CN105483214A - 一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用 Download PDF

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逄宇
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Abstract

本发明提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用。本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒，包括：上游引物，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1所示；下游引物，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：2所示；探针，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：3所示，并且在探针的5’端标记荧光基团，在探针的3’端标记淬灭基团。本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒能够快速地对结核分枝杆菌进行检测，并且具有较高的灵敏性、特异性和准确性。

Description

一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及结核分枝杆菌的检测，具体涉及一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用。
背景技术
结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)是引起结核病(tuberculosis)的病原体，可侵犯人体全身各器官，其中以肺结核最为多见。结核病是全世界面临的最大公共卫生问题，据世界卫生组织报道，全球每年约有800万新发结核病患者，并且至少有300万人死于该病。中国是世界结核病负担最重的国家之一，并且发病速度下降非常缓慢，疫情主要集中在经济相对不发达的西部地区以及农村地区。
作为呼吸道传染性疾病，结核分枝杆菌主要通过空气飞沫进行传播。据文献报道，1名结核病患者能够传染10名以上的普通人感染结核，特别是近年来，在学生及流动人口等人员相对密集的人群中，每年多次发生聚集性疫情。因此，如何快速并且准确地对结核分枝杆菌进行检测，对于及时发现传染源、及早开展有效地抗结核治疗以及控制结核病在人群中的传播和蔓延具有重要意义。
传统的结核分枝杆菌检测方法主要包括涂片和培养等细菌学检测方法。涂片法虽然检测时间较短，然而灵敏度较低，通常要求待测样本中结核分枝杆菌含量高于1000个/mL，此外特异性较差，特别是无法区分样本中结核分枝杆菌的存活状态，因此易造成假阳性；培养法的灵敏度和特异性较高于涂片法，其能区分标本中结核分枝杆菌的存活状态，然而由于结核分枝杆菌细胞壁较厚且生长周期较长，培养时间通常需要4-8周，因此不利于实际的临床应用。
目前，已有研究将多聚酶链反应(PCR)扩增技术应用于结核分枝杆菌DNA的鉴定，该方法主要针对的是样本中核酸的存在与否以及拷贝数，其虽具有灵敏度高、快速等优点，然而无法区分样本中的死菌和活菌这一缺陷导致检测假阳性率较高，此外引物和探针的设计对于检测结果的准确性和特性异至关重要。
发明内容
本发明提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒及其应用，用于解决现有技术中的结核分枝杆菌检测方法灵敏度和特异性低、假阳性率高等技术缺陷。
本发明提供一种结核分枝杆菌检测试剂盒，包括：
上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，并且在探针的5’端标记荧光基团，在探针的3’端标记淬灭基团。
在本发明中，所述荧光基团和淬灭基团可以为本领域的常规基团，例如所述荧光基团可以为FAM，所述淬灭基团可以为MGB。
进一步地，所述上游引物、下游引物和探针可以常规浓度单独存在试剂盒中，例如上游引物的浓度可以为5-20μM，下游引物的浓度可以为5-20μM，探针的浓度可以为1-10μM。
