CN108060244A - 一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列及应用 - Google Patents

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赵雁林
周复
程倩
何广学
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Abstract

本发明涉及一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列及应用，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。本发明针对结核分枝杆菌符合群含有的特异基因IS6110设计了一套全新的用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列，通过上述核酸序列用于多交叉置换扩增反应检测结核分枝杆菌复合群具有快速、简便、灵敏、特异等优点。

Description

一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列及应用
技术领域
本发明属于分子生物学和微生物学领域，具体地说是涉及一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列及应用。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)是引起结核病的重要病原菌。根据世界卫生组织报告，目前全世界有约20亿人口被结核分枝杆菌感染，每年的新发结核病患者约为800-1000万，每年因结核病死亡人数约为200-300万。我国是全球22个结核病高负担国家之一，结核病患病率居世界第三，并且我国多药耐药结核病流行严重。因此，结核病是我国重点控制的重大传染病之一。
结核分枝杆菌主要通过呼吸道飞沫传播，主要引起人及动物肺部感染。肺结核可以引起咯血、气胸、胸腔积液、呼吸衰竭等症状，严重威胁着患者的生命安全。近年来由结核病引发的突发公共卫生事件，特别是学校聚集性疫情及口岸事件的发生，引起了社会的广泛关注及恐慌。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗以及避免结核病疫情的扩散，研发一个快速、简便和准确的结核分枝杆菌检测方法是很有必要的。
目前对于结核分枝杆菌的检测主要依靠直接涂片法(萋尼法和荧光染色法)和培养法，直接涂片法虽然简便易行，但是灵敏度较低；培养法虽然灵敏度较高，但是获得结果的周期太长，并且操作繁琐，由此以上两种方法均难以满足临床及检疫检验的要求。随着核酸诊断技术的快速发展，一些以PCR为基础的诊断技术(如GeneXpert MTB/RIF)被用于结核分枝杆菌的快速检测，然而这些方法依赖昂贵的仪器设备，并且每次反应的成本较高，这些都限制GeneXpert MTB/RIF的广泛推广使用。
随着恒温技术的出现，环介导恒温扩增技术(LAMP)及交叉恒温扩增技术(CPA)已经应用于结核分枝杆菌的快速检测，其中LAMP技术在扩增反应后，需要在特定的仪器中读取变色反应结果，增加了检测步骤及仪器成本，不利于该技术的推广。将CPA技术结合免疫层析乳胶标记试纸条检测技术可以避免对仪器的依赖，但是该种方法需要开盖操作，极易造成后续检测试验的假阳性结果。
多交叉置换扩增(Multiple Cross Displacement Amplification，MCDA)是由YeChangyun等建立的一种新型核酸扩增技术，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高等优点。该技术已被广泛用于分子诊断领域。MCDA针对靶序列10个特异部位设计10条引物，利用具有链置换活性的Bst 2.0DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶序列高效扩增。10条引物中2条为置换引物F1和F2；2条交叉引物，即CP1和CP2；6条扩增引物，即C1和C2，D1和D2，R1和R2。交叉引物包含CP1包含C1和P1，即5’-C1-P1；CP2包含C2和P2，即5’-C2-P2。
