CN111733227B

CN111733227B - 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用

Info

Publication number: CN111733227B
Application number: CN202010325792.5A
Authority: CN
Inventors: 江冰; 陈碧玥; 卢伟; 王聪; 罗莹莹; 张璐丝; 刘利群; 周也荻; 张楠; 邹京伶; 段向巍
Original assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Current assignee: Second Xiangya Hospital of Central South University
Priority date: 2020-04-23
Filing date: 2020-04-23
Publication date: 2021-07-02
Anticipated expiration: 2040-04-23
Also published as: CN111733227A

Abstract

本发明涉及生物检测领域，特别涉及特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用。本发明采用circRNA芯片检测以获取异常表达的脑脊液circRNAs表达谱，并应用qRT‑PCR的方法进行验证，具有严密的设计和成熟的评价体系。首次发现脑脊液中hsa_circ_0007503作为一个重要的生物学检测指标，检测指标微创廉价，可广泛应用于临床检测，解决特发性视神经炎临床诊断时间长，过程繁琐，成本较高，并且灵敏度低的问题。为特发性视神经炎的诊断提供新的思路，同时为完善特发性视神经炎的发病机制以及治疗靶点提供新的方向。

Description

特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用。

背景技术

视神经炎指由多种病因导致的急性视神经的炎性病变，是青中年人最易罹患的致盲性视神经疾病。主要以急性或亚急性视力下降，眼球转动痛为表现，分类包括特发性、感染相关性、自身免疫相关性以及其他类型。其中特发性视神经炎是其中最常见的类型，其病因复杂，部分患者反复发作，预后相对较差，甚至使患者视力终生无法恢复，目前仍然是眼科领域的疑难疾病，也是导致中青年人群视力丧失的重要原因之一，对患者的生理和心理健康都造成了严重的影响。临床上为了准确诊断特发性视神经炎，需要与多种疾病进行鉴别排除，如非动脉炎性缺血性视神经病变、遗传性视神经病变等。诊断方法主要依靠检测血清学感染指标，血液学自身免疫指标以及脑脊液相关生化指标综合判断，检测过程耗时较长且过程繁琐。视神经脊髓炎(Neuromyelitis Optica，NMO)作为特发性视神经炎中的一类，临床常采用血清或脑脊液中的水通道蛋白4抗体(aquaporin-4 IgG,AQP4-IgG)作为临床诊断的特异性标志物。但20％-30％具有临床症状的NMO患者无法检测到AQP4-IgG，且该抗体不能区分疾病严重程度也不能鉴别疾病的不同表型。所以对于特发性视神经炎疾病，寻找新的可靠而准确的临床生物标记物对诊断具有非常重要的意义。

circRNA是一类由特殊剪切机制形成的、具有闭合环状结构的非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)，通过转录调控在生理及病理过程中发挥作用。circRNA的组织特异性、疾病特异性、时序特异性及高稳定性等特点使其成为潜在的临床疾病的生物标记物。目前关于circRNA作为生物标志物在多种疾病中都得到了验证，尤其是癌症领域，例如肺癌、乳腺癌等都已找出高灵敏度的circRNA指标作为生物标志物来辅助临床诊断。近年来circRNA在疾病中的作用机制也成为研究热点，使circRNA生物标志物成为揭示治疗疾病靶点的关键分子。但目前针对特发性视神经炎相关circRNA的研究还较少，以circRNA作为生物标志物的研究未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用。本发明建立特发性视神经炎患者circRNAs表达谱，提供一种用于特发性视神经炎早期诊断的circRNA，建立相较于目前手段更加快速、灵敏度高的方法以应用于临床诊断，并为疾病提供潜在治疗靶点。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了环状非编码RNA在制备特发性视神经炎早期诊断的分子标记物中的应用；所述环状非编码RNA为hsa_circRNA_0007503、hsa_circRNA_007630、hsa_circRNA_406587、hsa_circRNA_054220或hsa_circRNA_005133中的一个或多个。

