KR102101500B1

KR102101500B1 - 신장이식 환자의 급성거부반응 진단용 소변 전사체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102101500B1
Application number: KR1020180064359A
Authority: KR
Inventors: 이상호; 서정우
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2017-06-02
Filing date: 2018-06-04
Publication date: 2020-04-16
Also published as: KR20200039654A; KR20180132567A; KR102155731B1

Abstract

본 발명은 비침습적인 신장이식 급성거부반응 진단용 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3, PSMB9 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 마커로 포함하는 신장이식 급성거부반응 진단용 마커 조성물, 상기 마커 조성물을 이용하여 신장이식 급성거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 상기 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 진단용 조성물, 및 상기 마커에 대한 정량장치를 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및/또는 PSMB9 유전자의 mRNA는 신장이식 급성거부반응 환자의 소변에서 높은 수준으로 존재하므로, 신장이식 급성거부반응을 비침습적인 방법으로 간편히 진단하는데 활용될 수 있다.

Description

신장이식 환자의 급성거부반응 진단용 소변 전사체 및 이의 용도{Urinary mRNA for non-invasive differential diagnosis of acute rejection in kidney transplanted patients and uses thereof}

본 발명은 비침습적인 신장이식 급성거부반응 진단용 소변 전사체 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3, PSMB9 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 마커로 포함하는 신장이식 급성거부반응 진단용 마커 조성물, 상기 마커 조성물을 이용하여 신장이식 급성거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법, 상기 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 진단용 조성물, 및 상기 마커에 대한 정량장치를 포함하는 진단용 키트에 관한 것이다.

인체의 면역체계는 세균이나 바이러스 등과 같이 신체에 침입하여 병을 일으키는 단백질 성분을 파괴시키는 작용을 한다. 그러나, 이러한 면역체계는 이식된 신장 조직과 세균 또는 바이러스 등의 이물질 단백질을 구분하지 못하여, 이식된 신장을 외부 침입물질로 간주하여 공격하게 된다. 이렇게 면역체계가 이식된 신장을 공격하는 과정을 신장이식 거부반응이라고 한다.

신장이식 후의 급성거부반응은 일반적으로 무증상이지만, 방치하면 이식 신장의 기능 소실과 연관되어 이식 후 조기에 식욕 부진, 소변량 감소, 부종, 호흡 곤란 등 신장 기능 저하에 따른 요독관련 증상들이 발생할 수 있다. 따라서 이식 후 급성거부반응이 의심이 된다면, 생검(biopsy)을 통한 조기 진단 및 치료가 권장되고 있다. 그러나, 조직을 직접 채취하는 생검은 비용, 시간 또는 회복 측면에서 환자의 부담이 가중되는 단점이 있으며, 또한 진단에 많은 시간이 필요함에 따라 급성거부반응으로 나타나는 경우에는 치료 시간이 절대적으로 부족하여 회복률을 향상시키기 어렵다는 문제점이 있었다.

이에 따라, 신장이식 급성거부반응을 간편히 진단하는 다양한 방법이 개발되고 있으며, 그 예로 혈액에 포함된 특정 유전자의 발현 수준을 비교함으로써 신장 동종이식 거부반응을 진단하는 방법이 개발된바 있다(한국공개특허 제2011-0020853호). 그러나, 상기의 방법 역시 채혈의 불편함을 수반함에 따라, 이를 극복한 비침습적인 방법의 개발이 요구되고 있는 실정이었다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 신장이식 환자에서 비침습적으로 급성거부반응을 진단하는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 환자의 소변 내 포함된 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9의 6종 유전자의 mRNA는 급성거부반응 환자에서 그의 수준이 현저히 증가함을 확인하여, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3, PSMB9 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 마커로 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단용 마커 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마커 조성물을 이용하여 신장이식 급성거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 마커에 대한 정량장치를 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단용 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 C1QB , CD3ε , CXCL9, IP-10, Tim-3, PSMB9 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA를 마커로 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단용 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "신장이식 급성거부반응"은 특이적인 면역반응에 의해 이식된 신장이 붕괴되는 현상으로서, 이식 후 약 1주일 내지 3개월 내에 발병한다는 점에서 수개월에서 수년 이후에 서서히 발병하는 만성거부반응과 구별된다.

본 발명에 있어서, 상기 신장이식 환자의 급성거부반응을 진단하기 위하여 본 발명에서 새롭게 규명한 마커로서, C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 또는 PSMB9 유전자의 mRNA를 사용할 수 있다.

본 발명의 용어, "C1QB"는 보체 시스템을 담당하는 C1q 복합체의 구성요소인 complement C1q chain B 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 단백질은 complement subcomponent C1q chain B; complement component 1, q subcomponent, B chain; complement component 1, q subcomponent, beta polypeptide 등으로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. NM_000491.4 등).

본 발명의 용어, "CD3ε"는 CD3(cluster of differentiation 3) T 세포 보조수용체를 구성하고 있는 CD3-epsilon polypeptide 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 단백질은 CD3-epsilon; CD3e antigen, epsilon polypeptide (TiT3 complex); CD3e molecule, epsilon (CD3-TCR complex) 등으로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. NM_000733.3 등).

본 발명의 용어, "CXCL9"는 CXC 케모카인(chemokine) 패밀리에 속하는 C-X-C motif chemokine ligand 9 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 단백질은 gamma-interferon-induced monokine; monokine induced by gamma interferon; small-inducible cytokine B9 등으로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. NM_002416.2 등).

본 발명의 용어, "IP-10"는 CXC 케모카인(chemokine) 패밀리에 속하는 C-X-C motif chemokine 10 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 단백질은 CXCL10; Interferon gamma-induced protein 10; small-inducible cytokine B10 등으로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. NM_001565.3 등).

본 발명의 용어, "Tim-3"는 대식세포 활성화를 조절하는 TIM-3 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 단백질은 HAVCR2; Hepatitis A virus cellular receptor 2; T-cell membrane protein 3; T cell immunoglobulin mucin 3; TIM-3; TIM3; TIMD-3; TIMD3 등으로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession No. NM_032782.4 등).