MCDA扩增反应包括两个过程，即扩增引物介导的循环扩增和交叉引物介导的置换扩增，在既定的反应温度下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。其过程如图1所示，首先在Bst DNA聚合酶的作用下，以CP1引物P1区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列P1s配对，启动链置换DNA合成。F1引物与P1s前端F1s序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出CP1引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F1引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然而由交叉引物CP1先合成的DNA链被F1引物进行链置换产生一单链，该单链的D1s、C1s、R1s、P2s、F2s区域能够依次与扩增引物D1、C1、R1、交叉引物CP2及置换引物F2结合，并发挥链置换扩增作用(步骤1、2)。C1引物扩增并置换D1的扩增链，生成短片段C1s-D1产物，该产物能够与C1和CP1引物结合，启动链置换扩增，使短片段C1s-D1产物累积(步骤3)。R1引物扩增并置换C1的扩增链，生成短片段C1s-C1产物，该产物含有互补的两个区域(C1s和C1)，从而形成一个单链单茎环结构(步骤4)。该结构可以与CP1引物结合，启动扩增反应，形成的短片段双链产物在反应温度下解链两条单链，形成的单链通过两个互补区域产生两个单链单茎环结构，单链单环结构可与引物CP1、D1、C1结合，启动新一轮的置换扩增，这样产生了以单链单茎环结构为基础的循环置换扩增，导致C1s和C1产物的积累(循环1)。R1引物形成的扩增片段可被交叉引物CP2的扩增片段置换，产生短链产物C1s-R1，该产物可以发生类似于C1引物介导的扩增反应，启动R1引物介导的扩增循环，导致C1s-R1产物积累(循环2)。交叉引物CP2的扩增片段被上游的置换引物F2扩增置换，该产物为单链，可以依次与扩增引物D2、C2、R2结合，启动类似于扩增引物D1、C1、R1的循环扩增反应，导致短片段产物的累积(步骤6、7)。CP2单链产物通过3′末端的C1s区段和C1区段互补，发生自我碱基配对，在一端形成茎环状结构，以茎环的3′端开始合成自我互补链，置换R2扩增片段产物。同时，交叉引物CP1同该单链茎环区域杂交结合，以CP1引物的3′端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。解离出的核酸产物一端双链，一端为单链，在单链一端上会形成茎环结构，在茎环结构上存在单链形式P2s区域，交叉引物CP2能够与其杂交，启动新一轮置换扩增(步骤6、8)，经过相同的过程，又形成茎环结构(步骤9、10、11)。通过此过程，在同一条链上互补序列周而复始形成大小不一的结构，从而短时间内完成对靶序列的特异性检测。
MCDA扩增产物可以通过实时浊度计，琼脂糖凝胶电泳及可视化颜色改变进行检测。实时浊度计法及琼脂糖凝胶电泳法需要依赖机器设备来完成，而根据颜色改变来判读结果，更为简单、便宜并且不易造成后续污染。羟基萘酚蓝(Hydroxyl naphthol blue,HNB)是一种高灵敏度核酸扩增指示染料，在核酸扩增体系中，有大量Mg2+存在时，呈现紫色，随着扩增的进行，反应体系中Mg2+被消耗，阳性反应管呈现蓝色或者天蓝色。而阴性反应管则仍然呈现紫色。如此可以让检测结果的判读更为简单、易行、可靠。
发明内容
本发明针对结核分枝杆菌符合群含有的特异基因IS6110设计一套MCDA扩增引物，建立一种针对结核分枝杆菌的快速、敏感和特异的核酸检测方法。
一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列，具有序列表SEQ ID No.1至SEQID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。
作为优选，所述引物序列通过下述方法获得：根据结核分枝杆菌的特异性基因IS6110设计多交叉置换扩增反应引物，利用引物设计软件PRIMER PREMIER5.0和PrimerExplorer V4设计多交叉置换扩增反应引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的一套多交叉置换扩增反应引物。
一种用于结核分枝杆菌复合群检测的试剂盒，包含序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。
一种用于结核分枝杆菌复合群检测的方法，使用序列表SEQ ID No.1至SEQ IDNo.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列检测结核分枝杆菌的特异性基因IS6110并对检测结果进行信息分析。
作为优选，SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列分别对应于置换引物F1、交叉引物CP1、扩增引物C1、扩增引物D1、扩增引物R1、扩增引物R2、扩增引物D2、扩增引物C2、交叉引物CP2、置换引物F2。
作为优选，所述的用于结核分枝杆菌复合群检测的方法，包括下述步骤：
(1)进行结核分枝杆菌的基因组DNA的提取；
(2)利用提取的DNA作为模板进行多交叉置换扩增反应；
(3)运用颜色改变、琼脂糖凝胶电泳、实时浊度的检测手段进行检测。