在本发明的一些具体实施方案中，hsa_circRNA_0007503和/或hsa_circRNA_007630表达量上调；hsa_circRNA_406587、hsa_circRNA_054220和/或hsa_circRNA_005133表达量下调。

在上述研究的基础上，本发明还提供了检测环状非编码RNA表达水平的产品在制备特发性视神经炎早期诊断工具中的应用；所述环状非编码RNA为hsa_circRNA_0007503、hsa_circRNA_007630、hsa_circRNA_406587、hsa_circRNA_054220或hsa_circRNA_005133中的一个或多个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述产品包括：通过实时荧光定量PCR检测所述环状非编码RNA表达水平的试剂。

在本发明的一些具体实施方案中，所述产品为特异性扩增所述环状非编码RNA的引物，序列如SEQ ID No.2～3所示。

本发明还提供了检测环状非编码RNA表达水平的产品，包括特异性扩增所述环状非编码RNA的引物；所述环状非编码RNA为hsa_circRNA_0007503、hsa_circRNA_007630、hsa_circRNA_406587、hsa_circRNA_054220或hsa_circRNA_005133中的一个或多个。

在本发明的一些具体实施方案中，所述引物的序列如SEQ ID No.2～3所示。

在本发明的一些具体实施方案中，所述检测的样本包括脑脊液、血浆、全血样本。脑脊液是临床常用的体液标本，产生于侧脑室的脉络丛，其自身在脑室和脊髓池中不断循环流动，并且保持相对稳定的化学及物理条件。脑脊液中的外泌体可以运输细胞之间交互的信号，包括lncRNAs、mRNAs、蛋白质、脂质及circRNAs。由于脑脊液直接与中枢神经细胞接触进行物质交换，所以相对于血浆、血液等样本更适合作为中枢神经系统疾病诊断的样本，具有在临床广泛应用的潜能。

本发明还提供了检测环状非编码RNA表达水平的试剂盒，包括所述的产品以及可接受的试剂。

本发明的优点包括但不限于：

circRNA具有稳定性好，不易降解等优点，有较高的辅助诊断价值，利于临床推广使用。本发明采用circRNA芯片检测以获取异常表达的脑脊液circRNAs表达谱，并应用qRT-PCR的方法进行验证，具有严密的设计和成熟的评价体系。首次发现脑脊液中hsa_circ_0007503作为一个重要的生物学检测指标，检测指标微创廉价，可广泛应用于临床检测，解决特发性视神经炎临床诊断时间长，过程繁琐，成本较高，并且灵敏度低的问题。为特发性视神经炎的诊断提供新的思路，同时为完善特发性视神经炎的发病机制以及治疗靶点提供新的方向。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示对照组(control)与特发性视神经炎患者组(Test)脑脊液之间差异表达环状RNA的分层聚类分析产生的热图；色标显示不同样本中circRNA的相对表达水平，红色代表上调，绿色代表下调；

图2示特发性视神经炎患者脑脊液中差异表达circRNA火山图；其中，图中以绿色直线划分相应的fold change和P-values fold change上调或下调1.5倍，且P<0.05；

图3示脑脊液目标circRNA经qPCR扩增后检测结果；图中数据以means±SD展示(NCn₁＝4，ON n₂＝6)*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001；图中hsa_circRNA_100579即为hsa_circRNA_0007503，前者为芯片命名后者为circbase统一命名；其中，图3(A)、图3(B)分别示检测结果；样本量是NC n₁＝4，ONn₂＝6共10个样本；

