CN111455094A

CN111455094A - 检测深部感染真菌的组合物、试剂盒、用途及其方法

Info

Publication number: CN111455094A
Application number: CN202010553180.1A
Authority: CN
Inventors: 孙青芝; 刘佩珊; 任小梅; 谭德勇; 刘佳; 邓中平; 戴立忠
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Shengxiang Shanghai Gene Technology Co ltd
Priority date: 2020-06-17
Filing date: 2020-06-17
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2040-06-17
Also published as: CN111455094B

Abstract

本发明涉及分子生物学检测领域，更具体地，涉及白色念珠菌、新型隐球菌，以及人源肺孢子虫的检测。本发明提供了一种用于检测上述真菌的组合物；同时，还提供了含该组合物的试剂盒，所述组合物的用途，以及用于检测深部感染真菌并分型的方法。本发明的组合物结合荧光探针法能够在一管同时检测三种真菌并进行分型，具有成本低、通量高、耗时短，并且操作简便，避免由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染的优势，进一步地，本发明的组合物适配一步法，在节约了检测时间提高了检测效率的同时，保证了灵敏度和特异性。

Description

检测深部感染真菌的组合物、试剂盒、用途及其方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域；具体地，涉及深部感染真菌的检测，更具体地，涉及白色念珠菌、新型隐球菌，以及人源肺孢子虫的检测。

背景技术

接受化疗的肿瘤患者、器官移植患者以及AIDS感染的免疫抑制患者感染深部真菌症的发病率和死亡率逐年增高。而感染深部真菌症的主要真菌有以下几种：

肺孢子虫，目前将寄生于鼠类者成为卡氏肺孢子虫（pneumocystis carinii），寄生于人体者称为耶氏肺孢子虫（pneumocystis jiroveci），也称人源肺孢子虫。孢子虫肺炎（Pneumocystis pneumonia，PCP）是由肺孢子虫寄生于肺部引起的一种严重的致命性肺炎。PCP好发于艾滋病、白血病、器官移植、早产儿、营养不良婴儿、肿瘤放疗和化疗、以及胶原性疾病长期大量使用类固醇激素化疗患者等免疫力低下人群。近年来随着艾滋病的流行，免疫抑制剂的广泛应用，PCP发病率明显上升。PCP患者病程进展较快，若不及时治疗，死亡率高达100%。但早期治疗反应较好，多数可以得到恢复，故关键在于早期诊断和治疗。

新型隐球菌（Cryptococcus neoformans），其作为机会感染病原，常发生于恶性肿瘤、血液病、长期应用大剂量糖皮质激素等免疫功能低下患者中，通常通过吸入感染肺部，进而侵犯中枢神经系统，引发脑膜炎，病死率高。隐球菌在肺部感染时症状较轻，多为低热、咳嗽等，此时治疗效果好，预后佳，但容易被忽略，以至于诊断出来时，已经引起脑膜炎等重症，此时治疗较难，预后差。新型隐球菌的诊断一般采用脑脊液的墨汁染色、培养以及荚膜抗原的凝集试验，但对于支气管肺泡灌洗液、肺活检和血液标本，上述检测则显得更加困难。抗原凝集试验尽管是敏感而特异的诊断工具，但假阳性及假阴性的报道时有出现，所以并不能监测抗新型隐球菌治疗的疗效。

白色念珠菌（Canidia albicans），是寄居在正常人体消化道、呼吸道和女性生殖道黏膜上的正常菌群。也是念珠菌属中最常见的一种条件致病菌。近年来，由于免疫抑制剂的大量应用，肿瘤放疗、化疗，侵入性治疗，器官移植的开展，以及大量广谱抗生素的广泛应用导致正常菌群失调，白色念珠菌的感染率和发病率较以往有明显的增加。1995—2002年美国49所医院连续7年的监测资料表明，念珠菌败血症在医院感染败血症中居第4位，病死率则居首位。深部白色念珠菌感染病死率为68.9%。目前临床对该病的诊断主要依靠血培养和组织病理检查，但阳性率低且耗时长，致使不少患者因病情延误导致治疗失败。甚至丧失生命。因此。快速、准确地从临床标本中直接检出白色念珠菌对于疾病的早期诊断和治疗具有十分重要的意义。