본 발명의 용어, "PSMB9"는 프로테아좀(proteasome)을 구성하고 있는 proteasome subunit beta type-9 단백질을 암호화하고 있는 유전자를 의미한다. 상기 단백질은 20S proteasome subunit beta-1i 등으로도 명명되며, 이의 염기서열은 NCBI의 GenBank 등 공지의 데이터베이스에서 얻을 수 있다(예: GenBank Accession NM_002800.4, NM_148954.2 등).

구체적으로, 상기 각 유전자의 mRNA는 신장이식 급성거부반응 의심 환자의 소변 시료 내에 포함된 것일 수 있으며, 본 명세서에서 상기 유전자의 mRNA는 '소변 전사체' 또는 '전사체'로 혼용되어 명명될 수 있다.

상기 6종의 유전자의 mRNA 마커, 즉 소변 전사체 마커를 발굴하는 방법의 일 예를 도 1을 참조하여 구체적으로 설명한다:

먼저, 공지된 데이터 세트를 이용한 메타분석을 수행하여 신장이식환자에게서 급성거부반응이 발생한 경우, 발현수준이 특이적으로 증가된 전사체를 발굴하였다. 이어, 상기 발굴된 전사체를 신장이식후 안정된 환자의 소변시료와 신장이식후 급성거부반응이 발생된 환자의 소변시료를 포함하는 후보군의 RNA 시료를 대상으로, 상기 발굴된 전사체의 발현수준을 측정하여, 신장이식환자에게서 급성거부반응이 발생한 경우, 발현수준이 특이적으로 증가된 전사체를 AR 마커 유전자로서 개발하였다. 상기 개발된 전사체의 발현수준을 회귀분석 방법으로 통계처리하여 AR 예측모델을 개발하였다. 개발된 AR 예측모델을 신장이식환자에게서 급성거부반응이 발병될 것인지의 진단에 사용될 수 있는지를 확인하고자, 신장이식후 안정된 환자의 소변시료와 신장이식후 급성거부반응이 발생된 환자의 소변시료를 포함하는 검증군의 RNA 시료를 대상으로 상기 개발된 AR 마커 유전자의 발현수준을 측정하고, 측정된 발현수준을 상기 개발된 AR 예측모델에 적용하여, 상기 모델의 이용성을 검증하였다.

또한, 상기 발굴된 유전자의 mRNA 마커, 즉 소변 전사체 마커의 효과를 검증하는 방법의 일 예를 다음과 같이 서술한다:

로지스틱 회귀분석을 사용하여 개발한 급성거부반응 예측 모델(AR prediction model)에 상기 소변 전사체의 발현량을 대입한다. 이후, ROC(Receiver Operating Characteristic) 분석을 통해 얻어진 AUC(Area Under the Curve) 값을 비교하여, 소변 전사체 마커의 민감도와 특이도를 확인함으로써, 상기 마커의 효과를 검증한다.

다른 양태로서, 본 발명은 신장이식 급성거부반응이 의심되는 개체의 시료로부터 C1QB, CD3ε , CXCL9 , IP-10, Tim-3, PSMB9 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되 는 하나 이상의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

이때, 상기 용어 'C1QB', 'CD3ε', 'CXCL9', 'IP-10', 'Tim-3', 'PSMB9' 및 '신장이식 급성거부반응'에 대한 정의는 전술한 바와 같다.

본 발명의 용어, "개체"는 신장이식 급성거부반응이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 쥐, 가축, 인간 등을 포함하는 포유동물, 양식어류 등을 제한 없이 포함할 수 있다.

본 발명의 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.

상기 시료는 특별히 이에 제한되지 않으나, 신장이식 개체로부터 분리된 소변일 수 있다.

본 발명에서, 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 상기 단계는 당업자에게 알려진 어떠한 방법이든 사용 가능하다. 구체적인 예로, PCR, 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사증폭(transcription amplification), 자가유지 서열 복제, 핵산에 근거한 서열 증폭(NASBA) 방법 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 본 발명에 따른 상기 6종의 유전자의 염기서열은 NCBI 등의 데이터베이스에 공지된바, 당업자라면 상기 mRNA 수준의 측정에 요구되는 적절한 수단을 사용할 수 있다.

본 발명의 목적상, 상기 신장이식 급성거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 측정된 상기 유전자의 mRNA 수준이 정상 대조구 시료의 mRNA 수준보다 증가하는 경우, 신장이식 급성거부반응으로 판정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이때, 상기 정상 대조구는 신장이식을 받은 개체 중에서 안정된 예후를 보이는 정상군(stable graft function; STA)일 수 있다.

본 발명의 구체적인 일 실시예에서, 신장이식 개체의 소변 시료에 포함된 상기 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9 전사체의 mRNA 발현수준은 정상군(STA)에 비하여, 급성거부반응군(acute rejection; AR)에서 통계적으로 유의하게 증가함을 확인하였다(도 2). 이는, 소변 시료에서 검출된 상기 6종의 유전자의 mRNA는 신장이식 급성거부반응 진단의 마커로서 유용하게 이용될 수 있으며, 상기 mRNA의 발현 수준이 증가하는 경우에 신장이식 급성거부반응이 발생한 것으로 판단할 수 있음을 시사하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적상, 상기 방법은 상기 각 유전자의 mRNA 수준을 정량분석한 결과를 신장이식 급성거부반응 진단과 연관시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이때, 상기 연관시키는 단계는 상기 각 유전자의 mRNA의 수준을 정량분석한 결과를 조합하여 수행될 수 있다. 즉, 상기 각 유전자의 mRNA는 정상인 또는 안정된 예후를 보이는 신장이식환자의 소변에서도 검출되기 때문에, 상기 유전자의 mRNA의 단편적인 수준만으로는 신장이식 급성거부반응을 진단하기가 용이하지 않을 수 있으므로, 상기 각 유전자의 mRNA의 수준을 조합하여 분석함으로써, 보다 정확하게 신장이식 급성거부반응을 진단할 수 있다.