本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒还可以包括光敏DNA染料；进一步地，光敏DNA染料可以5-20mg/mL的浓度单独存在于试剂盒中。光敏DNA染料是对DNA具有高度亲和力的光敏染料，例如可以为叠氮溴化乙锭(EMA)、叠氮溴化丙啶(PMA)等，其能选择性地进入细胞壁和细胞膜受损的死细胞中，通过光活化反应(例如光照处理)与死细胞中的DNA共价结合，从而阻断死细胞DNA后续的PCR扩增；此外，由于活细胞的细胞壁和细胞膜相对完整，该类染料无法进入活细胞中，从而不会影响活细胞DNA后续的PCR扩增。在本发明的试剂盒中设置上述光敏DNA染料有利于提高结核分枝杆菌检测的特异性和准确性，避免造成假阳性。
本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒还可以包括实施荧光定量PCR所必要的其它试剂，例如稀释液、裂解液、PCR混合液等，其均可以为本领域的常规试剂。其中，稀释液用于进行稀释，其可以为PBS缓冲液等；裂解液用于提取样本DNA，其可以为本领域常规提取方法所用的裂解液，包括但不限于CTAB法、酚/氯仿法、ChelexlOO法等；PCR混合液用于实施荧光定量PCR，其可以包括本领域常规的PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、镁离子等。
进一步地，本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒还可以包括结核分枝杆菌阳性对照液和结核分枝杆菌阴性对照液中的一种或多种。其中，结核分枝杆菌阳性对照液可以为活的结核分枝杆菌，例如结核分枝杆菌H37Rv，其浓度可为102-104个/mL；结核分枝杆菌阴性对照液可以为灭活的结核分枝杆菌或者活的非结核分枝杆菌，非结核分枝杆菌例如可以为耻垢分枝杆菌(菌株编号为ATCC19420)，其浓度可为102-104个/mL。上述阳性对照液和阴性对照液用于在结核分枝杆菌检测过程中作为内参，从而避免因人为等因素造成的检测误差，提高检测的准确性。
本发明还提供一种上述任一所述的结核分枝杆菌检测试剂盒在结核分枝杆菌检测中的应用。
本发明还提供一种结核分枝杆菌检测方法，采用上述任一所述的结核分枝杆菌检测试剂盒进行，所述方法包括如下步骤：
1)对待测样本进行液化处理，制得液化样本；
2)向所述液化样本中加入光敏DNA染料，避光孵育后进行光照处理，制得处理样本；
3)提取所述处理样本的DNA，并以所述DNA为模板进行荧光定量PCR，得到Ct值；若Ct值≥36则为阴性，若Ct值<36则为阳性。
在本发明中，可以采用常规方法进行所述液化处理。在一实施方式中，步骤1)可以包括：向待测样本中加入质量含量为4％的NaOH溶液，震荡后静置，随后加入缓冲液并离心，弃上清液后加入缓冲液重悬沉淀，制得液化样本。
进一步地，步骤2)可以包括：向所述液化样本中加入叠氮溴化丙锭至终浓度为10-20μg/mL，置于2-6℃暗处理1-3h，随后避光孵育15-25min，再光照处理15-25min，制得处理样本。
在本发明中，可以采用本领域常规方法进行所述荧光定量PCR，例如反应体系可以为：所述探针2μL，所述上游引物2μL，所述下游引物2μL，所述DNA2μL，无RNA酶的水2μL，PCR混合液10μL；反应程序可以为：95℃预变性2min，95℃变性5秒，60℃退火20秒，共40个循环。
进一步地，所述方法还包括同时以结核分枝杆菌阳性对照液和结核分枝杆菌阴性对照液作为内参。
本发明的实施，至少具有以下优势：
1、本发明提供的结核分枝杆菌检测试剂盒操作简单，并且能够快速地对结核分枝杆菌进行检测，特别是特定设计的引物和探针不仅在不同结核分枝杆菌菌株间同源性高，并且在结核分枝杆菌基因组中具有较高的拷贝数，此外与其他非结核分枝杆菌微生物的同源性较低，特异性好。
2、本发明提供的结核分枝杆菌检测试剂盒可包括光敏DNA染料，因此有利于区别待测样本中的死菌和活菌，从而有效避免假阳性结果的出现；此外，该试剂盒还可包括结核分枝杆菌阳性对照液和结核分枝杆菌阴性对照液，其作为内参进一步保证了检测结果的准确性。
3、本发明提供的结核分枝杆菌检测试剂盒对检测样本的要求低，灵敏度高，检测速度快，特异性和准确性高，适应性广泛，特别适用于对临床标本中结核分枝杆菌的早期检测。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒，包括：
上游引物:GGTCAGCACGATTCGGAGTG(SEQIDNO：1)；
下游引物：CGGATTCTTCGGTCGTGGTC(SEQIDNO：2)；
探针：5’-FAM-CGTCTACTTGGTGTTGGCTGCG-MGB-3’(SEQIDNO：3)。
本发明的结核分枝杆菌检测试剂盒中，上游引物的浓度为5μM；下游引物的浓度为5μM，探针的浓度为1μM。
上述结核分枝杆菌检测试剂盒进一步包括叠氮溴化丙锭；其浓度为10mg/mL。