因此，能够在感染初期就诊断出炎症是由这几种真菌感染导致的，就能够有效的进行针对性的治疗，使得预后较好，避免高死亡率的出现。

目前，尽管有一些研究尝试使用荧光定量PCR方法来检测肺孢子虫、新型隐球菌以及白色念珠菌，以解决常规的检测方法（如染色镜检、病理检查、血培养和凝集实验等）的耗时长，灵敏度低的问题，例如，CN110551840A公开了一种检测侵袭性真菌的核酸试剂，该方法使用的核酸试剂中对应有三种真菌的引物和探针，检测了这三种真菌。然而，这些方法仍存在灵敏度低（检测率仅为40~60%），特异性不好（对粪肠球菌和肉毒杆菌有非特异性扩增）等缺陷，特别是在一步法的检测方法中，更加不能保证灵敏度。

因此，本领域需要一种灵敏度高、特异性好的检测肺孢子虫、新型隐球菌以及白色念珠菌的产品，进一步地，其能很好的配合一步法检测，节约检测时间，提升检测效率。

发明内容

有鉴于此，第一方面，本发明提供一种检测深部感染真菌并分型的组合物，所述组合物同时包括：

如SEQ ID NO:1所示的新型隐球菌上游引物、如SEQ ID NO:2所示的新型隐球菌下游引物，和如SEQ ID NO:3所示的新型隐球菌探针；

如SEQ ID NO:4所示的人源肺孢子虫上游引物、如SEQ ID NO:5所示的人源肺孢子虫下游引物，和如SEQ ID NO:6所示的人源肺孢子虫探针；和

如SEQ ID NO:7所示的白色念珠菌上游引物、如SEQ ID NO:8所示的白色念珠菌下游引物，和如SEQ ID NO:9所示的白色念珠菌探针。

进一步地，所述组合物包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

在一个具体的实施方案中，所述组合物还包括：如SEQ ID NO:10所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:11所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的内标探针。

进一步地，所述探针的荧光基团彼此不互相干扰。

在本文中，“彼此不互相干扰”是指组合物中每个探针所用的荧光基团是不一样的，并且不会影响彼此的检测，即可以利用不同的通道进行检测。例如可以使用FAM、HEX、ROX和CY5，这些荧光基团的吸光值不接近，能选择不同的检测通道，因而不会互相干扰。

在一个具体的实施方案中，如SEQ ID NO:3所示的新型隐球菌探针的荧光基团为HEX；如SEQ ID NO: 6所示的人源肺孢子虫探针的荧光基团为ROX；如SEQ ID NO:9所示的白色念珠菌探针的荧光基团为FAM；如SEQ ID NO:12所示的内标探针的荧光基团为CY5。

进一步地，所述组合物中引物的用量为100~500nM；所述组合物中探针的用量为50~250nM。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物用于检测一步法获得的核酸。

在一个具体的实施方案中，本发明的组合物的各成分存在于同一个包装中。

进一步地，本发明的组合物的各成分以混合的形式存在。

第二方面，本发明提供了上述本发明的组合物在制备检测深部感染真菌并分型的试剂盒中的用途。

进一步地，本发明提供了上述本发明的组合物在制备一步法检测深部感染真菌并分型的试剂盒中的用途。

所述引起深部感染的真菌包括：白色念珠菌、新型隐球菌，以及人源肺孢子虫。

第三方面，本发明提供了一种检测深部感染真菌并分型的试剂盒，所述试剂盒包括上述本发明的组合物。

进一步地，所述试剂盒还包括核酸释放剂。

进一步地，所述试剂盒还包括dNTP(U)、DNA聚合酶、PCR缓冲液、UDG酶以及Mg²⁺中的至少一种。

在本文中，术语“样本释放剂”是指能够释放样本中核酸而无需进行核酸的纯化和/或提取就能用于PCR的化学试剂。例如强酸性或强碱性的化学试剂。示例性的样本释放剂可以是包括0.01~0.5mmol/L莎梵婷（surfactin）、100~200mmol/L氯化钾、50~200mmol/L氯化锂、质量/体积比为0.1%~1%十二烷基硫酸三乙醇胺、体积/体积比为0.1%~1%乙基苯基聚乙二醇（NP-40）、质量/体积比为0.01%~2%十二烷基磺酸钠、体积/体积比为0.05%~1%乙醇等组分中的一种或几种，但本发明不限于此。