이처럼, 상기 각 유전자의 mRNA 수준을 정량분석한 결과를 조합하여 분석하는 방법으로는, 통상적인 통계분석방법을 사용할 수 있다. 이때, 사용될 수 있는 통계분석방법은 신장이식 급성거부반응을 진단할 수 있는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 선형 또는 비선형 회귀분석방법(Lasso panelized logistic regression, Forward stepwise selection, Logistic regression 등); 선형 또는 비선형 분류(classification) 분석방법; 분산분석(ANOVA) 방법; 신경망 분석방법; 유전적 분석방법; 서포트 벡터 머신 분석방법; 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 또는 커넬 원리요소(Kernel principal components) 분석방법; 마코브 블랜킷(Markov Blanket) 분석방법; RFE(recursive feature elimination) 분석방법; 전방 또는 후방 FS(floating search) 분석방법 등을 단독으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.

또한, 상기 검출 결과의 조합은 상기 통계방법을 자동적으로 수행할 수 있는 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 수행할 수도 있다.

상기 검출 결과의 조합의 구체적인 일 예로서, CXCL9 유전자와 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 선형 또는 비선형 회귀분석방법으로 조합하여 얻어진, 하기 [수학식 1]의 회귀분석모델이 될 수 있다.

[수학식 1]

상기 식에서,

CXCL9은 CXCL9 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

Tim-3는 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다.

상기 [수학식 1]의 회귀분석모델의 컷오프 값은 0.476으로서, 상기 수학식 1에 CXCL9 유전자와 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 적용하여 얻어진 결과값이 0.476 보다 높은 경우에는 신장이식 후 급성거부반응이 발병할 것으로 예측할 수 있고, 상기 결과값이 0.476 보다 낮은 경우에는 신장이식 후 급성거부반응이 발병하지 않을 것으로 예측할 수 있다.

상기 검출 결과의 조합의 구체적인 다른 예로서, CXCL9 유전자, Tim-3 유전자 및 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 선형 또는 비선형 회귀분석방법으로 조합하여 얻어진 하기 [수학식 2]의 회귀분석모델이 될 수 있다.

[수학식 2]

상기 식에서,

CXCL9은 CXCL9 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

Tim-3는 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 나타내며,

PSMB9는 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다.

상기 [수학식 2]의 회귀분석모델의 컷오프 값은 0.457로서, 상기 수학식 2에 CXCL9 유전자, Tim-3 유전자 및 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 적용하여 얻어진 결과값이 0.457 보다 높은 경우에는 신장이식 후 급성거부반응이 발병할 것으로 예측할 수 있고, 상기 결과값이 0.457 보다 낮은 경우에는 신장이식 후 급성거부반응이 발병하지 않을 것으로 예측할 수 있다.

상기 검출 결과의 조합의 구체적인 또 다른 예로서, C1QB 유전자, CD3ε 유전자, CXCL9 유전자, IP-10 유전자, Tim-3 유전자 및 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 선형 또는 비선형 회귀분석방법으로 조합하여 얻어진 하기 [수학식 3]의 회귀분석모델이 될 수 있다.

[수학식 3]

상기 식에서,

C1QB는 C1QB 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

CD3ε은 CD3ε 유전자의 mRNA 수준을 나타내며,

CXCL9는 CXCL9 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

IP-10은 IP-10 유전자의 mRNA 수준을 나타내며,

Tim-3은 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

PSMB9는 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다.

상기 [수학식 3]의 회귀분석모델의 컷오프 값은 0.518로서, 상기 수학식 3에 1QB 유전자, CD3ε 유전자, CXCL9 유전자, IP-10 유전자, Tim-3 유전자 및 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 적용하여 얻어진 결과값이 0.518 보다 높은 경우에는 신장이식 후 급성거부반응이 발병할 것으로 예측할 수 있고, 상기 결과값이 0.518 보다 낮은 경우에는 신장이식 후 급성거부반응이 발병하지 않을 것으로 예측할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 C1QB , CD3ε , CXCL9 , IP-10, Tim-3, PSMB9 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제"는 상기 유전자의 mRNA에 특이적으로 결합하여 인식할 수 있도록 하거나 상기 mRNA을 증폭시킬 수 있는 제제를 의미한다. 구체적인 예로, 상기 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 당업자라면 발명의 목적에 맞게 적절한 제제를 선택할 수 있을 것이다.

상기 제제는 상기 유전자의 발현 수준 측정을 위해 직접 또는 간접적으로 표지될 수 있다. 구체적으로, 상기 표지에는 리간드, 비드(bead), 방사성 핵종, 효소, 기질, 보조인자, 억제제, 형광물질(fluorescer), 화학발광물질, 자성 입자, 합텐 및 염료 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적인 예로, 상기 리간드에는 바이오틴, 아비딘 및 스트렙토아비딘 등이 포함되고, 상기 효소에는 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제 및 베타 갈락토시다아제 등이 포함되며, 상기 형광물질에는 플루오레세인, 쿠마린, 로다민, 피코에리트린 및 설포로다민산 클로라이드(텍사스 레드: Texas red) 등이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 검출 가능한 표지물로 공지의 표지물 대부분이 사용될 수 있고, 당업자라면 발명의 목적에 맞게 적절한 표지물을 선택할 수 있을 것이다.

상기 용어, '프라이머'는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 서열을 의미한다. 본 발명에서, 상기 유전자의 mRNA 증폭에 사용되는 프라이머는, 적절한 버퍼 중의 적절한 조건(예를 들면, 4개의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 DNA, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소와 같은 중합제) 및 적당한 온도하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드가 될 수 있는데, 상기 프라이머의 적절한 길이는 사용 목적에 따라 달라질 수 있다. 상기 프라이머 서열은 상기 유전자의 mRNA의 폴리뉴클레오티드 또는 이의 상보적인 폴리뉴클레오티드와 완전하게 상보적일 필요는 없으며, 혼성화할 정도로 충분히 상보적이면 사용가능하다.

상기 용어, '프로브'는 mRNA 또는 단백질과 특이적 결합을 이룰 수 있는, 라벨링(labeling)된 핵산 단편 또는 펩타이드를 의미한다. 구체적인 예로, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단일 사슬 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중 사슬 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브, 올리고펩타이드(oligonucleotide peptide) 프로브, 폴리펩타이드 프로브(polypeptide) 등의 형태로 제작될 수 있다.