作为优选，步骤(1)具体为：利用CTAB法对培养后的结核分枝杆菌进行DNA提取，然后利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，结核分枝杆菌基因组DNA用TE缓冲液连续倍比稀释至不同浓度。
作为优选，步骤(2)包括：
(a)建立多交叉置换扩增反应体系：交叉引物CP1和CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1和C2的浓度为20pmol，10mM的甜菜碱，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL；
(b)确定反应温度：在标准反应体系条件下，加入结核分枝杆菌检测多交叉置换扩增反应引物和DNA模板，模板浓度为10pg/μL，反应在不同温度条件下进行，利用实时浊度仪进行结果检测，得到不同的动态曲线；
(c)确定检测下限：在标准应体系条件下，运用连续稀释的结核分会杆菌基因组DNA进行多交叉置换扩增反应；
(d)确定反应时间：在标准应体系条件下，加入结核分枝杆菌基因组模板，反应在恒温条件下进行，多交叉置换扩增反应时间分别10分钟、20分钟、30分钟和40分钟，根据颜色变化判断结果是否为阳性。
作为优选，步骤(3)包括灵敏度评价和特异性评价，
所述灵敏度评价为：选取106株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌的卡介苗进行特异性评价，利用水煮法提取细菌的DNA，在标准反应体系条件下加入1μL羟基萘酚蓝，反应全部在68℃条件下进行，最终根据颜色改变判定结果；
所述特异性评价为：选取58株非结核分枝杆菌进行特异性评价，利用水煮法提取细菌的DNA，在标准反应体系条件下加入1μL羟基萘酚蓝，反应全部在68℃条件下进行，最终根据颜色改变判定结果。
所述核酸序列用于结核分枝杆菌复合群检测的应用。
本发明针对结核分枝杆菌符合群含有的特异基因IS6110设计了一套全新的用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列，通过上述核酸序列用于多交叉置换扩增反应检测结核分枝杆菌复合群具有快速、简便、灵敏、特异等优点。
附图说明
图1是MCDA扩增反应原理图；
图2是引物设计的位置和方向图；
图3是针对IS6110基因序列设计的检测结核分枝杆菌的MCDA引物温度动态曲线图；
图4是不同基因组模板量进行多交叉置换扩增反应检测曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明所要保护的范围并不限于此。
本发明中所使用和涉及的试剂：
Loopamp Kit(Eiken Chemical Co.Ltd.,Tokyo,Japan)购于日本荣研公司；羟基萘酚蓝购于北京海泰正元科技有限公司；TE缓冲液，蛋白酶K，溶菌酶均购于索莱宝科技有限公司；DL100DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司；溴代十六烷基三甲胺(CTAB)和十二烷基硫酸钠(SDS)购于美国AMRESCO公司。
本发明实验中使用和涉及的主要仪器：Loopamp实时浊度仪LA-320C(EikenChemical Co.,Ltd,Japan)购于日本荣研公司；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR，美国Bio-Rad产品。
根据结核分枝杆菌的特异性基因IS6110(Y17220.1，Mycobacteriumtuberculosis)设计多交叉置换扩增反应引物，IS6110基因只存在于结核分枝杆菌复合群中，包括结核分枝杆菌，牛分枝杆菌，非洲分枝杆菌及田鼠分枝杆菌等，如此可以将结核分枝杆菌复合群感染与其他分枝杆菌感染区分开来。利用引物设计软件PRIMER PREMIER 5.0和Primer Explorer V4设计多交叉置换扩增反应引物。并将获得的特异性引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的一套多交叉置换扩增反应引物。引物设计的位置和方向见图2，本发明所针对IS6110基因设计的引物序列如表1所示：
表1
实验中，先进行结核分枝杆菌的基因组DNA的提取，利用提取的DNA作为模板进行MCDA反应，最后运用不同的检测手段进行检测。
DNA的提取：利用CTAB法对培养后的结核分枝杆菌进行DNA提取，然后利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，结核分枝杆菌(H37Rv)基因组DNA用TE缓冲液连续稀释(10ng,1ng,100pg,10pg,1pg,100fg,10fg,1fg)，各浓度基因组DNA均少量分装，-20℃保存备用。
多交叉置换扩增反应体系：
标准的MCDA反应体系：交叉引物CP1和CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1和C2的浓度为20pmol，10mM的Betain，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL。