进一步地，所述组合物中引物的用量为100~500nM；所述组合物中探针的用量为50~250nM；所述dNTP(U)的用量为0.2~0.5mM。

所述DNA聚合酶的浓度为5U/μL~20U/μL，例如DNA聚合酶可以是Taq酶。所述UDG酶的浓度为0.1U/μL~1U/μL。

进一步地，所述试剂盒中的组分和浓度为：

。

第四方面，提供了一种用于检测深部感染真菌并分型的方法，所述方法包括以下步骤：

1）释放待测样本的核酸；

2）使用如上述本发明的组合物或上述本发明的试剂盒对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；

3）获得并分析结果。

进一步地，上述步骤1）中采用一步法释放待测样本核酸。

进一步地，在上述步骤1）之后，步骤2）之间加入UDG酶。

在本发明中，用于检测的样本可以是咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，但不限于此。

进一步地，所述荧光定量PCR的反应条件为：

UDG酶反应，温度为50℃，时间1~3分钟，1次循环；预变性，温度为94℃，时间2~10分钟，1次循环；变性，温度为94℃，时间为10~20秒，退火，温度为60℃，时间为20~40秒，45~50次循环。

在一个具体实施方案中，提供了一种用于以非诊断目的检测深部感染真菌并分型的方法，所述方法包括以下步骤：

1）释放待测样本的核酸；

3）获得并分析结果。

进一步地，上述步骤1）中采用一步法释放待测样本核酸。

进一步地，在上述步骤1）之后，步骤2）之间加入UDG酶。

使用本发明的组合物，能够同时检测3种引起深部感染的真菌并进行分型，使得能够在感染早期就检测除引起感染的真菌，并进行针对性的治疗，避免高死亡率的出现。

在本文中，术语“非诊断目的”指并非旨在获得个体感染罹患相关疾病的信息。例如，该方法可以在以科研为目的的实验中检测培养物中是否有真菌。

本发明的组合物，结合荧光探针法，能够使用一个管在一次试验中同时检测，其成本低，通量高，灵敏度高，特异性好。使得单次试验一管能给出4个靶点的信息，并且操作简便，结果读取过程通过CT值即可以判定。检测全过程均在单管封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阳性和环境污染。

并且可以结合一步法使用本发明的组合物耗时少，从样本到获得结果总时长为约90min，极大的提升了检测效率，尤其地，本发明的组合物配合一步法使用时，能够保证高的灵敏度和特异性。

在本文中，术语“一步法”是指样本免提取的核酸释放及扩增技术（ExtractionFree Nucleic Acid Release and Amplification Technology, EFNART）。其是指在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系，进行直接的样本核酸扩增检测。