图4示qPCR检测hsa_circRNA_0007503在不同分组脑脊液中的表达情况；图中ON，n₁＝14；NC,n₂＝9；**P<0.01；

图5示hsa_circRNA_0007503的ROC曲线；AUC＝0.825P＝0.01<0.05；

图6示qPCR检测hsa_circRNA_0007503在不同分组血浆中的表达情况；其中，ON，n₁＝11；NC,n₂＝13；P＞0.05。

具体实施方式

本发明公开了一种特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

术语：

circRNA(cicular RNA,环状RNA)：是一类特殊的非编码RNA分子，呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。

ncRNA(non-coding RNA,非编码RNA)：是指不编码蛋白质的RNA。包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等。共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA水平上行使生物学功能。

qRT-PCR(Quantitative real time polymerase chain reaction，实时定量PCR)：是一种在DNA扩增反应中，以荧光染剂侦测每次聚合酶链锁反应(PCR)循环后产物总量的方法技术。

本发明提供了一种用于特发性视神经炎早期诊断的环状非编码RNA，对特发性视神经炎的发病检测有重要意义。用于特发性视神经炎早期诊断的分子标记物hsa_circRNA_0007503，其序列为(来源于circbase)：

>hsa_circ_0007503|NR_024557|WAC，序列如SEQ ID No.1所示：

GGACCAGTTACTCTCCACAAGAAAATTCACACAACCACAGTGCTCTTCATAGTTCAAATTCACATTCTTCTAATCCAAGCAATAACCCAAGCAAAACTTCAGATGCACCTTATGATTCTGCAGATGACTGGTCTGAGCATATTAGCTCTTCTGGGAAAAAGTACTACTACAATTGTCGAACAGAAGTTTCACAATGGGAAAAACCAAAAGAGTGGCTTGAAAGAGAACAGAGACAAAAAGAAGCAAACAAGATGGCAGTCAACAGCTTCCCAAAAGATAGGGATTACAGAAGAGAGGTGATGCAAGCAACAGCCACTAGTGGGTTTGCCAGTGGAATGGAAGACAAGCATTCCAGTGATGCCAGTAGTTTGCTCCCACAGAATATTTTGTCTCAAACAAGCAGACACAATGACAGAGACTACAGACTGCCAAGAGCAGAGACTCACAGTAGTTCTACGCCAGTACAGCACCCCATCAAACCAGTGGTTCATCCAACTGCTACCCCAAGCACTGTTCCTTCTAGTCCATTTACGCTACAGTCTGATCACCAGCCAAAGAAATCATTTGATGCTAATGGAGCATCTACTTTATCAAAACTGCCTACACCCACATCTTCTGTCCCTGCACAGAAAACAGAAAGAAAAG

本发明提供了上述分子标记物hsa_circ_0007503的应用。检测hsa_circ_0007503表达水平的产品在制备特发性视神经炎早期诊断工具中的应用。所述的检测表达水平的产品包括：通过实时荧光定量PCR检测hsa_circ_0007503表达水平的制剂。包括特异性扩增hsa_circ_0007503的引物。序列如表1中SEQ ID No.2～3所示。

本发明还提供了一种用于特发性视神经炎早期诊断的试剂盒，包含检测hsa_circ_0007503表达水平的试剂，包含一对通过实时荧光定量PCR特异性扩增hsa_circ_0007503的引物，其引物序列。申请人发现相对于对照组人群，hsa_circ_0007503在特发性视神经炎患者的房脑脊液中表达上调。提示hsa_circ_0007503是特发性视神经炎中的高表达circRNA，是有助于特发性视神经炎诊断的生物标志物。本发明为特发性视神经炎诊断提供了强有力的分子生物学基础，具有深远的临床意义和推广性。

本发明采用的样本为脑脊液，由于特发性视神经炎往往结合全身系统疾病，也可采用血浆、全血样本等其他临床常用样本进行试验。本试验同时已采用血浆进行试验，发现患者与对照组表达水平无统计学差异(如图6所示)。

qRT-PCR的准确度有一定限制，针对脑脊液中circRNA含量较低的情况可采取ddPCR(数字PCR)等精准度更高的手段进行试验。

本发明的生物标记物适用于特发性视神经炎疾病，特发性视神经炎包括NMO-ON(视神经脊髓炎相关性视神经炎)、MS-ON(多发性硬化相关性视神经炎)和其他中枢脱髓鞘疾病相关性视神经炎。本专利的生物标记物均适用，这些亚型不是排除标准。