또 다른 하나의 양태는 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3, PSMB9 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 mRNA에 대한 정량장치를 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단용 키트를 제공한다.

본 발명의 진단 키트에 포함된 정량장치는 상기 6종 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다. 구체적인 예로, RT-PCR 키트일 수 있으나, 유전자의 mRNA의 발현량을 측정할 수 있는 한, 이에 제한되는 것은 아니다.

이때, 상기 RT-PCR 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, 상기 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및/또는 PSMB9 유전자의 mRNA는 신장이식 급성거부반응 환자의 소변에서 높은 수준으로 존재하므로, 신장이식 급성거부반응을 비침습적인 방법으로 간편히 진단하는데 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 연구과정의 전체적인 진행과정을 도식적으로 나타내는 개략도로서, 신장이식 급성거부반응 환자의 소변으로부터 바이오마커를 검출하기 위한 메타분석 및 급성거부반응(AR) 예측모델 개발 등의 과정을 도식적으로 나타낸다.
도 2는 후보군(training set)의 소변시료에서 추출된 RNA를 대상으로, CD3εe, C1QB, CXCL9, Foxp3, IDO1, IP-10, PSMB9, PTPRC 및 Tim-3 전사체의 발현수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 STA 환자의 신장 생검시료, ACR 환자의 신장 생검시료 및 AMR 환자의 신장 생검시료의 사구체 영역 및 간질부에서 CXCL9 전사체의 발현수준을 검출한 결과를 나타내는 형광 현미경 사진이다.
도 4는 본 발명에서 발굴한 6종 전사체의 일부 또는 전부를 이용하여 개발된 AR 예측모델의 ROC 커브를 나타내는 그래프이다.
도 5는 검증군 RNA를 대상으로, C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9 전사체의 발현수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명에서 제공하는 3종의 AR 예측모델을 이용하여 검증군에서 6종 전사체의 발현수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 3종 예측모델에 대한 결정 커브분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 환자의 선발 및 시료의 준비

신장이식 환자의 급성거부반응을 진단하기 위한 유전자의 mRNA 마커를 발굴하기 위하여, 2013년 9월부터 2015년 6월까지 6개의 센터(강동경희대학교병원, 경북대학교병원, 경희의료원, 삼성서울병원, 서울성모병원, 인제대백병원)에서 이식 생체검사를 받은 신장 이식 환자와 10년 이상의 장기간 동안 이식 안정 기능(eGFR ≥ 50 ml/min/1.73㎡)을 가진 이식환자로부터 315 개의 소변 시료를 수집하였다. 이때, 상기 모든 환자에게 칼시뉴린 억제제(타클로리무스 또는 사이클로스포린), mTOR 억제제, 프레드니손 및 마이코페놀레이트 모페틸을 포함하는 표준 면역억제제를 처리하였다.

상기 소변 시료를 수집한 환자의 임상특징은 분석한 결과는 다음과 같다(표 1).

상기 표에서 약어는 다음과 같다

STA, stable patients; 안정화된 환자

ACR, acute cellular rejection; 급성 세포성 거부 반응

AMR, acute antibody-mediated rejection; 급성 항체-매개성 거부 반응

OGI, other graft injury; 기타 이식편 손상

BKVN, BK viral nephropathy; BK 바이러스 신증

KT, kidney transplantation; 신장이식

HLA, human leukocyte antigen; 인간 백혈구 항원

eGFR, estimated glomerular filtration rate; 사구체 여과율

PCR, protein-to-creatinine ratio; 단백질 중 크레아틴 비율

ATN, acute tubular necrosis; 급성 관상 괴사

GN, glomerulonephritis; 사구체 신염

CNI, calcineurin inhibitor; 칼시뉴린 억제제

이어, 상기 수득한 315 개의 각 소변시료를 2,000 x g 및 -4℃에서 20 분간 원심분리한 다음, 이로부터 침전물을 수득하였다.

상기 수득한 침전물을 대상으로, PureLink™ RNA Mini Kit(Invitrogen)를 사용한 방법을 수행하여 각 시료의 총 RNA를 추출하였다.

이후, NanoDrop® ND-2000 UV 분광 광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 RNA의 정량(260nm 흡광도) 및 순도(260nm 및 280nm 흡광도 비)를 측정하였다.

그 결과, 315 개의 시료로부터 수득한 총 RNA 함량의 중간값(25 번째 및 75 번째 백분위 수)은 0.345(0.200-0.807)이고, 총 RNA 순도의 중간값(25 번째 및 75 번째 백분위 수)은 1.95 (1.83-2.09)임을 확인하였다.

상기 315개의 소변시료로부터 추출된 총 RNA는 98개의 후보군(training set)와 217개의 검증군(validation set)으로 나누어, 급성 거부반응 마커를 도출 및 검증하는 시료로서 사용하였다.

실시예 2: 급성 거부반응(acute rejection, AR) 마커 유전자의 발굴

Gene Expression Omnibus 데이터베이스의 공개 데이터 세트로부터 442 명의 안정한 환자 및 212 명의 급성 거부 환자의 유전자 발현 프로파일을 수집하고, 이를 대상으로 메타분석을 수행하여 6개의 AR 마커용 후보 유전자를 도출하였다.

또한, 공지된 기존의 연구결과를 분석하여 3개의 AR 마커용 후보 유전자를 추가로 도출하였다.

상기 도출된 9개의 후보유전자를 대상으로 실시간 PCR을 수행하여, AR 마커 유전자를 최종 선발하였다.

