荧光染料所发射的荧光进行实时监测。荧光发射量反映循环数,并由序列检测仪的软件读出,给出对PCR扩增有意义的循环数阈值,循环数的值与基因组DNA对数呈线性关系,使用ΔΔCT法进行相对定量。
5、统计学方法
结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示,采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的,两者之间的差异采用t检验,认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图1所示,与正常人相比,帕金森症患者血液中CAPG基因的mRNA水平显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05),结果同RNA-Seq实验。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.检测CAPG基因mRNA表达水平的产品在制备诊断帕金森症的工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片或高通量测序平台检测CAPG基因mRNA表达水平以诊断帕金森症的产品。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述用RT-PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增CAPG基因的引物;所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括一对特异扩增CAPG基因的引物;所述用原位杂交诊断帕金森症的产品包括:与CAPG基因的核酸序列杂交的探针;所述用芯片诊断帕金森症的产品包括:与CAPG基因的核酸序列杂交的探针。
4.根据权利要求3所述的应用,其特征在于,所述用实时定量PCR诊断帕金森症的产品至少包括的一对特异扩增CAPG基因的引物如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述工具能够通过检测样本中CAPG基因mRNA的表达水平来诊断帕金森症。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述工具包括芯片、试剂盒、试纸或高通量测序平台。
7.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述芯片包括固相载体以及固定在固相载体的寡核苷酸探针,所述寡核苷酸探针包括用于检测CAPG基因转录水平的针对CAPG基因的寡核苷酸探针;所述试剂盒包括用于检测CAPG基因转录水平的试剂;所述试纸包括用于检测CAPG基因转录水平的试剂;所述高通量测序平台包括用于检测CAPG基因转录水平的试剂。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述检测CAPG基因转录水平的试剂包括针对CAPG基因的引物和/或探针。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述针对CAPG基因的引物序列如下:正向引物序列如SEQ ID NO.3所示,反向引物如SEQ ID NO.4所示。
10.根据权利要求5-9中任一项所述的应用,其特征在于,所述样本是血液。
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