最佳反应温度的确定：
在标准反应体系条件下，加入结核分枝杆菌检测MCDA引物和DNA模板，模板浓度为10pg/μL，反应在不同温度条件下进行(65～70℃)，利用实施浊度仪进行结果检测，得到不同的动态曲线，见图3。经验证68℃作为MTB-MCDA检测的最佳反应温度。
检测方法的灵敏度评价：
选取106株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌的卡介苗(BCG)(菌株信息见表2)进行特异性评价，利用水煮法(100℃，15分钟)提取细菌的DNA。在标准反应体系条件下加入1μL羟基萘酚蓝，反应全部在68℃条件下进行，最终根据颜色改变判定结果。
结果显示：106株结核分枝杆菌和1株卡介苗(牛结核分枝杆菌减毒株)全部呈现阳性结果。
表2
BCG：卡介苗；NTRL：国家结核病参比实验室
检测方法的特异性评价：
选取58株非结核分枝杆菌(菌株详细信息见表2)进行特异性评价，利用水煮法(100℃，15分钟)提取细菌的DNA。在标准反应体系条件下加入1μL羟基萘酚蓝，反应全部在68℃条件下进行，最终根据颜色改变判定结果。
结果显示：58株非结核分枝杆菌全部呈现阴性结果。
MTB-MCDA-HNB技术的检测下限：
在标准应体系条件下，运用连续稀释的结核分枝杆菌(H37Rv，10ng/μL,1ng/μL,100pg/μL,10pg/μL,1pg/μL,100fg/μL,10fg/μL,1fg/μL)基因组DNA进行多交叉置换扩增反应，其结果如图4所示，图4中由左至右各曲线分别对应的DNA模板量为：10ng,1ng,100pg,10pg,1pg,100fg,10fg,1fg，结果显示：用结核分枝杆菌标准株H37Rv进行检测，H37Rv菌株中IS6110含有10个以上拷贝，利用H37Rv进行测定，该方法检测下限为100fg，当反应体系中基因组模板量降低至100fg以下时，多交叉置换扩增反应不出现阳性扩增。
MTB-MCDA-HNB技术最佳反应时间：
在标准应体系条件下，加入1μL浓度为100fg/μL的结核分枝杆菌基因组模板，反应在恒温68℃条件下进行，多交叉置换扩增反应时间分别10分钟，20分钟，30分钟和40分钟。根据颜色变化判断结果是否为阳性。
结果显示：反应进行30分钟，反应管颜色已经变为蓝色。
MTB-MCDA-HNB技术在临床样本中的应用
选取52份临床痰标本(2mL)，然后将每份痰标本均分为2份，一份经过N-乙酰-L-半胱氨酸(NALC)-4％NaOH处理，静置15分钟后加入磷酸盐缓冲液3000×g离心15分钟，弃上清，所得的沉淀全部转移到1.5mL EP管中，加入100μL TE缓冲液，100℃加热15分钟，1.2×10000rpm离心2分钟，吸取1μL样本DNA加入到多交叉置换扩增反应反应管中，反应温度为68摄氏度，反应时间为40分钟。根据颜色改变读取结果。
一份用于GeneXpert MTB/RIF方法检测，将GeneXpert试剂盒配套的处理液加入含有标本的离心管中，震荡后静置15分钟，将处理后样品由加样孔缓慢加入到反应盒内。然后上机，反应2小时后读取结果。
与GeneXpert MTB/RIF比较MTB-MCDA-HNB的检测效能结果如表3所示：
表3
结果显示：以WHO推荐的GeneXpert MTB/RIF方法为标准，MTB-MCDA-HNB检测的灵敏度为94.7％，特异度为92.9％。
序列表
<110> 杭州上池科技有限公司
<120> 一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
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gatcgagcaa gccatctg 18
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 2
tcccctatcc gtatggtgga tgacccgcca acaagaagg 39
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 3
tcccctatcc gtatggtgga t 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 4
gtctttcagg tcgagtac 18
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 5
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<211> 16
<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 6
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<211> 19