실시예 2-1: 메타분석

메타분석은 GeneMeta 방식(Choi et al, Bioinformatics, 2003, i84-i90)을 통해 수행하였다. 구체적으로, GeneMeta R package를 사용하여 계산하였고, 1000회 permutation을 수행하였다. 한편, GeneMeta 방식은 다수의 유전자 전사체(mRNA)의 데이터를 통합하여 효과 크기(effect size)와 통계적 중요도를 계산하기 위한 방식으로서, 효과 크기는 랜덤 효과(random effect) 모델을 통하여 전체 평균으로 계산하고, 통계적 중요도는 다수의 데이터 전체 걸친 순열검정법(permutation test)으로부터 얻는 방식이다. 본 발명에서는, 후보군(training set)에서 가장 강한 신호를 찾는 고정 효과 모델(fixed-effect model) 보다는 전체 집단에서 신호를 찾는 랜덤 효과 모델(random-effect model)을 이용하였고, 전사체 분석에서 효과가 뛰어난 것으로 알려진 순열검정법을 사용했기 때문에 GeneMeta 방식을 사용하였다.

먼저, 메타분석을 통해 신장 이식과 관련한 소변 전사체의 데이터를 수집하기 위하여, 유전자 발현 옴니버스(Gene expression ombinus)로부터 신장이식 거부(kidney rejection) 관련 데이터 세트(data set)를 검색하고, 그 중에서 중복성과 대표성을 고려하여 4개의 데이터 세트를 선정하고, 이로부터 442 명의 안정한 환자(stable graft function, STA) 및 212 명의 급성 거부 환자(AR)를 포함하는 총 654개의 유전자 발현 프로파일을 수집하였다. 상기 수집한 유전자 발현 프로파일은 공통 플랫폼인 Affymetrics Gene Chip으로 측정된 것을 사용하였다.

상기 654개의 소변 전사체 중에서, 중요 유전자(전사체)를 선정하기 위하여, 메타분석 발현량 변화(Fold Change)는 각 데이터 세트에서의 발현량 변화의 가중치 합(weighted sum)으로 계산하였고, 가중치(weight)는 각 데이터 세트의 표본 크기(sample size)에 비례하도록 설정하였다. 구체적으로, 메타분석 FDR(False Discovery Rate)는 GeneMeta의 순열검정법으로 계산하였고, 선정 기준으로는 FDR<0.001 및 FC>2로 설정하였다.

그 결과, 총 109 개의 고유 유전자에 해당하는 137 개의 프로브 세트가 여러 데이터 세트에서 유의함을 확인하였다. 상기 확인된 109개 유전자 중에서 상위 10 개 유전자를 대상으로 유전자 주석의 명확성 및 PCR 프라이머 디자인의 용이성에 대해 추가로 조사하여, 최종적으로 6개의 유전자(C1QB, CXCL9, IDO1, IP-10, PSMB9 및 PTPRC)를 AR 마커 유전자로서 도출하였다(표 2).

한편, 신장이식후 급성거부반응시 발현수준이 증가되는 마커 유전자와 관련된 기존의 연구결과를 분석하여 3개의 AR 마커용 후보 유전자(CD3ε, Foxp3 및 Tim-3)를 추가로 도출하였다(참고: Huraib, S, Goldberg, et al., Am J Kidney Dis, 14: 13-17, 1989; Beckingham, IJ, et al., Br J Urol, 73: 13-15, 1994; Furness, PN, et al., Kidney Int, 60: 1998-2012, 2001; Li, B, Hartono, et al., N Engl J Med, 344: 947-954, 2001; Ding, R, Li, et al., Transplantation, 75: 1307-1312, 2003; Tatapudi, RR, et al., Kidney Int, 65: 2390-2397, 2004; Muthukumar, T, et al., N Engl J Med, 353: 2342-2351, 2005; Renesto, PG, et al., Am J Transplant, 7: 1661-1665, 2007; Suthanthiran, M, et al., N Engl J Med, 369: 20-31, 2013; Seo, JW, et al., PLoS One, 12: e0180045, 2017; Solez, K, et al., Am J Transplant, 8: 753-760, 2008; Odgers, DJ, et al., AMIA Joint Summits on Translational Science proceedings AMIA Joint Summits on Translational Science, 2016: 176-183, 2016; Youden, WJ, Cancer, 3: 32-35, 1950; Robin, X, et al., BMC bioinformatics, 12: 77, 2011; Vickers, AJ, et al., Medical decision making : an international journal of the Society for Medical Decision Making, 26: 565-574, 2006; Kirk, AD, Transplantation, 87: 953-955, 2009; Kirk, AD, et al., Transpl Int, 18: 2-14, 2005; Sugiyama, K, et al., Exp Clin Transplant, 12: 195-199, 2014; Wang, XZ, et al., Transpl Immunol, 30: 18-23, 2014; Boix, F, et al., Transplant Proc, 48: 2987-2989, 2016; Rabant, M, et al., Am J Transplant, 16: 1868-1881, 2016; Hricik, DE, et al., Am J Transplant, 3: 878-884, 2003; Galichon, P, et al., Am J Transplant, 16: 3033-3040, 2016; Shahbaz, SK, et al., Transpl Immunol, 43-44: 11-20, 2017; Hricik, DE, et al., Am J Transplant, 13: 2634-2644, 2013; Matignon, M, et al., J Am Soc Nephrol, 25: 1586-1597, 2014; Vanhecke, D, et al., Arthritis and rheumatism, 64: 3706-3714, 2012; Ma, R, Cui, et al., PLoS One, 9: e91250, 2014; Karin, M, et al., Semin Immunol, 12: 85-98, 2000; Ermolaeva, MA, et al., Ageing Res Rev, 23: 3-11, 2015; Li, L, Khatri, et al., Am J Transplant, 12: 2710-2718, 2012; Roedder, S, et al., PLoS medicine, 11: e1001759, 2014; Sigdel, TK, et al., PLoS One, 10: e0138133, 2015; Pakfetrat, M, et al., Int J Organ Transplant Med, 6: 77-84, 2015; Hirsch, HH, et al., Transplantation, 79: 1277-1286, 2005; Maehana, T, et al., PLoS One, 11: e0162942, 2016; Kariminik, A, et al., Cell Mol Biol (Noisy-le-grand), 62: 104-108, 2016; Rau, S, Schonermarck, et al., Clin Transplant, 27: E184-191, 2013; Zhou, W, Sharma, et al., Viral Immunol, 20: 379-388, 2007; Li, JY, McNicholas, et al., Am J Transplant, 14: 1183-1190, 2014; Kim, MH, et al., PLoS One, 12: e0190068, 2017)

실시예 2-2: 실시간 PCR 분석

상기 실시예 2-1에서 도출된 9종의 AR 마커용 후보 유전자의 발현수준을 실시예 1에서 분류된 98개의 후보군 RNA에서 확인하여, AR 마커 유전자를 최종 선발하고자 하였다. 이때, 상기 98개의 후보군에는 장기 이식 생존 시료(long-term graft survival, LGS)를 포함하는 46개의 안정한 이식기능군(stable graft function, STA) 시료, 35개의 급성 T 세포-매개성 거부반응(acute cellular-mediated rejection, ACR) 시료 및 17개의 급성 항체-매개성 거부반응(Acute Antibody-Mediated Rejection, AMR) 시료를 포함한다.