本发明提供的特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1特发性视神经炎circRNA表达谱的建立

样本收集：

该研究已通过中南大学湘雅二医院伦理委员会审批。所有脑脊液标本通过腰椎穿刺获得：嘱患者采取胸膝位，以L3/4椎间隙为穿刺点，常规消毒，以2％利多卡因逐层局麻后穿刺，使用普通管采集脑脊液1ml,冻存管每管250ul分装，在离体15分钟内放入-80℃冰箱保存，以进行circRNA生物标记物分析。对照组纳入标准：1、临床诊断为头痛查因2、头部核磁共振检查无异常3、脑脊液检查生化、常规、三大染色无异常4、不伴有眼科疾病。试验组纳入标准：临床诊断为首次发病的特发性视神经炎患者(符合《2014年视神经炎诊断和治疗专家共识》)排除标准：1、年龄小于等于12岁2、已确诊的感染相关性视神经炎3、患有自身免疫性疾病4、同时伴有其他眼科疾病。

RNA提取：

从-80℃冰箱中取出脑脊液，解冻后于4℃ 12,000×g离心10分钟，去除可能存在的杂质，取250ul脑脊液液体，转至1.5ml的离心管中，加入750μl的TRIzol LS Reagent(Invitrogen life technologies)试剂，手动剧烈振荡管体至混匀。于15到30℃孵育5分钟，以便核酸蛋白复合体完全解离。每管样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12,000×g离心15分钟。将上层的无色的水相转移到新离心管中，并加入500μl异丙醇，混匀以沉淀其中的RNA。混匀后15到30℃孵育10分钟，于4℃ 12,000×g离心10分钟。移去上清液，加入至少1ml的75％乙醇，清洗RNA沉淀。振荡后，4℃ 7,500×g离心5分钟。去除乙醇溶液，空气中干燥RNA沉淀5-10分钟，再加入无RNA酶水15ul。

cRNA合成及标记：

利用Rnase R去除线性RNA并富集circRNA。使用随机引物法，根据试剂盒说明书扩增circRNA并逆转录(Arraystar Super RNA Labeling kit)成为带荧光标记的cRNA。标记的cRNA通过RNeasy Mini Kit(Qiagen)纯化。利用NanoDrop ND-1000测量标记的cRNA的浓度及活性。

芯片杂交和数据分析：

在标准条件下将标记好的探针和芯片(Human Circular RNA Array 2.0)进行杂交。使用Agilent Scanner G2505C扫描芯片的荧光强度，并将实验结果数据转换保存。P值<0.05为差异有统计学意义。

结果：

脑脊液是临床常用的体液样本，由于其在临床上易取、具有个体特异性并且直接参与维护中枢神经系统微环境，所以适宜作为生物标志物相关研究的研究对象。目前已有多种研究报道以脑脊液作为中枢神经系统疾病诊断的介质，并广泛用于临床。因此，我们认为脑脊液具有应用于特发性视神经炎研究的潜能。在10份脑脊液样本中(4份对照组，6份患者组)，芯片检测目标包括13617个，对于荧光强度过低的circRNAs进行过滤后共检测到3476个目标circRNA(图1)，其中表达有显著差异的目标circRNA(Fold Change≥1.5且P-value<0.05)包括55个上调目标，149个下调目标(图2)。目前，这是第一个建立的特发性视神经炎脑脊液相关circRNAs表达谱。

实施例2 qRT-PCR验证

在先前建立的表达谱中挑选出14个有显著差异表达的目标circRNAs,利用qPT-PCR在10例样本中再次进行验证。5种circRNAs在两组脑脊液中的差异表达量具有统计学差异，且改变趋势与芯片一致，分别为hsa_circRNA_0007503、hsa_circRNA_007630相对于对照组上调；hsa_circRNA_406587、hsa_circRNA_054220、hsa_circRNA_005133相对于对照组下调(图3)。然后选取具有统计学差异的circRNA:hsa_circRNA_0007503进行进一步验证。