附图说明

图1为本发明组合物检测临床阳性样本的FAM通道的结果；

图2为本发明组合物检测临床阳性样本的HEX通道的结果；

图3为本发明组合物检测临床阳性样本的ROX通道的结果；

图4为本发明组合物检测临床阳性样本的CY5通道的结果；

图5为本发明组合物检测临床阴性样本的结果；

图6为本发明组合物检测阳性样本灵敏度的FAM通道的结果；

图7为本发明组合物检测阳性样本灵敏度的HEX通道的结果；

图8为本发明组合物检测阳性样本灵敏度的ROX通道的结果；

图9为本发明组合物检测强阳、弱阳2个浓度水平的精密度结果；

图10为本发明组合物的特异性结果；

图11为白色念珠菌第三套引物探针的单检结果；

图12为人源肺孢子虫第二套引物探针的单检结果；

图13为白色念珠菌第三套引物探针的四联检结果；

图14为人源肺孢子虫第二套引物探针的四联检结果；

图15为对比例组合物的粪肠球菌非特异扩增结果；

图16为对比例组合物的肉毒杆菌非特异扩增。

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、本发明所使用的引物及探针

本发明所使用的引物及探针如下所示：

新型隐球菌上游引物（SEQ ID NO:1）：5’- TTGGACTTGGATTTGGGTGTTT-3’；

新型隐球菌下游引物（SEQ ID NO:2）：5’-CTTATTACGCCGGGCTGACA-3’；

新型隐球菌探针（SEQ ID NO:3）：5’-CCTGCAAAGGACGTCGGCTCGC-3’；

人源肺孢子虫上游引物（SEQ ID NO:4）：5’-AGCCGAGTTCCAGGCACTTA-3’；

人源肺孢子虫下游引物（SEQ ID NO:5）：5’-GCTACAGACGTGCTGCAAAATT-3’；

人源肺孢子虫探针（SEQ ID NO:6）：5’-CTCCGACTTCCATCATTGCATCCCA-3’；

白色念珠菌上游引物（SEQ ID NO:7）：5’-ACTTCAGGTACCGTTGATTTCCA-3’；

白色念珠菌下游引物（SEQ ID NO:8）：5’-TTTCACGAACACGAATTTCACAT-3’；

白色念珠菌探针（SEQ ID NO:9）：5’-TCTCCGTTCCTGCTTCGGAATTCCTTTA-3’；

内标上游引物（SEQ ID NO:10）：5’ -AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’；

内标下游引物（SEQ ID NO:11）：5’ -GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’；

内标探针（SEQ ID NO:12）：5’-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-3’；

其中，如SEQ ID NO:3所示的新型隐球菌探针的荧光基团为HEX；如SEQ ID NO: 6所示的人源肺孢子虫探针的荧光基团为ROX；如SEQ ID NO:9所示的白色念珠菌探针的荧光基团为FAM；如SEQ ID NO:12所示的内标探针的荧光基团为CY5，探针的3’末端还具有BHQ1或BHQ2猝灭基团。

实施例2、检测深部感染真菌并分型的方法

本发明检测样本为咽拭子、痰液、肺泡灌洗液、血液等，在样本处理室进行如下操作：

（1）样本离心后，去上清，在沉淀中加入核酸释放剂，充分混合，静置5-10min（无需提取或纯化核酸）；

（2）根据下述组分配制荧光PCR扩增反应体系50µl；

（3）在PCR扩增仪上，引物和探针特异性扩增待测基因靶序列；

（4）结果分析。

实时荧光PCR反应体系按照如下进行配置：

PCR扩增程序如下进行设置：

。

结果分析：

1）目的检测信号为FAM-白色念珠菌，HEX-隐球菌，ROX-人源肺孢子虫，内参为CY5通道；

2）Baseline的设置：Baseline一般设置为3-15个循环，具体可根据实际情况进行调整。其调整原则为：选择指数扩增前荧光信号较稳定的区域，起点（Start)避开荧光采集起始阶段的信号波动，终点（End）比最早出现指数扩增的样本Ct减少1-2个循环。Threshold的设置：设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点，一般取扩增斜率1/3-1/2处；

3）先分析内标在CY5通道是否有扩增曲线，且Ct≤40，若有，表示本次检测有效，可继续进行后续分析：

A) 若FAM通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，表示白色念珠菌为阳性，若Ct＞40或无Ct，则为阴性；

B) 若HEX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，表示隐球菌为阳性，若Ct＞40或无Ct，则为阴性；

C) 若ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，表示人源肺孢子虫为阳性，若Ct＞40或无Ct，则为阴性；

4）若内在CY5通道没有检测到Ct或Ct＞40，表示本次检测样本浓度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新准备实验。

5）对于阳性样本及细菌培养物，内标检测结果不作要求。

实施例3、本发明组合物测试临床样本的检测结果

使用本发明实施例1中的所述组合物（包含所有引物和探针）配置到一个PCR管中，形成一个体系，按照实施例2所述的方法，对80例临床样本进行检测，最终检测出12例白色念珠菌，8例新型隐球菌，6例人源肺孢子虫阳性。用临床样本在宏石荧光定量PCR仪器上进行多重PCR检测，阳性样本的结果如图1~4所示，阴性样本的所有通道的结果如图5所示。各通道均能检测到良好的扩增曲线，表明本发明的组合物能对引起深部感染的真菌进行检测并分型，并且不会出现假阳性。