우선, 각 후보군 RNA 10 ㎕을 주형으로, M-MLV Reverse Transcriptase system을 사용하여 상보적 DNA(complementary DNA; cDNA)를 합성하였다. 이때, 표준 유전자로서 18S rRNA를 선발하였으며, 검체의 대조 유전자(quality control)로서 18S rRNA와 TGF-β1을 선발하였다. 또한, 반응시에 1 ㎕의 역전사 생성물, 1x TaqMan Universal PCR mastermix, no AmpErase UNG, 및 1 ㎕의 프라이머 믹스를 포함하는 반응물을 사용하였다.

이어, 상기 합성된 각 cDNA의 증폭에는 ABI StepOnePlus real-time PCR system(Applied Biosystems)을 이용하였고, 이를 위해 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 및 60℃에서 60초의 반응을 40회 수행하였다. 각 전사체의 발현양은 통합 인간 표준 RNA(universal human reference RNA) 및 18S rRNA의 Ct(threshold cycle)값으로 보정하는 방법인 상대비교 방법(comparative threshold cycle(CT) method)를 사용하여 계산하였다(도 2). 이때, 상기 분석에 사용한 프라이머 및 프로브의 서열 또는 종류는 하기 표 3 및 4에 기재하였다.

전사체의 종류	카탈로그 번호 (Cat. Number)	브랜드 (Brands)
C1QB	Hs.PT.56a.20374814	IDT
CXCL9	Hs.PT.58.27316119	IDT
IDO1	Hs.PT.58.924731	IDT
PSMB9	Hs.PT.58.23199410	IDT
PTPRC	Hs.PT.58.38947549	IDT
Foxp3	Hs01085834_m1	ABI
Tim-3	Hs00958618_m1	ABI
18S rRNA	Hs9999901_s1	ABI
TGF-b1	Hs00998133_m1	ABI

전사체의 종류	서열
CD3ε	Sense: 5'-AAGAAATGGGTGGTATTACACAGACA-3' (서열번호 1) Reverse: 5'-TGCCATAGTATTTCAGATCCAGGAT-3' (서열번호 2) Probe: 5'-FAM-CCATCTCTGGAACCACAGTAATATTGACATGCC-TAMRA-3' (서열번호 3)
IP-10	Sense: 5'-TGTCCACGTGTTGAGATCATTG-3' (서열번호 4) Reverse: 5'-GGCCTTCGATTCTGGATTCA-3' (서열번호 5) Probe: 5'-FAM-TACAATGAAAAAGAAGGGTGAGAA-MGB-3' (서열번호 6)

도 2는 후보군(training set)의 소변시료에서 추출된 RNA를 대상으로, CD3εe, C1QB, CXCL9, Foxp3, IDO1, IP-10, PSMB9, PTPRC 및 Tim-3 전사체의 발현수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 2에서 보듯이, STA 시료에 비하여, C1QB, CD3ε, CXCL9, Foxp3, IP-10, Tim-3 및 PSMB9의 7종 전사체의 발현수준은 AR 시료에서 통계적으로 유의하게 증가하였으나, IDO1 및 PTPRC의 전사체의 발현수준은 STA 시료와 AR 시료에서 별다른 차이를 나타내지 않음을 확인하였다, 또한, Foxp3 전사체의 발현수준은 통계적으로는 유의하게 증가한 것으로 측정되었으나, 대부분의 샘플에서 일정 수준의 발현수준을 나타내지 않았으므로, AR 진단 예측 모델에는 적합하지 않는 것으로 분석되었다.

이에 따라, C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9의 6종 전사체가 신장이식 환자의 AR 진단에 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 2-3: in situ 혼성화 분석을 통한 검증

상기 실시예 2-2의 결과로부터, C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9의 6종 전사체가 신장이식 환자의 AR 진단에 사용될 수 있음을 확인하였는 바, 실제로, 상기 전사체의 발현수준이 AR 환자 특이적으로 증가하는지의 여부를 CXCL9 전사체를 이용한 in situ 혼성화 분석을 통해 검증하고자 하였다. 이때, in situ 혼성화 분석은 RNAscope 2.5 HD BROWN assay kit (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, California)를 사용하여 수행되었다.

대략적으로, 정상인(NP)의 신장 생검시료, ACR 환자의 신장 생검시료 및 AMR 환자의 신장 생검시료의 사구체 영역(glomerulus) 및 간질부(interstitium)를 포르말린으로 고정하고, 공지된 마이크로테크닉 방법을 이용하여, 각각의 조직박편을 제작하였다. 상기 각 조직박편에 CXCL9 올리고뉴클레오타이드 프로브를 가하고, 40 ℃에서 2 시간 동안 혼성화시킨 다음, 사전증폭기(preamplifier)를 처리하고 40 ℃에서 30분, 신호 인핸서(signal enhancer)를 처리하고 40 ℃에서 15분, 증폭기(amplifier)를 처리하고 40 ℃에서 30분 및 표지 프로브(label probe)를 처리하고 40 ℃에서 15분동안 순차적으로 반응시켰다. 이후, 실온에서 신호 증폭기(signal amplifier)를 처리하고 30분 및 HRP 결합 표지화 과정을 15분 동안 수행하였다. 마지막으로, DAB (3,3-diaminobenzidine)로 염색하고, 헤마톡실린으로 대조염색하여, 혼성화 신호를 형광 현미경으로 확인하였다(도 3). 이때, 양성 대조군으로는 Hs-PPIB (human peptidylprolyl isomerase B)를 사용하고, 음성 대조군으로는 dapB (bacterial dihydrodipicolinate reductase)를 사용하였다.