实施例3利用qRT-PCR的方法进一步扩大样本量验证

hsa_circRNA_0007503在脑脊液中的表达水平，检验其诊断价值

样品采集及总RNA提取同前。

cDNA合成及qRT-PCR：

使用RevertAidFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Thermofisher)按照说明书配制逆转录体系进行逆转录。逆转录产物可-20℃保存或立即使用。通过circbase数据库或者UCSC genome browser下载circRNA序列，利用引物设计软件Primer 5.0对目标序列及内参序列设计引物。(表1)使用2X FastStart Universal SYBR Green Master(Roche)进行qPCR检测。将96孔板置于Realtime PCR仪(StepOnePlus^TM Real-Time PCR System,AppliedBiosystems)上进行反应。条件为95℃，10分钟；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒)，扩增反应结束后建立PCR产物的熔解曲线。

表1 circRNA引物序列

数据利用-2ΔΔCt法计算结果。计量资料以中位数±四分位数间距表示，利用Mann-whitney进行U检验。P值<0.05为有统计学差异(表2)。

结果：

检测了23个脑脊液样本(14个特发性视神经炎患者样本，9个对照组样本，年龄性别相匹配)中hsa_circRNA_0007503的表达水平。结果显示，在两组脑脊液样本hsa_circRNA_0007503的表达量有统计学差异(图4)。

表2 hsa_circRNA_0007503在不同分组中的表达水平

为进一步检验hsa_circRNA_0007503在脑脊液中诊断特发性视神经炎的有效性，我们绘制了受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线(图5)。发现hsa_circRNA_0007503在脑脊液样本中诊断特发性视神经炎的ROC曲线下面积为0.825。当hsa_circRNA_0007503在脑脊液中的诊断值设为0.0329时，其诊断的敏感性和特异性分别为0.86和0.78(图5)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中南大学湘雅二医院

<120> 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用

<130> MP2002472

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggaccagtta ctctccacaa gaaaattcac acaaccacag tgctcttcat agttcaaatt 60

cacattcttc taatccaagc aataacccaa gcaaaacttc agatgcacct tatgattctg 120

cagatgactg gtctgagcat attagctctt ctgggaaaaa gtactactac aattgtcgaa 180

cagaagtttc acaatgggaa aaaccaaaag agtggcttga aagagaacag agacaaaaag 240

aagcaaacaa gatggcagtc aacagcttcc caaaagatag ggattacaga agagaggtga 300

tgcaagcaac agccactagt gggtttgcca gtggaatgga agacaagcat tccagtgatg 360

ccagtagttt gctcccacag aatattttgt ctcaaacaag cagacacaat gacagagact 420

acagactgcc aagagcagag actcacagta gttctacgcc agtacagcac cccatcaaac 480

cagtggttca tccaactgct accccaagca ctgttccttc tagtccattt acgctacagt 540

ctgatcacca gccaaagaaa tcatttgatg ctaatggagc atctacttta tcaaaactgc 600

ctacacccac atcttctgtc cctgcacaga aaacagaaag aaaag 645

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaaactgcct acacccacat c 21

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaatttgaac tatgaagagc actgt 25

Claims

1.环状非编码RNA在制备特发性视神经炎早期诊断的分子标记物中的应用；所述环状非编码RNA为hsa_circRNA_0007503，其序列如SEQ ID No.1所示；hsa_circRNA_0007503表达量上调。

2.检测环状非编码RNA表达水平的产品在制备特发性视神经炎早期诊断工具中的应用；所述环状非编码RNA为hsa_circRNA_0007503，其序列如SEQ ID No.1所示；hsa_circRNA_0007503表达量上调。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述产品包括：通过实时荧光定量PCR检测所述环状非编码RNA表达水平的试剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品为特异性扩增所述环状非编码RNA的引物，序列如SEQ ID No.2~3所示。