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
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<400> 9
catccaaccg tcggtcggag atcgtctcgg ctagtgca 38
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<212> DNA
<213> 结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)
<400> 10
ggtcttgtat aggccgttg 19

Claims (10)

1.一种用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列，其特征在于：具有序列表SEQ IDNo.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。
2.根据权利要求1所述用于结核分枝杆菌复合群检测的核酸序列，其特征在于：所述引物序列通过下述方法获得：根据结核分枝杆菌的特异性基因IS6110设计多交叉置换扩增反应引物，利用引物设计软件PRIMER PREMIER 5.0和Primer Explorer V4设计多交叉置换扩增反应引物，并将获得的特异性引物在NCBI数据库中进行序列比对分析，以排除引物与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的一套多交叉置换扩增反应引物。
3.一种用于结核分枝杆菌复合群检测的试剂盒，其特征在于：包含序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列。
4.一种用于结核分枝杆菌复合群检测的方法，其特征在于：使用序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列检测结核分枝杆菌的特异性基因IS6110并对检测结果进行信息分析。
5.根据权利要求4所述的用于结核分枝杆菌复合群检测的方法，其特征在于：SEQ IDNo.1至SEQ ID No.10所示的多交叉置换扩增反应引物序列分别对应于置换引物F1、交叉引物CP1、扩增引物C1、扩增引物D1、扩增引物R1、扩增引物R2、扩增引物D2、扩增引物C2、交叉引物CP2、置换引物F2。
6.根据权利要求5所述的用于结核分枝杆菌复合群检测的方法，其特征在于包括下述步骤：
(1)进行结核分枝杆菌的基因组DNA的提取；
(2)利用提取的DNA作为模板进行多交叉置换扩增反应；
(3)运用颜色改变、琼脂糖凝胶电泳、实时浊度的检测手段进行检测。
7.根据权利要求5所述的用于结核分枝杆菌复合群检测的方法，其特征在于步骤(1)具体为：利用CTAB法对培养后的结核分枝杆菌进行DNA提取，然后利用紫外分光光度计测定基因组DNA的浓度和纯度，结核分枝杆菌基因组DNA用TE缓冲液连续倍比稀释至不同浓度。
8.根据权利要求5所述的用于结核分枝杆菌复合群检测的方法，其特征在于步骤(2)包括：
(a)建立多交叉置换扩增反应体系：交叉引物CP1和CP2的浓度为60pmol，置换引物F1和F2的浓度为10pmol，扩增引物R1，R2，D1和D2的浓度为30pmol，扩增引物C1和C2的浓度为20pmol，10mM的甜菜碱，6mM的MgSO4，1mM的dNTP，12.5μL的10×Bst DNA聚合酶缓冲液，10U的链置换DNA聚合酶，1μL的模板，补加去离子水至25μL；
(b)确定反应温度：在标准反应体系条件下，加入结核分枝杆菌检测多交叉置换扩增反应引物和DNA模板，模板浓度为10pg/μL，反应在不同温度条件下进行，利用实时浊度仪进行结果检测，得到不同的动态曲线；
(c)确定检测下限：在标准应体系条件下，运用连续稀释的结核分会杆菌基因组DNA进行多交叉置换扩增反应；
(d)确定反应时间：在标准应体系条件下，加入结核分枝杆菌基因组模板，反应在恒温条件下进行，多交叉置换扩增反应时间分别10分钟、20分钟、30分钟和40分钟，根据颜色变化判断结果是否为阳性。
9.根据权利要求5所述的用于结核分枝杆菌复合群检测的方法，其特征在于步骤(3)包括灵敏度评价和特异性评价，
所述灵敏度评价为：选取106株结核分枝杆菌和1株牛分枝杆菌的卡介苗进行特异性评价，利用水煮法提取细菌的DNA，在标准反应体系条件下加入1μL羟基萘酚蓝，反应全部在68℃条件下进行，最终根据颜色改变判定结果；
所述特异性评价为：选取58株非结核分枝杆菌进行特异性评价，利用水煮法提取细菌的DNA，在标准反应体系条件下加入1μL羟基萘酚蓝，反应全部在68℃条件下进行，最终根据颜色改变判定结果。
10.权利要求1所述核酸序列用于结核分枝杆菌复合群检测的应用。
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