上述结核分枝杆菌检测试剂盒进一步包括结核分枝杆菌阳性对照液和结核分枝杆菌阴性对照液；其中：结核分枝杆菌阳性对照液为结核分枝杆菌H37Rv，其浓度为1×102个/mL；结核分枝杆菌阴性对照液为耻垢分枝杆菌(菌株编号为ATCC19420)，其浓度为1×103个/mL。
上述结核分枝杆菌检测试剂盒进一步包括稀释液、裂解液、PCR混合液等其它必要试剂。其中，PCR混合液包括PCR缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs和镁离子；DNA聚合酶用量为5U/uL，dNTPs的终浓度为0.5mmol/L，镁离子的终浓度为2.0mmol/L。
上述各组分单独设于结核分枝杆菌检测试剂盒中。
实施例2
1、样品制备
利用改良罗氏培养基对结核分枝杆菌H37Rv进行培养，培养后刮取菌落于磨菌瓶，并将其制成浓度为1×108个/mL的活菌液。
将上述活菌液分成两份，将其中一份活菌液梯度稀释成浓度为1×102个/mL的菌液，记作样品1；将另一份活菌液置于沸水中加热30分钟灭活，灭活后梯度稀释成浓度为1×103个/mL的灭活菌液，记作样品2；此外，将样品1和样品2等体积混合成混合菌液，记作样品3。
将上述样品1、样品2和样品3各自分成两份，每份500μL，分别记作样品1-1、样品1-2、样品2-1、样品2-2、样品3-1和样品3-2，备用。
2、样品处理
分别向上述样品1-1、样品2-1和样品3-1中加入PMA至终浓度为20μg/mL，同时分别向上述样品1-2、样品2-2和样品3-2中加入与PMA等体积的去离子水；随后将各样品置于4℃暗处理2h，接着避光孵育20min，再光照反应20min，制得各处理样品。
采用酚/氯仿法分别提取上述各处理样品的DNA，各样品DNA的浓度均为0.001ng/uL左右。
3、样品检测
采用实施例1的结核分枝杆菌检测试剂盒，并以上述提取的各处理样品的DNA作为模板进行荧光定量PCR，其中：
反应体系如下：
反应条件如下：
检测后得到扩增曲线的Ct值，其中将Ct值≥36判定为阴性，将Ct值<36判定为阳性。各样品的检测结果见表1。
表1各样品检测结果
样品编号 Ct值
1-1 32.56
1-2 32.32
2-1 39.114 -->
2-2 31.74
3-1 34.91
3-2 32.07
由表1结果可知：
1、样品1-2结果判定为阳性，与实际情况一致，说明本发明设计的引物和探针具有良好的特异性，其与结核分枝杆菌的同源性高；样品1-1结果判定为阳性，并且与和样品1-2的Ct值无显著差异，说明PMA等光敏DNA染料处理对结核分枝杆菌不会造成损害，检测结果准确性高。
2、样品2-2结果判定为阳性，然而该样品为灭活的菌液，与实际情况不符，说明在检测时若不加入PMA等光敏DNA染料进行处理，则可能造成假阳性；样品2-1结果判定为阴性，与实际情况一致，说明加入PMA等光敏DNA染料进行处理能够有效避免假阳性，从而提高检测的准确性。
3、样品3-2的Ct值与样品1-1和样品1-2无显著差异，且明显低于样品3-1，说明未经PMA等光敏DNA染料处理样品的Ct值实际包含样品中的死菌DNA和活菌DNA，而经处理后仅检测出活菌DNA，检测结果特异性更高。
实施例3
1、临床标本液化
从某医院取经确诊的阳性临床标本和阴性临床标本各1mL，向各标本中分别加入等体积的质量含量为4％的NaOH溶液，涡旋震荡1min，静置15min，随后向其中加入42ml的PBS缓冲液，离心15min,弃上清，再加入1mlPBS缓冲液重选沉淀，并将重悬液吸取至1.5ml离心管中，视需要适当稀释，制得阳性液化标本和阴性液化标本。
2、临床标本处理
取稀释的阳性液化标本和阴性液化标本各1mL，向各液化标本中加入PMA至终浓度为20μg/mL，放置于4℃冰箱中暗处理2h，随后置于BluCoo活菌甄选仪中避光孵育20min，再光照反应20min，制得阳性处理标本和阴性处理标本。
采用酚/氯仿法分别提取上述两种处理标本的DNA，备用。
3、样品检测
采用实施例2的方法，分别以上述两种处理标本的DNA为模板进行荧光定量PCR，结果表明：阳性临床标本的Ct值<36，阴性临床标本的Ct值＞36，与实际情况一致，说明本发明的方法检测准确性高。
实施例4
采用实施例2方法对四株不同的结核分枝杆菌分别进行培养，并制成浓度为1×102个/mL的菌液，分别记作样品4-1、样品4-2、样品4-3和样品4-4。
将上述各样品分成两份，每份500μL，并分别记作样品4-1-1、样品4-1-2、样品4-2-1、样品4-2-2、样品4-3-1、样品4-3-2、样品4-4-1和样品4-4-2。
采用实施例2方法对样品4-1-1、样品4-2-1、样品4-3-1和样品4-4-1进行处理和检测，结果见表2。