도 3은 STA 환자의 신장 생검시료, ACR 환자의 신장 생검시료 및 AMR 환자의 신장 생검시료의 사구체 영역 및 간질부에서 CXCL9 전사체의 발현수준을 검출한 결과를 나타내는 형광 현미경 사진이다.

도 3에서 보듯이, CXCL9 전사체는 정상인의 신장조직에서는 발현되지 않았으나, ACR 환자 및 AMR 환자의 신장조직에서는 발현됨을 확인하였다.

따라서, 상기 실시예 2-2에서 확인된 6종 전사체는 신장이식 환자의 AR 진단용 마커로서 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3: 급성거부반응 예측 모델의 개발

상기 실시예 2-2에서 발굴한 6종 전사체의 전체 또는 일부를 이용하여 다양한 통계분석법을 수행함으로써, 다양한 AR 예측모델(AR prediction model)을 개발하고, 이들 모델의 효용성을 확인하였다.

실시예 3-1: 2개 전사체를 이용한 예측모델

상기 실시예 2-2에서 발굴한 6종 전사체 중에서 Tim-3 및 CXCL9 전사체의 발현수준과, Lasso panelized logistic regression을 이용하여 다음과 같은 AR 예측모델(2gene-M)을 개발하였다:

[수학식 1]

상기 식에서,

CXCL9은 CXCL9 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

Tim-3는 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다.

실시예 3-2: 3개 전사체를 이용한 예측모델

상기 실시예 2-2에서 발굴한 6종 전사체 중에서 Tim-3, CXCL9 및 PSMB9 전사체의 발현수준과, Forward stepwise selection을 이용하여 다음과 같은 AR 예측모델(3gene-M)을 개발하였다:

[수학식 2]

상기 식에서,

CXCL9은 CXCL9 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

Tim-3는 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 나타내며,

PSMB9는 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다.

실시예 3-3: 6개 전사체를 이용한 예측모델

상기 실시예 2-2에서 발굴한 6종 전사체 모두의 발현수준과, Logistic regression을 이용하여 다음과 같은 AR 예측모델(6gene-M)을 개발하였다:

[수학식 3]

상기 식에서,

C1QB는 C1QB 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

CD3ε은 CD3ε 유전자의 mRNA 수준을 나타내며,

CXCL9는 CXCL9 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

IP-10은 IP-10 유전자의 mRNA 수준을 나타내며,

Tim-3은 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,

PSMB9는 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다.

실시예 3-4: 각 예측모델의 ROC 커브 분석

상기 실시예 3-1 내지 3-3에서 개발된 3종의 예측모델이 나타내는 ROC 커브를 분석하였다(도 4).

도 4는 본 발명에서 발굴한 6종 전사체의 일부 또는 전부를 이용하여 개발된 AR 예측모델의 ROC 커브를 나타내는 그래프이다.

도 4의 ROC 커브를 분석하여 확인된 컷오프 값(Cutoff point), 민감도(Semsitivity), 특이도(Specificity) 및 AUC는 표 5에 기재하였다.

AR 예측모델의 ROC 커브 분석결과

모델	Cutoff point	Semsitivity (%)	Specificity (%)	AUC(95% CI)	p-value
2gene-M	0.476	82	78	0.87 (0.79-0.95)	<0.001
3gene-M	0.457	84	78	0.90 (0.82-0.97)	<0.001
6gene-M	0.518	84	83	0.90 (0.82-0.97)	<0.001

상기 표 5에서, 모델을 통해 얻어진 값이 Cutoff point 보다 높은 값을 나타낼 경우 AR이 발병할 것으로 예측할 수 있고, 상기 모델을 통해 얻어진 값이 Cutoff point 보다 낮은 값을 나타낼 경우, AR이 발병하지 않을 것으로 예측할 수 있다.

실시예 4: 검증군(validation set)을 이용한 AR 예측모델의 효과 확인

상기 실시예 1에서 분류한 217개의 검증군(validation set) RNA를 이용하여, 6개의 AR 마커 유전자(C1QB, CXCL9, IDO1, IP-10, PSMB9 및 PTPRC)의 발현수준을 측정하고, 측정된 발현수준을 상기 실시예 3에서 개발한 AR 예측모델에 적용하여, 상기 AR 예측모델이 사용가능한지의 여부를 확인하고자 하였다.

이때, 상기 검증군의 RNA는 다음과 같이 세분하였다: 78개의 STA 시료, 38개의 ACR 시료, 11개의 AMR 시료, 15개의 BK 바이러스 신증(BK virus nephropathy, BKVN) 시료 및 75개의 기타 이식편 손상(other graft injury, OGI) 시료. 이때, STA 시료는 장기 이식 생존(long-term graft survival, LGS) 시료와 정상 병리소견(normal pathology, NP) 시료를 포함하고; 상기 OGI 시료는 급성 관상 괴사(acute tubular necrosis), 칼시뉴린 억제제 독성(calcineurin inhibitor toxicity) 및 사구체 신염(glomerulonephritis)을 포함한다.

실시예 4-1: RNA 발현수준 검증

후보군 RNA 대신에 217개의 검증군 RNA를 사용하는 것을 제외하고는, 실시예 2-2와 동일한 방법을 수행하여 6종 전사체의 발현수준을 비교하였다(도 5).

도 5는 검증군 RNA를 대상으로, C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9 전사체의 발현수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 5에서 보듯이, 6종 전사체 모두 STA 시료(NP/LGS)에 비하여, AR 및 BKVN 시료에서 높은 발현수준을 나타내었고, AR 시료 보다는 OGI 시료에서 상대적으로 낮은 발현수준을 나타냄을 확인하였다.