实施例4、本发明组合物的灵敏度

分别取三种真菌的梯度稀释的样本DNA，浓度分别为1000000、100000、10000、1000、100拷贝/ml，使用本发明实施例1中的所述组合物（包含所有引物和探针）配置到一个PCR管中，形成一个体系，按照实施例2的方法分别对白色念球菌、新型隐球菌和人源肺孢子虫的的经系列稀释的样本进行检测，结果依次如图6~8所示，从图中可以看出，白色念珠菌的灵敏度为1000拷贝/ml，而新型隐球菌和人源肺孢子虫的灵敏度均可以达到100拷贝/ml。

实施例5、本发明组合物测试阳性对照的重复性结果和精密度结果

使用本发明实施例1中的所述组合物（包含所有引物和探针）配置到一个PCR管中，形成一个体系，按照实施例2所述的方法，对浓度为1000拷贝/ml的各阳性样本重复检测20次，实验结果如表1所述，本发明组合物的检测率为95%~100%。

除此之外，本实验选择强阳、弱阳2个浓度水平（分别为100000拷贝/ml和5000拷贝/ml)的质控品使用本发明实施例1所述的组合物进行批内精密度和批间精密度的测定，每个样本重复测定10次，结果如图9所示。结果显示强阳、弱阳参考品的检出率均为100%，并批内、批间的检测Ct值变异系数（CV）小于5%，实验证明本发明组合物批内、批间均有着很好的检测精密度。

实施例6、本发明组合物的特异性

使用本发明实施例1中的所述组合物（包含所有引物和探针）配置到一个PCR管中，形成一个体系，按照实施例2所述的方法对光滑念珠菌，肺炎链球菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、丁酸酸菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、肉毒杆菌、藤黄微球菌、马红球菌、格式李斯特菌、琼氏不动杆菌、副流感嗜血杆菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、脑膜炎奈瑟菌的阳性样本（浓度为1000000拷贝/ml）进行了检测，结果如图10所示，曲线为每种阳性样本测量时的内标，并无非特异性扩增曲线。结果表明本发明的组合物对这些病原体均没有特异性扩增，特异性好。

实施例7、本发明组合物的筛选

分别针对人源肺孢子虫（PCP）、白色念珠菌（CA）、新型隐球菌（CN）设计5套引物和探针，分别为：PCP-F1，PCP-F2，PCP-F3，PCP-F4，PCP-F5，CA-F1，CA-F2，CA-F3，CA-F4，CA-F5，CN-F1，CN-F2，CN-F3，CN-F4,CN-F5，PCP-R1，PCP-R2，PCP-R3，PCP-R4，PCP-R5，CA-R1，CA-R2，CA-R3，CA-R4，CA-R5，CN-R1，CN-R2，CN-R3，CN-R4，CN-R5，PCP-P1，PCP-P2，PCP-P3，PCP-P4，PCP-P5，CA-P1，CA-P2，CA-P3，CA-P4，CA-P5，CN-P1，CN-P2，CN-P3，CN-P4，CN-P5。同时，找出管家基因Rnase P保守区段，以相同方法针对Rnase P基因设计3套内标引物和探针，分别为：Rnase P-F1，Rnase P-F2，Rnase P-F3，Rnase P-R1，Rnase P-R2，Rnase P-R3，Rnase P-P1，Rnase P-P2，Rnase P-P3。上述探针5’端采用荧光报告基团（FAM、HEX、ROX、CY5）标记，3’端采用非荧光淬灭剂（BHQ1、BHQ2）标记，以降低背景干扰。

上述的引物和探针共形成了18套单检体系，以阳性样本为模板分别用这18套单检体系进行测试。人源肺孢子虫（PCP）、白色念珠菌（CA）、新型隐球菌（CN）以及内标分别筛选出2套引物和探针，分别为：CA-F1，CA-F3，CA-R1，CA-R3，CA-P1，CA-P3；CN-F2，CN-F5，CN-R2，CN-R5，CN-P2，CN-P5；PCP-F1，PCP-F2，PCP-R1，PCP-R2，PCP-P1，PCP-P2； Rnase P-F2，RnaseP-R2，Rnase P-P2，Rnase P-F3，Rnase P-R3，Rnase P-P3。