同时，采用实施例2方法对样品4-1-2、样品4-2-2、样品4-3-2和样品4-4-2进行处理和检测，其中不同的是，荧光定量采用以16SrRNA设计的下述引物和探针：
上游引物:AGGGTGCGAGCGTTGTCC(SEQIDNO：4)
下游引物：CGTTTACGGCGTGGACTACC(SEQIDNO：5)
探针：5’-FAM-TCGTGAAATCTCACGGCTTAA-MGB-3’(SEQIDNO：6)
结果见表2。
表2四株结核分枝杆菌检测结果
样品编号 Ct值 样品编号 Ct值
4-1-1 17.32 4-1-2 19.15
4-2-1 14.76 4-2-2 18.72
4-3-1 19.63 4-3-2 23.41
4-4-1 23.16 4-4-2 24.87
实施例5
对表3中的五株不同的非结核分枝杆菌进行培养，并制成浓度为1×103个/mL的菌液；采用实施例2方法进行样品处理和样品检测，结果见表3。
表3五株非结核分枝杆菌检测结果
菌株名称 菌株编号 Ct值
耻垢分枝杆菌 ATCC19420 NA
胞内分枝杆菌 ATCC13950 NA
鸟分枝杆菌 ATCC25291 NA
堪萨斯分枝杆菌 ATCC12478 NA
偶然分枝杆菌 ATCC6481 NA
戈登分枝杆菌 ATCC14470 NA
龟分枝杆菌 ATCC14472 NA
脓肿分枝杆菌 ATCC19977 NA
注：NA代表Ct值＞36。
由上述结果可知：
本发明设计的特定引物和探针在不同结核分枝杆菌菌株之间的同源性高，并且与其他非结核分枝杆菌微生物的同源性较低，特异性好；此外，与传统的基因靶标16SrRNA设计的引物和探针相比，本发明得到的扩增曲线Ct值均低于以16SrRNA设计的引物和探针，说明本发明设计的引物和探针在结核分枝杆菌基因组中具有更高的拷贝数，更适于对临床标本中结核分枝杆菌的早期检测。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，包括：
上游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示；
下游引物，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示；
探针，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示，并且在探针的5’端标记荧光基团，在探针的3’端标记淬灭基团。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为MGB。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，还包括光敏DNA染料。
4.根据权利要求3所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，所述光敏DNA染料为叠氮溴化丙锭。
5.根据权利要求1至4任一所述的结核分枝杆菌检测试剂盒，其特征在于，还包括稀释液、裂解液、PCR混合液、结核分枝杆菌阳性对照液和结核分枝杆菌阴性对照液中的一种或多种；其中，所述PCR混合液包括PCR缓冲液、DNA聚合酶和dNTPs。
6.权利要求1至5任一所述的结核分枝杆菌检测试剂盒在结核分枝杆菌检测中的应用。
7.一种结核分枝杆菌检测方法，其特征在于，采用权利要求1至5任一所述的结核分枝杆菌检测试剂盒进行，所述方法包括如下步骤：
1)对待测样本进行液化处理，制得液化样本；
2)向所述液化样本中加入光敏DNA染料，避光孵育后进行光照处理，制得处理样本；
3)提取所述处理样本的DNA，并以所述DNA为模板进行荧光定量PCR，得到Ct值；若Ct值≥36则为阴性，若Ct值<36则为阳性。
8.根据权利要求7所述的结核分枝杆菌检测方法，其特征在于，步骤1)包括：向待测样本中加入质量含量为4％的NaOH溶液，震荡后静置，随后加入缓冲液并离心，弃上清液后加入缓冲液重悬沉淀，制得液化样本。
9.根据权利要求7所述的结核分枝杆菌检测方法，其特征在于，步骤2)包括：向所述液化样本中加入叠氮溴化丙锭至终浓度为10-20μg/mL，置于2-6℃暗处理1-3h，随后避光孵育15-25min，再光照处理15-25min，制得处理样本。
10.根据权利要求7所述的结核分枝杆菌检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应体系为：所述探针2μL，所述上游引物2μL，所述下游引物2μL，所述DNA2μL，无RNA酶的水2μL，PCR混合液10μL；反应程序为：95℃预变性2min，95℃变性5秒，60℃退火20秒，共40个循环。
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