또한, C1QB, PSMB9 및 Tim-3 전사체는 STA 시료(NP/LGS)에 비하여 OGI 시료에서도 높은 발현수준을 나타냄을 확인하였으나, CD3ε, CXCL9 및 IP-10 전사체는 STA 시료(NP/LGS)와 유의한 차이를 나타내지 않음을 확인하였고, 특이적으로 IP-10 전사체는 BKVN.에서 가장 높은 발현수준을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 통해, C1QB, CD3, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9의 6종 전사체는 신장이식 환자의 AR 진단에 유용하게 사용될 수 있으며, 추가로 CD3ε, CXCL9 및 IP-10 전사체는 AR과 다른 질병군을 구분하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 4-2: AR 예측모델의 효과검증

상기 검증군 RNA에서 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9 전사체의 발현수준을 측정하고, 측정된 발현수준을 실시예 3에서 개발한 모델에 적용한 후, 상기 각 모델이 나타내는 ROC 커브를 분석하였다(도 6).

도 6은 본 발명에서 제공하는 3종의 AR 예측모델을 이용하여 검증군에서 6종 전사체의 발현수준을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 6에서 보듯이, 3종 모델 모두에서, STA 시료는 Cutoff point 보다 낮은 값을 나타낸 반면, AR 시료는 Cutoff point 보다 높은 값을 나타냄을 확인하였다.

실시예 4-3: 결정 커브분석(Decision curve analysis)

상기 실시예 3을 통해 개발된 3종의 AR 예측모델이 임상에 사용될 수 있는지 검증하고자 결정 커브분석(Decision curve analysis)을 수행하였다(도 7). 상기 결정 커브분석은 급성거부반응의 다양한 한계적 확률(various threshold probabilities; pt)과 최소예상 확률(minimum expected probability)의 순편익(net benefit)을 나타낸다. 따라서, 급성거부반응의 진단을 위한 생검(biopsy)의 실시 여부를 판단하기 위한 도구로 사용될 수 있다.

도 7은 3종 예측모델에 대한 결정 커브분석을 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 7에서 보듯이, 본 발명에서 제공하는 3종의 AR 예측모델은 0.2 내지 0.5의 합리적인 확률범위에서 가장 큰 순편익을 나타냄을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 6종의 소변 전사체 및 이를 이용한 3종의 AR 예측모델은 높은 신뢰도, 민감도 및 특이도로 신장이식 환자의 급성거부반응을 진단할 수 있으며, 나아가 급성거부반응의 생검의 실시를 위한 진단 도구로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> Urinary mRNA for non-invasive differential diagnosis of acute rejection in kidney transplanted patients and uses thereof <130> KPA161526-KR-P1 <150> KR 10-2017-0069212 <151> 2017-06-02 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 aagaaatggg tggtattaca cagaca 26 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tgccatagta tttcagatcc aggat 25 <210> 3 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 ccatctctgg aaccacagta atattgacat gcc 33 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tgtccacgtg ttgagatcat tg 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 ggccttcgat tctggattca 20 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 tacaatgaaa aagaagggtg agaa 24

Claims

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신장이식 급성거부반응 의심 개체의 소변시료로부터 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9의 조합으로 구성된 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
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제2항에 있어서,
상기 방법은 측정된 상기 유전자의 mRNA 수준이 정상 대조구 시료의 mRNA 수준보다 증가하는 경우, 신장이식 급성거부반응으로 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제2항에 있어서,
상기 방법은 상기 유전자의 mRNA 수준을 측정하여 수득한 결과를 신장이식 급성거부반응 진단과 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 연관시키는 단계는 상기 유전자의 mRNA의 수준을 측정하여 수득한 결과를 조합하여 수행되는 것인, 방법.
제9항에 있어서,
상기 결과의 조합은 선형 또는 비선형 회귀분석방법; 선형 또는 비선형 분류(classification) 분석방법; 분산분석(ANOVA) 방법; 신경망 분석방법; 유전적 분석방법; 서포트 벡터 머신 분석방법; 계층 분석 또는 클러스터링 분석방법; 결정 트리를 이용한 계층 알고리즘, 또는 커넬 원리요소(Kernel principal components) 분석방법; 마코브 블랜킷(Markov Blanket) 분석방법; RFE(recursive feature elimination) 분석방법; 전방 또는 후방 FS(floating search) 분석방법; 및 이들의 조합으로 구성되는 군으로부터 선택되는 분석방법을 이용하여 수행되는 것인, 방법.
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제9항에 있어서,
상기 결과의 조합은 C1QB 유전자, CD3ε 유전자, CXCL9 유전자, IP-10 유전자, Tim-3 유전자 및 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 선형 또는 비선형 회귀분석방법으로 조합하여 얻어진 하기 [수학식 3]의 회귀분석모델 형태로 표시되는 것인, 방법:
[수학식 3]

상기 식에서,
C1QB는 C1QB 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,
CD3ε은 CD3ε 유전자의 mRNA 수준을 나타내며,
CXCL9는 CXCL9 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,
IP10은 IP-10 유전자의 mRNA 수준을 나타내며,
Tim3은 Tim-3 유전자의 mRNA 수준을 나타내고,
PSMB9는 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 나타낸다.
제16항에 있어서,
상기 [수학식 3]의 회귀분석모델의 컷오프 값은 0.518로서, 상기 수학식 3에 C1QB 유전자, CD3ε 유전자, CXCL9 유전자, IP-10 유전자, Tim-3 유전자 및 PSMB9 유전자의 mRNA 수준을 적용하여 얻어진 결과값이 0.518 보다 높은 경우에는 신장이식 후 급성거부반응이 발병할 것으로 예측할 수 있고, 상기 결과값이 0.518 보다 낮은 경우에는 신장이식 후 급성거부반응이 발병하지 않을 것으로 예측할 수 있는 것인, 방법.
신장이식 급성거부반응 의심 개체의 소변시료로부터 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9의 조합으로 구성된 유전자의 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단용 조성물.
신장이식 급성거부반응 의심 개체의 소변시료로부터 C1QB, CD3ε, CXCL9, IP-10, Tim-3 및 PSMB9의 조합으로 구성된 유전자의 mRNA에 대한 정량장치를 포함하는, 신장이식 급성거부반응 진단용 키트.