将筛选出的2套引物探针与内标引物探针进行联检测试，形成16个多重体系，引物探针组合形式见下表2。最终选出最佳体系为A5组合，即为本申请的组合物。

在体系筛选过程中，发现2套靶基因（即，白色念珠菌第三套引物探针和人源肺孢子虫第二套引物探针）在单检体系中的检测效果较好，试验结果如图11~12所示。然而，当它们用于四联检的体系（A11）中检测却受到影响，Ct和荧光值均表现较差，如图13~14所示。

通过一系列实验，我们最终筛选出A5组合，且它们互相之间不会相互影响使得检测效率降低（例如灵敏度降低），特别地，在一步法中。

实施例8、对比例组合物的检测效果

进一步地，合成了CN110551840A中的公开的白色念珠菌、隐球菌、人源肺孢子虫的引物探针（对比例组合物），按照实施例2所述的方法，对浓度为1000拷贝/ml的各阳性样本重复检测20次，实验结果如表3所示，在一步法中，对比例组合物的检测率为40%~60%；而本发明表1中本发明组合物的检出率为95~100%。

进一步地，使用对比例组合物按照实施例2所述的方法对光滑念珠菌，肺炎链球菌、粘质沙雷氏菌、大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、粪肠球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、丁酸酸菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌、肉毒杆菌、藤黄微球菌、马红球菌、格式李斯特菌、琼氏不动杆菌、副流感嗜血杆菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、脑膜炎奈瑟菌的阳性样本（浓度为1000000拷贝/ml）进行了检测。结果发现粪肠球菌、肉毒杆菌中有肺孢子虫的非特异扩增，结果如图15~16所示。因此，实验证明，在一步法中，对比例组合物的特异性比本发明组合物的特异性差。

序列表

<110> 圣湘生物科技股份有限公司

<120> 检测深部感染真菌的组合物、试剂盒、用途及其方法

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttggacttgg atttgggtgt tt 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cttattacgc cgggctgaca 20

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cctgcaaagg acgtcggctc gc 22

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agccgagttc caggcactta 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctacagacg tgctgcaaaa tt 22

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctccgacttc catcattgca tccca 25

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

acttcaggta ccgttgattt cca 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tttcacgaac acgaatttca cat 23

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tctccgttcc tgcttcggaa ttccttta 28

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agatttggac ctgcgagcg 19

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gagcggctgt ctccacaagt 20

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ttctgacctg aaggctctgc gcg 23

Claims

1.一种检测深部感染真菌并分型的组合物，所述组合物同时包括：

2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括：用于监控的内标上游引物、内标下游引物和内标探针。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物进一步包括：如SEQ ID NO:10所示的内标上游引物、如SEQ ID NO:11所示的内标下游引物，和如SEQ ID NO:12所示的内标探针。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中，SEQ ID NO:3所示的新型隐球菌探针的荧光基团为HEX；如SEQ ID NO: 6所示的人源肺孢子虫探针的荧光基团为ROX；如SEQ ID NO:9所示的白色念珠菌探针的荧光基团为FAM；如SEQ ID NO:12所示的内标探针的荧光基团为CY5。

5.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述组合物中引物的用量为100~500nM；所述组合物中探针的用量为50~250nM。

6.权利要求1~5中任一项所述的组合物在制备检测深部感染真菌并分型的试剂盒中的用途。

7.一种检测深部感染真菌并分型的试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求1~5中任一项所述的组合物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒进一步包括核酸释放剂。

9.一种用于检测深部感染真菌并分型的方法，所述方法包括以下步骤：

1）释放待测样本的核酸；

2）使用如权利要求1~5中任一项所述的组合物对步骤1）获得的核酸进行荧光定量PCR；

3）获得并分析结果。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，在所述步骤1）中采用一步法释放待测样本核酸。